CN109749981B - 人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞的方法以及得到的肝细胞样细胞群。所述方法包括在特定的诱导分化步骤中利用特定的细胞因子组合，从而能够自人源脂肪干细胞中得到高度成熟的肝细胞样细胞，进而用于急性肝衰竭的治疗。

Description

人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细胞(Human-Adipose Derived Stem Cell，hADSC)来源的肝细胞样细胞(Hepatocyte likecell，HLC)及其制备方法和在治疗急性肝衰竭等疾病中的应用。

背景技术

肝功能衰竭(Liver failure)严重威胁人类健康。原位肝移植是目前最好的治疗手段，但治疗费用高且受肝源限制；干细胞具有强大的自我更新能力和跨胚层的多向分化潜能，已成为急性肝衰竭等肝脏疾病治疗的热点。

已证实人间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，hMSC)可通过在培养体系中添加数种细胞因子的组合被诱导分化为肝细胞样细胞(Hepatocyte like cell，HLC)，hMSC来源广泛，有望用于急性肝衰竭(Acuteliver failure，ALF)等重症肝病的治疗。然而，不同组织来源的干细胞的肝向分化能力并不一致，何种组织来源的干细胞更易于向肝细胞分化，分化后更有利于肝衰竭的治疗尚属未知。此外，如何将特定组织来源的干细胞经肝向分化为成熟度高、能够用于急性肝衰竭治疗的肝细胞样细胞也未知。

因此，本领域急需能够从特定组织来源的干细胞经肝向分化得到成熟度高，可以用于急性肝衰竭治疗的肝细胞样细胞的方法以及这样的肝细胞样细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝细胞样细胞，所述的肝细胞样细胞具备成熟度高等优点，从而能够用于治疗急性肝衰竭。

本发明的还有一目的在于提供自特定组织来源的干细胞经肝向分化得到成熟度高，可以用于急性肝衰竭治疗的肝细胞样细胞的方法。

在第一方面，本发明提供一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用含Activin A的培养基培养人源脂肪干细胞；

2)利用肝分化培养基诱导步骤(1)所得的经培养的人源脂肪干细胞分化成肝细胞样细胞；和

3)利用肝成熟培养基使得步骤(2)所得的肝细胞样细胞成熟，从而得到高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞；

其中，所述肝分化培养基包含一种或多种以下成分：

HGF、EGF、IGF、FGF4、胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠添加剂、地塞米松、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、任选的DMEM-F12培养基；

所述肝成熟培养基包含一种或多种以下成分：

HGF、EGF、IGF、FGF4、ITS、地塞米松、尼克酰胺、抑瘤素M(OSM)、BSA、青霉素-链霉素溶液、任选的DMEM-F12培养基。

在具体的实施方式中，所述步骤1)进行18-30小时，优选22-26小时，最优选24小时；所述步骤2)进行5-9天，优选6-8天，最优选7天；所述步骤3)进行5-9天，优选6-8天，最优选7天。

在优选的实施方式中，在步骤1)之前利用DNA甲基化酶抑制剂预处理人源脂肪干细胞。

在优选的实施方式中，所述DNA甲基化酶抑制剂包括但不限于5-氮杂胞苷。

在优选的实施方式中，所述DNA甲基化酶抑制剂进行预处理的剂量为10ug/L，时间为24小时。

在具体的实施方式中，得到高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞具备以下一种或多种特征：

1)有40％以上，优选50％以上，最优选60％以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4mRNA的表达增加30％以上，优选50％以上，最优选70％以上；

2)有20％以上，优选50％以上，最优选75％以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加10％以上，优选20％以上，最优选30％以上；

3)有10％以上，优选30％以上，最优选60％以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4)有5％以上，优选20％以上，最优选30％以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和

5)与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加10％以上，优选20％以上，最优选30％以上。

在优选的实施方式中，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，在中央静脉周围出现较多人Alb抗体阳性细胞。

在优选的实施方式中，本发明的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子如IL-1ra、IL-13等升高20％以上，优选100％以上，最优选300％以上。

在具体的实施方式中，每100个初始人源脂肪干细胞得到约40个以上，优选约50个以上，最优选约50-60个高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞。

