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CN109844105A - 包含硒代半胱氨酸的重组多肽及其产生方法 - Google Patents

包含硒代半胱氨酸的重组多肽及其产生方法 Download PDF

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CN109844105A
CN109844105A CN201780048121.5A CN201780048121A CN109844105A CN 109844105 A CN109844105 A CN 109844105A CN 201780048121 A CN201780048121 A CN 201780048121A CN 109844105 A CN109844105 A CN 109844105A
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amino acid
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CN201780048121.5A
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安德鲁·D·埃林顿
罗西·塞耶尔
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University of Texas System
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University of Texas System
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Abstract

提供了包含纯化的重组硒蛋白，如抗体和酶的组合物。同样提供了产生此类重组多肽的方法和用于产生此类重组多肽的细菌菌株。

Description

包含硒代半胱氨酸的重组多肽及其产生方法
本申请要求2016年7月11日提交的美国临时专利申请号62/360,745的权益，所述临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
本发明是在政府的支持下根据国家科学基金会授予的资助号CHE1402753进行的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
1.技术领域
本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及包含非规范氨基酸的多肽。
2.相关技术说明
某些生物体使用硒来表达硒蛋白。硒蛋白是一组独特的多肽，其存在于原核生物和真核生物中并且含有非规范氨基酸硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸具有比半胱氨酸显著更低的pKa(对于游离氨基酸5.2对8.5)和更强的亲核性质，从而使其成为改变蛋白质化学和功能的有吸引力的靶标。不幸的是，大多数硒蛋白已被证明难以在大肠杆菌中产生，大肠杆菌是用于重组蛋白产生的标准宿主。这是由于细菌中硒代半胱氨酸并入的固有低效率(4％-5％对蛋白质合成的终止)。此外，要求SECIS元件紧跟UGA密码子，从而形成编码序列的一部分，极大地限制了哪些蛋白质适合于硒代半胱氨酸插入。
最近，还开发了一种进化的大肠杆菌tRNASec，其与经典翻译机制相容并且可遏制琥珀终止密码子以高效率地并入硒代半胱氨酸。然而，对于允许有效并入硒代半胱氨酸以产生商业上相关量的重组硒蛋白的系统存在未满足的需求。
发明内容
本公开的第一实施方案提供一种包含纯化的重组多肽的组合物，所述多肽在所述多肽的野生型型式中未发现的选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基，其中所述组合物中至少80％的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在某些方面，所述重组多肽包含抗体或酶。在某些方面，所述组合物包含至少10μg、50μg、100μg、500μg或1mg的纯化的重组多肽。在一些方面，所述纯化的重组多肽是95％-99.9％纯的，例如至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％纯的。
在一些方面，所述组合物中80％-99.9％的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在某些方面，所述组合物中90％-99％的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述组合物中至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在其它方面，组合物包含在选定位置具有至少两个硒代半胱氨酸残基的重组多肽，并且所述组合物中80％-99.9％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的重组多肽在所述选定位置包含两个硒代半胱氨酸残基。在其它方面，组合物包含在形成二硒键的选定位置具有至少两个硒代半胱氨酸残基的重组多肽，并且所述组合物中80％-99.9％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的重组多肽包含在所述选定位置的硒代半胱氨酸残基之间的二硒键。
在一些方面，所述重组多肽与人多肽至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在某些方面，所述人多肽是疾病中涉及的多肽。在一些方面，所述人多肽是酶、趋化因子、细胞因子、抗体或T细胞受体。在一些方面，所述抗体是无糖基化抗体。在其它方面，所述人多肽是包含二硫键的多肽，并且所述重组多肽包含代替所述二硫键的二硒键。
在某些方面，所述多肽在选定位置包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个硒代半胱氨酸残基。在其它方面，所述组合物中至少约80％-99.9％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的重组多肽在所述选定位置中的每一个处包含硒代半胱氨酸残基。在其它方面，所述多肽在选定位置包含至少两个硒代半胱氨酸残基。在某些方面，所述选定位置处的两个硒代半胱氨酸残基形成二硒键。
另一实施方案提供一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案的组合物，所述组合物包含纯化的重组多肽，所述多肽在所述多肽的野生型型式中未发现的选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基，其中所述组合物中至少80％-99.9％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。
其它实施方案提供一种治疗受试者的方法，所述方法包括施用有效量的实施方案的药物组合物，所述药物组合物包含纯化的重组多肽，所述多肽在所述多肽的野生型型式中未发现的选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基，其中所述组合物中至少80％-99.9％(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。
在另一实施方案中，提供了一种编码多肽的核酸分子，所述多肽：(a)包含与SEQID NO：1至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：1的位置344的位置处具有氨基酸取代或缺失；(b)包含与SEQ ID NO：2至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：2的位置702的位置处具有氨基酸取代或缺失；(c)包含与SEQ ID NO：3至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：3的位置655的位置处具有氨基酸取代或缺失；(d)包含与SEQ ID NO：4至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处具有氨基酸取代或缺失；(e)包含与SEQ ID NO：5至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：5的位置781的位置处具有氨基酸取代或缺失；(f)包含与SEQ ID NO：6至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：6的位置136的位置处具有氨基酸取代或缺失；(g)包含与SEQ ID NO：7至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：7的位置183的位置处具有氨基酸取代或缺失；(h)包含与SEQ ID NO：8至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：8的位置1的位置处具有氨基酸取代或缺失；(i)包含与SEQ ID NO：9至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：9的位置102的位置处具有氨基酸取代或缺失；(j)包含与SEQ ID NO：10至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：10的位置105的位置处具有氨基酸取代或缺失；(k)包含与SEQ ID NO：11至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：11的位置673的位置处具有氨基酸取代或缺失；(l)包含与SEQ ID NO：12至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ IDNO：12的位置69的位置处具有氨基酸取代或缺失；(m)包含与SEQ ID NO：13至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQID NO：13的位置107的位置处具有氨基酸取代或缺失；(n)包含与SEQ ID NO：17至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处具有氨基酸取代或缺失；(o)包含与SEQ ID NO：18至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：18的位置545的位置处具有氨基酸取代或缺失；和/或(p)包含与SEQ IDNO：19至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：19的位置124的位置处具有氨基酸取代或缺失。
另一实施方案提供一种重组多肽，所述重组多肽：(a)包含与SEQ ID NO：1至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：1的位置344的位置处具有氨基酸取代或缺失；(b)包含与SEQ ID NO：2至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：2的位置702的位置处具有氨基酸取代或缺失；(c)包含与SEQ ID NO：3至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：3的位置655的位置处具有氨基酸取代或缺失；(d)包含与SEQ IDNO：4至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处具有氨基酸取代或缺失；(e)包含与SEQ IDNO：5至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：5的位置781的位置处具有氨基酸取代或缺失；(f)包含与SEQID NO：6至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：6的位置136的位置处具有氨基酸取代或缺失；(g)包含与SEQ ID NO：7至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：7的位置183的位置处具有氨基酸取代或缺失；(h)包含与SEQ ID NO：8至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：8的位置1的位置处具有氨基酸取代或缺失；(i)包含与SEQ ID NO：9至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：9的位置102的位置处具有氨基酸取代或缺失；(j)包含与SEQ ID NO：10至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：10的位置105的位置处具有氨基酸取代或缺失；(k)包含与SEQ ID NO：11至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：11的位置673的位置处具有氨基酸取代或缺失；(l)包含与SEQ ID NO：12至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：12的位置69的位置处具有氨基酸取代或缺失；(m)包含与SEQ ID NO：13至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：13的位置107的位置处具有氨基酸取代或缺失；(n)包含与SEQ ID NO：17至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处具有氨基酸取代或缺失；(o)包含与SEQ ID NO：18至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：18的位置545的位置处具有氨基酸取代或缺失；或(p)包含与SEQ ID NO：19至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ IDNO：19的位置124的位置处具有氨基酸取代或缺失。