CN109824777A - 一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用。所述单克隆抗体为抗人CTGF单克隆抗体，所述抗人CTGF单克隆抗体的抗体片段包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。本发明的单克隆抗体可与人体内血液、体液中的CTGF特异性结合，以达到抑制CTGF促进细胞形成微管的作用，从而预防及治疗玻璃体视网膜纤维化病变，适用于制备治疗玻璃体视网膜纤维化病变的单克隆抗体药物。

Description

一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及 其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)是组织损伤后促进纤维化瘢痕形成的重要细胞因子，在心、脑、肾、肺、肝以及胎盘等组织器官中均可表达。人类CTGF基因定位于第6号染色体长臂，包括5个外显子和4个内含子，其编码蛋白是由349个氨基酸构成的分子质量为36～38kD的富含半胱氨酸的分泌肽，与转化生长因子-β(TGF-β)有着密切的关系，可视为TGF-β的下游反应元件。在瘢痕形成、器官纤维化、动脉粥样硬化、系统性硬化症、创伤修复和一些良、恶性肿瘤等疾病中，CTGF均有不同程度的表达上调。

此外，CTGF与纤维化疾病的发生、发展等病理过程有密切的关系，已成为可替代TGF-β治疗纤维化疾病的新靶细胞因子。CTGF作用部位的不同，其表现的生物学效应也不同，主要表现为促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附促进细胞外基质的合成。CTGF还可以调节血管生成、诱导细胞凋亡。

眼组织纤维化在眼科疾病中较为常见，青光眼滤过性手术、眼外伤、糖尿病性视网膜病变和玻璃体视网膜手术以后也都涉及组织的纤维化。由于眼部结构的特殊性，特别是手术和外伤造成血眼屏障破坏，角膜损害，血管通透性增加，使纤维蛋白原、炎性细胞、成纤维细胞移行进入眼内，然后在凝血酶作用下转变为纤维蛋白。各种因素损伤所致眼组织纤维化对视力恢复造成不可逆的副作用，所以抑制损伤组织的纤维化，减轻瘢痕形成是保证视力的关键，也是世界性的难题。

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是一种因炎症、损伤、缺血而引起的过度修复性疾病，在视网膜脱离患者中发病率达到10％，其本质是眼内纤维化。在眼科中，纤维化疾病是一类眼科难治性疾病，除PVR外还包括糖尿病视网膜病变增殖期、视网膜的新生血管膜、视网膜前膜、青光眼滤过术后滤过泡纤维化等，这些都是发病率高、危害严重的致盲性的眼病。然而，现有的临床常用药物有许多并发症和副作用，其他类型的治疗方法有的仅限于动物实验阶段，尚有待于进一步的临床研究。

因此，亟需寻找一种更有益的抗眼内纤维化途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用，所述单克隆抗体能够有效抑制由于CTGF引起的玻璃体视网膜纤维化病变。

本发明的一方面提供一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体，所述单克隆抗体为抗人CTGF单克隆抗体，所述抗人CTGF单克隆抗体的抗体片段包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。

进一步的，所述抗体片段与其他的肽或蛋白质融合、或者被修饰剂修饰。

本发明的另一方面提供一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体的制备方法，包括：获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组人CTGF抗原蛋白；以所述重组人CTGF抗原蛋白免疫小鼠，并从免疫后的小鼠中分离获得脾细胞；将所述小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞；筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，进行体外增殖培养，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，预定时间后从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体。

进一步的，从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体的步骤包括：对所述腹水进行粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。

进一步的，以所述重组人CTGF抗原蛋白免疫小鼠的步骤包括：在所述重组人CTGF抗原蛋白中加入弗氏完全佐剂，对小鼠进行首次免疫注射；在所述重组人CTGF抗原蛋白中加入弗氏不完全佐剂，对首次免疫后的小鼠进行加强免疫注射。

进一步的，按1×10⁸个所述小鼠脾细胞和2～3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

本发明提供的单克隆抗体在制备治疗玻璃体视网膜纤维化病变药物中的应用。

进一步的，所述玻璃体视网膜纤维化病变包括：青光眼滤过性手术、眼外伤、糖尿病性视网膜病变和玻璃体视网膜手术后引起的玻璃体视网膜纤维化病变。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体具有优良的结合活性和/或中和活性，能够与人体内血液、体液中的CTGF特异性结合，从而清除CTGF，抑制CTGF促进细胞形成微管，进而阻断纤维化的进程，保护视网膜组织，达到预防和治疗增生性玻璃体视网膜纤维化病变的作用，适用于制备治疗玻璃体视网膜纤维化病变的单克隆抗体药物。