在第二方面，本发明提供一种高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述肝细胞样细胞群体具备以下一种或多种特征：

1)有40％以上，优选50％以上，最优选60％以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4mRNA的表达增加30％以上，优选50％以上，最优选70％以上；

2)有20％以上，优选50％以上，最优选75％以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加10％以上，优选20％以上，最优选30％以上；

3)有10％以上，优选30％以上，最优选60％以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4)有5％以上，优选20％以上，最优选30％以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和；

5)与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加10％以上，优选20％以上，最优选30％以上。

在优选的实施方式中，所述的肝细胞样细胞群体在移植后第1天，在中央静脉周围出现较多人Alb抗体阳性细胞。

在优选的实施方式中，本发明的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子如IL-1ra、IL-13等升高20％以上，优选100％以上，最优选300％以上。

在具体的实施方式中，所述肝细胞样细胞通过第一方面所述的方法制备。

在第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第二方面所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体或通过第一方面所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞，以及任选的药学上可接受的载体。

在第四方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒装有第二方面所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，或通过第一方面所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞，或权利要求7所述的药物组合物，以及任选的所述试剂盒的使用说明书。

在第五方面，本发明提供第二方面所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体或通过第一方面所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等。

在具体的实施方式中，所述疾病是急性肝衰竭。

在第六方面，本发明提供一种疾病的治疗方法，所述方法包括利用第二方面所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，或通过第一方面所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞，或第四方面所述的试剂盒来治疗有此需要的对象的步骤，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等。

在优选的实施方式中，所述疾病是急性肝衰竭。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了hASC和hUCMSC的形态和鉴定结果；

图2显示了hASC和hUCMSC分化前后的肝细胞特异mRNA检测；

图3显示了细胞免疫荧光检测hASC向HLC分化过程中Alb和AFP表达情况；

图4显示了细胞免疫荧光检测hUCMSC向HLC分化过程中Alb和AFP表达情况；

图5显示了对hASC诱导组和hUCMSC诱导组细胞进行功能鉴定的结果；

图6显示了hASC和hUCMSC来源的HLC治疗ALF大鼠的肝功能指标检测结果；

图7显示了免疫组化染色提示hASC和hASC-HLC向肝组织迁移能力更强；

图8显示Ki67染色和Tunnel试验提示hASC、hASC-HLC对损伤肝组织具有更强的再生促进作用和凋亡抑制作用；

图9显示蛋白芯片检测移植后第1天大鼠血清中炎症因子和趋化因子的水平；

图10显示蛋白芯片检测移植后第7天大鼠血清中炎症因子和趋化因子的水平。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，在体外分离得到hASC和hUCMSC，使用Activin A(活化素A)、HGF、EGF、FGF4等多种细胞因子在体外诱导这两种干细胞分化为肝细胞，通过荧光定量PCR、细胞免疫荧光、糖原PAS染色、ICG摄取实验等探讨两种组织来源的干细胞肝向分化能力的差异；并使用分化前后的两种干细胞分别治疗D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝衰竭大鼠，观察它们对大鼠生存情况和肝功能重建的影响。

本发明人出乎意料地发现在特定的诱导分化步骤中利用特定的细胞因子组合能够从人源脂肪干细胞中得到高度成熟的肝细胞样细胞，从而可以用于急性肝衰竭的治疗。在此基础上完成了本发明。

人源脂肪干细胞

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为间质类细胞，如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。

近年来，多潜能人源脂肪干细胞(hADSC)已成为治疗人类一些严重疾病，如脊髓损伤、脑卒中、急性肝衰竭等的很好的细胞来源。

为了举例和方便的目的，本发明的实施例部分从人体抽脂术得到的脂肪组织中分离人源脂肪干细胞(hADSC)。但本领域公知，可以通过各种来源，包括但不限于商业来源获得人源脂肪干细胞(hADSC)。

肝衰竭与脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿。临床上可出现凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等系列症状。肝衰竭的治疗是国际性的难题，目前的手段均不能有效治愈，干细胞技术的出现为肝衰竭的治疗提供了另一种解决方案。

