CN109762058A - 一种重组g-17蛋白及其单克隆抗体的制备 - Google Patents
一种重组g-17蛋白及其单克隆抗体的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白包含胃泌素‑17(以下称G‑17)全部抗原表位，并将全部抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复十次，形成重组G‑17蛋白氨基酸序列。为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应核苷酸序列，通过化学合成该核苷酸序列并构建重组蛋白表达载体。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过抗原免疫、细胞融合及多轮筛选后得到单克隆细胞株。纯化的单克隆抗体经过蛋白分子相互作用仪筛选出优势抗体配对，分别标记荧光微球和包被NC膜，通过实验确定最佳单抗配对组合，可用于G‑17的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列，含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述重组蛋白制备G-17单克隆抗体并筛选G-17单克隆抗体配对，并将配对单抗应用于胃泌素定量检测。
背景技术
我国是胃癌高发国家，胃癌每年新增67.91万例，平均46秒就有一人新患胃癌，居全球首位。胃癌是一种慢性疾病，通常从炎症发展而来。可以通过早期检测发现胃癌前疾病风险，通过及时就诊治疗，避免最终发展至胃癌。
胃泌素是一种主要由胃窦和十二指肠的G细胞分泌的胃肠激素，对调节消化道功能和维持其结构完整有重要作用。人体中，95％以上有生物活性的胃泌素是α-酰胺化胃泌素，主要含两种异构体G-17和G-34，其中80％～90％是G-17。 G-17仅由胃窦部G细胞分泌，因此G-17是反映胃黏膜损伤情况的重要指标，其与胆囊收缩素受体(cholecystokininreceptor,CCKR)结合后通过一系列信号转导而发挥生物学效应，主要参与刺激胃酸分泌及营养胃肠道黏膜，近年研究表明G-17还有促进细胞增殖和抑制凋亡的作用。G-17可以提示患者胃黏膜的功能状态，与反映胃底胃体部萎缩的胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II及其比值已被科技部列为早期胃癌筛查项目之一，因此G-17在胃肠疾病的诊断中具有重要意义。
G-17与胃酸存在严格的负反馈机制。当G-17低值时，通常提示胃部存在高酸的状况；G-17高值时，提示存在胃部炎症，患者具有高胃泌素血症的症状，可能与幽门螺旋杆菌感染、胃溃疡或者药物影响、患者饮食刺激、其它疾病影响相关。
目前检测G-17的成品试剂盒仅采用ELISA方法(BIOHIT公司)，ELISA 能检出极低浓度的G-17(pg级)，但试验流程繁琐且消耗时间长；免疫层析法由于其操作极为简单，且结果不受脂血症和溶血的影响，适合临床应用，例如通过荧光微球平台检测G-17。该方法特异性及灵敏度俱佳，一般能在15～20 分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊人员要求。该方法通常需要制备可识别G-17的单克隆抗体，常规G-17单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列短，仅含17个氨基酸(Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu GluGlu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe)，使用G-17全长多肽作为免疫原，分子量太小难以制备得到单克隆抗体。
发明内容
设计目的：为解决免疫学方法检测G-17的不足之处，通过设计、合成重组 G-17蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现对G-17的特异性检测识别，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。
设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以G-17为靶抗原，为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复，形成重组G-17蛋白氨基酸序列。(2)为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。(3)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pET-28a(+)，构建重组G-17蛋白表达载体。(4)重组G-17蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(5)重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱纯化，洗脱得到重组G-17蛋白。(6)重组G-17蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用重组G-17蛋白多轮筛选最终得到分泌G-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(7)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别测算亲和力及抗体表位配对。(8)将可配对抗体制作成荧光免疫层析试纸条，并检测标准品，结果显示1F6单抗标记与5B1 单抗包被配对为检测G-17最佳组合。
设计方案1：一种重组蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No:1所示。
设计方案2：一种核苷酸序列，其序列如序列表SEQ ID No:2所示，可编码权利1所述的重组G-17蛋白。
设计方案3：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。
设计方案4：一种菌株，该菌株包含权利要求3所述的质粒载体。
本发明与背景技术相比，一是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，极大提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；二是作为免疫原的重组G-17蛋白含有G-17所有抗原表位，并重复其表位，提高了免疫效率，可以快速筛选得到最优单抗配对组合，提高了检测灵敏度；三是本专利中抗体通过荧光免疫层析平台筛选，可以确保其在免疫诊断中的使用效果。
附图说明
图1是5B1作为一抗的表位配对结合曲线；
图2是5B1作为二抗的表位配对结合曲线；
图3是1F6-5B1配对单抗检测G-17梯度浓度标准品曲线。
具体实施方式
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：G-17全长抗原表位串联
