CN109770323A - 一种食品添加剂的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法以及相关应用。具体涉及以甜叶菊提取物与麦芽糊精的混合物为底物，加入环糊精糖基转移酶和β‑淀粉酶进行双酶催化后，获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品的制备方法，以及使用一步树脂法将甜菊糖苷粗产品制备为甜菊糖苷精制产品的方法。本发明所述方法提供了一种安全高产的葡萄糖基甜菊糖苷，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物食品领域，具体涉及功能性食品添加剂或功能甜味剂的生物酶法合成及加工生成领域。
背景技术
葡萄糖基甜菊糖苷即为酶改质甜菊糖，一般是通过环糊精糖基转移酶将多个葡萄糖链连接至普通甜菊糖的甙元或糖苷上获得的甜菊糖苷混合产物，是近年来对普通甜菊糖中后苦涩味等不悦口感改善的有效措施，通过酶催化改质的甜菊糖产品由于其仍含有甜菊糖的主要活性单元四环二萜部分，因此保留了与甜菊糖相同的生理活性及加工特性，如热量低、甜度高、味质好、稳定性好、耐高温等特点；加到食品中，不易变性、变质，保存期长，不会结块、褐变；更重要的是，食用后对血糖毫无影响，属于“零卡路里”甜味剂，同时可能还具有降血压、抗炎、预防肿瘤、免疫调节、治疗和预防糖尿病等多种重要活性。
2016年6月，我国国家卫生计生委食品安全标准与监测评估司已正式批准葡萄糖基甜菊糖苷(即酶改质甜菊糖)作为食品添加剂的使用，并随后对其适用范围进行了进一步的扩增，显示其作为下一代重要的天然甜味剂和潜在药物的价值已经获得了广泛的认可。
大量研究表明导致甜菊糖苷不良口感即后苦涩味的原因一是提纯过程中未被除去的生物碱、奎宁、类黄酮等苦味物质；二是甜菊糖分子结构与对应成分的味质的相关，其中C13糖基是甜味的主要功能基团，C19的酯基为助味基团，一定程度上影响甜菊糖的甜味强度和味质，同时糖基的数量和种类对甜菊糖的甜度与味质有不同程度的影响，如莱鲍迪苷D(甜菊糖苷高端产品，口感最接近蔗糖)就是在莱鲍迪苷A(甜菊糖苷类主要产品，也是甜叶菊中的主要成分之一)的C19位上通过β-1,2键连接了一个葡萄糖基，其口感味质明显优于莱鲍迪苷A，此外也有研究表明莱鲍迪苷M的口感味质更优于莱鲍迪苷D，其莱鲍迪苷M的分子结构为在莱鲍迪苷D的C19位上通过β-1,3键继续连接添加一个葡萄糖基。在具体的工业生产中，发明人惊奇的发现，生产工艺的改变对于苦味的去除具有很大的影响。
目前市场上出售的大部分酶改质甜菊糖产品还存在问题包括：
1、口感不佳：市场上部分甜菊糖苷不良口感；
2、甜度有待提升：虽然其中部分产品去除了甜菊糖的后苦涩味，口感得到了一定提升，且产品价格等同于普通甜菊糖，但其甜度却不到甜菊糖(约为蔗糖的300倍)的一半；
3、工业生产差异大：该产品生产工艺粗糙、批次差异较大；
4、结构不明确：最终产品组分不明确，作为食品添加剂主要成分不清楚；现有的酶改质甜菊糖苷的工艺多为一步环糊精糖基转移酶法，获得的产物较杂，多为添加多个葡萄糖基的甜菊糖，产物多而结构不明确，口感提升效果有限。
5、成本高：目前现有技术中，工业操作复杂，成本高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术及生产工艺的缺陷，利用环糊精糖基转移酶的多功能催化反应将长链的麦芽糊精葡萄糖链连接至甜菊糖分子上，进而利用β-淀粉酶的外切型水解特性将连接至甜菊糖上的葡萄糖长链以麦芽糖为单元依次水解下来，使最终的催化反应产物集中为在甜菊糖上连接1-3个葡萄糖基的甜菊糖苷，提供了一种产品组分相对单一清楚、转化率较高、甜度更高、口感更接近蔗糖、且生产成本更低的葡萄糖基甜菊糖苷制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先涉及一种双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，包括，以甜叶菊提取物与麦芽糊精的混合物为底物，底物浓度为20％-55％，加入环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶进行双酶催化后，获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；其中，所述甜叶菊提取物中总苷含量不小于50％；所述底物中甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加质量比为1：1-5；所述环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的质量比为1.1-1.3：1；
