CN109750077A - 杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途 - Google Patents
杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109750077A CN109750077A CN201910036819.6A CN201910036819A CN109750077A CN 109750077 A CN109750077 A CN 109750077A CN 201910036819 A CN201910036819 A CN 201910036819A CN 109750077 A CN109750077 A CN 109750077A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- doby
- cockroach
- symbiotic effects
- antibacterial
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途，该方法包含：将从杜比亚蟑螂上分离得到的共生真菌采用PDB培养基进行发酵培养，抽滤，将菌丝和菌液分离，菌液直接采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到菌液活性次生代谢产物；具有活性次生代谢产物的杜比亚蟑螂共生真菌包含：Penicillium sp.Aspergillus sp.和Clonostachys sp.其中，所述的Penicillium sp.具有抗菌和抗氧化活性；其中，所述的Aspergillus sp.和Clonostachys sp.具有抗菌活性。本发明的方法能够通过发酵培养提取共生真菌的次生代谢产物，并测定其抗菌和抗氧化活性，以期为杜比亚蟑螂及其共生真菌的综合开发与利用提供重要的理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种共生菌次生代谢产物，具体涉及杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途。
背景技术
杜比亚蟑螂(Blaptica dubia)又名度比亚大蠊、度比亚蟑螂，属蜚蠊目(Blattaria)、蜚蠊科(Blattidae)、碧蠊属(Blaptica)软胎生昆虫，分布于中美洲、南美洲，属于卫生害虫。杜比亚蟑螂体内的蛋白质含量丰富，现多用于爬行动物和两栖动物的活体饲料，为开发潜力较大的资源昆虫之一。杜比亚蟑螂产生的几丁质、抗菌肽和壳聚糖等已用于生产医药保健品、化妆品等。
随着对昆虫体内微生物研究方法的不断改善，其体内大量的共生真菌不断被人们所知。研究发现昆虫体内微生物参与到昆虫生活的许多方面，包括昆虫的生理和进化，协助肠道消化食物，改善宿主营养，有利于种间种内通讯，抵御捕食者、病原体以及寄生虫的入侵等。
昆虫共生真菌及其产生的次生代谢产物类型丰富、结构新颖、抗性较好，是目前国内外研究的重点。Sorres等(Phytochemistry,2018,151:69-77)从白蚁的巢中分离出共生真菌Neonectria discophora SNB-CN63，发酵培养后得到的6个冬青生菌素衍生物表现出较好的抗微生物活性。Barretto等(Indian Journal of Microbiology,2018,58(2):146-158)从家蚕的肠道共生菌Staphylococcusgallinarum中分离到葡萄球菌黄素，该物质表现出良好的抗细菌、抗氧化以及抗癌活性。
目前尚未见关于杜比亚蟑螂共生真菌的研究，故有必要对于其是否存在共生真菌以及共生真菌的生物学特性进行研究。
发明内容
本发明的目的是提供杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途，该方法解决了目前尚未有对杜比亚蟑螂共生真菌的研究的问题，能够通过发酵培养提取共生真菌的次生代谢产物，并测定其抗菌和抗氧化活性，以期为杜比亚蟑螂及其共生真菌的综合开发与利用提供重要的理论依据。
为了达到上述目的，本发明提供了杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法，该方法包含：将从杜比亚蟑螂上分离得到的共生真菌采用PDB培养基菌进行发酵培养，抽滤，将菌丝和菌液分离，菌液直接采用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩，得到菌液活性次生代谢产物；具有活性次生代谢产物的杜比亚蟑螂共生真菌包含：Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Clonostachys sp.。
其中，所述的Penicillium sp.具有抗菌和抗氧化活性。
其中，所述的Aspergillus sp.和Clonostachys sp.具有抗菌活性。
优选地，所述杜比亚蟑螂离体的器官在含500μg/mL的硫酸链霉素的PDA培养基平板中于28℃恒温培养箱内暗培养，获得共生真菌，从每个菌落的边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA培养基上，连续纯化多次，得到分离纯化的共生真菌。
本发明还提供了一种所述的制备方法获得的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的用途，具有活性次生代谢产物的杜比亚蟑螂共生真菌包含：Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Clonostachys sp.；其中，所述的Penicillium sp.具有抗菌和抗氧化活性；其中，所述的Aspergillus sp.和Clonostachys sp.具有抗菌活性。
