CN109758459A

CN109758459A - 取代的吡啶的新用途

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Publication number: CN109758459A
Application number: CN201910140764.3A
Authority: CN
Inventors: 杨吉春; 耿彬; 陈霁; 向瑞; 李双越
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2039-02-25
Also published as: CN109758459B

Abstract

本发明涉及取代的吡啶的新用途，具体涉及式(I)所示的化合物或其可药用盐在制备用于治疗高血压特别是糖尿病引起的高血压的药物中的用途，其中R₁为被C_1‑10烷基任选取代的‑CH₂‑或者被C_1‑10烷基任选取代的‑NH‑；并且R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H或C_1‑10烷基。

Description

取代的吡啶的新用途

技术领域

本发明涉及一种取代的吡啶的新用途。

背景技术

N2-1H-吲唑-5-基-N6-甲基-3-硝基-2，6-吡啶二胺通常称为KRIBB11，分子量为284.27g/mol，是已知的热休克因子1(HSF1)的抑制剂，结构式如下：

研究表明，该化合物以浓度依赖性的方式抑制HSF1的活性。它能够下调HSP70和HSP27，可抑制癌细胞的增殖、将细胞周期阻止在G2/M期并诱导凋亡。

它对热激诱导的hsp70启动子对HSF1的招募没有抑制作用，对HSF1第230位丝氨酸的磷酸化也没有抑制作用，但抑制热激诱导的hsp70启动子对pTEFb的招募以及依赖于p-TEFb的聚合酶II CTD第2位丝氨酸的磷酸化。

用KRIBB11处理的细胞中PARP和caspase-3裂解增加。将RKO与KRIBB11一起孵育，显示出约10μM的毒性阈值，IC50为20-30μM。

综上，现有技术中对于KRIBB11在治疗肿瘤方面的作用已有大量报道。

然而，现有技术中并没有关于该化合物在治疗其他疾病方面的报道。

糖尿病血管病变是2型糖尿病并发症中致死率最高的疾病，能够直接诱发心梗及脑梗等急性心脑血管疾病的发生。探究其中的发病机制以及如何缓解高血压及动脉粥样硬化等，是亟待解决的重大科学问题。

FAM3A是一个新线粒体蛋白，本发明人前期研究发现，其通过促进ATP合成分泌激活P2Y受体，进而激活PI3K-Akt及ERK1/2信号转导通路刺激血管平滑肌细胞(VascularSmooth Muscle Cells，VSMCs)增殖和迁移。血管损伤时，前列腺素E2受体EP2表达水平明显增加，其抑制FAM3A表达，防止VSMCs过度增殖及内膜过度增生，从而对防治动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄有着重要意义。

血管紧张素2(AngiotensinII，AngII)和同型半胱氨酸(Homocyteine，Hcy)在糖尿病发生时往往升高，其是导致糖尿病血管病变的重要病因。FAM3A是否介入了AngII和Hcy诱导的血管平滑肌增殖迁移及血管重构过程，也尚未揭示。