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，根据前一段落的多肽包含在对应于SEQ ID NO：1的位置344的位置处的Pro取代。在某些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：2的位置702的位置处的His取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：3的位置655的位置处的Ala取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处的Ala取代。在某些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：5的位置781的位置处的Gly取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：6的位置136的位置处的Val取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：7的位置183的位置处的Ala取代。在某些方面，所述多肽包含在对应于SEQ IDNO：8的位置1的位置处的Arg取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：9的位置102的位置处的Cys取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：10的位置105的位置处的Cys取代。在某些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：11的位置673的位置处的Leu取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：12的位置69的位置处的Gly取代。在某些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：13的位置107的位置处的Ser取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQID NO：17的位置246的位置处的Ala取代。在某些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：18的位置545的位置处的Ile取代。在一些方面，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：19的位置124的位置处的Pro取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：1至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：1的位置999的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置457的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置591的位置处的Pro取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置183的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置358的位置处的Leu取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置23的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置902的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置889的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置620的位置处的Cys取代和/或在对应于SEQ ID NO：1的位置174的位置处的Gly取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在某些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：3至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：3的位置398的位置处的Cys取代、在对应于SEQ ID NO：3的位置652的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：3的位置264的位置处的Cys取代和/或在对应于SEQ ID NO：3的位置21的位置处的Ala取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：4至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：4的位置45的位置处的Asn取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置290的位置处的Leu取代、在对应于SEQID NO：4的位置271的位置处的Asp取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置153的位置处的Tyr取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置45的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置284的位置处的Pro取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处的Ile取代、在对应于SEQ IDNO：4的位置68的位置处的Leu取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置69的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置305的位置处的Cys取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置144的位置处的Ser取代和/或在对应于SEQ ID NO：4的位置281的位置处的Val取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在某些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：5至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：5的位置916的位置处的Gly取代、在对应于SEQ ID NO：5的位置938的位置处的His取代、在对应于SEQ ID NO：5的位置860的位置处的His取代、在对应于SEQ ID NO：5的位置925的位置处的Asp取代和/或在对应于SEQ ID NO：5的位置470的位置处的Met取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：6至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：6的位置115的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置386的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置155的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置98的位置处的Ser取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置201的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置294的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置159的位置处的Tyr取代和/或在对应于SEQ ID NO：6的位置112的位置处的Ile取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：18至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：18的位置76的位置处的Gly取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置293的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置637的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置3的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置311的位置处的Ser取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置471的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置228的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置311的位置处的Ser取代和/或在对应于SEQ ID NO：18的位置257的位置处的Thr取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：7至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：7的位置173的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置196的位置处的Leu取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置180的位置处的Phe取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置249的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置5的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置273的位置处的Leu取代和/或在对应于SEQ ID NO：7的位置176的位置处的Asn取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：9至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：9的位置15的位置处的Cys取代和/或在对应于SEQ ID NO：9的位置30的位置处的取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在某些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：19至少90％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：19的位置193的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：19的位置233的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：19的位置300的位置处的Ala取代和/或在对应于SEQ ID NO：19的位置199的位置处的Arg取代。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：17至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处的Ala取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在一些方面，所述多肽还包含与SEQ ID NO：11至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列以及在对应于SEQ ID NO：11的位置119的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置535的位置处的Pro取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置373的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：1l的位置535的位置处的Ser取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置119的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置601的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置103的位置处的Lys取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置31的位置处的Asp取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置662的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置359的位置处的Lys取代和/或在对应于SEQID NO：11的位置519的位置处的Asp取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