干细胞几乎存在于所有组织中，本发明人先后从人脂肪、脐血、脐带、胎盘中分离得到成体干细胞，并在急性肝衰竭大鼠模型中通过股静脉、脾脏注射等多种途径进行hASC移植，发现hASC有助于大鼠生存率的提高和肝功能的恢复[1]；然而，hASC移植后7天未表达肝细胞相关蛋白如Alb，推测其短时间内并未发挥“细胞替代作用”。通过进一步研究，发现其主要作用机制可能为hASC旁分泌作用介导的肝细胞再生[2]。但肝衰竭的治疗争分夺秒，这种“细胞替代作用”更为重要。因此，在体外直接操纵hASC向肝细胞转分化并用于肝衰竭大鼠治疗，人为缩短hASC在体内转分化时间，使其直接发挥“肝细胞替代作用”，极可能进一步提高hASC治疗肝衰竭的疗效。

胚胎干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞均可在体外被诱导分化为HLC。其中，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞更易获得、伦理问题更少。然而，体外培养条件难以模拟体内细胞所处的复杂微环境，通过国际上现有的肝向分化体系难以获得功能完全成熟的肝细胞。

本发明人创造性地采用三阶段诱导法(启动期、分化期、成熟期)结合特定的细胞因子(包括aFGF、bFGF、FGF-4、HGF、EGF、IGF和OSM等)的组合诱导hASC向HLC分化。探索了一系列细胞因子在hASC向HLC定向分化过程中的作用，发现在分化期利用FGF-4和HGF能诱导hASC向HLC分化(但效率不高)。除了HGF和FGF-4，本发明人联用EGF、ITS、OSM等因子，在诱导第3天，部分细胞即出现形态学的改变，在诱导第11天，类圆形细胞进一步增多，经鉴定其具有蛋白分泌、糖原合成、尿素合成和ICG摄取排泄等肝细胞的功能。采用本发明的方法，每100个初始人源脂肪干细胞可以得到40个以上，优选50个以上，最优选50-60个高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞。

考虑到干细胞的组织异源性，本发明人检验了各组织来源干细胞的肝向分化能力。本发明人模拟肝脏体内发育过程，运用分步诱导策略同时诱导hASC和hUCMSC向HLC分化，通过对肝细胞特异mRNA的检测发现hASC比hUCMSC更容易被诱导分化为HLC，在同样的体外分化条件下，hASC表达更高的Alb、HNF1α、HNF4α、CYP3A4等肝细胞相关基因和蛋白，CYP450酶的表达是目前国际上比较公认的HLC功能成熟标准；细胞免疫荧光检测也提示hASC合成更多Alb。在随后的动物实验中，hASC来源的HLC更显著的提高了肝衰竭大鼠的生存率并促进其肝功能的恢复；通过细胞增殖抗原Ki67染色和Tunnel试验，我们发现hASCs和hASCs-HLC对损伤肝组织的再生促进作用强于hUCMSC和hUCMSCs-HLC，且能明显抑制肝细胞凋亡。值得一提的是，大鼠血清的蛋白芯片检测提示，和hASC-HLC治疗组相比，hASC治疗组似乎发挥了更高效的抑炎作用。

进一步地，本发明人发现使用DNA甲基化酶抑制剂，5-氮杂胞苷预处理hASC时，如果严格控制5-氮杂胞苷的剂量和作用时间，hASC向HLC分化的时间明显缩短，推测5-氮杂胞苷可能通过抑制DNA甲基化酶促进DNA去甲基化，上调肝细胞相关转录因子如HNF1和HNF4表达从而促进hASC的肝向分化。横向分化可能是其另外一个机制，在MSCs肝向分化的过程中发生了间质向上皮转化(MET)，是上皮向间质转化(EMT)的相反过程。

本研究中我们发现脂肪组织来源的hASC比脐带华通胶来源的hUCMSC具有更强的肝向分化能力和更好的疗效，更适合急性肝衰竭等肝脏疾病的治疗。鉴于目前hASC肝向分化过程中分子调控网络尚未明确，如何寻找该调控网络的关键因子，通过对其中关键因子进行干预，进一步提高hASC的分化效率并促进HLC的功能成熟，这是未来干细胞分化研究的主要方向。然而，在现阶段，寻求更合适的干细胞来源对于目前尚缺乏有效肝向分化策略的现况可能具有更高的临床价值。