优选地，所述Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Clonostachys sp.均对大肠杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄疮痂病菌、枯草芽孢杆菌、青枯病菌、根癌土壤杆菌和溶血葡萄球菌具有抑菌作用。
本发明的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途，解决了目前尚未有对杜比亚蟑螂共生真菌的研究的问题，具有以下优点：
本发明通过分离、纯化并鉴定其中的共生真菌，通过发酵培养提取共生真菌的次生代谢产物，并测定其抗菌和抗氧化活性，以期为杜比亚蟑螂及其共生真菌的综合开发与利用提供重要的理论依据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1杜比亚蟑螂共生真菌分离
将活体杜比亚蟑螂用清水清洗20min，晾干。先用75％乙醇处理30s，再用0.2％氯化汞处理20min，而后用无菌水冲洗3次，每次5min，最后置于无菌滤纸上晾干。去除杜比亚蟑螂的翅、足和头胸部，将蟑螂的腹部剖开后放置在PDA培养基平板中(含500μg/mL的硫酸链霉素)，在28℃恒温培养箱内暗培养。待共生真菌长出后，从每个菌落的边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA培养基上，连续纯化多次，直至菌落形态均匀一致为止。将分离纯化得到的杜比亚蟑螂共生真菌依次编号为Bdf-1～Bdf-5。将纯化好的共生真菌接种到PDA斜面上，4℃保存，备用。
实验例2杜比亚蟑螂共生真菌鉴定
(1)形态学鉴定
将共生真菌菌株接种于PDA平板上，28℃恒温培养5～10d，观察、记录菌落形态并拍照，并在光学显微镜下观察菌丝形态和产孢情况，记录菌丝有无隔膜以及孢子的大小等等。
光学显微镜下观察发现，分离到的所有菌株菌丝均为有隔菌丝，在正常培养条件下均有孢子产生。
(2)分子生物学鉴定
将纯化后的菌株(在PDA平板上生长5d)接种到PDB培养基中，于28℃150rpm振荡培养6～7d，减压抽滤后获得其菌丝。用液氮将菌丝充分研磨至粉末状，采用试剂盒法(上海生工DNA抽提取试剂盒)提取其DNA。
使用真菌通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增其ITS序列。
PCR反应体系(50μL)：2×Taq PCR MasterMix(含染料)25μL，ITS4(10μmol/L)1μL，ITS5(10μmol/L)1μL，DNA模板(10ng/μL)2μL；双蒸水21μL，混匀。
扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min 20s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
所得序列使用DNAMAN软件进行互补拼接，将正向与反向引物互补序列两端加上引物序列拼接成完整序列。
将扩增所得的rDNA-ITS序列在NCBI网站上进行Blast，在GeneBank数据库中进行同源性检索。Bdf-1为Penicillium sp.(GenBank登录号：MH681591)，Bdf-2为Aspergillussp.(GenBank登录号：MH681592)，Bdf-3为Aspergillus sp.(GenBank登录号：MH681593)，Bdf-4为Clonostachys sp.(GenBank登录号：MH681594)，Bdf-5为Aspergillus sp.(GenBank登录号：MH681595)，所有菌株均为已知菌株。
表1 本发明的杜比亚蟑螂共生真菌的鉴定表
实验例3杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备
采用PDB培养基对分离鉴定后的共生真菌进行发酵培养，通过减压抽滤分别得到菌丝和菌液。菌丝经乙酸乙酯冷浸提取3次，每次7d，菌液直接采用乙酸乙酯萃取3次，分别将提取液和萃取液减压浓缩，得到菌丝和菌液次生代谢产物，4℃保存备用。
实验例4杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物抗细菌活性的测定
采用薄层层析(TLC)-噻唑蓝(MTT)-生物自显影法测定共生真菌次生代谢产物对不同供试细菌的抑制活性。
供试细菌：大肠杆菌(Escherichia coli，G-)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonaslachrymans，G-)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria，G-)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，G+)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum，G-)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens，G-)和溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus，G+)。
将菌丝或菌液次生代谢产物用丙酮溶解，在薄层层析板上用0.5mm直径的毛细管点样，点样量为5μL。采用二氯甲烷和甲醇的混合溶液作为展开剂进行薄层层析，浓度为0.2mg/mL的硫酸链霉素作为阳性对照。向灭菌的LB半固体培养基中加入菌液(45mL LB+5mL菌液)，调其浓度约为108CFU/mL，振荡、均匀。用喷样器将菌液均匀快速地喷洒到硅胶板上，待培养基冷却凝固后，将硅胶板置于培养皿中于4℃冰箱中放置4h，以利于抗菌成分的扩散；再将硅胶板置于28℃下保湿培养，12h后取出硅胶板，均匀喷洒0.5mg/mL的MTT，静待几分钟后可观察实验结果。