另一个实施方案提供了一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：(i)与SEQ IDNO：14至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置212的位置处的Ile取代、在对应于位置162的位置处的Asn取代、在对应于位置299的位置处的Ala取代和/或在对应于位置220的位置处的Arg取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在又一个实施方案中，提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含：(i)与SEQ IDNO：14至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置212的位置处的Ile取代、在对应于位置162的位置处的Asn取代、在对应于位置299的位置处的Ala取代和/或在对应于位置220的位置处的Arg取代。在其它方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述多肽之一。
在另一实施方案中，提供了一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：(i)与SEQID NO：15至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置184的位置处的Ala取代、在对应于位置1730的位置处的Asn取代、在对应于位置1888的位置处的Asp取代、在对应于位置352的位置处的Thr取代、在对应于位置374的位置处的Ser取代、在对应于位置1423的位置处的Arg取代、在对应于位置1502的位置处的Glu取代、在对应于位置285的位置处的Gln取代、在对应于位置470的位置处的Lys取代、在对应于位置939的位置处的Thr取代、在对应于位置1669的位置处的Phe取代、在对应于位置2034的位置处的Ile取代、在对应于位置1713的位置处的Asn取代、在对应于位置704的位置处的Thr取代和/或在对应于位置1084的位置处的Ile取代。
在另一实施方案中，提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含：(i)与SEQ ID NO：15至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置184的位置处的Ala取代、在对应于位置1730的位置处的Asn取代、在对应于位置1888的位置处的Asp取代、在对应于位置352的位置处的Thr取代、在对应于位置374的位置处的Ser取代、在对应于位置1423的位置处的Arg取代、在对应于位置1502的位置处的Glu取代、在对应于位置285的位置处的Gln取代、在对应于位置470的位置处的Lys取代、在对应于位置939的位置处的Thr取代、在对应于位置1669的位置处的Phe取代、在对应于位置2034的位置处的Ile取代、在对应于位置1713的位置处的Asn取代、在对应于位置704的位置处的Thr取代和/或在对应于位置1084的位置处的Ile取代。
在一个实施方案中，提供了一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：(i)与SEQID NO：16至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置112的位置处的Phe取代、在对应于位置126的位置处的Ala取代、在对应于位置978的位置处的Leu取代、在对应于位置199的位置处的Gly取代、在对应于位置476的位置处的Thr取代和/或在对应于位置735的位置处的Val取代。
另一实施方案提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含：(i)与SEQ ID NO：16至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置112的位置处的Phe取代、在对应于位置126的位置处的Ala取代、在对应于位置978的位置处的Leu取代、在对应于位置199的位置处的Gly取代、在对应于位置476的位置处的Thr取代和/或在对应于位置735的位置处的Val取代。
一个实施方案还提供了一种细菌菌株，所述细菌菌株包含实施方案的至少一种核酸分子或表达实施方案的至少一种多肽(例如，与SEQ ID NO：1的多肽之一至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且包含表1中列出的取代之一的多肽)。在一些方面，所述细菌菌株包含编码表1的多肽的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种核酸分子。在一些方面，所述细菌菌株表达由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种核酸分子编码的多肽。
在其它方面，所述细菌菌株包含编码tRNA和用于并入硒代半胱氨酸的氨酰基-tRNA合成酶的核酸。在一些方面，所述tRNA识别UAG密码子。在一些方面，所述细菌菌株包含编码tRNA的核酸，所述tRNA与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22至少90％相同。在一些方面，所述细菌菌株还包括一个或多个以下特征：(i)在对应于位置7的位置处的G或C；(ii)在对应于位置49的位置处的T；(iii)在对应于位置50的位置处的A或C；(iv)在对应于位置64的位置处的T；(v)在对应于位置65的位置处的G或A；和/或(vi)在对应于位置66的位置处的G、T或C。在一些方面，所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ ID NO：20至少约90％相同的序列；并且包括一个或多个以下特征：(i)在对应于位置7的位置处的G；(ii)在对应于位置49的位置处的T；(iii)在对应于位置50的位置处的C；(iv)在对应于位置64的位置处的T；(v)在对应于位置65的位置处的G；和/或(vi)在对应于位置66的位置处的C。在其它方面，所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：4至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在具体方面，所述分子编码tRNA，所述tRNA包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20或SEQ ID NO：4。
在一些方面，所述细菌菌株还包含编码目标多肽的可表达核酸序列，所述目标多肽在编码序列中具有至少一个位置，所述位置具有用于硒代半胱氨酸并入的TAG密码子。在某些方面，所述可表达的核酸序列编码人多肽。在一些方面，所述可表达的核酸序列编码酶或抗体。在某些方面，所述可表达的核酸序列包含T7RNA聚合酶启动子。在一些方面，所述细菌菌株还包含编码T7RNA聚合酶的核酸序列。
在其它方面，所述细菌菌株是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌菌株。在另一实施方案中，提供了在NCIMB以登录号42595保藏的大肠杆菌细菌菌株。在另一实施方案中，提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含在选定位置处的至少一个硒代半胱氨酸残基，所述重组多肽是通过在根据实施方案的细菌菌株中且在硒源存在下表达编码多肽的核酸并且从所述细菌中纯化所述重组多肽而产生。
另一实施方案提供了一种细菌培养物，所述细菌培养物包含5至100mg/L所述培养物的量的表达的重组多肽。在某些方面，所述表达的重组多肽包含至少一个硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述细菌培养物包含10至40mg/L所述培养物的量的表达的重组多肽，所述表达的重组多肽包含至少一个硒代半胱氨酸残基。在某些方面，所述表达的重组多肽以5至50mg/L、10至80mg/L、15至60mg/L、10至30mg/L、20至80mg/L、30至90mg/L、40至80mg/L、50至70mg/L、60至90mg/L、70至80mg/L或90至100mg/L所述培养物的量存在。在某些方面，所述表达的重组多肽以5至10mg/L、7至15mg/L、10至20mg/L、15至30mg/L、20至35mg/L、30至40mg/L、35至45mg/L、40至50mg/L、45至55mg/L、50至50mg/L、55至65mg/L、50至60mg/L、65至70mg/L、75至85mg/L、85至90mg/L、80至95mg/L、85至98mg/L或95至100mg/L所述培养物的量存在。在某些方面，所述表达的重组多肽在所述培养物中的量是至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、75mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L、100mg/L或更高。
在一些方面，所述表达的重组多肽是实施方案的多肽(例如与SEQ ID NO：1的多肽之一至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且包含表1中列出的取代之一的多肽)。在某些方面，所述表达的重组多肽在所述多肽的野生型型式中未发现的选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述培养物中至少80％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在某些方面，所述培养物中80％-99.9％的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述培养物中90％-99％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述培养物中至少95％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述培养物中至少99％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述表达的重组多肽与人多肽至少90％相同。在某些方面，所述人多肽是疾病中涉及的多肽。在一些方面，所述表达的重组多肽包含抗体或酶。在某些方面，所述多肽在选定位置包含至少两个硒代半胱氨酸残基。在一些方面，所述选定位置处的两个硒代半胱氨酸残基形成二硒键。在具体方面，所述多肽在选定位置包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个硒代半胱氨酸残基。另一实施方案提供了一种从实施方案的培养物中纯化的多肽，所述多肽包含至少第一硒代半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，提供了一种表达多肽的方法，所述多肽包含至少一个硒代半胱氨酸残基，所述方法包括：(a)在实施方案的细菌菌株中且在硒源存在下表达编码所述多肽的核酸；以及(b)从所述细菌中纯化所述重组多肽。在另一个实施方案中，提供了一种通过以下方法产生的重组多肽，所述重组多肽在选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基，所述方法包括：(a)在实施方案的细菌菌株中且在硒源存在下表达编码所述多肽的核酸；以及(b)从所述细菌中纯化所述重组多肽。
在另一实施方案中，提供了实施方案的细菌菌株作为宿主用于产生包含至少一个硒代半胱氨酸残基的多肽的用途。在其它方面，所述细菌菌株在包含硒源的培养基中培养。
在另一实施方案中，提供了一种包含异源核酸的转基因细菌菌株，所述异源核酸编码用于并入至少第一非规范氨基酸的翻译组分和可筛选或选择性标记多肽，当所述标记多肽的至少一个位置是所述第一非规范氨基酸时，所述标记多肽表现出增强的活性。在具体方面，所述可筛选标记是荧光或发光多肽。在其它方面，所述细菌菌株包含实施方案的至少一种核酸分子或表达实施方案的至少一种多肽(例如，与SEQ ID NO：1的多肽之一至少90％相同并且包含表1中列出的取代之一的多肽)。
在其它方面，所述细菌菌株包含编码选择性标记的异源核酸，当标记多肽的至少一个位置是所述第一非规范氨基酸时，所述选择性标记表现出增强的活性。在其它方面，所述选择性标记是提供抗生素抗性的多肽。在特定方面，所述选择性标记是β-内酰胺酶。