附图说明

图1为本发明实施例制备抗人CTGF单克隆抗体的流程图。

图2A为CTGF重组蛋白的表达与纯化的电泳结果图；

其中，FT为流穿液组分；W1-W3为低浓度洗脱液洗脱组分；MW为蛋白质Marker；E1-E9为目的蛋白CTGF不同出峰时间电泳结果。

图2B为2μg目的蛋白CTGF的定量电泳结果。

图3为纯化的单克隆抗体还原SDS-PAGE电泳结果；

其中，M为蛋白质Marker；1为抗人CTGF单克隆抗体。

图4为抗人CTGF单克隆抗体与抗原CTGF特异性结合的WB结果。

图5为抗人CTGF单克隆抗体对大鼠平滑肌的侵袭能力图；

其中，A为正常细胞培养，细胞数为1605个/视野；B为下层培养基中加入IgG，细胞数为998个/视野；C为下层培养基中加入抗人CTGF单克隆抗体1，细胞数为727个/视野；D为下层培养基中加入抗人CTGF单克隆抗体2，细胞数为562个/视野。

具体实施方式

现在，将参照附图更充分地描述示例实施例，其中，一些示例性实施例在附图中示出。

本发明的实施例提供一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体，其特异性抗原为核酸序列如SEQ ID NO:1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人CTGF。

所述单克隆抗体为抗人CTGF单克隆抗体，所述抗人CTGF单克隆抗体的抗体片段包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。

所述抗体片段与其他的肽或蛋白质融合、或者被修饰剂修饰。

下面结合图1至图5详细描述具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体的制备方法。

参照图1，本发明实施例提供一种抗人CTGF单克隆抗体的制备方法，包括：

在步骤S10，获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组人CTGF抗原蛋白。

作为示例，重组人CTGF抗原蛋白的获得方法如下：

1、通过生物信息学方法，在NCBI数据库中检索获得CTGF核酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据此核酸序列信息，人工合成CTGF的DNA。

2、以所述人工合成CTGF的DNA为模板，进行PCR扩增。

PCR引物如下：

P1：GAATTCATGACCGCCGCCAGTATG

P2：GCGGCCGCTCATGCCATGTCTCCGTA

PCR体系如下：Ex Taq(5U/μL)0.25μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5mM)4μL，Template 1μL，上游引物P1(10μM)1μL，下游引物P2(10μM)1μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR扩增条件：变性温度93℃，退火温度55℃，延伸温度72℃，30～40个循环，时间为2～3小时。

3、将得到的PCR产物以EcoR/Not I双酶切法链接到pATX2上，同时加入6*His标签，构建重组质粒。

4、将所述重组质粒转染HEK293细胞后进行培养，六天后收集样品并进行SDS-PAGE电泳检测和蛋白质免疫印迹(western blotting)检测，检测成果获得表达株。

5、大量培养所述表达株并经亲和层析纯化获得重组人CTGF抗原蛋白。

将获得的重组人CTGF抗原蛋白作SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，电泳结果如图2A和图2B所示。图2A中E1-E9为目的蛋白CTGF抗原蛋白不同出峰时间电泳结果，图2B表示上样量为2μg时，目的蛋白CTGF的定量电泳结果。由图2B可见隐约条带，其浓度达到要求。

将获得的重组人CTGF抗原蛋白送普健生物(武汉)科技有限公司进行基因检测，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，由此可见，成功合成了重组人CTGF抗原蛋白。

应当理解，可利用本领域常规的分子生物学方法获得人CTGF抗原蛋白，本发明对此不作限定。

在步骤S20，以获得的重组人CTGF抗原蛋白免疫小鼠，并从免疫后的小鼠中分离获得脾细胞。

作为示例，选用6～8周龄Balb/c小鼠为免疫动物，进行重组人CTGF抗原蛋白免疫注射，刺激相应的B淋巴细胞活化、增殖和分化为致敏B淋巴细胞。

优选地，以获得的重组人periostin抗原蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠。

在一个实施例中，以所述重组人CTGF抗原蛋白免疫小鼠的步骤包括：在所述重组人CTGF抗原蛋白中加入弗氏完全佐剂，对小鼠进行首次免疫注射；在所述重组人CTGF抗原蛋白中加入弗氏不完全佐剂，对首次免疫后的小鼠进行加强免疫注射。

作为示例，重组人CTGF抗原蛋白加入弗氏完全佐剂，按每只小鼠10～100μg重组人CTGF抗原蛋白的剂量进行首次免疫，注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内。

加强免疫采用首次免疫一半剂量的重组人CTGF抗原蛋白，加入弗氏不完全佐剂，进行加强免疫，注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内。免疫后7～10天取血测效价，加强免疫3～4次后，分离获得小鼠脾细胞。

优选地，按每只小鼠50μg重组人CTGF抗原蛋白的剂量进行首次免疫，注射于小鼠的颈背部皮下四点；按每只小鼠25μg重组人CTGF抗原蛋白的剂量进行加强免疫，注射于小鼠的颈背部皮下四点。免疫后8天取血测效价，加强免疫4次后，分离获得小鼠脾细胞。

在步骤S30，将所述小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG(聚乙二醇)进行膜融合，形成杂交瘤细胞。

作为示例，采用杂交瘤细胞融合技术，将分离获得的小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞。

优选地，按1×10⁸个小鼠脾细胞和2～3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

作为示例，按1×10⁸个小鼠脾细胞和3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

应当理解，可以采用本领域常规的杂交瘤细胞融合技术和克隆化技术制备分泌抗目的抗原CTGF的杂交瘤细胞株。

在步骤S40，筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，进行体外增殖培养，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，预定时间后从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体。

优选地，经ELISA检测OD495大于1.5，是成功膜融合的杂交瘤细胞。

作为示例，杂交瘤阳性细胞筛选与克隆化：在HAT(H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择性培养基上筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，体外增殖培养，并及时对小鼠(未免疫的常规小鼠，例如8周龄Balb/c小鼠)腹腔内接种杂交瘤细胞，制备腹水，约1～2周后抽取腹水，获得大量粗单克隆抗体。这里，抽取的腹水为含有大量粗单克隆抗体的小鼠腹水。

此外，对粗单克隆抗体进行纯化。

优选地，从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体的步骤可包括：对所述腹水进行粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化。

作为示例，基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的小鼠腹水进行盐析。

具体地，将含有大量粗单克隆抗体的小鼠腹水原液进行第一次低温离心处理(4℃，10000rpm，15min)，从而除去细胞残渣及颗粒物等，将第一次低温离心所得上清液用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液稀释至5倍(即，所述第一次低温离心所得上清液与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1:4，稀释至5倍后的总体积记为样品体积)后，在冰浴搅拌下，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为50％(v/v)(即，所述样品体积与所述饱和硫酸铵溶液的体积比为1:1)，于4℃盐析4小时，并进行第二次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液得固体物。然后，采用0.02mol/L、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液溶解第二次低温离心所得固体物，所述磷酸盐缓冲液的体积与所述样品体积相等，在冰浴搅拌下，逐滴加入饱和硫酸铵溶液(这里，饱和硫酸铵溶液的浓度的初始值为1g/mL)至终浓度为33.33％(v/v)(即，溶解后的总体积与所述饱和硫酸铵溶液的体积比为2:1)，于4℃盐析过夜，并进行第三次低温离心(4℃，10000rpm，15min)处理，弃上清液得固体物，将第三次低温离心所得固体物作为盐析所得粗提纯样品，即粗提纯的产物。

作为示例，采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液对所述粗提纯的产物进行透析。

具体地，采用0.025mol/L、pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解盐析后所得粗提纯样品，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的体积与所述样品体积相等；然后利用浓度为0.025mol/L，pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，于4℃透析过夜，期间需更换3次三羟甲基氨基甲烷缓冲液，截留分子量为150KD，从而获得透析的产物。

作为示例，利用HPLC法(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)对透析的产物进行纯化。所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A是pH值为6.5～8.5，浓度为10～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液；所述流动相B是pH值为6.5～8.5，三羟甲基氨基甲烷终浓度为10～50mmol/L和氯化钠终浓度为0.5～1mol/L的混合溶液。

优选地，采用Thermo Propac-wax-10色谱柱，填料的颗粒度为约10μm，色谱柱规格为250mm×4.6mm，选用流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温40℃，检测波长为280nm；所述流动相A为pH值为7，浓度为30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述流动相B为pH值为7，三羟甲基氨基甲烷缓冲液终浓度为30mmol/L和氯化钠终浓度为1mol/L的混合溶液。连接色谱柱，用流动相A对色谱柱进行平衡。上样，上样后执行梯度程序对样品进行分离纯化，按表1的洗脱程序进行梯度洗脱，收集保留时间为22～24分钟的洗脱峰，获得纯化的抗人CTGF单克隆抗体。收率为85.2％，纯度为97.4％。

表1：梯度洗脱程序

应当理解，也可以采用本领域常规的纯化方法对单克隆抗体进行纯化，本发明对此不作限定。

将获得的纯化后的抗人CTGF单克隆抗体进行还原SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，由图3可见，还原剂将抗体的二硫键打开使抗体的重链和轻链断裂，形成两个清晰条带，且无其他条带，说明纯化后的抗人CTGF单克隆抗体纯度高、无其他杂蛋白。

下面详细描述本发明实施例的抗人CTGF单克隆抗体的实验。

一、抗人CTGF单克隆抗体效价检测。

利用ELISA实验方法将本实施例中获得的纯化后的抗人CTGF单克隆抗体进行效价检测，已知抗人CTGF单克隆抗体浓度为100μg/mL。方法如下：

1、取适量孔数的酶标板进行抗原包埋，将适量的CTGF蛋白包被到酶标板的每个孔；

2、用漂洗液清洗酶标板3～5次，加入本实施例获得的纯化后的抗人CTGF单克隆抗体，37℃孵育1h；

3、漂洗液清洗5次，加入带有辣根过氧化物酶标或碱性磷酸酯酶标的二抗(例如，羊抗鼠IgG)，37℃孵育1h，漂洗液清洗5次；

4、加入底物显色10～20min，加入终止液(例如，2M硫酸)，终止反应，利用酶标仪进行OD值读取，结果如表2所示。

表2：抗人CTGF单克隆抗体效价检测结果

注：抗体1和抗体2为不同小鼠腹水中获得的抗人CTGF单克隆抗体。

由表2可见，抗体1与抗体2效价都可达到1:64000，且抗体2的效价要好于抗体1。

二、蛋白免疫印迹实验检测抗人CTGF单克隆抗体与CTGF蛋白的结合活性。

1、制备CTGF蛋白，进行SDS-PAGE电泳；

2、转膜，NC膜或者PVDF膜；

3、用BSA或者脱脂奶粉进行封闭2h；

4、加入一抗(本发明实施例制备的抗人CTGF单克隆抗体1)，37℃，1h；

5、用漂洗液清洗3～5次，每次10min，加入酶标二抗，37℃，40min；

6、加入底物反应显色或者ECL显色液压片显影。

结果如图4所示，由图4可见，抗体1能特异性结合人CTGF蛋白，为抗人CTGF抗体。

三、抗人CTGF单克隆抗体中和活性检测(Transwell法)。

1、在上层小室中放入血清含量低培养基。

2、在下层放入血清含量高培养基。在下层中分别放入抗人CTGF单克隆抗体1、抗人CTGF单克隆抗体2或者IgG，空白不放入抗体。

3、上层小室中底部的膜可以使细胞通过。

4、铺入大鼠平滑肌细胞后观察细胞侵袭生产情况，拍照记录。

结果如图5所示，A为10％FBS正常细胞培养，下层不放入抗体，由照片可见细胞数为1605个/视野；B为下层培养基中加入lgG单克隆抗体(10％FBS+300μg/L lgG单克隆抗体)，由照片可见细胞数为998个/视野；C为下层培养基中加入本发明制备的抗人CTGF单克隆抗体1(10％FBS+300μg/L单克隆抗体1)，由照片可见细胞数为727个/视野；D为下层培养基中加入本发明制备的抗人CTGF单克隆抗体2(10％FBS+300μg/L单克隆抗体2)，由照片可见细胞数为562个/视野。

通过上述实验结果，表明本发明实施例制备的抗人CTGF单克隆抗体具有高活性，可以有效抑制大鼠平滑肌细胞的侵袭生长。

本发明实施例制备的抗人CTGF单克隆抗体具有高活性，可以抑制CTGF促进细胞微管形成及细胞纤维化，从而避免纤维化形成所造成的玻璃体视网膜病变。

尽管已经参照其示例性实施例具体显示和描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理解，在不脱离权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节上的各种改变。