发明内容

在一方面中，本公开内容涉及式(I)所示的化合物或其可药用盐在制备用于治疗高血压特别是糖尿病引起的高血压的药物中的用途，

其中：

R₁为被C_1-10烷基任选取代的-CH₂-或者被C_1-10烷基任选取代的-NH-；并且

R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H或C_1-10烷基。

在另一方面中，本公开内容涉及药物组合物，其包含如上所述的式(I)化合物或其可药用盐和药物可接受的载体，该药物组合物用于治疗高血压，特别是糖尿病引起的高血压。

在另一方面中，本公开内容涉及治疗高血压特别是糖尿病引起的高血压的方法，其包括对有需要的个体施用如上所述的式(I)化合物或其可药用盐或药物组合物。

附图说明

下文将仅以举例的方式并参照附图描述本申请的实施方案，其中：

图1A示出了未输注AngII时Loxp和FAM3A^VSMC-/-小鼠的血压。

图1B示出了输注AngII 28天后Loxp和FAM3A^VSMC-/-小鼠的血压。

图1C示出了腹腔注射KRIBB11或对照DMSO前，两组SHR大鼠的血压。

图1D示出了腹腔注射KRIBB11或对照DMSO 7天后，两组SHR大鼠的血压。

图1E示出了腹腔注射KRIBB11或对照DMSO前和7天后，两组SHR大鼠的心率。

图2A示出了PE诱导的小鼠胸主动脉的内皮依赖性收缩。

图2B示出了预孵育L-NAME(NOS抑制剂，100μM)1小时后PE诱导的小鼠胸主动脉的内皮非依赖性收缩。

图2C示出了Ach诱导的小鼠胸主动脉的内皮依赖性舒张。

图2D示出了预孵育L-NAME(NOS抑制剂，100μM)1小时后SNP诱导的小鼠胸主动脉的内皮非依赖性舒张。

图2E示出了PE诱导的SHR大鼠的内皮依赖性收缩。

图2F示出了SNP诱导的SHR大鼠的内皮非依赖性舒张。

图2G示出了Ach诱导的SHR大鼠肠系膜上动脉的内皮依赖性舒张。

图3A示出了SHR和SD大鼠中胸主动脉的免疫荧光(400X)，该图为将DAPI(染核)、α-SMA(染肌丝)和HSF1三者的荧光图合并显示的图片。

图3B示出了SHR和SD大鼠中肠系膜上动脉的免疫荧光(400X)，该图为将DAPI(染核)、α-SMA(染肌丝)和HSF1三者的荧光图合并显示的图片。

图4A示出了在原代大鼠VSMCs中，不同浓度的Ang II和Hcy(Bioss)处理下，FAM3A、EP2蛋白表达和Akt活化水平的代表图。

图4B示出了在原代大鼠VSMCs中，不同浓度的Ang II和Hcy处理下FAM3A、EP2蛋白表达和Akt活化水平的统计图。

图4C示出了质粒过表达HSF1时，加或不加GW9662(PPARγ抑制剂，10μM)时，在原代大鼠VSMCs中的FAM3A蛋白表达和Akt活化水平的代表图及统计图。

图4D示出了在Ang II(0.5μM)处理下，加或不加KRIBB11(HSF1抑制剂，3μM)时的FAM3A、PPARγ蛋白表达水平的代表图和统计图。

图4E示出无血清培养下，苏拉明(P2受体抑制剂，100μM)处理原代大鼠VSMCs后所引起的细胞增殖的变化。

图5A示出了Ad-GFP、Ad-FAM3A或Ad-FAM3A+苏拉明处理或未经任何处理的原代大鼠VSMCs中游离Ca²⁺水平。

图5B示出了Ang II或Ang II+苏拉明处理或未经任何处理的原代大鼠VSMCs中游离Ca²⁺水平。

图5C示出了Ang II或Ang II+KRIBB11处理或未经任何处理的原代大鼠VSMCs中游离Ca²⁺水平。

图6示出了FAM3A参与血压调节的机理概述图。

具体实施方式

在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其它方法、部件、材料等的情况下可实现实施方案。

除非本申请中另外要求，在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。

在整个本说明书中提到的“一实施方案”或“实施方案”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案。此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。

还应当理解，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义而使用，除非文中另外明确地规定。

定义

由表明在所示化学基团中找到的碳原子总数的简化符号在前面标示本文中命名的某些化学基团。例如，C_1-10烷基描述具有总数为1至10个碳原子的如下定义的烷基。简化符号中碳原子总数并不包含可能存在于所述基团的取代基中的碳。

因此，除非另有相反的说明，否则说明书及权利要求中所用的下列术语具有以下的意思：

“烷基”指仅由碳和氢原子组成的，不含不饱和键的，且由单键与分子的其余部分相连的直链或支链烃链基团，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)等。

其中：

在一些具体的实施方案中，R₁为被C_1-6烷基任选取代的-CH₂-或者被C_1-6烷基任选取代的-NH-。

在一些具体的实施方案中，R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H或C_1-6烷基。

在一些更具体的实施方案中，R₁为被C_1-3烷基任选取代的-CH₂-或者被C_1-3烷基任选取代的-NH-。

在一些更具体的实施方案中，R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H或C_1-3烷基。

在一些更具体的实施方案中，R₂为C_1-3烷基。

在一些更具体的实施方案中，R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀均为H。

在一些更具体的实施方案中，R₁为-NH-，R₂为-CH₃，并且R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀均为H。