有抗菌活性成分处，供试细菌由于受到活性成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试细菌正常生长，MTT显色后显蓝色。通过抑菌斑的迁移率来初步评价样品中抗菌化合物的极性，根据抑菌斑的大小和多少来初步评价活性化合物的抑菌活性和数量，如下表2所示，为本发明的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物抗细菌活性结果表。
表2 本发明的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物抗细菌活性结果表
注：展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1(v/v)，显色剂为5％MTT溶液。“--”表明无抑菌斑；“+”表明抑菌斑的最大直径d＝0-5mm，“++”表明d＝5-10mm，“+++”表明d≥10mm。
结果表明，5种共生真菌菌液和菌丝提取物均表现出一定的抗菌活性，但同一提取物对不同供试细菌的抑制活性存在一定的差异。其中，Bdf-1菌丝提取物对黄瓜角斑病菌未表现出抑制活性，而Bdf-3菌丝提取物对枯草芽孢杆菌未表现出抑制活性。所有菌株菌液提取物抑菌斑的Rf值(抑菌斑的迁移率)范围明显大于菌丝提取物，说明菌液中含有更多的抗菌活性化合物。
Rf值主要与化合物的极性有关，Rf值越小，化合物极性越大，Bdf-1、Bdf-3和Bdf-4菌液提取物Rf值在0.0～0.5之间均有分布，说明三株菌的菌液中具有抗菌活性的次生代谢产物其极性为中等偏大。Bdf-1和Bdf-3菌丝提取物Rf值主要分布在0.35-0.60之间，说明两菌的菌丝中具有抗菌活性的物质主要为中等极性的次生代谢产物，而Bdf-4菌丝提取物Rf值主要分布在0.0-0.12之间，说明抗菌活性物质的极性偏大。Bdf-2和Bdf-5菌液提取物抑菌斑的Rf值范围完全覆盖菌丝提取物，说明菌液提取物中具有抑菌活性的次生代谢产物更为丰富。从抑菌斑的最大直径来看，Bdf-4和Bdf-5菌液提取物对所有供试细菌的抑菌斑最大直径均超过10mm，而菌丝提取物要明显弱于菌液，抑菌斑最大直径一般在5-10mm之间，其中Bdf-4菌丝提取物对黄瓜角斑病菌和大肠杆菌抑菌斑的最大直径要大于10mm。除黄瓜角斑病菌外，Bdf-2菌液提取物对其他供试细菌的抑菌斑的最大直径也超过10mm，菌丝提取物弱于菌液提取物。Bdf-1和Bdf-3对不同供试细菌的抑制活性要弱于Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5，但也表现一定的抗菌活性，抑菌斑的最大直径多集中于5-10mm之间。
实施例5杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物抗氧化活性的测定
采用多孔板-DPPH显色法测定共生真菌次生代谢产物对DPPH的清除率，以IC50值来表示内生真菌次生代谢产物的抗氧化能力。
精密称取DPPH 20.0mg溶于100mL无水乙醇中，振荡摇匀，使其终浓度为0.2mg/mL。阳性对照BHT和各提取物的初始浓度为10.0mg/mL，而后用DMSO依次对半稀释成浓度为5mg/mL～0.0390625mg/mL的溶液。向96微孔板中加入80μL浓度为0.2mg/mL的DPPH无水乙醇溶液，而后加入20μL系列浓度的待测样品溶液或阳性对照溶液，震荡摇匀。在37℃下水浴30min，517nm下测定吸光值。以20μL DMSO溶液代替样品溶液作为空白对照，每个处理3个重复，供试样品对DPPH清除率的有效中浓度(IC50)计算公式如下：
所得数据采用Excel软件进行作图分析，供试样品浓度取对数(X)，清除率换算成机率值(Y)，初步求得抗氧化活性的回归方程(Y＝aX+b)和IC50值。
采用DPPH法测定了5株杜比亚蟑螂共生真菌菌液和菌丝提取物的抗氧化活性，如表3所示，为本发明杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物抗氧化活性结果表。结果表明，Bdf-4和Bdf-5菌液和菌丝提取物在供试浓度下均未表现出任何抗氧化活性。Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3的菌液提取物均表现出明显的抗氧化活性，IC50值分别为0.26±0.01mg/mL、2.20±0.99mg/mL和0.75±0.16mg/mL；而菌丝提取物的IC50值均大于5mg/mL。说明Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3中具有抗氧化活性的次生代谢产物主要分布于菌液中。
表3 本发明杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物抗氧化活性结果表
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (4)
1.杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法，其特征在于，该方法包含：
将从杜比亚蟑螂上分离得到的共生真菌采用PDB培养基菌进行发酵培养，抽滤，将菌丝和菌液分离，菌液直接采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到菌液活性次生代谢产物；
具有活性次生代谢产物的杜比亚蟑螂共生真菌包含：Penicillium sp.、Aspergillussp.和Clonostachys sp.；
其中，所述的Penicillium sp.具有抗菌和抗氧化活性；
其中，所述的Aspergillus sp.和Clonostachys sp.具有抗菌活性。