<110> 辽宁何氏医学院

<120> 一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2339

<212> DNA

<213> 人CTGF（Connective tissue growth factor）

<400> 1

CACACAACAA CTCTTCCCCG CTGAGAGGAG ACAGCCAGTG CGACTCCACC CTCCAGCTCG 60

ACGGCAGCCG CCCCGGCCGA CAGCCCCGAG ACGACAGCCC GGCGCGTCCC GGTCCCCACC 120

TCCGACCACC GCCAGCGCTC CAGGCCCCGC CGCTCCCCGC TCGCCGCCAC CGCGCCCTCC 180

GCTCCGCCCG CAGTGCCAAC CATGACCGCC GCCAGTATGG GCCCCGTCCG CGTCGCCTTC 240

GTGGTCCTCC TCGCCCTCTG CAGCCGGCCG GCCGTCGGCC AGAACTGCAG CGGGCCGTGC 300

CGGTGCCCGG ACGAGCCGGC GCCGCGCTGC CCGGCGGGCG TGAGCCTCGT GCTGGACGGC 360

TGCGGCTGCT GCCGCGTCTG CGCCAAGCAG CTGGGCGAGC TGTGCACCGA GCGCGACCCA 420

TGCGACCCGC ACAAGGGCCT ATTCTGTCAC TTCGGCTCCC CGGCCAACCG CAAGATCGGC 480

GTGTGCACCG CCAAAGATGG TGCTCCCTGC ATCTTCGGTG GTACGGTGTA CCGCAGCGGA 540

GAGTCCTTCC AGAGCAGCTG CAAGTACCAG TGCACGTGCC TGGACGGGGC GGTGGGCTGC 600

ATGCCCCTGT GCAGCATGGA CGTTCGTCTG CCCAGCCCTG ACTGCCCCTT CCCGAGGAGG 660

GTCAAGCTGC CCGGGAAATG CTGCGAGGAG TGGGTGTGTG ACGAGCCCAA GGACCAAACC 720

GTGGTTGGGC CTGCCCTCGC GGCTTACCGA CTGGAAGACA CGTTTGGCCC AGACCCAACT 780

ATGATTAGAG CCAACTGCCT GGTCCAGACC ACAGAGTGGA GCGCCTGTTC CAAGACCTGT 840

GGGATGGGCA TCTCCACCCG GGTTACCAAT GACAACGCCT CCTGCAGGCT AGAGAAGCAG 900

AGCCGCCTGT GCATGGTCAG GCCTTGCGAA GCTGACCTGG AAGAGAACAT TAAGAAGGGC 960

AAAAAGTGCA TCCGTACTCC CAAAATCTCC AAGCCTATCA AGTTTGAGCT TTCTGGCTGC 1020

ACCAGCATGA AGACATACCG AGCTAAATTC TGTGGAGTAT GTACCGACGG CCGATGCTGC 1080

ACCCCCCACA GAACCACCAC CCTGCCGGTG GAGTTCAAGT GCCCTGACGG CGAGGTCATG 1140

AAGAAGAACA TGATGTTCAT CAAGACCTGT GCCTGCCATT ACAACTGTCC CGGAGACAAT 1200

GACATCTTTG AATCGCTGTA CTACAGGAAG ATGTACGGAG ACATGGCATG AAGCCAGAGA 1260

GTGAGAGACA TTAACTCATT AGACTGGAAC TTGAACTGAT TCACATCTCA TTTTTCCGTA 1320

AAAATGATTT CAGTAGCACA AGTTATTTAA ATCTGTTTTT CTAACTGGGG GAAAAGATTC 1380

CCACCCAATT CAAAACATTG TGCCATGTCA AACAAATAGT CTATCAACCC CAGACACTGG 1440

TTTGAAGAAT GTTAAGACTT GACAGTGGAA CTACATTAGT ACACAGCACC AGAATGTATA 1500

TTAAGGTGTG GCTTTAGGAG CAGTGGGAGG GTACCAGCAG AAAGGTTAGT ATCATCAGAT 1560

AGCATCTTAT ACGAGTAATA TGCCTGCTAT TTGAAGTGTA ATTGAGAAGG AAAATTTTAG 1620

CGTGCTCACT GACCTGCCTG TAGCCCCAGT GACAGCTAGG ATGTGCATTC TCCAGCCATC 1680

AAGAGACTGA GTCAAGTTGT TCCTTAAGTC AGAACAGCAG ACTCAGCTCT GACATTCTGA 1740

TTCGAATGAC ACTGTTCAGG AATCGGAATC CTGTCGATTA GACTGGACAG CTTGTGGCAA 1800

GTGAATTTGC CTGTAACAAG CCAGATTTTT TAAAATTTAT ATTGTAAATA TTGTGTGTGT 1860

GTGTGTGTGT GTATATATAT ATATATGTAC AGTTATCTAA GTTAATTTAA AGTTGTTTGT 1920

GCCTTTTTAT TTTTGTTTTT AATGCTTTGA TATTTCAATG TTAGCCTCAA TTTCTGAACA 1980

CCATAGGTAG AATGTAAAGC TTGTCTGATC GTTCAAAGCA TGAAATGGAT ACTTATATGG 2040

AAATTCTGCT CAGATAGAAT GACAGTCCGT CAAAACAGAT TGTTTGCAAA GGGGAGGCAT 2100

CAGTGTCCTT GGCAGGCTGA TTTCTAGGTA GGAAATGTGG TAGCCTCACT TTTAATGAAC 2160

AAATGGCCTT TATTAAAAAC TGAGTGACTC TATATAGCTG ATCAGTTTTT TCACCTGGAA 2220

GCATTTGTTT CTACTTTGAT ATGACTGTTT TTCGGACAGT TTATTTGTTG AGAGTGTGAC 2280

CAAAAGTTAC ATGTTTGCAC CTTTCTAGTT GAAAATAAAG TGTATATTTT TTCTATAAA 2339

<210> 2

<211> 349

<212> PRT

<213> 人CTGF（Connective tissue growth factor）

<400> 2

Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu Leu Ala

1 5 10 15

Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro Cys Arg Cys Pro

20 25 30 35

Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu Val Leu Asp Gly Cys

40 45 50

Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp

55 60 65 70

Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu Phe Cys His Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg

75 80 85 90

Lys Ile Gly Val Cys Thr Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr

95 100 105

Val Tyr Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys

110 115 120 125

Leu Asp Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro

130 135 140

Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys Glu

145 150 155 160

Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly Pro Ala Leu Ala

165 170 175 180

Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr Met Ile Arg Ala Asn

185 190 195

Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly

200 205 210 215

Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser

220 225 230

Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys

235 240 245 250

Gly Lys Lys Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu

255 260 265 270

Ser Gly Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr

275 280 285

Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe Lys

290 295 300 305

Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys Thr Cys Ala

310 315 320

Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg

325 330 335 340

Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala

345

Claims (8)

1.一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为抗人CTGF单克隆抗体，所述抗人CTGF单克隆抗体的抗体片段包括单链可变区片段、Fab、Fab’、F(ab’)2或纳米抗体。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体片段与其他的肽或蛋白质融合、或者被修饰剂修饰。

3.一种具有抑制玻璃体视网膜纤维化病变作用的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组人CTGF抗原蛋白；

以所述重组人CTGF抗原蛋白免疫小鼠，并从免疫后的小鼠中分离获得小鼠脾细胞；

将所述小鼠脾细胞与同系骨髓瘤细胞进行混合，利用PEG进行膜融合，形成杂交瘤细胞；

筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，进行体外增殖培养，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，预定时间后从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，从接种后的小鼠的腹水中获得所述单克隆抗体的步骤包括：

对所述腹水进行粗提纯；

对所述粗提纯的产物进行透析；

利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，

其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；

所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，以所述重组人CTGF抗原蛋白免疫动物的步骤包括：

在所述重组人CTGF抗原蛋白中加入弗氏完全佐剂，对小鼠进行首次免疫注射；

在所述重组人CTGF抗原蛋白中加入弗氏不完全佐剂，对首次免疫后的小鼠进行加强免疫注射。

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，按1×10⁸个所述小鼠脾细胞和2～3×10⁷个同系骨髓瘤细胞进行混合。

7.权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗玻璃体视网膜纤维化病变药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述玻璃体视网膜纤维化病变包括：青光眼滤过性手术、眼外伤、糖尿病性视网膜病变和玻璃体视网膜手术后引起的玻璃体视网膜纤维化病变。