为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的激活效果以缩短单克隆抗体制备时间，将全部抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复，得到重组G-17蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID No:1所示。
实施例2：优化编码重组G-17蛋白的核苷酸序列
在重组G-17蛋白氨基酸序列不变的前提下，为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No:2所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因连接于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例3：构建重组G-17蛋白表达载体
将含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)分别通过限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃双酶切12小时，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和 pET-28a(+)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例4：构建重组G-17蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。次日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为1.0mmol/L) 诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。13.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组G-17蛋白表达菌株。
实施例5：纯化重组G-17蛋白
接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为 50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至 OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体，4℃低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组G-17蛋白。
实施例6：杂交瘤细胞株构建
取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组G-17蛋白，共400μL/只。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80μg重组G-17蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，共400μL/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取 100μg重组G-17蛋白腹腔加强注射，于72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0 (小鼠骨髓瘤细胞)，混和离心后，加入聚乙二醇(Sigma公司)使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于 37℃、5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中杂交瘤细胞培养上清。具体方法如下：
合成G-17多肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)并经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭1小时，洗涤液洗涤1次；加待检细胞培养上清、阳性对照血清及阴性对照样本，100μL/孔，37℃孵育35 分钟后，洗涤液洗涤3次；加HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，100μL/ 孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤4次；每孔加显色液A和显色液B各50μL， 37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g 牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加双蒸水定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，再使用有限稀释法进行亚克隆，挑选单个细胞培养并通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测。经过三次亚克隆，共筛选得到4株单克隆细胞株(1F6、4A3、4G2、5B1)。
实施例7：单克隆抗体制备及纯化
取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，500μL/只，5天后腹腔注射单克隆细胞(约1.2×106个/只)，7-9天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水。用 50mL平衡缓冲液PBS(pH7.4)平衡琼脂糖亲和介质Protein A层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度为0。腹水12000rpm离心5分钟，收集上清过0.45μm滤器并上样后加PBS洗涤至吸光度为0，然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱，收集流出液并加入500mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液中和至pH 7.0左右，得到纯化的单克隆抗体。
实施例8：抗体亲和力水平评估及表位配对
基础磷酸盐(0.01M PBS)缓冲液配制：Na2HPO4.12H2O 2.68g， NaH2PO4.2H2O0.39g，NaCl 8.5g，加双蒸水定容至1000mL，调节pH至7.4。
取400μg重组G-17蛋白，加入10μL 10nM生物素(Thermo-Fisher公司， DMSO稀释)室温反应30分钟。使用10kDa超滤管截留生物素化的重组G-17 蛋白，弃去穿透液后再使用0.01M PBS(pH7.4)清洗两次，收集生物素化重组蛋白并定容至400μL，得到生物素化重组G-17蛋白并测定其浓度。纯化后的抗体使用0.01M PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4，含0.02％Tween-20)稀释至200nM 待测。在蛋白分子相互作用仪(Octec-K2，ForteBio-Pall公司)中，使用SA传感器(含链霉亲和素)与生物素化的重组G-17蛋白反应，使传感器表面固化结合重组G-17蛋白。固化后的传感器依次与抗体稀释液结合反应180秒后再浸入 0.01M PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4，含0.02％Tween-20)中解离30秒。使用 ForteBio Data Analysis7.0软件(ForteBio-Pall公司)依据抗体与重组蛋白的结合解离曲线，计算得到每株单抗的亲和力常数。结果如下表1，其中5B1单抗亲和力最高。