本发明的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群的用途

本领域技术人员鉴于本发明的教导可以明白，本发明所得的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群可用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等。

药物组合物及其应用

在本发明的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群的基础上，本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的本发明人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群，以及药学上可接受的载体。

通常，可将本发明人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8；较佳地，pH约为7-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群的有效量可随给药的模式和待治疗疾病的严重程度等具体选择。例如，可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂与及静脉注射试剂同时使用。在另一优选例中，所述皮下注射试剂的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群的浓度为10⁷个/ml，较佳地为10⁸个/ml，更佳地为10⁹个/ml。

在本发明中，给所需要的对象施用人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群的施用部位是在所述对象的损伤区作原位注射或者进行静脉注射。

本发明的主要优点包括：

1.本发明开发了一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群的方法，从而能得到成熟程度高于现有技术所得的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群；

2.本发明方法操作简便易行；和

3.本发明的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群的成熟度更高，从而更易用于临床治疗，例如急性肝衰竭等疾病。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料和方法

1.hASC的分离、培养

取年轻健康人体抽脂术后的脂肪组织(由同济大学第十人民医院提供)，PBS液冲洗3遍后剪碎成约1mm3的小块,加入0.1％|型胶原酶(Gibco，17100-017)消化30min。配制完全培养基：500ml DMEM-F12培养基(WISENT INC.，319-075-CL)，10％FBS(Gibco，10099-141)，10ng/ml bFGF(Sino Biological Inc.，10014-HNAE)，加等体积完全培养基终止消化，1000rpm离心10min。重悬细胞，100μm滤网过滤后按1X106/ml接种于T25细胞培养瓶中,置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养,48小时后换液。观察细胞至80％融合时,0.25％胰酶(Gibco，25200-056)消化,按1：3传代培养。显微镜下观察P0、P5、P10、P15代细胞形态。

2.hUCMSC分离、培养

取年轻健康产妇剖宫产术后的脐带(由同济大学第十人民医院提供)，用镊子剥离得到华通胶，75％酒精浸泡2min，PBS液冲洗3遍后剪碎成约1mm3的小块，加入0.2％|型胶原酶、0.2％Ⅳ型胶原酶(Gibco)、0.1％胰酶(Gibco，27250-018)、0.1％透明质酸酶(BeijingBiodee Biotechnology，9004-61-9)、15IU/ml DNA酶(Beijing Biodee Biotechnology，R0110)消化4h。加等体积完全培养基终止消化，1000rpm离心10min。使用完全培养基重悬细胞，100μm滤网过滤后按1×106/ml接种于T25细胞培养瓶中，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱培养，48小时后换液。观察细胞至80％融合时，0.25％胰酶消化，按1：3传代培养。显微镜下观察P0、P5、P10、P15代细胞形态。

3.流式细胞术检测hASCs和hUCMSCs表面分子标记

分别取P4代hASC和hUCMSC加0.25％胰酶消化后制成500ul单细胞悬液。分别加入人间充质干细胞分析试剂盒(BD，562245)中的CD90-FITC、CD44-PE、CD73-APC、CD105-PerCP-CP5.5抗体各5μl，冰上孵育30min，1000rpm离心10min，PBS冲洗三遍后流式细胞仪(BD FACSVerse)检测。

4.成脂成骨分化

1)成脂诱导分化：将细胞以1×10⁴/ml的密度接种于24孔板内，观察细胞至80％融合时，使用成脂基础培养基(R&D，CCM007)和成脂培养添加物(R&D，390415)，诱导分化2周，油红O溶液(Beijing Solarbio Science&Technology Co.，Ltd，G1260)染色观察。

2)成骨诱导分化：将细胞以1×10⁴/ml的密度接种于24孔板内，观察细胞至50％融合时，使用成骨基础培养基(R&D，CCM007)和成骨培养添加物(R&D，390416)，诱导分化2周，茜红素(sigma)染色观察。

5.肝向分化

分别将hASC和hUCMSC以1×10⁴/ml的密度接种于10cm dish，观察细胞至50％融合时，加入含100ng/ml Activin A(Shanghai ExCell Biology,Inc.，CB031-0033)的完全培养基，次日改用肝分化培养基诱导1周：100ng/ml HGF(Sino Biological Inc.，10463-HNAS)、20ng/ml EGF(R&D，236-EG-200)、20ng/ml IGF(R&D，291-G1-200)、20ng/ml FGF4(Shanghai ExCell Biology,Inc.，CB055-0343)、10μg/ml Insulin-Transferrin-SodiumSelenite Supplement(胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠添加剂，Roche，11074547001)、1μM地塞米松(sigma，D4902-25MG)、2mg/ml胎牛血清(BSA,EMB Millipore Corp.，126575-10GM)、1％Penicillin Streptomycin(Gibco，15070-063)、DMEM-F12培养基；之后改用肝成熟培养基1周：40ng/ml HGF、20ng/ml EGF、20ng/ml IGF、20ng/ml FGF4、10μg/ml ITS、1μM地塞米松、1mM尼克酰胺(Sigma，N0636-100G)、20ng/ml OSM(Sino Biological Inc.，10452-HNAH)、2mg/ml BSA、1％双抗、DMEM-F12培养基。

6.荧光定量PCR

分别将hASCs和hUCMSCs细胞以1×10⁴/ml的密度接种于10cm dish内，分别于诱导前、诱导后第7、15天使用Trizol(Invitrogen,15596-026)提取细胞RNA，使用RT-PCR试剂盒(Fermentas，K1622)逆转录成cDNA，实时荧光定量PCR检测ALB、AFP、CK18、GATA4、HNF1α、HNF4α、CYP2B6、CYP3A4mRNA的表达。PCR反应条件为：95℃2min,95℃10min，95℃30sec，60℃30sec，40cycles。软件自动分析并绘制PCR产物溶解曲线。最终数据以2-△△Ct进行分析。引物见表1。

表1.肝细胞相关基因引物

7.细胞免疫荧光

分别将hASC和hUCMSC细胞以1×10⁴/ml的密度接种于24孔板内，分别于诱导前、诱导后第3、7、11、15天，4％多聚甲醛固定细胞，Triton X 100封闭细胞,分别加入人白蛋白抗体(R&D，MAB1455)和人甲胎蛋白抗体(R&D，MAB13691)1μl/孔，4度过夜，加入小鼠二抗(R&D，NL007)1μl/孔，避光孵育后抗荧光衰减封片剂(Beijing Solarbio Science&TechnologyCo.，Ltd，S2100)封片，荧光显微镜(Nikon，Ti-S，eclipse)下观察细胞中ALB和AFP蛋白的表达情况。

8.PAS染色检测肝样细胞糖原合成功能

分别将hASC和hUCMSC细胞以1×10⁴/ml的密度接种于24孔板内，分别于诱导前、诱导后第7、15天，4％多聚甲醛固定细胞，使用糖原PAS染色液(Beijing Solarbio Science&Technology Co.，Ltd，G1281)行糖原染色，显微镜(Nikon，Ti-S，eclipse)下观察。

9.肝样细胞摄取ICG试验

分别将hASC和hUCMSC细胞以1×10⁴/ml的密度接种于24孔板内，分别于诱导前、诱导后第7、15天加入200ul 1mg/ml吲哚菁绿，30min后显微镜(Nikon，Ti-S，eclipse)下观察。

10.ELISA检测

分别将hASC和hUCMSC细胞以1×10⁴/ml的密度接种于24孔板内，分别于诱导前、诱导后第7、15天取各组培养上清液，按人白蛋白ELISA Kit(Abcam，ab108788)和人甲胎蛋白ELISA Kit(Abcam，ab108838)说明进行操作，在450nm波长下测量吸光度，根据标准曲线计算培养基上清中ALB和AFP蛋白的浓度。分别于诱导前、诱导后第7、15天加入NH4Cl，24h后取各组培养上清液，按人尿素ELISA Kit(Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co.,Ltd.,ML07367)说明进行操作，在450nm波长下测量吸光度，根据标准曲线计算培养基上清中Urea的浓度。