在一些方面，所述细菌菌株是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞。在一些具体方面，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。在其它特定方面，所述细菌细胞是肠杆菌属或沙雷氏菌属细菌。在其它方面，所述细菌细胞是阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)细菌细胞。
在某些方面，用于并入第一非规范氨基酸的翻译组分包含编码tRNA和用于第一非规范氨基酸的氨酰基-tRNA合成酶的核酸。在一些方面，所述tRNA识别UAG密码子。在其它方面，所述tRNA与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在具体方面，所述tRNA包含SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23。
在其它方面，用于并入第一非规范氨基酸的翻译组分还包含编码用于合成第一非规范氨基酸的酶的核酸。在一个特定方面，所述非规范氨基酸是硒代半胱氨酸。在其它方面，所述细胞包含编码selA、selB和/或selC的核酸。在一个具体方面，所述细胞包含编码selA的核酸。在一些方面，所述细菌细胞包含失活或缺失的prfA基因。在某些方面，所述细胞已被工程改造为缺乏内源性琥珀(TAG)密码子。在一些特定方面，所述细胞是或源自大肠杆菌C321.ΔA。
在另一实施方案中，本发明提供了一种根据上述实施方案和方面的细菌细胞群体。在某些方面，所述群体包含1x103至1x1012个细菌细胞。
在另一实施方案中，提供了一种产生商业多肽的方法，所述商业多肽包含至少第一非规范氨基酸，所述方法包括(i)获得根据实施方案的细菌菌株和编码所述商业多肽的表达盒；以及(ii)在允许所述商业多肽表达的条件下孵育所述细菌菌株。在一些方面，编码所述商业多肽的表达盒在诱导型启动子的控制之下。在某些方面，所述方法还包括分离表达的商业多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了一种筛选具有所需活性的多肽的方法，所述方法包括(i)获得根据实施方案的细菌细胞群体，所述细胞编码候选多肽文库，所述多肽包含至少第一非规范氨基酸位置；以及(ii)筛选所述细菌群体以鉴别具有所需生物活性的候选多肽。在具体方面，所述细菌细胞群体包含编码100至10,000,000种不同候选多肽的核酸构建体。
在另一实施方案中，提供了一种重组核酸分子，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同；并且包括一个或多个以下特征：在对应于位置7的位置处的G或C；在对应于位置49的位置处的T；在对应于位置50的位置处的A或C；在对应于位置64的位置处的T；在对应于位置65的位置处的G或A；和/或在对应于位置66的位置处的G、T或C。在一些特定方面，所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ ID NO：20至少约90％相同的序列；并且包括一个或多个以上列出的特征。在其它具体方面，所述分子包括以上列出的特征中的2、3、4、5或6个。在某些方面，所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：19至少约90％相同的序列。在特定方面，所述分子编码tRNA，所述tRNA包含SEQID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的序列。
在另一实施方案中，提供了一种重组多肽，所述重组多肽编码β-内酰胺酶，所述酶包含为所述酶的活性所需的两个半胱氨酸位置之间的二硫键，其中所述两个半胱氨酸位置中的至少一个被硒代半胱氨酸取代。在一些方面，两个所述半胱氨酸残基都被硒代半胱氨酸取代。在其它方面，所述β-内酰胺酶是SME型β-内酰胺酶或NMC-Aβ-内酰胺酶。例如，β-内酰胺酶可包含与SEQ ID NO：24至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列，并且其中对应于C69和/或C238的位置是硒代半胱氨酸。在某些方面，对应于C69和C238的位置是硒代半胱氨酸。
本发明的其它实施方案提供了一种重组核酸分子，所述重组核酸分子编码根据上述实施方案和方面的多肽。在一些方面，对应于一个或多个硒代半胱氨酸位置的密码子是UAG密码子。在其它方面，所述序列与SEQ ID NO：25至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文所用，就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅以污染物或痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染产生的指定组分的总量远低于0.01％。最优选的是用标准分析方法检测不到指定组分量的组合物。
如本文在说明书中所用，“一个/种(a/an)”可指一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求中所用，当与词语“包括/包含(comprising)”结合使用时，词语“一个/种”可指一个(种)或多于一个(种)。
除非明确指明仅仅指代替代物，或替代物相互排斥，否则权利要求书中所用的术语“或”用于指“和/或”，尽管本公开支持仅仅指代替代物和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可指至少第二个(种)或更多个(种)。
在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括装置、用以测定所述值的方法的误差的固有变化，或研究受试者中存在的变化。
通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的优选实施方案，但是详细描述和特定实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参考与本文提出的具体实施方案的详细描述结合的这些附图中的一个或多个来更好地理解。
图1A-1C：用于产生硒蛋白的大肠杆菌菌株条件性地依赖于硒代半胱氨酸来生长和存活。含有整合的β-内酰胺酶与天然二硫键的大肠杆菌菌株(图1A)不需要硒补充来在β-内酰胺抗生素羧苄青霉素存在下存活。具有一个(图1B)或两个(图1C)必需硒代半胱氨酸残基(其分别形成氢硒基-巯基或二硒键)的大肠杆菌菌株需要硒来获得对β-内酰胺抗生素的抗性。对硒代半胱氨酸并入的条件依赖性防止另外有毒的硒代半胱氨酸生物合成和并入机制的丧失或减弱。在图1B和1C中，在时间16小时处从顶部至底部的线表示MOPS EZ、仅Se、Se+Carb和仅Carb。
图2A-2B：用于产生硒蛋白的大肠杆菌菌株含有一组突变，所述突变经由硒代半胱氨酸依赖性β-内酰胺酶显著增强细胞生长和对β-内酰胺抗生素的抗性。亲本大肠杆菌菌株(图2A)在丰富培养基中生长期间对经由硒代半胱氨酸依赖性β-内酰胺酶介导的β-内酰胺抗生素具有中等抗性。用于产生含有一系列突变的重组硒蛋白(图2B)的大肠杆菌菌株具有较高的生长速率、最终细胞密度和对羧苄青霉素的抗性。这种改善的生长使突变菌株成为用于产生重组硒蛋白的优良宿主。在图2A中，在时间16小时处从顶部至底部的线表示LB、100Carb、1000Carb和10000Carb，其中1000Carb和10000Carb的线重叠。在图2B中，在时间16小时处从顶部至底部的线表示LB、100Carb、1000Carb和10000Carb，其中100Carb和1000Carb的线重叠。
图3A-3B：用于产生硒蛋白的大肠杆菌菌株含有一组突变，所述突变显著增强限定培养基中的细胞生长。亲本大肠杆菌菌株(图3A)具有延长的迟滞期并且在限定生长培养基中显示出较差生长。用于产生含有一系列突变的重组硒蛋白(图3B)的大肠杆菌菌株具有较高的生长速率、最终细胞密度和对β-内酰胺抗生素的硒代半胱氨酸依赖性抗性。为了再现性和质量保证，限定生长培养基通常用于重组蛋白的商业生产。在图3A和3B中，在时间20小时处从顶部至底部的线表示MOPS EZ、仅Se、Se+Carb和仅Carb。
图4A-4B：含有二硒键的大肠杆菌二氢叶酸还原酶的完整质谱和UVPD片段化图谱。大肠杆菌DHFR的质谱(图4A，所示的平均质量)证实以大约100％效率并入两个硒代半胱氨酸残基。未检测到对应于并入一个或两个丝氨酸残基的质量。UVPD片段化作图(图4B，SEQID NO：26)证实在位置39和85处并入硒代半胱氨酸(U)和形成二硒键。二硒键形成由对应于两个硒代半胱氨酸残基之间的片段化事件的离子的缺乏来指示。DHFR的产量是8mg/L。含有二硒键的其它蛋白质已经以超过40mg/L的产量表达。
图5A-5C：含有两个必需二硒键的抗-MS2scFv的质谱和UVPD片段化图谱。被开发用于表达重组硒蛋白的大肠杆菌菌株能够在细菌细胞质中产生二硒化物稳定的抗体片段。与被开发用于表达含有二硫键的蛋白质的大肠杆菌菌株不同，这种菌株不需要升高的细胞质氧化还原电位。实验确定的单同位素质量(图5A)与含有四个硒代半胱氨酸残基的重组抗-MS2scFv一致，所述硒代半胱氨酸残基已经形成了两个二硒键。二硒键形成由四个质子的损失指示(图5A，第3行对第2行)。含有四个硒代半胱氨酸残基的抗-MS2scFv的完整质谱(图5B)显示为平均质量。未检测到对应于丝氨酸残基并入的质量。UVPD片段化作图(图5C，SEQID NO：27)证实在位置42、116、179和249并入硒代半胱氨酸(U)以及还有二硒键形成。二硒键形成由对应于硒代半胱氨酸残基对(U42：U116和U179：U249)之间的片段化事件的离子的缺乏来指示。
图6A-6D：野生型抗蓖麻毒素A链scFv(分别图6A和6B)和硒抗蓖麻毒素A链scFv(分别图6C和6D)的UVPD片段图谱和ELISA。对于193nm UVPD序列信息，共价键合(或潜在键合)的半胱氨酸残基(图6A，SEQ ID NO：28)和共价键合(或潜在键合)的硒代半胱氨酸残基(图6C，SEQ ID NO：29)以灰色阴影表示。序列覆盖中的间隙表明在半胱氨酸残基之间形成共价二硫键。硒代半胱氨酸残基之间不存在片段化证实两个二硒键的形成。键连接性与野生型抗蓖麻毒素A链scFv相同。用DTT处理野生型抗蓖麻毒素A链scFv导致显著活性丧失(图6B)。含有硒代半胱氨酸的scFv对还原条件具有强烈抗性(图6D)。用50mM DTT处理仅导致轻微亲和力损失(EC507.95nM至EC5011.4nM)。在图6B和6D中，在scFv浓度10nM处从顶部至底部的线代表0mM DTT、1mM DTT、10mM DTT和50mM DTT。
图7A-7C：在大肠杆菌菌株BL21DE3(图7A，SEQ ID NO：30)、T7Shuffle Express(图7B，SEQ ID NO：30)和RTΔA-2X310K(图7C，SEQ ID NO：31)中产生的曲妥珠单抗(赫赛汀)scFv的UVPD片段图谱。对于上文所示的193nm UVPD序列信息，共价键合(或潜在键合)的半胱氨酸残基(图7B)和共价键合的硒代半胱氨酸残基(图7C)以灰色阴影表示。(图7A)整个蛋白质序列中的均匀片段化表明未形成二硫键。(图7B)序列的后半部分缺乏片段化证实仅在VH区域中形成二硫键。尽管在氧化条件下表达，但在VL区中未形成二硫键。(图7C)VL区和VH区两者中缺乏片段化证实形成两个二硒键。只有二硒化物scFv采用了天然和预期的共价结构。
具体实施方式
在蛋白质中使用非规范氨基酸提供了具有极大扩展的功能的多肽的可能性，所述功能可用于广泛应用。例如，通过将硒代半胱氨酸并入多肽中，可能有可能开发具有增强的稳定性或活性水平的酶并产生高活性治疗性多肽。然而，迄今为止，这些方法因不能产生稳定地保留翻译途径的生物体并可预测且可靠地将硒代半胱氨酸并入编码的多肽中而受到阻碍。因此，本公开通过提供能够有效产生硒代半胱氨酸蛋白的进化的大肠杆菌菌株和先进的大肠杆菌基因克服了与当前技术相关的挑战。特别地，首次可实现商业上相关量的硒蛋白，所述硒蛋白显示基本上完全并入编码的硒代半胱氨酸残基。还提供了能够实现这种产生的细菌菌株和突变基因。例如，在此提出的研究已经鉴别了基因中的若干点突变，包括acrB、adhE、arcB、cysK、dnaE、ftsA和ftsL，所述点突变优化富含硒的培养基中的存活并且含有确保维持对硒代半胱氨酸的依赖性的途径。一种示例性细菌菌株是突变体RTΔA2X310K大肠杆菌菌株，所述菌株含有这些核心突变，从而提供增强的生长速率、更大的最终细胞密度和使用这种菌株产生的多肽中大约100％并入硒代半胱氨酸。因此，本文提供了用于有效并入硒代半胱氨酸和用于产生并入硒代半胱氨酸位置的多肽的方法和组合物。
I.用于硒代半胱氨酸并入的系统
本公开的实施方案提供了一种用于并入硒代半胱氨酸，如用于产生硒蛋白的系统。在一方面，所述系统是细菌菌株，如大肠杆菌菌株，所述菌株包含一种或多种增强细胞生长或硒代半胱氨酸并入的基因内的一个或多个氨基酸取代或缺失。细菌菌株可以是大肠杆菌菌株K012 MG1655(GenBank登录号U00096.3)、大肠杆菌菌株C321ΔA(US2016/0060301)或大肠杆菌菌株RTΔA。在某些实施方案中，所述细菌菌株是RTΔA 2X310K菌株。