| Sample ID | KD | kon | kdis |
| 1F6 | 1.03E-08 | 4.74E+05 | 4.87E-03 |
| 4A3 | 2.33E-10 | 6.11E+05 | 1.42E-04 |
| 4G2 | 1.12E-08 | 6.61E+05 | 7.42E-03 |
| 5B1 | <1.0E-12 | 4.26E+05 | <1.0E-07 |
表1 1F6、4A3、4G2、5B1单抗的亲和常数(KD)、结合常数(kon)与解离常数(kdis)
选取亲和力最高的5B1抗体与其余三株1F6、4A3、4G2进行表位配对。在蛋白分子相互作用仪(Octec-K2，ForteBio-Pall公司)中，使用SA传感器(含链霉亲和素)与生物素化的重组G-17蛋白反应，使传感器表面固化结合重组 G-17蛋白。固化后的传感器先与5B1抗体稀释液结合120秒后浸入0.01M PBST 缓冲液中平衡30秒，再分别浸入空白对照(PBST缓冲液)和抗体1F6、4A3、 4G2稀释液中，在空白对照保持水平即无明显结合的情况下，若第二抗体可以继续结合，即可判断该抗体与第一抗体特异结合抗原不同表位并形成夹心。5B1 作为一抗的表位配对结合曲线如图1所示，图1中的A曲线表示5B1为一抗1F6 为二抗的表位配对结合曲线，图1中的B曲线表示5B1为一抗4A3为二抗的表位配对结合曲线，图1中的C曲线表示5B1为一抗4G2为二抗的表位配对结合曲线，其中1F6与4G2可以和5B1形成夹心配对，其中1F6与4G2可以和5B1 形成夹心配对。
调换一抗，二抗顺序，固化结合重组G-17蛋白的传感器先依次与抗体1F6、 4A3、4G2结合120秒后浸入0.01M PBST缓冲液中平衡30秒，再分别浸入空白对照(PBST缓冲液)和5B1抗体稀释液中，即5B1抗体做二抗反应。5B1 作为二抗的表位配对结合曲线如图2所示，图2中的A曲线表示1F6为一抗5B1 为二抗的表位配对结合曲线，图2中的B曲线表示4A3为一抗5B1为二抗的表位配对结合曲线，图2中的C曲线表示4G2为一抗5B1为二抗的表位配对结合曲线，其中1F6与4G2可以和5B1形成夹心配对，1F6为一抗、5B1为二抗时的结合高度明显大于5B1为一抗、1F6为二抗时的结合高度，综上所述在夹心法免疫诊断中适合将1F6作为第一抗体、5B1作为第二抗体使用。
实施例9：荧光免疫层析平台验证G-17单克隆抗体配对
选用直径为210nm的荧光微球(南京微测生物科技公司)，用0.05M pH5.5 MES缓冲液调节微球浓度为1％，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS) 共价偶联的方式将G-17单克隆抗体1F6标记到荧光微球上，抗体浓度为 0.2mg/mL。将制备好的荧光微球使用定量喷膜仪以4μL/cm的量喷涂于玻纤垫上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥环境备用。
用10mmol/L pH7.4PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20) 调节G-17单克隆抗体5B1至其浓度为0.4mg/mL，将所得溶液喷涂在NC膜上形成检测区(T线)；用10mmol/L pH7.4PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)调节羊抗鼠IgG浓度为0.5mg/mL，将所得溶液喷涂在NC 膜上形成质控区(C线)。两区的喷膜量均为1μL/cm，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。
组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)滤纸和样本垫，样本垫为一种经过5％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(2)喷涂有荧光微球标记G-17 的荧光微球垫；(3)喷涂G-17单克隆抗体5B1作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的硝酸纤维素膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即成为免疫层析试纸卡。
G-17梯度浓度标准品(ELISA G-17试剂盒，BIOHIT公司)，100μL/孔上样，室温放置15min后，通过荧光分析仪(和迈生物科技股份有限公司)分别读值，见下表2，将测量值与浓度值绘制曲线图并拟合，如图3所示，图3作为 1F6-5B1配对单抗检测G-17梯度浓度标准品曲线，其中R2>0.99；检测结果相关性较好。
| pmol/L | T值 | C值 | T/(T+C) |
| 0 | 379 | 3712 | 0.092642389 |
| 5 | 1626 | 7211 | 0.183999091 |
| 10 | 2254 | 7324 | 0.235330969 |
| 40 | 6060 | 5045 | 0.545700133 |
表2 1F6标记微球5B1划膜检测G-17梯度浓度标准品结果
综上，5B1单抗包被与1F6单抗标记为检测G-17最佳配对组合。
SEQ ID NO1：重组G-17蛋白氨基酸序列；
SEQ ID NO2：编码重组G-17蛋白的核苷酸序列。
Claims (5)
1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:1所示。
2.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示，可编码权利1所述的重组蛋白。
3.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种菌株，其特征在于该菌株包含采用权利要求3所述的质粒载体。
5.权利要求1所述的重组蛋白用于G-17单克隆抗体的制备，包括：
(a)化学合成权利要求2所述的核苷酸序列，并连接质粒载体，构建重组G-17蛋白表达载体；
(b)将步骤(a)中重组G-17蛋白表达载体转化到大肠杆菌，筛选得到重组G-17蛋白表达菌株；
(c)大规模培养重组G-17蛋白表达菌株，经纯化获取重组G-17蛋白；
(d)重组G-17蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经G-17多肽多轮筛选得到单克隆细胞株；
纯化单抗通过双抗夹心法检测重组G-17蛋白，并分别标记荧光微球和包被NC膜，实验确定最佳单抗配对组合。
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