2.根据权利要求1所述的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法，其特征在于，所述杜比亚蟑螂离体的器官在含500μg/mL的硫酸链霉素的PDA培养基平板中于28℃恒温培养箱内暗培养，获得共生真菌，从每个菌落的边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA培养基上，连续纯化多次，得到分离纯化的共生真菌。
3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法获得的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的用途，其特征在于，具有活性次生代谢产物的杜比亚蟑螂共生真菌包含：Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Clonostachys sp.；其中，所述的Penicillium sp.具有抗菌和抗氧化活性；其中，所述的Aspergillus sp.和Clonostachys sp.具有抗菌活性。
4.根据权利要求3所述的杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法，其特征在于，所述Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Clonostachys sp.均对大肠杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄疮痂病菌、枯草芽孢杆菌、青枯病菌、根癌土壤杆菌和溶血葡萄球菌具有抑菌作用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910036819.6A CN109750077A (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910036819.6A CN109750077A (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109750077A true CN109750077A (zh) | 2019-05-14 |
Family
ID=66405754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910036819.6A Pending CN109750077A (zh) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109750077A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110283053A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-09-27 | 华南农业大学 | 一种共生真菌单体化合物快速分离制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110207604A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Marrone Bio Innovations | Isolated bacterial strain of the genus burkholderia and pesticidal metabolites therefrom |
| CN103787953A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-14 | 杭州维康科技有限公司 | 化合物Aspochalasin V及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-01-15 CN CN201910036819.6A patent/CN109750077A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110207604A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Marrone Bio Innovations | Isolated bacterial strain of the genus burkholderia and pesticidal metabolites therefrom |
| CN103261398A (zh) * | 2010-02-25 | 2013-08-21 | 马罗内生物创新公司 | 伯克霍尔德氏菌属的分离细菌菌株及其农药代谢物 |
| CN103787953A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-14 | 杭州维康科技有限公司 | 化合物Aspochalasin V及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAMID KASSIRI等: "Pathogenic Fungal Species Associated with Digestive System of Periplaneta americana (Blattaria: Blattidae) Trapped from Residential Dwellings in Ahvaz City, Southwestern Iran", 《J ARTHROPOD-BORNE DIS.》 * |