在特定方面，所述系统包含条件性地依赖于硒代半胱氨酸的进化的细菌菌株。在一个实例中，所述进化的细菌菌株源自菌株，如RTΔA菌株，所述菌株包含基因组selA、selB和selC基因(分别编码SelA、SelB和tRNASec)的缺失并且缺少编码释放因子1(RF1)的prfA基因，从而允许有效并入一系列非天然氨基酸。这些基因的缺失消除了UAG遏制tRNA(例如，tRNASecUx)和内源性硒代半胱氨酸并入机制之间的任何串扰。此外，RTΔA菌株含有硒代半胱氨酸的报告蛋白，其是来自阴沟肠杆菌的具有必需氢硒基-巯基或二硒键(ΔaphC：：nmcAC69U C238或C69U C238U)的NMC-Aβ-内酰胺酶，从而使得条件性依赖于硒代半胱氨酸并入来获得对β-内酰胺抗生素的抗性。对硒代半胱氨酸并入的条件依赖性防止另外有毒的硒代半胱氨酸生物合成和并入机制的丧失或减弱。硒代半胱氨酸并入的效率可通过表达用于位点特异性并入硒代半胱氨酸的进化的tRNA来增强(例如，例如tRNASecUX；美国专利申请公布2017/0166945，以引用的方式并入本文)。进一步增强可包括各种基因的表达，包括但不限于selD、selA和/或pstK基因。例如，细菌菌株可表达大肠杆菌selD、大肠杆菌selA和詹氏甲烷球菌pstK。
在某些实施方案中，所述硒代半胱氨酸并入系统编码具有一个或多个氨基酸缺失或取代的一种或多种大肠杆菌基因。所述基因可包括acrB(SEQ ID NO：1)、adhE(SEQ IDNO：2)、arcB(SEQ ID NO：3)、cysK(SEQ ID NO：4)、dnaE(SEQ ID NO：5)、ftsA(SEQ ID NO：6)、ftsL(SEQ ID NO：18)、hemA(SEQ ID NO：7)、mdfA(SEQ ID NO：8)、ompR(SEQID NO：9)、oxyR(SEQ ID NO：19)、pcnB(SEQ ID NO：10)、prfB(SEQ ID NO：17)、pta(SEQ ID NO：11)、queE(SEQ ID NO：69)和/或ydiL(SEQID NO：13)。另外的基因包括pdxB(SEQ ID NO：14)、yeeJ(SEQ ID NO：15)和yphG(SEQ ID NO：16)。例如，并入硒代半胱氨酸的细菌菌株可包含prfB基因中的T246A突变与至少一种hemA突变的组合。作为另一个实例，并入硒代半胱氨酸的细菌菌株可包含prfB基因中的T246A突变与至少一种hemA突变和至少一种yeeJ突变的组合。表1中描绘了这些基因的示例性氨基酸取代。
表1：进化的菌株中富含的突变。
呈粗体的突变是大肠杆菌RTΔA 2X310K中的核心突变。
在另外的方面，大肠杆菌基因可通过一个或多个其它氨基酸取代进一步修饰。例如，氨基酸取代可在一个或多个位置进行，其中所述取代是用于具有相似亲水性的氨基酸。本领域中通常了解亲水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。可接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的次级结构，这进而界定蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。因此，这种保守取代可在含有硒代半胱氨酸的多肽中进行并且可能仅对其活性具有轻微影响。如美国专利4,554,101中所详述，以下亲水性值已指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。这些值可用作指导并且因此优选亲水性值在±2内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1内的那些，并且甚至更特别优选亲水性值在±0.5内的那些。因此，对于具有相似亲水性值的不同但同源的氨基酸，可通过氨基酸的取代来修饰本文所述的任何含硒代半胱氨酸的多肽。亲水性在+/-1.0或+/-0.5点内的氨基酸被认为是同源的。
II.包含硒代半胱氨酸的重组多肽的产生
本文提供的硒代半胱氨酸并入系统可用于产生包含硒代半胱氨酸的多肽，如抗体或二硫键键合的蛋白质。在一些情况下，硒代半胱氨酸残基可被天然存在的半胱氨酸取代，或在其中硒代半胱氨酸残基的取代不会改变多肽的结构和功能的任何位点(例如在丝氨酸残基处)被取代。在其它方面，根据实施方案的方法可用于产生天然地包含一个或多个硒代半胱氨酸残基的多肽，如人硒蛋白(例如，人TrxR)。
在某些实施方案中，编码多肽的核酸(例如质粒)可被引入所述系统并在含硒的生长培养基中在细胞将至少一个硒代半胱氨酸残基并入多肽的条件下培养。然后可分离所得含硒代半胱氨酸的多肽并且如通过质谱法或x射线晶体学进行分析。
可将核酸引入并维持在重组载体中的细胞中，所述重组载体能够根据标准技术在细胞中自主复制。转化方法和表达载体的选择将取决于待表达的多肽的性质和所选择的宿主系统。转化方法描述于例如Ausubel等人(编辑)Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley&Sohs，New York，1994)；表达媒介物可从本领域中熟知的那些中选择，例如Cloning Vectors：A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等人，1985，增刊1987)中。为了诱导异源多肽的表达，细胞培养基通常含有1与50ng/ml之间、优选2至40ng/ml且最优选5至25ng/ml的硒。硒可以亚硒酸钠或另一种可溶的氧化形式的硒存在(例如，可使用0.1至50μM、优选5至25μM Na2SeO3)。“异源”核酸是指对其所引入的细胞或动物来说部分或完全外来的核酸，或与所述细胞或动物的内源性基因同源的核酸，除了异源蛋白质含有被至少一个氨基酸取代的硒代半胱氨酸。
为了获得核酸序列的表达，可将所述序列并入具有一个或多个与核酸可操作连接的控制序列的载体中以控制其表达。所述载体可包括其它序列，如驱动插入的核酸、核酸序列的表达的启动子，以使得所述多肽或肽作为编码分泌信号的融合体和/或核酸产生，以使得在宿主细胞中产生的多肽从细胞中分泌。然后可通过以下方式来获得多肽：将载体转化到载体有功能的宿主细胞中、培养所述宿主细胞以使得产生多肽并从所述宿主细胞或周围培养基中回收所述多肽。可用于本发明的实施方案中的原核细胞包括大肠杆菌，并且为了易于过表达，可优选具有T7RNA聚合酶的菌株。
在一些情况下，硒代半胱氨酸残基可被天然存在的半胱氨酸取代，或在其中硒代半胱氨酸残基的取代不会改变多肽的结构和功能的任何位点(例如在丝氨酸残基处)被取代。此类氨基酸可通过本领域技术人员熟知的方法鉴别，并且通常将在不参与蛋白质的催化或结合活性的位置(如例如通过突变分析所确定)或在被认为对多肽的结构完整性至关重要的位置处发生。在特定多肽中，可将硒代半胱氨酸残基并入通常将被形成二硫桥的两个半胱氨酸残基占据的位置中；因此，所述硒代半胱氨酸残基将形成二硒键，所述二硒键可通过质谱法鉴别。使用标准技术，还可修饰硒代半胱氨酸以形成硒化物、硒亚砜、亚硒酸、硒酸、硒砜或硒代-硫基团。
在另一个实施方案中，将硒代半胱氨酸残基并入多肽中的位点，在所述位点中已知(或预测)所述取代改变多肽的结构和/或功能。这可用于改进多肽的功能或特征，以帮助确定多肽的生物学功能、确定多肽的结构或用于纯化多肽，例如，以帮助鉴别多肽结构域、活性位点或用于药物或另一多肽的结合位点。
A.具有硒代半胱氨酸的抗体
包含硒代半胱氨酸的重组多肽可编码抗体，如单克隆抗体。在一些方面，所述硒代半胱氨酸残基可在于野生型抗体中将是半胱氨酸的位置处被取代。抗体可以是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在某些方面，抗体是Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。抗体可以是非人抗体、鼠抗体、人抗体、人源化抗体或脱免疫抗体。在一些情况下，抗体可与成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。本文还提供了一种组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的本文所述的实施方案和方面的抗体。
如本文所用，术语“抗体”意图广泛地指任何免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和遗传修饰的IgG以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。抗体可选自由以下组成的组：嵌合抗体、亲和力成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或者天然或合成配体。因此，通过已知的方式并且如本文所述，可产生含有至少一个硒代半胱氨酸残基的多克隆或单克隆抗体、抗体片段以及结合结构域和CDR(包括前述中的任一种的工程改造形式)。在一些方面，所述抗体包含可形成二硒键的至少两个硒代半胱氨酸残基。
单克隆抗体是单一种类的抗体，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞都源自单一B淋巴细胞细胞系。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与用于制备多克隆抗体的那些方式相同的方式开始。在一些实施方案中，啮齿动物如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或青蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是众所周知的并且可提供某些优点。小鼠(例如，BALB/c小鼠)常规地使用并且通常给出高百分比的稳定融合体。
在一个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体，例如，包含来自非人供体的抗原结合序列的抗体，所述非人供体被移植至异源非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)。已经开发了方法来用人起源的类似结构域置换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，从而使外源抗体的可变区保持完整。或者，在针对人免疫球蛋白基因转基因的小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。还开发了方法来通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更具人形式。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR源自小鼠单克隆抗体，并且框架和恒定区源自人氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。据认为，用在人抗体的相应位置中发现的氨基酸序列置换抗体中为啮齿动物所特有的氨基酸序列将降低治疗使用期间不良免疫反应的可能性。杂交瘤或产生抗体的其它细胞也可经受基因突变或其它变化，所述基因突变或其它变化可以或可以不改变由所述杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
适用于本发明实施方案的抗体片段的实例包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)“dAb”片段，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，其是包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；以及(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公布20050214860)。可通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体分子。还可制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu等人，1996)。
还在实施方案中考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人(2003)描述“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，其是充当简化抗体并且具有较长血清半衰期以及较不麻烦的合成方法的某些优点的肽。
抗体可从任何动物来源(包括鸟类和哺乳动物)产生。优选地，抗体是牛、绵羊、鼠、大鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，较新的技术允许从人组合抗体文库开发和筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，如美国专利号6,946,546中所描述，所述专利以引用的方式并入本文。这些技术进一步描述于：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等人(1992)；Barbas等人(1994)；以及Schier等人(1996)。
在一些方面，具有硒代半胱氨酸残基的抗体可以是用作治疗剂的抗体。例如，抗体可包含商业抗体治疗剂如西妥昔单抗的CDR序列。
III.保藏信息
大肠杆菌菌株RTΔA 2X310K的代表性冷冻保藏物已在2016年6月22日保藏于国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(NCIMB)，23St.Machar Drive，Aberdeen AB21RY，Scotland，United Kingdom。那些沉积的细胞已被指定登录号NCIMB 42595。
前述保藏是根据布达佩斯条约关于微生物保藏的条款和规定进行的，并且在保藏所接收供给保藏物的样品的最近一次请求后至少三十(30)年和至少五(05)年的保藏期或持续专利的有效期限(以较长者为准)收取，并且如果在此期间变得不可存活，则将予以更换。
IV.实施例
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域的普通技术人员应理解的是，在以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在本发明的实践中起良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