将所述甜叶菊提取物与麦芽糊精混合物溶于水；
本发明所述甜叶菊提取物是指一类混合物质，在本发明的实施例中，所述甜叶菊提取物可以是甜菊糖苷粗提物、莱鲍迪苷A精制产品、甜菊母液糖等，上述甜菊糖苷粗提物、莱鲍迪苷A精制产品、甜菊母液糖都可以被称为甜叶菊提取物。
优选的，以甜叶菊提取物与麦芽糊精的混合物为底物，所述底物浓度为10％、20％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％；
优选的，底物浓度为25％-45％；
优选的，所述甜叶菊提取物中总苷含量不小于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；
优选的，所述底物中甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加质量比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5；
更优选的，所述底物中甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加质量比为1：3；
优选的，所述环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的质量比为1.1：1、1.15：1、1.2：1、1.25：1或1.3：1。
进一步优选的，所述环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的质量比为1.25：1。
在本发明的一个实施例中，所述方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品中在C13或C19位上通过a-1,4键连接有1个、2个或3个葡萄糖基的甜菊糖苷，也称为甜菊糖苷G1-G3，占葡萄糖基甜菊糖苷粗产品总苷含量的65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％或78％以上。
本发明所述甜叶菊提取物中的总苷由甜菊糖、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷D(RD)、莱鲍迪苷M(RM)、莱鲍迪苷C(RC)、莱鲍迪苷B(RB),莱鲍迪苷E(RE)，甜茶苷，悬钩子苷、杜克苷A、杜克苷B、甜菊醇、异甜菊醇、甜菊单糖苷，甜菊双糖苷、甜菊三糖苷中的一种或多种组成。
本发明涉及一种双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：步骤一：在酶催化反应罐中以底物浓度为25％-45％将麦芽糊精和甜菊糖溶解在60℃-70℃的水中，以150rpm进行搅拌助溶，其中麦芽糊精和甜菊糖的投放质量比为1.5:1-4:1；步骤二：加入终浓度为0.5-1.0mg/mL的环糊精糖基转移酶，可选的酶的用量范围为每一升反应体系加入20-40ml，于60℃-70℃、50-100rpm的条件下反应15-25小时，随后加入终浓度为0.4-0.85mg/mL的β-淀粉酶，可选的酶的用量范围为每一升反应体系加入2.4-5ml，于60℃-70℃、50-100rpm的条件下反应1小时；步骤三：酶催化反应后，调节酶催化反应罐升温至90℃，保持30分钟，随后降温至室温，获得酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品。
此外，本发明还涉及一种获得精制葡萄糖基甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：步骤一：使用本发明所述的所述方法获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；步骤二：使用一步树脂法，对葡萄糖基甜菊糖苷粗产品进行分离精制；第三步：回收获得葡萄糖基甜菊糖苷精制产品。
在本发明的一个具体实施例中，涉及一种获得精制葡萄糖基甜菊糖苷的方法，包括如下步骤：步骤一：使用本发明所述方法获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；步骤二：将步骤一获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品中加入活性炭进行脱色，然后通过板框过滤，去除活性炭；取过滤液过大孔吸附树脂，树脂饱和后进行水洗，水洗用量约为柱内树脂装填体积的5-8倍，冲洗至无甜味；之后用60％乙醇洗脱，乙醇用量约为柱内树脂装填体积的1-1.5倍，冲洗至无甜味，收集洗脱的糖液；将洗脱后的糖液转入单效蒸发器脱醇，浓缩条件为：料液温度为75℃-90℃、负压0.04-0.06MPa、设备夹层压力为0.2MPa-0.3MPa，待料液脱醇完全后停止设备，开启排空阀至常压后获得浓缩液，加水稀释至固含量20％以下；步骤三：将步骤二获得的料液进行喷雾干燥，并回收，最终获得葡萄糖基甜菊糖苷精制产品。
此外，本发明还涉及保护了利用本发明所述方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品，所述葡萄糖基甜菊糖苷粗产品中在C13或C19位上通过a-1,4键连接有1个、2个或3个葡萄糖基的甜菊糖苷，也称为甜菊糖苷G1-G3，占葡萄糖基甜菊糖苷粗产品总苷含量的70％以上，且整体催化体系葡萄糖基甜菊糖苷转化率可达到90％。
以及一种使用本发明所述方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷精制产品，所述在葡萄糖基甜菊糖苷精制产品中总苷含量高于95％，并且回收率大于90％。
同时，本发明还涉及以下应用：发明所述的方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品作为食品添加剂的应用；和/或，本发明还涉及本发明所述的方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品作为甜味剂的应用；和/或，本发明所述的方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷精制产品作为甜味剂的应用；和/或，本发明所述的方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷精制产品作为食品添加剂的应用。
本发明的优点包括但不限于以下几点：
1、本发明提供了一种食品用添加剂或甜味剂葡萄糖基甜菊糖苷的生产制备工艺，该工艺显著的特征在于采用双酶催化法制备葡萄糖基甜菊糖苷，所获得的产物集中为在甜菊糖上连接1-3个葡萄糖基的甜菊糖苷，使得该产品组分相对单一清楚；整体催化体系葡萄糖基甜菊糖苷转化率可达到90％。
2、本发明获得产品甜度可近达蔗糖的280倍、口感更接近蔗糖；
3、同时本发明提供的一步树脂分离精制葡萄糖基甜菊糖苷的制备工艺，在实现精制的葡萄糖基甜菊糖苷产品总苷含量高于95％的同时，可实现产品回收率大于90％，进而在保证产品品质更高的条件下，简化了生产工艺，降低了生产成本。
4、作为一种食品添加剂或甜味剂，本发明所述方法以及获得的产品具有广泛的应用价值和市场潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1：双酶法催化体系催化原理示意图；
图2：双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷产品高效液相检测图；
图3：单一酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷产品高效液相检测图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
蔗糖采购自太古糖业(中国)有限公司；
甜菊糖苷粗提产物采购自诸城市浩天药业有限公司，货号T20150208；
莱鲍迪苷A采购自诸城市浩天药业有限公司，货号20170102；
甜菊母液糖采购自曲阜圣仁制药有限公司，货号20170503；
麦芽糊精采购自中粮生化能源(公主岭)有限公司，货号为MD2017-03-25/03；
环糊精糖基转移酶采购自诺维信(中国)生物技术有限公司，货号为ACN00234，环糊精糖基转移酶的原始浓度为25mg/mL；
β-淀粉酶采购自山东隆大生物工程有限公司，货号为16015106，β-淀粉酶的原始浓度为170mg/mL；
制备例
本发明公开了一种双酶法精制富含连接1-3个葡萄糖的葡萄糖基甜菊糖苷产品的生产制备工艺。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明还采用如下检测和评价方法：
1、本发明中的高效液相色谱检测方法如下：
仪器：Agilent HPLC 1260，色谱柱：Athena C18-WP，4.6×250mm，5μm，柱前装有脱盐的预柱，检测器：紫外检测器，检测波长210nm，参考波长360nm，流动相：10mM磷酸二氢钠缓冲液(pH＝2.6)：乙腈＝70:30流速：1ml/min进样量：10μl进样前洗针，柱温：40℃，运行时间：30min。步骤：1、先用90％水10％乙腈平衡系统，流速1mL/min，至基线平衡；2、用70％水30％乙腈平衡系统，流速1mL/min，至基线平衡；3、保持步骤2中流动相比例，将流速降至0.2mL/min，将柱子接入系统，缓慢将流速升至1mL/min，至基线平衡；4、用70％磷酸盐缓冲液30％乙腈平衡柱子，流速1mL/min，至基线平衡；5、跑样品；6、样品检测结束后，先用70％水30％乙腈冲洗系统和柱子，至基线平衡；再用90％水10％乙腈冲洗系统和柱子，至基线平衡；最后用100％乙腈冲洗系统和柱子，至基线平衡，流速均为1mL/min。7、将流速降至0.2mL/min，卸下柱子。
2、本发明中的甜度检测方法如下：以蔗糖甜度作为标准，蔗糖的甜度为1(100％)，步骤：(1)对照样，10％蔗糖溶液，配置方法：称取10g蔗糖，加蒸馏水稀释至100ml；(2)系列浓度实验样品的配制，配制方法：先称取样品1g加蒸馏水稀释至100ml即成1％的样品溶液，分别量取1％样品溶液20ml、12.5ml、10.0ml、5ml、4ml、3.3ml、2.5ml到100ml容量瓶中，稀释至100nl，其溶液浓度分别是0.2％、0.125％、0.1％、0.05％、0.04％、0.033％、0.025％。(3)样品品尝比较：至少由5个人组成评定小组对样品进行品尝，判断系列浓度样品中哪一个与10％蔗糖溶液的甜度相同或者相近，从而计算出样品的甜度。公式如下：甜度＝10％/样品浓度。
3、本发明中的口感测试方法如下：根据GB/T 16291.1中的要求选择测试人员，口感测试根据GB/T 29605-2013中感官评价的准则进行。步骤：(1)根据甜度测试结果确定样品甜度倍数，以蔗糖为标准，配制相同甜度值的样品。(2)评价员人数≧8人，味觉灵敏，无抽烟，喝酒习惯，男女人数相等最佳。(3)为免避评价员相互之间的交流影响评价的客观性，各评价员分别到感官评价室的隔间单独评价，填写评价表。(4)测试产品采用随机编码，评价员不知道编码所代表的样品种类。(5)品尝一种后，纯净水漱口，品尝另一种。
4、本发明中的葡萄糖基甜菊糖苷总苷含量测试方法如下：准确称取约5g葡萄糖基甜菊糖苷，并将其倒入250mL水中溶解。以小于15mL/min的速率，将溶液加入装有200mL的大孔树脂的玻璃柱内(内径为25mm)，然后用1000mL水冲洗树脂；以15mL/min或更低的速率使用1000mL50％(体积)乙醇洗脱所吸附的甜菊糖苷；将所收集的乙醇洗脱液蒸发至干燥，然后将它们置于真空烘箱中，在105℃的温度下干燥两个小时。对每一组分的干重进行称重并记录，并通过下列公式计算总苷含量(％)：
其中，m1为干燥后乙醇组分总量，单位为克(g)；m2为原样品的湿重，单位为克(g)；wh为原样品中含水率(％)；
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1甜菊糖苷粗提产物为底物制备葡萄糖基甜菊糖苷粗产品
通过甜叶菊的植物提取法获得的甜菊糖苷粗提产物(采购自诸城市浩天药业有限公司，货号T20150208)，其中含有浓度不等的10余种甜菊糖苷组分，总苷含量为85％，经测定，总苷主要成分为莱鲍迪苷A(RA)和甜菊三糖苷(STv)，RA和STv约占总苷浓度的70％，甜味滞后且苦涩味、草腥味强烈。葡萄糖基甜菊糖苷粗产品制备方法，如下：
①制备底物：将麦芽糊精和甜菊糖苷粗提产物混合，制备底物混合物，
其中，麦芽糊精和甜菊糖苷粗提产物的投放量如表1所示；
②在酶催化反应罐中，将上述不同组的底物分别溶解在60℃的水中，以150rpm进行搅拌助溶；
③在实验例1-3的反应体系中加入终浓度为1.0mg/mL的环糊精糖基转移酶，于60℃、80rpm的条件下反应20小时，随后加入终浓度为0.85mg/mL的β-淀粉酶，环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的添加量如表1所示，于60℃、80rpm的条件下反应1小时；
④待酶催化反应后，调节酶催化反应罐升温至90℃，保持30分钟，随后降温至室温，获得酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；
⑤设计对比例1：仅使用环糊精糖基转移酶进行替换双酶反应体系，按照上述同样的实验步骤参照实验例1的条件进行实验；
表1
实施例2莱鲍迪苷A精制产品为底物制备葡萄糖基甜菊糖苷粗产品
通过甜叶菊的植物提取法获得的莱鲍迪苷A(RA)精制产品之一，其总苷含量为95％，主要成分为RA(采购自诸城市浩天药业有限公司，货号20170102)，约占总苷浓度的80％，其甜度约为蔗糖的300倍，甜味滞后口感清凉持久，仍具有一定的苦涩味和草腥味。
葡萄糖基甜菊糖苷粗产品制备方法，如下：
①制备底物：将麦芽糊精和莱鲍迪苷A精制产品混合，制备底物混合物，其中，麦芽糊精和莱鲍迪苷A精制产品的投放量如表2所示；
②在酶催化反应罐中，将上述不同组的底物分别溶解在60℃的水中，以150rpm进行搅拌助溶；
③在实验例4-6的反应体系中加入终浓度为0.8mg/mL的环糊精糖基转移酶，于60℃、80rpm的条件下反应15小时，随后加入终浓度为0.646mg/mL的β-淀粉酶，环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的添加量如表2所示，于60℃、80rpm的条件下反应1小时(实验例6的结果参见图2)。
④待酶催化反应后，调节酶催化反应罐升温至90℃，保持30分钟，随后降温至室温，获得酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品。
⑤设计对比例2，仅使用环糊精糖基转移酶进行替换双酶反应体系，按照上述同样的实验步骤参照实验例6的条件进行实验(参见图3)；
表2
实施例3甜菊母液糖为底物制备葡萄糖基甜菊糖苷粗产品
甜菊母液糖(采购自诸城市浩天药业有限公司，货号20170503)是在植物提取法获得甜菊糖苷粗提产物后进一步精制提取RA后的下脚料产品，其总苷含量相对较低，约为50％，主要成分为STv、RA、莱鲍迪苷C(RC)，杂质含量较高，其甜度倍数较低，是甜菊糖产品中口感最差的产品。
葡萄糖基甜菊糖苷粗产品制备方法，如下：
①制备底物：将麦芽糊精和甜菊母液糖混合，制备底物混合物，其中，麦芽糊精和甜菊母液糖的投放量如表3所示；
②在酶催化反应罐中，将上述不同组的底物分别溶解在60℃的水中，以100rpm进行搅拌助溶；
③在实验例7-9反应体系中加入终浓度为0.5mg/mL的环糊精糖基转移酶，于60℃、100rpm的条件下反应25小时，随后加入终浓度为0.408mg/mL的β-淀粉酶，于60℃、100rpm的条件下反应1小时。
④待酶催化反应后，调节酶催化反应罐升温至90℃，保持30分钟，随后降温至室温，获得酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品。
⑤设计对比例3，仅使用环糊精糖基转移酶进行替换双酶反应体系，按照上述同样的实验步骤参照实验例7的条件进行实验；
表3
实施例4葡萄糖基甜菊糖苷精制产品的制备
1、在实施例1-3中获得实验例1-9，实验例1’、实验例4’、实验例7’的酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品以及对比例1-3获得产品加入活性炭进行脱色，然后通过板框过滤，去除活性炭。
2、取过滤液过大孔吸附树脂，树脂饱和后进行水洗，水洗用量约为柱内树脂装填体积的5-8倍，冲洗至无甜味；之后用60％乙醇洗脱，乙醇用量约为柱内树脂装填体积的1-1.5倍，冲洗至无甜味，收集洗脱的糖液。
3、将洗脱后的糖液转入单效蒸发器脱醇，浓缩条件为：料液温度为75℃-90℃、负压0.04-0.06MPa、设备夹层压力为0.2MPa-0.3MPa，待料液脱醇完全后停止设备，开启排空阀至常压后获得浓缩液，加水稀释至固含量20％以下，再将料液进行喷雾干燥，获得葡萄糖基甜菊糖苷精制产品。
4、设计对比例4，原料使用实验例1获得的粗产品，纯化步骤使用现有技术中常规的纯化步骤进行，具体步骤为：
取实验例1的酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品用孔径1微米的过滤器进行过滤；滤液过大孔吸附树脂柱，树脂饱和后进行水洗，水洗用量约为柱内树脂装填体积的5-8倍，冲洗至无甜味；之后用60％乙醇洗脱，乙醇用量约为柱内树脂装填体积的1-1.6倍，冲洗至无甜味，收集洗脱的糖液；将洗脱后的糖液经过膜分离将含糖量提高到5-10％、进入1×16树脂柱和941树脂柱，收集糖液；进而利用糖液浓缩至含固量为15％，将浓缩后的糖液转入单效蒸发器脱醇，浓缩条件为：料液温度为75℃-90℃、负压0.04-0.06MPa、设备夹层压力为0.2MPa-0.3MPa，待料液脱醇完全后停止设备，开启排空阀至常压后获得浓缩液，加水稀释至固含量20％以下，再将料液进行喷雾干燥，获得对比例4的葡萄糖基甜菊糖苷精制产品。
实施例5产品评价结果
转化率＝(反应体系中初始RA、STv和RC的质量-催化反应后RA、STv和RC的质量)/反应体系中初始RA、STv和RC的质量×100％式(2)。
甜菊糖苷G1-G3含量＝葡萄糖基甜菊糖苷精制产品高效液相色谱结果中甜菊糖苷G1-G3的峰面积和/葡萄糖基甜菊糖苷精制产品高效液相色谱结果中所有峰的峰面积和×100％。 式(3)
产品回收率＝葡萄糖基甜菊糖苷精制产品的总苷含量/葡萄糖基甜菊糖苷粗产品总苷含量×100％。 式(4)
表4
由以上表4的数据可以看出：
首先，采用双酶法的实验例1-3其产品中甜菊糖苷G1-G3含量明显高于同组实验条件下的对比例1；实验例4-6其产品中甜菊糖苷G1-G3含量明显高于同组实验条件下的对比例2，同时，从图2和图3可以看出，实验例6其产品中甜菊糖苷G1-G3含量明显高于同组实验条件下的对比例2；实验例7-9其产品中甜菊糖苷G1-G3含量明显高于同组实验条件下的对比例3；甜菊糖苷G1-G3含量已经被证实是影响产品质量和口感的重要因素，甜菊糖苷G1-G3含量值越高产品质量和口感越好，故，可以看出，使用本实验中所述的双酶法进行葡萄糖基甜菊糖苷的制备获得的甜菊糖苷G1-G3含量值明显优于单酶法。
第二，利用实验例1’、实验例4’和实验例7’在仅改变双酶添加比例的情况下(与实验例1、实验例4和实验例7相比)，对最优的双酶添加量进行摸索，通过大量的实验发现，当环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的质量比为1.1-1.3：1时，实验效果最佳，获得的甜菊糖苷G1-G3含量值高。
第三，同时可以看出不同的底物浓度和(甜叶菊提取物和麦芽糊精)添加比例对结果存在一定影响，经过上述实验摸索发现：底物中甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加质量比为1：1-5提取效果好，最优选的方案是当底物浓度为45％，甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加体积比为1：3。
第四，从与对比例4的结果来看，采用本发明的一步树脂法精制葡萄糖基甜菊糖苷与其他多步树脂精制葡萄糖基甜菊糖苷的方法相比，产品总体回收率方面具有明显优势，体现出采用一步树脂法精制葡萄糖基甜菊糖苷可简化操作流程、回收率更高，明显降低了葡萄糖基甜菊糖苷产品的生产成本。
实施例6产品评价结果——口感测试
口感检测标注，以蔗糖为参照，本领域普遍认为，得分越接近蔗糖(10％)的得分，说明分离获得的葡萄糖基甜菊糖苷(葡萄糖基甜菊糖苷粗产品或葡萄糖基甜菊糖苷精制产品)的口感效果越好。
表5
由以上表5的数据可以看出：
首先，从对实验例的口感评价来看采用双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷产品比相同条件下的单酶法制备的产品在甜度倍数、甜味、后苦味方面都有明显的优势。
同时，双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷使其产品富含甜菊糖苷G1-G3，该部分组分的含量使产品整体的甜度倍数更高，甜味剂口感更接近蔗糖，同时在很大程度上降低了产品中的后苦味。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种双酶法制备葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，以甜叶菊提取物与麦芽糊精的混合物为底物，底物浓度为20％-55％，加入环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶进行双酶催化后，获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；
其中，
所述甜叶菊提取物中总苷含量不小于50％；
所述底物中甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加质量比为1：(1-5)；
所述环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的质量比为(1.1-1.3)：1。
2.一种如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品中在C13或C19位上通过a-1,4键连接有1个、2个或3个葡萄糖基的甜菊糖苷，也称为甜菊糖苷G1-G3，占葡萄糖基甜菊糖苷粗产品总苷含量的70％以上。
3.一种如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述甜叶菊提取物中的总苷由甜菊糖、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷D(RD)、莱鲍迪苷M(RM)、莱鲍迪苷C(RC)、莱鲍迪苷B(RB),莱鲍迪苷E(RE)，甜茶苷，悬钩子苷、杜克苷A、杜克苷B、甜菊醇、异甜菊醇、甜菊单糖苷，甜菊双糖苷、甜菊三糖苷(STv)中的一种或多种组成。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，其中：以甜叶菊提取物与麦芽糊精的混合物为底物，将所述甜叶菊提取物与麦芽糊精混合物溶于水；
优选的，底物浓度为25％-45％；
更优选的，所述底物中甜叶菊提取物和麦芽糊精的添加质量比为1：3；
进一步优选的，所述环糊精糖基转移酶和β-淀粉酶的质量比为1.25：1。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：在酶催化反应罐中以底物浓度为25％-45％将麦芽糊精和甜叶菊提取物溶解在60℃-70℃的水中，以150rpm进行搅拌助溶，其中麦芽糊精和甜叶菊提取物的投放质量比为1.5:1-4:1；
步骤二：加入终浓度为0.5-1.0mg/mL的环糊精糖基转移酶，于60℃-70℃、50-100rpm的条件下反应15-25小时，随后加入终浓度为0.4-0.85mg/mL的β-淀粉酶，于60℃-70℃、50-100rpm的条件下反应1小时；
步骤三：酶催化反应后，调节酶催化反应罐升温至90℃，保持30分钟，随后降温至室温，获得酶催化的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品。
6.一种获得精制葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：使用权利要求1-5任一项所述方法获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；
步骤二：使用一步树脂法，对葡萄糖基甜菊糖苷粗产品进行分离精制；
第三步：回收获得葡萄糖基甜菊糖苷精制产品。
7.一种如权利要求6所述的获得精制葡萄糖基甜菊糖苷的方法，其特征在于，
步骤一：使用权利要求1-5任一项所述方法获得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品；
步骤二：将步骤一获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品中加入活性炭进行脱色，然后通过板框过滤，去除活性炭；取过滤液过大孔吸附树脂，树脂饱和后进行水洗，水洗用量约为柱内树脂装填体积的5-8倍，冲洗至无甜味；之后用60％乙醇洗脱，乙醇用量约为柱内树脂装填体积的1-1.5倍，冲洗至无甜味，收集洗脱的糖液；将洗脱后的糖液转入单效蒸发器脱醇，浓缩条件为：料液温度为75℃-90℃、负压0.04-0.06MPa、设备夹层压力为0.2MPa-0.3MPa，待料液脱醇完全后停止设备，开启排空阀至常压后获得浓缩液，加水稀释至固含量20％以下；
步骤三：将步骤二获得的料液进行喷雾干燥，并回收，最终获得葡萄糖基甜菊糖苷精制产品。
8.一种使用权利要求1-5任一项所述方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品，其特征在于，所述葡萄糖基甜菊糖苷粗产品中在C13或C19位上通过a-1,4键连接有1个、2个或3个葡萄糖基的甜菊糖苷，也称为甜菊糖苷G1-G3，占葡萄糖基甜菊糖苷粗产品总苷含量的70％以上，且整体催化体系葡萄糖基甜菊糖苷转化率可达到90％。
9.一种使用权利要求6或7所述方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷精制产品，其特征在于，所述在葡萄糖基甜菊糖苷精制产品中总苷含量高于95％，并且回收率大于90％。
10.一种如权利要求1-7任一项所述的方法制备获得的葡萄糖基甜菊糖苷粗产品或葡萄糖基甜菊糖苷精制产品作为食品添加剂或甜味剂的应用。
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