| 赵斌: "蜚蠊共生菌Aspergillus sp.次级代谢产物及其功能的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110283053A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-09-27 | 华南农业大学 | 一种共生真菌单体化合物快速分离制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11459593B2 (en) | Dendrobium officinale endophytic fungus strain and extracellular polysaccharide produced thereby, and extraction method and application of extracellular polysaccharide | |
| Ferreira et al. | Molecular phylogeny, diversity, symbiosis and discover of bioactive compounds of endophytic fungi associated with the medicinal Amazonian plant Carapa guianensis Aublet (Meliaceae) | |
| Shi et al. | Isolation, characterization, and insecticidal activity of an endophyte of drunken horse grass, Achnatherum inebrians | |
| Gupta et al. | Isolation, characterization and identification of endophytic bacteria by 16S rRNA partial sequencing technique from roots and leaves of Prosopis cineraria plant | |
| CN115637235B (zh) | 具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用 | |
| CN101481670A (zh) | 具有溶藻活性铜绿假单胞菌及在蓝藻水华控制中的应用 | |
| Razia et al. | Morphological, pathological, biochemical and molecular characterization of Ralstonia solanacearum isolates in Bangladesh | |
| CN109280676A (zh) | 一种木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的制备方法和用途 | |
| Zhao et al. | Role of iturin from Bacillus velezensis DMW1 in suppressing growth and pathogenicity of Plectosphaerella cucumerina in tomato by reshaping the rhizosphere microbial communities | |
| CN106434372B (zh) | 珊瑚来源真菌土曲霉菌株c21-10的应用 | |
| Zheng et al. | Screening of core microorganisms in healthy and diseased peaches and effect evaluation of biocontrol bacteria (Burkholderia sp.) | |
| CN116426394B (zh) | 一种玉龙杓兰共生真菌及应用 | |
| Wang et al. | Culture separation, identification and unique anti-pathogenic fungi capacity of endophytic fungi from Gucheng Salvia miltiorrhiza | |
| CN109750077A (zh) | 杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的制备方法及用途 | |
| CN103232940A (zh) | 淡色生赤壳菌Bo-1菌株及其培养物和在拮抗病原细菌中的应用 | |
| CN113564074B (zh) | 一株粘细菌及其在制备抑菌药物中的应用 | |
| CN113604376B (zh) | 一株甘蔗内生枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN101270340A (zh) | 一种产挥发油的滇重楼内生毕赤酵母及其抗菌活性 | |
| CN106701602A (zh) | 一株厚垣镰刀菌及其应用 | |
| CN106635839A (zh) | 一种从土壤中分离长喙壳菌的方法 | |
| CN109400444A (zh) | 抑制植物病源真菌的倍半萜类化合物及其制备方法 | |
| CN104893986B (zh) | 蜻蜓肠道菌土曲霉qt122及其代谢产物和应用 | |
| CN108635490A (zh) | 紫花玉簪内生真菌代谢产物、医用生物活性及其应用 | |
| CN101270338A (zh) | 一种产挥发油的滇重楼内生粘鞭霉及其抗菌活性 | |
| CN109971655B (zh) | 一株黄芪内生球毛壳菌（Chaetomium sp.）HQ-1及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190514 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |