CN109781678B

CN109781678B - 一种应用于线粒体内次氯酸检测的比率荧光探针的制备及应用

Info

Publication number: CN109781678B
Application number: CN201711118691.5A
Authority: CN
Inventors: 申世立; 葛燕青; 曹晓群
Original assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Current assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN109781678A

Abstract

本发明涉及一种应用于线粒体内次氯酸检测的比率荧光探针的制备及应用。探针以咪唑并[1,5‑a]吡啶荧光团作为能量供体，罗丹明荧光团作为能量受体，吡啶盐结构为线粒体靶向基团。该探针可高选择性、高灵敏地与次氯酸作用。在没有次氯酸情况下，探针发射467 nm的荧光；当有次氯酸存在时，探针同时发射467 nm和575 nm的荧光。随着次氯酸浓度的增加，575 nm处的荧光逐渐增强，而467 nm处的荧光强度逐渐减弱，二者的比值（I₅₇₅/I₄₆₇）与次氯酸浓度在一定范围内（0.5‑3.5μM）呈良好的线性关系。探针可用于线粒体内次氯酸的成像分析，具有广阔的应用前景。

Description

一种应用于线粒体内次氯酸检测的比率荧光探针的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种次氯酸比率荧光探针的制备及应用，该探针可以用于线粒体内次氯酸浓度的检测。

背景技术

次氯酸是一类重要的信号分子，能调控多种细胞生理活动。生物体内的次氯酸是过氧化氢与氯离子在髓过氧化物酶的催化下产生的。免疫系统中，次氯酸能够对微生物的入侵起到一定的防御作用。但是，若体内次氯酸水平过量，容易导致关节炎、动脉粥样硬化甚至癌症等疾病。所以，实时监测细胞内次氯酸浓度具有重要的生物学意义。

目前多种分析方法已被用于次氯酸的测量，其中荧光探针因灵敏度高、选择性好、检测限低、对生物体损伤小等特点而受到广泛关注并得到了长足的发展。文献中很多次氯酸探针是通过单个发射峰荧光强度的改变来测量次氯酸，检测结果难免受环境因素的影响。为减少测量误差，我们设计合成了比率型次氯酸荧光探针，实现次氯酸的比率测定。

线粒体是细胞内产生活性氧的主要部位，由于线粒体内的次氯酸水平与细胞内氧化还原平衡密切相关，因此监测线粒体内次氯酸的浓度变化至关重要。

然而，有关线粒体靶向定位的比率型次氯酸荧光探针的报道并不多。

基于此，发明人设计以咪唑并[1,5-a]吡啶结构为能量供体，罗丹明结构为能量受体，同时在结构中引入线粒体靶向基团——吡啶盐结构，构建了比率型次氯酸荧光探针。探针具有线粒体靶向功能，并能应用于线粒体内次氯酸浓度的测定。

发明内容

1. 本发明的目的在于提供一种线粒体靶向的比率型次氯酸荧光探针的制备及应用。

2. 本发明公开一种线粒体靶向的比率型次氯酸荧光探针，具有如下结构（IRP）：

3. 本发明目的还在于提供所述荧光探针在检测线粒体内次氯酸浓度的荧光成像方面的应用。

本发明所述荧光探针的制备方法为（图1）。

配制上述次氯酸探针的乙醇与PBS（0.01 M）缓冲溶液（V/V = 3:7，pH 7.40）的溶液。在没有次氯酸存在时，探针发射467 nm荧光；当有次氯酸存在时，探针同时发射467 nm和575 nm的荧光。随着次氯酸浓度的增加，575 nm处的荧光逐渐增强，而467 nm处的荧光强度减弱，二者的比值（I₅₇₅/I₄₆₇）与次氯酸浓度在一定范围内（0.5-3.5 μM）呈良好的线性关系，见图2。

在上述探针的乙醇与PBS（0.01 M）缓冲溶液中，分别加入一定量活性氮、活性氧及其他常见物种，荧光测试结果表明探针对次氯酸有良好的选择性，见图3。

用本发明所述探针和线粒体染料Mito Tracker Deep Red分别孵育RAW264.7细胞，然后进行成像分析，由图4的结果可知，探针能够靶向线粒体。

用本发明所述探针孵育RAW264.7细胞，然后再进一步用LPS处理细胞后进行成像，探针的蓝/红荧光强度之比明显降低，因此上述探针可以用于线粒体次氯酸的检测，见图5。

本发明所述的比率型次氯酸荧光探针，不仅可以应用于溶液中的次氯酸检测，而且可以用于细胞线粒体内次氯酸的检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明所述探针的合成路线。

图2是本发明探针随次氯酸浓度变化时的荧光变化。图2（a）是荧光发射图谱；图2（b）是荧光强度比值在不同浓度次氯酸时的变化情况。

图3是本发明探针对HOCl及生物体内其他常见物种的选择性。

图4是本发明探针在RAW264.7细胞内的分布。图4（a）为探针蓝色通道（410-520nm）收集到的荧光图像；图4（b）为Mito Tracker Deep Red的荧光图像；图4（c）为（a）、（b）的叠加图；图4（d）为亮场图像；共定位系数为0.95。

图5是本发明探针对RAW264.7细胞线粒体内HOCl的荧光成像。图5（a）为LPS处理前后探针在细胞内的荧光情况；图5（b）为蓝光与红光的比值。

具体实施方法

实施例1：探针的合成路线见图1：

将化合物1（1 mmol）和三乙胺（3 mmol）溶于20 mL无水CH₂Cl₂中，0℃条件下搅拌，然后将氯乙酰氯（2 mmol）加入到上述溶液中，继续搅拌4小时，减压蒸馏除去溶剂，得红色固体，即化合物2（未分离提纯，直接用于下一步反应）。

将化合物2（1 mmol）、吡啶（1 mL）溶于30 mL无水乙腈中，回流12小时。减压除去溶剂，然后柱层析（二氯甲烷：甲醇 = 10：1）纯化，得到黄色固体，即是本发明所述次氯酸荧光探针。

以¹H NMR、¹³C NMR及HRMS对其进行表征，数据如下：

¹H NMR (400 MHz, d ₆-DMSO), δ (ppm): 0.92 (t, 3H, J = 7.6 Hz, CH3),1.09 (t, 6H, J = 6.8 Hz, CH3), 1.32 (q, 2H, J = 7.6 Hz, CH2), 1.68-1.73 (m,2H, CH2), 2.92 (t, 2H, J = 7.4 Hz, CH2), 3.26 (br, 4H, CH2), 3.32 (br, 4H,CH2 ), 3.68 (br, 4H, CH2), 5.48 (s, 2H, CH2), 6.34 (d, 2H, J = 9.2 Hz, ArH),6.49 (d, 1H, J = 8.8 Hz, ArH), 6.56-6.61 (m, 2H, ArH), 6.68 (d, 1H, J = 2.0Hz, ArH), 6.75 (d, 1H, J = 7.2 Hz, ArH), 7.05 (d, 1H, J = 6.8 Hz, ArH), 7.52(s, 1H, ArH), 7.54-7.62 (m, 2H, ArH), 7.85 (d, 1H, J = 6.8 Hz, ArH ), 8.14-8.17 (m, 2H, ArH), 8.29 (d, 1H, J = 7.2 Hz, ArH), 8.70 (t, 1H, J = 8.0 Hz,ArH), 8.74 (d, 2H, J = 5.6 Hz, ArH), 10.60 (s, 1H, NH)。

¹³C NMR (100 MHz, d ₆-DMSO), δ (ppm): 167.6, 164.2, 163.8, 153.4,153.1, 151.8, 151.7, 149.0, 146.9, 146.1, 138.9, 134.1, 129.5, 129.4, 129.2,128.5, 128.2, 126.4, 124.3, 123.7, 123.3, 122.8, 118.7, 115.9, 112.4, 111.7,108.5, 108.4, 104.1, 101.9, 97.5, 65.5, 60.6, 47.9, 44.1, 29.4, 29.1, 25.6,22.1, 14.1, 12.9。

HRMS m/z: calcd for C₄₇H₄₈ClN₈O₄S [M]+: 823.3487; found: 823.3552. m/z:calcd for C₄₇H₄₉ClN₈O₄S [M+H]²⁺/2: 412.1782; found: 412.1790。

实施例2：本发明所述探针随次氯酸浓度变化时的荧光变化。

配制探针的PBS缓冲溶液（含30%乙醇，pH 7.40）。分别向上述缓冲溶液中加入不同浓度的次氯酸溶液，然后进行荧光分析，λex = 370 nm。结果见图2。

实施例3：本发明所述探针的选择性。

配制探针的PBS缓冲溶液（含30%乙醇，pH 7.40）。分别加入一定量的某种干扰物质，然后对上述样品进行荧光测试分析，结果见图3。(1): 空白, (2): H₂O₂, (3): t-BuOOH, (4): t-BuO•, (5): ¹O₂, (6): ^-O₂, (7): ON, (8): •OH, (9): ONOO^-, (10):NO₂ ^-, (11): AcO^-, (12): Br^-, (13): Cl^-, (14): I^-, (15): CO₃ ^2-, (16): SO₄ ^2-, (17):^-OCl。其中，次氯酸浓度为4 µM，(2)-(9)浓度为40 µM，其他离子浓度为1 mM。

实施例4：本发明所述探针在细胞内的分布。

先用1 μM本发明所述探针培养RAW264.7细胞30分钟，随后加入线粒体标记物0.2μM Mito Tracker Deep Red 继续孵育30分钟。使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，分别收集探针（410-520 nm）波段的荧光成像照片和Mito Tracker Deep Red的荧光照片。然后进行叠加分析，计算共定位系数，见图4。

实施例5：本发明所述探针用于线粒体内次氯酸的成像分析。

实验组：先用1 μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞6小时，随后加入1 μg/mL PMA继续培养30分钟，随后在无血清培养基中加入1 μM本发明所述探针，培养30分钟；使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集410-520 nm和560-700 nm的荧光，并统计两个光的比值；

对照组：在无血清培养基中加入1 μM探针，培养30分钟；细胞分别用PBS洗3遍，再进行荧光成像，收集410-520 nm和560-700 nm的荧光，并统计两个光的比值，结果见图5。

Claims

1.次氯酸荧光探针IRP的化学结构式如下：

；

所述次氯酸荧光探针IRP的制备方法为：

将1 mmol化合物1和3 mmol三乙胺溶于20 mL无水CH₂Cl₂中，0℃条件下搅拌得到溶液，然后将2 mmol氯乙酰氯加入到上述溶液中，继续搅拌4小时，减压蒸馏除去溶剂，得红色固体，即化合物2；

将1 mmol化合物2、1 mL吡啶溶于30 mL无水乙腈中，回流12小时，减压除去溶剂，然后柱层析采用V二氯甲烷：V甲醇 = 10：1进行纯化，得到黄色固体，即所述次氯酸荧光探针IRP；

合成路线为：

。

2.权利要求1所述探针IRP在检测含次氯酸样品中的应用。

3.根据权利要求2所述探针IRP在检测含次氯酸样品中的应用，其特征在于，所述含次氯酸样品是含有次氯酸的溶液和生物细胞。