11.急性肝衰竭模型

健康雄性SPF级SD大鼠75只(上海斯莱克实验动物有限公司提供，【许可证号：SCXK(沪)2007-0005】)，6～8周龄，体重150～180g左右。以1g/kg体重D-gal给药剂量向大鼠腹腔内注射D-氨基半乳糖，注射2次，间隔12h[3]。

12.股静脉移植

75只急性肝衰竭模型大鼠随机分为5组，每组各15只。大鼠急性肝衰竭模型建立后第二天，于超净台取大鼠右侧腹股沟行横行切口，使用一次性1ml注射器，经股静脉5组分别注入500ul PBS、500ul hASC、500ul肝向分化第15天的hASC(hASC-HLC)、500ul hUCMSC、500ul肝向分化第15天的(hUCMSC-HLC)，细胞数均为2～5×10⁶个。注射后75％酒精棉球压迫止血，缝合伤口，手术操作过程严格遵守无菌操作原则。统计两组大鼠生存率。分别于造模后1天、移植后1天、7天断尾取血，全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALB、DB、LDH、ALP、γ-GT水平。

13.免疫组化

分别于移植后1天、7天采用免疫组化方法检测大鼠肝组织中ALB的表达情况，使用人白蛋白抗体(Abcam，ab137885)和人甲胎蛋白抗体(Abcam，ab133617)。

14.Ki67染色

取细胞治疗后肝脏组织制作石蜡切片，脱蜡，置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。加入过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。滴加用5％BSA，以1:300比例稀释好的Ki-67抗体(Novusbio，NB500-170)覆盖组织。切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。次日置切片于PBS中脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，加入兔二抗(R&D，NL004)，荧光显微镜(Nikon，80i，eclipse)下观察。

15.Tunnel检测

使用原位细胞凋亡试剂盒(Roche，11684817910)。取细胞治疗后肝脏组织制作石蜡切片，脱蜡、水合、细胞通透后加TUNEL反应液，加converter-POD，与底物DAB反应显色，荧光显微镜(Nikon，80i，eclipse)下观察。

15.蛋白芯片高通量定性分析

蛋白芯片高通量定性分析大鼠组织中细胞因子、趋化因子等相对表达水平：分别于移植后1天、7天采用大鼠细胞因子蛋白芯片(R&D，ARY008)蛋白芯片高通量定性分析大鼠血清中IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CCL3、CCL5、CCL20、CINC-1、CINC-2α/β、CINC-3、CNTF、CX3CL1、CXCL7、CXCL9、CXCL10、LECAM-1、LIX、sICAM-1、TIMP-1、VEGF的表达情况。凝胶成像仪(GE，LAS4000mini)拍照并使用HLImage软件分析Mean Pixel Density。

16.统计学分析

结果用均数±标准差(X±SD)表示。生存分析采用Kaplan-Meier analysis，采用SPSS22.0统计软件分析。

实施例1.hASC和hUCMSC的形态和鉴定

根据“材料与方法”所述进行hASC和hUCMSC的形态鉴定。

结果为：hASC和hUCMSC原代接种后三天可见细胞集落形成，集落内细胞呈长梭形，大小均一，排列紧密呈放射状生长；P5、P10、P15代细胞形态和增殖速度均无明显改变(见图1A)。流式细胞仪检测P3代hASC和hUCMSC：CD90、CD44、CD73、CD105均呈阳性表达，而CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR呈阴性表达(见图1B)。hASC和hUCMSC成脂诱导两周后，油红O染色可见hASC细胞浆内有大量透亮的、折光性好的红色脂滴，而hUCMSCs细胞浆内仅见少量细小红染颗粒；hASCs和hUCMSCs成骨诱导两周后，茜素红染色可见大部分细胞红染(见图1C)。

实施例2.hASC和hUCMSC向肝细胞分化

根据“材料与方法”所述进行hASC和hUCMSC的肝向分化。

结果为：荧光定量PCR结果显示hASC诱导组与hUCMSC诱导组相比，ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4mRNA表达均明显增强，且表达量随诱导时间延长而增加(见图2)。