实施例1-RTΔA 2X310K的产生和表征
产生若干细菌菌株用于硒代半胱氨酸并入且然后进化。先前描述的大肠杆菌RTΔA菌株(Thyer等人，2015；以引用的方式并入本文)用于衍生更有效的硒代半胱氨酸并入菌株。简言之，RTΔA菌株包含缺少编码释放因子1(RF1)的prfA基因的菌株C321.ΔA(Lajole等人，2013)中selA、selB和selC基因(分别编码SelA、SelB和tRNASec)的缺失，从而允许有效并入一系列非天然氨基酸。这些基因的缺失消除了新tRNASec文库与内源性硒代半胱氨酸并入机制之间的任何串扰。
此外，RTΔA菌株含有硒代半胱氨酸依赖性报告蛋白，其是来自阴沟肠杆菌的具有必需氢硒基-巯基或二硒键(ΔaphC：：nmcA C69U C238或C69U C238U)的NMC-Aβ-内酰胺酶，从而产生对硒代半胱氨酸的条件性依赖。这种酶与来自粘质沙雷氏菌的SME-1 β-内酰胺酶具有高度序列相似性，所述SME-1 β-内酰胺酶是先前已被证明需要与活性位点丝氨酸残基相邻的二硫键来获得活性、但赋予大肠杆菌显著适合度成本的酶。观察到，含有整合的β-内酰胺酶与天然二硫键的大肠杆菌菌株不需要硒补充来在β-内酰胺抗生素羧苄青霉素存在下存活。具有一个或两个必需硒代半胱氨酸残基(其分别形成氢硒基-巯基或二硒键)的大肠杆菌菌株需要硒来获得对β-内酰胺抗生素的抗性(图1A-1C)。对硒代半胱氨酸并入的条件依赖性防止另外有毒的硒代半胱氨酸生物合成和并入机制的丧失或减弱。
引入了两种质粒，所述质粒提供硒代半胱氨酸并入所必需的机制。第一质粒含有CIoDF13复制起点并表达大肠杆菌selD基因和用于位点特异性并入硒代半胱氨酸的进化tRNA(tRNASecUX；美国专利申请公布2017/0166945)。第二质粒(含有RSF1030复制起点)表达大肠杆菌selA基因和詹氏甲烷球菌pstK基因。在用这两种质粒转化后，含有零个、一个或两个硒代半胱氨酸残基的NMC-Aβ内酰胺酶代替形成半胱氨酸残基的必需二硫键被整合到aphC基因座处的基因组中。这赋予对一些β-内酰胺抗生素的硒代半胱氨酸依赖性抗性，并且用于设定细胞中硒代半胱氨酸并入的最小阈值。
将所得菌株(一式三份，与对照菌株一起)在两种不同条件下进化超过2500代(205次传代至汇合)：增加抗生素浓度或增加温度。在进化后，对所有菌株进行全基因组测序。菌株在编码区内含有一至三百个非同义突变。将高度富集的这些突变的子集(存在于多个独立品系中)引入亲本菌株以用于表征。这些突变(参见以上表1)赋予增加的生长速率、活力、亚硒酸盐抗性或其它有益特征。与各种不同条件下的亲本菌株相比，所有进化的菌株显示出显著改善的生长。
分离来自其中一个品系的单克隆(命名为2X310K)并用于比较这些进化的菌株用于重组硒蛋白产生的潜力。这种菌株能够以显著产率产生含有二硒化物的蛋白质。虽然含有整合的NMC-Aβ内酰胺酶与两个硒代半胱氨酸残基的亲本RTΔA菌株显示出对β-内酰胺抗生素羧苄青霉素的中等抗性，但突变体2X310K菌株显示出对羧苄青霉素的更大抗性(图2A-2B)。这种改善的生长使突变菌株成为用于产生重组硒蛋白的优良宿主。此外，虽然亲本菌株显示出延长的迟滞期并在限定培养基中生长不良，但突变体2X310K菌株显示出更高的生长速率和最终的细胞密度(图3A-3B)。
为了监测硒代半胱氨酸并入的效率并证明蛋白质工程改造的可能性，产生了含有工程改造的非必需氢硒基-巯基键的大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)。自上而下质谱法显示接近100％的硒代半胱氨酸并入而无对应于含丝氨酸的DHFR的可检测的背景。观察到两个硒代半胱氨酸残基分别在位置39和85以大约100％的效率并入(图4A-4B)。所述分析还证实存在二硒键。
突变体2X310K菌株用于在细菌细胞质中产生二硒化物稳定的抗-MS2抗体片段。与被开发用于表达含有二硫键的蛋白质的大肠杆菌菌株不同，这种菌株不需要升高的细胞质氧化还原电位。实验确定的单同位素质量与含有形成两个二硒键的四个硒代半胱氨酸残基的重组抗-MS2scFv一致(图5A-5C)。因此，所述菌株可有效地产生稳定的硒蛋白。此外，将菌株工程改造为含有T7RNA聚合酶，这将进一步增加重组硒蛋白的产量。
突变体2X310K菌株用于产生硒代抗蓖麻毒素A链scFv。在UVPD序列信息中硒代半胱氨酸残基之间不存在片段化(如图6C中所示)证实两个二硒键的形成。硒代抗蓖麻毒素A链scFv的键连接性与野生型抗蓖麻毒素A链scFv相同，如图6A中所示。然而，用DTT处理野生型抗蓖麻毒素A链scFv导致显著活性丧失(图6B)，而含有硒代半胱氨酸的scFv对还原条件具有强烈抗性(图6D)。
大肠杆菌菌株BL21DE3、T7Shuffle Express和RTΔA-2X310K用于产生曲妥珠单抗(赫赛汀)scFv。在BL21DE3菌株中，未形成二硫键，如可通过图7A中蛋白质序列的均匀片段化所观察到。在T7Shuffle Express菌株中，仅在VH区域中形成二硫键，如可通过图7B中序列的后半部分中缺乏片段化所观察到。然而，在RTΔA-2X310K菌株中，形成两个二硒键，如可通过图7C中VL区和VH区两者中缺乏片段化所观察到。因此，只有二硒化物scFv采用了天然和预期的共价结构。
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根据本公开，本文公开且要求保护的所有方法可在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但对本领域技术人员显而易见的是可使本文所述的方法和本文所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，显而易见的是在化学上和生理学上相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时达到相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替换和修改均被认为是在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献以引用方式特别并入本文，在某种程度上，它们提供示例性程序或对本文所阐述的那些进行补充的其它细节。
美国专利号4,554,101
美国专利号5,091,513
美国专利号6,946,546
美国专利号6,881,557
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Claims (91)

1.一种包含纯化的重组多肽的组合物，所述多肽在所述多肽的野生型型式中未发现的选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基，其中所述组合物中至少80％的所述重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中80％-99.9％的所述重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中90％-99％的所述重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中至少95％的所述重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中至少99％的所述重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述重组多肽与人多肽至少90％相同。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述人多肽是疾病中涉及的多肽。
8.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述重组多肽包含抗体或酶。
9.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述多肽在选定位置包含至少两个硒代半胱氨酸残基。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述选定位置处的所述两个硒代半胱氨酸残基形成二硒键。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述多肽包含酶或抗体。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述抗体是无糖基化抗体。
13.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其包含至少50μg所述纯化的重组多肽。
14.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中纯化的重组多肽是97％至99.9％纯的。
15.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述多肽在选定位置包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个硒代半胱氨酸残基。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的组合物。
17.一种治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求16所述的药物组合物。
18.一种编码多肽的核酸分子，所述多肽：
(a)包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：1的位置344的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(b)包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：2的位置702的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(c)包含与SEQ ID NO：3至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：3的位置655的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(d)包含与SEQ ID NO：4至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(e)包含与SEQ ID NO：5至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：5的位置781的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(f)包含与SEQ ID NO：6至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：6的位置136的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(g)包含与SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：7的位置183的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(h)包含与SEQ ID NO：8至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：8的位置1的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(i)包含与SEQ ID NO：9至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：9的位置102的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(j)包含与SEQ ID NO：10至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：10的位置105的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(k)包含与SEQ ID NO：11至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：11的位置673的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(l)包含与SEQ ID NO：12至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：12的位置69的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(m)包含与SEQ ID NO：13至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：13的位置107的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(n)包含与SEQ ID NO：17至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(o)包含与SEQ ID NO：18至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：18的位置545的位置处具有氨基酸取代或缺失；和/或