在另一方面中，本公开内容涉及药物组合物，其包含如上所述的式(I)化合物或其可药用盐和药物可接受的载体，所述药物组合物用于治疗高血压，特别是糖尿病引起的高血压。

术语“可药用盐”指保留上述化合物的期望生物学活性的盐，包括可药用酸加成盐和碱加成盐。式(I)化合物的合适的可药用酸加成盐可通过无机酸或有机酸来制备。这些无机酸的实例是盐酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自脂肪族、环脂肪族、芳香族、杂环羧酸和磺酸类有机酸，其实例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、烷基磺酸、芳基磺酸。式(I)化合物的合适的可药用碱加成盐包括由锂、钠、钾、镁、钙、铝和锌制备的金属盐，以及由有机碱如胆碱、二乙醇胺、吗啉制备的有机盐。有机盐的其他实例是铵盐、季盐例如四甲基铵盐；氨基酸加成盐例如与甘氨酸和精氨酸所成的盐。可药用盐的其它信息可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Edition，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995。在这些物质为固体的情形下，本领域技术人员应当理解的是，本发明化合物和盐可以不同的晶体或多晶型存在，所有这些形式都旨在落在本发明和具体式的范围之内。

药物组合物可以是颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、糖浆剂、果汁、混悬剂、乳剂、滴剂、可注射溶液剂等。例如，为了制备成片剂或胶囊剂，可将活性成分与无毒的药学上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等组合。另外，若需要或必要，可包含足够的粘合剂、润滑剂、崩解剂或着色剂。所述粘合剂可包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然或合成胶(如阿拉伯树胶、黄蓍胶)、或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等，但是不限于这些。崩解剂可包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但是不限于这些。

当将组合物制备成液体溶液时，适合灭菌的药学上可接受的载体可选自盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或其混合物。若需要，组合物可包含其他代表性添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂或抑菌剂。另外，可额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂以将组合物制备成注射剂(如水溶液、混悬剂或乳剂)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

此外，可根据Remington′s Pharmaceutical Science(Mack PublishingCompany，Easton，PA)中公开的方法根据特定疾病或组分将组合物制备成合适的形式。

本公开内容的药物组合物可经口或肠胃外施用。当肠胃外施用时，其可静脉内、皮下、肌内、腹内或经皮施用。具体地，其可经口施用。

可根据多种因素确定本公开内容的药物组合物的足够剂量，例如配制方法，施用方法，患者的年龄、体重和性别、病理状态、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和响应灵敏度。本领域技术人员可以容易地确定对于期望预防或治疗有效的剂量。在本公开内容的一个示例性实施方案中，本公开内容之药物组合物的日剂量是0.001g/kg至10g/kg。

可根据本领域中通常使用的方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂将本公开内容的药物组合物制备成单剂量形式或多剂量形式。制剂可以是油或水介质中的溶液的形式、混悬剂、乳剂、提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且还可包含分散剂或稳定剂。

包含式(I)化合物作为活性成分的组合物可经口、直肠、静脉内、动脉内、腹内、肌内、胸骨内、经皮、局部、眼内或皮内施用。

下文中，本申请将通过如下实施例进行详细解释以便更好地理解本发明的各个方面及其优点。然而，应当理解，以下的实施例是非限制性的而且仅用于说明本发明的某些实施方案。

实施例

缩写：

AngII：血管紧张素II；

FAM3：蛋白序列相似度为3的类细胞因子家族；

FAM3A^VSMC-/-小鼠：FAM3A平滑肌特异性敲除小鼠；

DMSO：二甲基亚砜；

SHR大鼠：自发性高血压大鼠；

PE：苯丙肾上腺素；

Ach：乙酰胆碱；

SNP：硝普钠；

L-NAME：L-硝基精氨酸甲酯；

PFA：多聚甲醛；

PBS：磷酸缓冲盐溶液；

OCT：Optimum Cutting Temperature，最佳切割温度；

DAPI：4，6’-二脒基-2-苯基吲哚；

FBS：胎牛血清；

S：Suramin，苏拉明；

Hcy：同型半胱氨酸；

VSMC：血管平滑肌细胞。

一般试验方案

动物

使用C57BL/6背景、雄性、8至12周的FAM3A^VSMC-/-小鼠和未经任何处理的Loxp小鼠。利用Cre-Loxp技术在Cyagen Biosciences Inc(中国)构建FAM3A^VSMC-/-小鼠。

使用雄性、体重为150至200g的Wistar和SHR大鼠。

将小鼠和大鼠圈养在标准动物实验室中，温度保持在24℃，并且进行人工12小时光-暗循环，不限制食物和饮水。

所有动物护理和实验方案均符合中华人民共和国卫生部动物管理规则和北京大学实验动物护理和使用指南。

渗透性迷你泵植入和AngII输注

通过Alzet渗透微型泵(Alzet Model#2004；Durect；Cupertino，CA，美国)皮下注入AngII(1,000ng/kg/min；Cat#H-1706；Bachem；Torrance，CA，美国)。在皮下植入前，将微型泵在37℃的生理盐水中孵育24小时。在Loxp和FAM3A^VSMC-/-小鼠中输注AngII(1000ng/kg/min)。将小鼠用戊巴比妥镇静，并将泵皮下植入每只小鼠的背部，28天后进行后续实验。使用外科钉来封闭切口部位。

SHR大鼠腹腔注射KRIBB11

将雄性、体重为200g的SHR大鼠(12只)分成两组，两组在血压方面没有显著差异。实验组腹腔注射KRIBB11(HSF1抑制剂，5mg/kg/day；Cat#S8402；Selleck)，而假手术组腹腔注射等量DMSO(Sigma)，连续注射7天。

实施例一、尾套法测血压

实验仪器

CODA，Kent，USA(美国肯特公司动物无创血压测量系统CODA)

实验方法

通过尾套法测量Loxp小鼠和FAM3A^VSMC-/-小鼠在埋泵前和埋泵28天后的血压及心率。通过尾套法测量SHR大鼠腹腔注射KRIBB11前和连续注射7天后的血压及心率。当小鼠和大鼠稳定时，测量血压及心率。取10次测量的平均值。

实验结果示于图1A-1E中

从图1A可以看出，在生理条件下，FAM3A^VSMC-/-小鼠的血压明显低于Loxp小鼠。

从图1B可以看出，AngII(1000ng/kg/min)埋泵28天后，FAM3A^VSMC-/-小鼠的收缩压和平均动脉压显著低于对照组，而舒张压两组之间没有明显差别。

从图1C可以看出，腹腔注射前，两组SHR大鼠的血压没有明显差别。

从图1D可以看出，连续腹腔注射KRIBB11(图中简写为KRI)的DMSO溶液(5mg/kg/天)7天后，处理组血压明显低于注射DMSO的对照组。虽然与第0天的图C相比整体水平均上升，但是与同处于注射后第7天的对照组相比，KRIBB11仍明显降低了血压。

从图1E可以看出，腹腔注射给药前后，SHR大鼠两组之间的心率没有明显差异。

实施例二、血管张力实验

通过注射戊巴比妥麻醉成年雄性小鼠[FAM3A^VSMC-/-(5只)，Loxp(5只)]和SHR大鼠(5只)，取出小鼠胸主动脉及SHR大鼠肠系膜上动脉，并置于预先通过二元气30分钟的、预冷的Krebs溶液中：119mmol/L NaCl、4.7mmol/L KCl、2.5mmol/L CaCl₂、1mmol/L MgCl₂、25mmol/LNaHCO₃、1.2mmol/L KH₂PO₄和11mmol/L D-葡萄糖。清除动脉粘附的脂肪组织并切成2mm长的环段。在剥血管的过程中特别注意避免损伤内皮。小鼠的胸主动脉，在有和没有AngII(100nmol/L)的情况下孵育10分钟，而SHR大鼠的肠系膜上动脉，在有和没有KRIBB11(HSF1抑制剂，12μmol/L；Cat#S8402；Selleck)的情况下孵育6小时。将所有动脉在含有10％FBS(Gibco)、100IU青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM(Gibco，Grand Island，NY)培养基中孵育，并置于具有95％O₂+5％CO₂的CO₂孵箱中培养。将血管环悬挂在肌动描记器(MyoTechnology，丹麦奥尔胡斯)中以记录等长张力的变化。简言之，将2根钢丝(直径40μm)插入容器的内腔，并将每根导线固定到仪器的钳口上。在小室中加入5mL Krebs溶液，并在37℃(pH＝7.4)、95％O₂+5％CO₂环境下培养。将每个血管环调零后拉伸至3mN这一初始张力，然后在每个实验开始前稳定30分钟。

通过加入氯化钾(KCl，60mM)所引起的稳定且可重复的收缩，来检查血管活性。然后用Kreb液洗三次，并进行30分钟的平衡。随后，将这些动脉与累积添加的苯丙肾上腺素(10^-9至10^-5mol/L)(每种浓度各3分钟左右)一起孵育，并记录每个容器内血管在各个浓度下的血管张力。在达到最大且稳定的收缩后，通过累积添加乙酰胆碱(10^-9至10^-5mol/L)使血管发生内皮依赖性舒张。利用硝普钠(10^-9至10^-5mol/L)研究内皮非依赖性舒张。

实验结果示于图2A-2G中。

从图2A至2D可以看出，对于PE诱导的内皮依赖性或非依赖性收缩，FAM3A^VSMC-/-小鼠的胸主动脉的收缩力显著低于Loxp小鼠，而两组之间的血管舒张力没有明显差别。

从图2E可以看出，与对照组相比，KRIBB11(12μM)可抑制SHR大鼠肠系膜上动脉的血管收缩力。

从图2F可以看出，与对照组相比，KRIBB11(12μM)可改善SHR大鼠肠系膜上动脉的血管舒张功能。

从图2G可以看出，当Ach浓度为10^-8M和10^-7M时，与对照组相比，KRIBB11(12μM)可以改善SHR大鼠的血管舒张功能。由于SHR大鼠本身血管内皮有损伤，Ach在高浓度下反而诱导收缩反应。

实施例三、免疫荧光

首先用PBS灌流雄性、体重为200g的Wistar和SHR大鼠血管，然后再用4％PFA灌流，灌流完之后剥下血管，在4％PFA中于4℃固定过夜，然后转移至30％蔗糖中并在4℃下孵育直至组织下沉(3天左右)。然后将血管包埋在OCT胶(Tissue-Tek)中并冷冻切片用于染色。利用10％山羊血清封闭非特异性结合位点，封闭1小时。然后与以下抗体一起孵育：鼠抗α-SMA(1∶200，Abcam)，兔抗HSF1(1∶200，Abcam)，在4℃下过夜。第二天，用PBS洗涤三次后，将血管与第二抗体：FITC-山羊抗兔IgG(Invitrogen)和CY3-山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)在37℃下温育2小时，然后用DAPI(Invitrogen)标记细胞核。用共聚焦显微镜获得荧光图像。

实验结果示于图3A和3B中。

从图3A可以看出，SHR大鼠胸主动脉HSF1的表达水平显著高于SD大鼠。从图3B可以看出，SHR大鼠肠系膜上动脉HSF1的表达水平显著高于SD大鼠。因此，KRIBB11作为HSF1的抑制剂，可以作为治疗高血压的潜在药物。

实施例四、细胞实验

大鼠原代血管平滑肌细胞培养

从雄性SD(Sprague Dawley)大鼠中分离主动脉平滑肌细胞，并在有20％FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。培养基每周更新两次。所有实验步骤均在CO₂培养箱(37℃的温度、95％O₂+5％CO₂环境中)培养。

蛋白质印迹

使用含有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂(北京普利莱公司)的裂解缓冲液从大鼠血管和细胞中提取蛋白质。将细胞裂解物和匀浆物在4℃下以12000rpm离心10分钟。使用BCA蛋白质测定试剂盒定量上清液中的蛋白质含量。通过SDS-PAGE分离蛋白质样品并转移至硝酸纤维素膜。使用针对靶基因的一抗进行免疫印迹。与第一抗体：兔抗HSF1(1∶1000，Abcam)，或兔抗EP2(1∶1000，Abcam)，或兔抗FAM3A(1∶500，Bioss)或鼠抗PPARγ(1∶1000，Santa Cruz)或兔抗Akt、pAkt(1∶1000，Cell Signaling Technology，CST)鼠抗GAPDH(1∶1000，中杉金桥)孵育过夜后，洗涤膜并与HRP缀合的第二抗体一起温育，并使用化学发光试剂盒检测。

大鼠原代VSMCs中腺病毒过表达FAM3A

在进一步分析之前，用50MOI Ad-GFP或Ad-FAM3A感染细胞36小时。

大鼠原代VSMCs中质粒过表达HSF1

细胞应在转染前饥饿24小时。转染前1小时换液，用2μg pGFP或pHSF1(Invitrogen)转染细胞，6-8小时后，更换培养基并加入AngII(0.5μM，Cat#H-1706；Bachem；Torrance，CA，USA)，加或不加GW9662(PPARγ抑制剂，10μM，Santa Cruz)、苏拉明(P2受体抑制剂，100μM，Santa Cruz)，培养24小时后收细胞。

实验结果示于图4A-4E中。

从图4A和4B可以看出，当Ang II的浓度为0.5μM、Hcy的浓度为500μM时，FAM3A蛋白的表达水平增加最为明显。

从图4C可以看出，抑制PPARγ后，可以显著抑制HSF1对FAM3A表达的上调及对Akt的活化。

从图4D可以看出，在抑制HSF1后，Ang II促进PPARγ和FAM3A表达的上调被显著抑制。

从图4E可以看出，苏拉明处理后，HSF1对原代大鼠VSMCs增殖水平的上调被显著抑制。

实施例五、胞浆钙离子测定

将原代大鼠VSMCs(P4-P8)接种并在6孔板中传代培养(6孔板内，每个孔预先放置24×24mm盖玻片)。细胞贴壁后更换培养基，加入50MOI Ad-GFP或Ad-FAM3A 36小时，或者加入AngII处理，细胞应在加入AngII前饥饿24小时，同时加或不加苏拉明或KRIBB11处理24小时。收细胞前1小时，用PBS洗涤三次后，向每个孔中加入1μM Fura-2AM(Invitrogen)染液，并将6孔板置于CO₂培养箱中孵育30分钟。然后用台式液洗涤3次，并向每个孔中加入1ml台式液(将板用锡箔包裹以避光待测)。用奥林巴斯ix 71荧光显微镜成像，记录每秒340nM和380nM处的发光强度，及200秒内F340/F380(该比率反映细胞内基础游离钙离子水平)。

实验结果示于图5A-5C中。

从图5A可以看出，在原代大鼠VSMCs中，过表达FAM3A可以增加胞内游离钙离子含量，而苏拉明(P2受体抑制剂，100μM)可以抑制这一过程。

从图5B可以看出，在原代大鼠VSMCs中，Ang II(0.5μM)处理可以增加胞内游离钙离子含量，而苏拉明可以抑制该过程。

从图5C可以看出，在原代大鼠VSMCs中，Ang II处理可以增加胞内游离钙离子含量，而KRIBB11(HSF1抑制剂，3μM)可以抑制该过程。

为了探究FAM3A是否参与高血压的发生，本发明人构建了VSMC特异性FAM3A敲除小鼠(FAM3A^VSMC-/-)。相比于Loxp小鼠，FAM3A^VSMC-/-小鼠在基础状态下血压明显降低；用AngII包埋处理一个月后，FAM3A^VSMC-/-小鼠的血压也显著低于相同处理的Loxp小鼠(图1A-B)。血管张力实验揭示FAM3A^VSMC-/-小鼠的血管收缩功能较Loxp小鼠血管显著降低，而舒张功能无明显差别(图2A-D)。这揭示FAM3A参与了血压调节过程，其介导了AngII诱导的高血压及血管重构。

为了探索AngII和Hcy调控FAM3A表达的分子机制，本发明人选用正常大鼠原代血管平滑肌细胞进行体外实验。在分别用AngII和Hcy处理后，细胞中EP2表达显著下降，而FAM3A蛋白表达明显增加，同时Akt被显著激活(图4A-B)。

FAM3A基因启动子区有一个PPRE的结合位点，是核受体PPARγ(Peroxisomeproliferatro-activated receptor γ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的直接靶基因。前期研究表明，VSMCs增殖过程中，EP2表达增加伴随PPARγ表达下降，另外，大量研究已经证明，PPARγ与动脉粥样硬化等血管疾病具有相关性，但是PPARγ是否介入EP2对FAM3A的调节并参与VSMCs增殖和迁移调控尚待研究。

本发明人通过生物信息预测，发现在大鼠和人的PPARγ基因启动子区存在多个HSF1结合位点。免疫荧光显示(图3A-B)，SHR大鼠胸主动脉和肠系膜上动脉HSF1表达水平均明显高于对照SD大鼠，这说明HSF1可能介入了高血压的发生过程。为了进一步研究，本发明人利用HSF1抑制剂KRIBB11给SHR大鼠腹腔注射，来观察注射前后血压的情况。结果显示，连续注射七天后，与对照组(注射等量DMSO)血压相比，SHR大鼠血压明显下降，两组心率没有显著差别(图1C-E)。血管张力实验揭示，HSF1抑制剂KRIBB11可明显降低SHR大鼠的血管收缩力，同时改善血管舒张功能(图2E-G)。质粒过表达HSF1之后，FAM3A蛋白表达明显增加，同时Akt被显著激活，PPARγ的抑制剂GW9662可以抑制这一过程(图4C)；同时，质粒过表达HSF1还可促进VSMCs增殖，而P2受体抑制剂苏拉明可以抑制这一过程(图4E)。在AngII处理后，VSMCs中PPARγ和FAM3A蛋白表达水平上升，而HSF1抑制剂KRIBB11可以抑制这一过程(图4D)。以上结果说明，抑制或激活HSF1表达之后，PPARγ-FAM3A-ATP-Akt信号轴被抑制或激活。

腺病毒过表达FAM3A后，胞浆游离钙离子水平增加，P2受体抑制剂苏拉明可抑制这一过程(图5A)；AngII处理后，VSMCs胞浆游离钙离子浓度显著升高，这一过程可被P2受体抑制剂苏拉明及HSF1抑制剂KRIBB11所反转(图5B-C)。

HSF1-PPARγ-FAM3A-ATP-Akt信号轴被激活后，可增加胞浆游离钙离子水平，促进血管收缩，促进VSMCs的增殖与迁移，从而导致血管重构和高血压的发生。在糖尿病发生时，血浆中升高的AngII和Hcy，通过AngII受体途径抑制EP2表达，进而激活HSF1-PPARγ-FAM3A-Akt信号轴，刺激血管平滑肌的增殖和迁移，从而介导了高血压及血管重构的发生。在糖尿病血管病治疗时，以HSF1抑制剂KRIBB11抑制血管平滑肌中FAM3A表达并阻断其下游通路，有可能成为糖尿病高血压及血管病变的新干预策略。图6显示的机制有助于理解上述公开内容。

从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本申请的具体实施方案，但是在不偏离本申请的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进。这些变形或修改都应落入本申请所附权利要求的范围。

Claims

1.式(I)所示的化合物或其可药用盐在制备用于治疗高血压特别是糖尿病引起的高血压的药物中的用途，

其中：

2.如权利要求1所述的用途，其中R₁为被C_1-6烷基任选取代的-CH₂-或者被C_1-6烷基任选取代的-NH-。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H或C_1-6烷基。

4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中R₁为被C_1-3烷基任选取代的-CH₂-或者被C_1-3烷基任选取代的-NH-。

5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地为H或C_1-3烷基。

6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中R₂为C_1-3烷基。

7.如权利要求1至6中任一项所述的用途，其中R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀均为H。

8.如权利要求1至7中任一项所述的用途，其中R₁为-NH-，R₂为-CH₃，并且R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀均为H。

9.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的化合物或其可药用盐和药物可接受的载体，所述药物组合物用于治疗高血压，特别是糖尿病引起的高血压。