(p)包含与SEQ ID NO：19至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：19的位置124的位置处具有氨基酸取代或缺失。
19.一种重组多肽，所述重组多肽：
(a)包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：1的位置344的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(b)包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：2的位置702的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(c)包含与SEQ ID NO：3至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：3的位置655的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(d)包含与SEQ ID NO：4至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(e)包含与SEQ ID NO：5至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：5的位置781的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(f)包含与SEQ ID NO：6至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：6的位置136的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(g)包含与SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：7的位置183的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(h)包含与SEQ ID NO：8至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：8的位置1的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(i)包含与SEQ ID NO：9至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：9的位置102的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(j)包含与SEQ ID NO：10至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：10的位置105的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(k)包含与SEQ ID NO：11至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：11的位置673的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(l)包含与SEQ ID NO：12至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：12的位置69的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(m)包含与SEQ ID NO：13至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：13的位置107的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(n)包含与SEQ ID NO：17至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处具有氨基酸取代或缺失；
(o)包含与SEQ ID NO：18至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：18的位置545的位置处具有氨基酸取代或缺失；或
(p)包含与SEQ ID NO：19至少90％相同的氨基酸序列并且在对应于SEQ ID NO：19的位置124的位置处具有氨基酸取代或缺失。
20.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：1的位置344的位置处的Pro取代。
21.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：2的位置702的位置处的His取代。
22.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：3的位置655的位置处的Ala取代。
23.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处的Ala取代。
24.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：5的位置781的位置处的Gly取代。
25.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：6的位置136的位置处的Val取代。
26.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：7的位置183的位置处的Ala取代。
27.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：8的位置1的位置处的Arg取代。
28.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：9的位置102的位置处的Cys取代。
29.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：10的位置105的位置处的Cys取代。
30.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：11的位置673的位置处的Leu取代。
31.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：12的位置69的位置处的Gly取代。
32.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：13的位置107的位置处的Ser取代。
33.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处的Ala取代。
34.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：18的位置545的位置处的Ile取代。
35.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO：19的位置124的位置处的Pro取代。
36.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：1的位置999的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置457的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置591的位置处的Pro取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置183的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置358的位置处的Leu取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置23的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置902的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置889的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：1的位置620的位置处的Cys取代和/或在对应于SEQ ID NO：1的位置174的位置处的Gly取代。
37.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：3的位置398的位置处的Cys取代、在对应于SEQ ID NO：3的位置652的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：3的位置264的位置处的Cys取代和/或在对应于SEQ ID NO：3的位置21的位置处的Ala取代。
38.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：4的位置45的位置处的Asn取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置290的位置处的Leu取代、在对应于SEQID NO：4的位置271的位置处的Asp取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置153的位置处的Tyr取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置45的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置284的位置处的Pro取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置73的位置处的Ile取代、在对应于SEQ IDNO：4的位置68的位置处的Leu取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置69的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置305的位置处的Cys取代、在对应于SEQ ID NO：4的位置144的位置处的Ser取代和/或在对应于SEQ ID NO：4的位置281的位置处的Val取代。
39.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：5的位置916的位置处的Gly取代、在对应于SEQ ID NO：5的位置938的位置处的His取代、在对应于SEQ ID NO：5的位置860的位置处的His取代、在对应于SEQ ID NO：5的位置925的位置处的Asp取代和/或在对应于SEQ ID NO：5的位置470的位置处的Met取代。
40.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：6的位置115的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置386的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置155的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置98的位置处的Ser取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置201的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置294的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：6的位置159的位置处的Tyr取代和/或在对应于SEQ ID NO：6的位置112的位置处的Ile取代。
41.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：18的位置76的位置处的Gly取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置293的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置637的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置3的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置311的位置处的Ser取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置471的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置228的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：18的位置311的位置处的Ser取代和/或在对应于SEQ ID NO：18的位置257的位置处的Thr取代。
42.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：7的位置173的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置196的位置处的Leu取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置180的位置处的Phe取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置249的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置5的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：7的位置273的位置处的Leu取代和/或在对应于SEQ ID NO：7的位置176的位置处的Asn取代。
43.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：9的位置15的位置处的Cys取代和/或在对应于SEQ ID NO：9的位置30的位置处的取代。
44.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：19的位置193的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：19的位置233的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：19的位置300的位置处的Ala取代和/或在对应于SEQ ID NO：19的位置199的位置处的Arg取代。
45.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：17的位置246的位置处的Ala取代。
46.如权利要求19所述的重组多肽，其中所述多肽还包含在对应于SEQ ID NO：11的位置119的位置处的Val取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置535的位置处的Pro取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置373的位置处的Arg取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置535的位置处的Ser取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置119的位置处的Thr取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置601的位置处的Ala取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置103的位置处的Lys取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置31的位置处的Asp取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置662的位置处的Ile取代、在对应于SEQ ID NO：11的位置359的位置处的Lys取代和/或在对应于SEQ ID NO：11的位置519的位置处的Asp取代。
47.一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：(i)与SEQ ID NO：14至少90％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置212的位置处的Ile取代、在对应于位置162的位置处的Asn取代、在对应于位置299的位置处的Ala取代和/或在对应于位置220的位置处的Arg取代。
48.一种重组多肽，其包含：(i)与SEQ ID NO：14至少90％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置212的位置处的Ile取代、在对应于位置162的位置处的Asn取代、在对应于位置299的位置处的Ala取代和/或在对应于位置220的位置处的Arg取代。
49.一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：(i)与SEQ ID NO：15至少90％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置184的位置处的Ala取代、在对应于位置1730的位置处的Asn取代、在对应于位置1888的位置处的Asp取代、在对应于位置352的位置处的Thr取代、在对应于位置374的位置处的Ser取代、在对应于位置1423的位置处的Arg取代、在对应于位置1502的位置处的Glu取代、在对应于位置285的位置处的Gln取代、在对应于位置470的位置处的Lys取代、在对应于位置939的位置处的Thr取代、在对应于位置1669的位置处的Phe取代、在对应于位置2034的位置处的Ile取代、在对应于位置1713的位置处的Asn取代、在对应于位置704的位置处的Thr取代和/或在对应于位置1084的位置处的Ile取代。
50.一种重组多肽，其包含：(i)与SEQ ID NO：15至少90％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置184的位置处的Ala取代、在对应于位置1730的位置处的Asn取代、在对应于位置1888的位置处的Asp取代、在对应于位置352的位置处的Thr取代、在对应于位置374的位置处的Ser取代、在对应于位置1423的位置处的Arg取代、在对应于位置1502的位置处的Glu取代、在对应于位置285的位置处的Gln取代、在对应于位置470的位置处的Lys取代、在对应于位置939的位置处的Thr取代、在对应于位置1669的位置处的Phe取代、在对应于位置2034的位置处的Ile取代、在对应于位置1713的位置处的Asn取代、在对应于位置704的位置处的Thr取代和/或在对应于位置1084的位置处的Ile取代。
51.一种编码多肽的核酸分子，所述多肽包含：(i)与SEQ ID NO：16至少90％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置112的位置处的Phe取代、在对应于位置126的位置处的Ala取代、在对应于位置978的位置处的Leu取代、在对应于位置199的位置处的Gly取代、在对应于位置476的位置处的Thr取代和/或在对应于位置735的位置处的Val取代。
52.一种重组多肽，其包含：(i)与SEQ ID NO：16至少90％相同的氨基酸序列，以及(ii)在对应于位置112的位置处的Phe取代、在对应于位置126的位置处的Ala取代、在对应于位置978的位置处的Leu取代、在对应于位置199的位置处的Gly取代、在对应于位置476的位置处的Thr取代和/或在对应于位置735的位置处的Val取代。
53.一种细菌菌株，其包含选自如权利要求18、47、49或51所述的核酸分子的至少一种核酸分子。
54.如权利要求53所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株表达由选自如权利要求18、47、49或51所述的核酸分子的至少一种核酸分子编码的多肽。
55.如权利要求53所述的细菌菌株，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种所述核酸分子。
56.如权利要求55所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株表达由至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种所述核酸分子编码的多肽。
57.如权利要求55所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株是大肠杆菌菌株。
58.如权利要求53所述的细菌菌株，其包含编码tRNA的核酸，所述tRNA与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22至少90％相同，并且包括一个或多个以下特征：
(i)在对应于位置7的位置处的G或C；
(ii)在对应于位置49的位置处的T；
(iii)在对应于位置50的位置处的A或C；
(iv)在对应于位置64的位置处的T；
(v)在对应于位置65的位置处的G或A；和/或
(vi)在对应于位置66的位置处的G、T或C。
59.如权利要求58所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ IDNO：20至少约90％相同的序列；并且包括一个或多个以下特征：
(i)在对应于位置7的位置处的G；
(ii)在对应于位置49的位置处的T；
(iii)在对应于位置50的位置处的C；
(iv)在对应于位置64的位置处的T；
(v)在对应于位置65的位置处的G；和/或
(vi)在对应于位置66的位置处的C。
60.如权利要求59所述的细菌菌株，其中所述分子包含所述特征(i)-(vi)中的2、3、4、5或6个。
61.如权利要求58所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ IDNO：20至少95％相同的序列。
62.如权利要求61所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含SEQ ID NO：20的序列。
63.如权利要求58所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ IDNO：21至少约90％相同的序列。
64.如权利要求63所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含SEQ ID NO：21的序列。
65.如权利要求58所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含与SEQ IDNO：22至少约90％相同的序列。
66.如权利要求65所述的细菌菌株，其中所述分子编码tRNA，所述tRNA包含SEQ ID NO：22的序列。
67.如权利要求53所述的细菌菌株，其还包含编码目标多肽的可表达核酸序列，所述目标多肽在编码序列中具有至少一个位置，所述至少一个位置具有用于硒代半胱氨酸并入的TAG密码子。
68.如权利要求67所述的细菌菌株，其中所述可表达核酸序列编码人多肽。
69.如权利要求67所述的细菌菌株，其中所述可表达核酸序列编码酶或抗体。
70.如权利要求67所述的细菌菌株，其中所述可表达核酸序列包含T7RNA聚合酶启动子。
71.如权利要求53所述的细菌菌株，其还包含编码T7RNA聚合酶的核酸序列。
72.一种大肠杆菌细菌菌株，其在NCIMB以保藏号42595保藏。
73.一种细菌培养物，其包含根据权利要求53-72中任一项所述的细菌菌株。
74.一种细菌培养物，其包含所述培养物，所述培养物包含1至100mg/L所述培养物的量的表达的重组多肽，所述表达的重组多肽包含至少一个硒代半胱氨酸残基。
75.如权利要求74所述的培养物，其包含10至40mg/L所述培养物的量的表达的重组多肽，所述表达的重组多肽包含至少一个硒代半胱氨酸残基。
76.如权利要求74或75所述的培养物，其中所述表达的重组多肽是根据权利要求中任一项所述的多肽
77.如权利要求74或75所述的培养物，其中所述表达的重组多肽在所述多肽的野生型型式中未发现的选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基。
78.如权利要求77所述的培养物，其中所述培养物中至少80％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
79.如权利要求77所述的培养物，其中所述培养物中80％-99.9％的所述重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
80.如权利要求77所述的培养物，其中所述培养物中90％-99％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
81.如权利要求77所述的培养物，其中所述培养物中至少95％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
82.如权利要求77所述的培养物，其中所述培养物中至少99％的所述表达的重组多肽在所述选定位置包含所述硒代半胱氨酸残基。
83.如权利要求74或75所述的培养物，其中所述表达的重组多肽与人多肽至少90％相同。
84.如权利要求83所述的培养物，其中所述人多肽是疾病中涉及的多肽。
85.如权利要求74或75所述的培养物，其中所述表达的重组多肽包含抗体或酶。
86.如权利要求74或75所述的培养物，其中所述多肽在选定位置包含至少两个硒代半胱氨酸残基。
87.如权利要求86所述的培养物，其中所述选定位置处的所述两个硒代半胱氨酸残基形成二硒键。
88.如权利要求86所述的培养物，其中所述多肽在选定位置包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个硒代半胱氨酸残基。
89.一种多肽，其从根据权利要求74-88中任一项所述的培养物中纯化，所述多肽包含至少第一硒代半胱氨酸残基。
90.一种表达多肽的方法，所述多肽包含至少一个硒代半胱氨酸残基，所述方法包括：
(a)在根据权利要求53-72中任一项所述的细菌菌株中且在硒源存在下表达编码所述多肽的核酸；以及
(b)从所述细菌中纯化所述重组多肽。
91.一种通过以下方法产生的重组多肽，所述重组多肽在选定位置包含至少一个硒代半胱氨酸残基，所述方法包括：
(a)在根据权利要求53-72中任一项所述的细菌菌株中且在硒源存在下表达编码所述多肽的核酸；以及
(b)从所述细菌中纯化所述重组多肽。
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