实施例3.Alb和AFP细胞免疫荧光观察

根据“材料与方法”所述检测hASC诱导组细胞和hUCMSC诱导组细胞的Alb和AFP表达量。

结果为：hASCs诱导组中，Alb和AFP表达量随诱导时间延长而增加，第11天时Alb表达量明显增加(如图3所示)。而hUCMSC诱导组中，ALB和AFP表达量增加不明显(如图4所示)。

实施例4.功能学鉴定

根据“材料与方法”所述检测hASC诱导组细胞和hUCMSC诱导组细胞的糖原储存、ICG摄取和蛋白合成情况。

结果为：

1)糖原储存水平：诱导第11天时，hASC诱导组和hUCMSC诱导组的部分细胞可检测到糖原染色阳性；诱导第15天时，细胞糖原染色阳性细胞增多，hASC诱导组更加明显(见图5A、B)。

2)ICG摄取实验：诱导第11天时，hASC诱导组和hUCMSC诱导组的少数细胞可摄取ICG，胞质中可见绿色颗粒物；诱导第15天时，可摄取ICG的细胞明显增多，hASCs诱导组更加明显(见图5C)。

3)蛋白合成功能：随诱导时间延长，hASC诱导组Alb和尿素表达量均有增加(见图5E-G)。

实施例5.股静脉移植

根据“材料与方法”所述进行股静脉移植研究，结果如下所述：

治疗后8小时五组大鼠均出现死亡，48小时内PBS对照组大鼠全部死亡，72小时后无大鼠死亡。hASC治疗组、hASC-HLC治疗组、hUCMSC治疗组和hUCMSC-HLC治疗组大鼠的生存率分别为26.7％(4/15)、33.3％(5/15)、13.3％(2/15)、6.7％(1/15)(图6A)。

四个治疗组大鼠ALB水平在治疗后一天即恢复正常，AST水平在治疗后一天明显降低，与PBS对照组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05)(图6D、E)；hASC治疗组和hASC-HLC治疗组大鼠DB水平在治疗后一天较对照组均有降低，而hUCMSC治疗组和hUCMSC-HLC治疗组大鼠DB水平较对照组反而升高，其中hASC治疗组与hUCMSC治疗组相比、hASC-HLC治疗组与hUCMSC-HLC治疗组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05)(图6F)。

实施例6.免疫组织化学染色

根据“材料与方法”所述进行免疫组织化学染色，结果如下：

正常大鼠和PBS对照组大鼠肝组织不能被人Alb抗体染色(见图7A、B)；hASC移植后第1天人白蛋白抗体染色呈阴性(见图7C)，第7天在中央静脉周围出现较多人Alb阳性细胞(见图7D)；而hASC-HLC移植后第1天在中央静脉周围即出现较多人Alb抗体阳性细胞(见图7E)，第7天Alb阳性细胞略有减少(见图7F)。hUCMSC和hUCMSC-HLC移植后第1、7天Alb阳性细胞数均少于hASC和hASC-HLC治疗组(见图7G-J)。

实施例7.Ki67染色和Tunnel试验

根据“材料与方法”所述进行Ki67染色和Tunnel试验，结果如下：

正常肝组织和PBS对照组进行免疫组化染色后可见少量细胞被Ki67抗体染色。四个治疗组移植后第1天可见部分Ki67阳性细胞，第7天Ki67阳性细胞进一步增多；其中，hASCs和hASCs-HLC治疗组Ki67阳性细胞数更多(见图8A)。

正常肝脏组织切片行Tunnel染色后未见阳性细胞，hASC和hASC-HLC移植后第1天可见少量阳性细胞；而hUCMSC、hUCMSC-HLC治疗组和PBS对照组均可见大量阳性细胞；第7天各组均仅见极少数细胞阳性(见图8B)。

实施例8.蛋白芯片检测

根据“材料与方法”所述进行蛋白芯片高通量定性分析hASC和hASC-HLC移植后，大鼠组织中细胞因子、趋化因子等的相对表达水平，结果如下：

hASC和hASC-HLC移植后第1天大鼠血清中炎症因子如IL-1α、IL-6等均明显升高、抑炎因子如IL-1ra、IL-13等均明显升高，其中IL-1ra在hASC治疗组最高，IL-13在hASC-HLC治疗组最高；趋化因子两组均有升高(见图9)。

hASC和hASC-HLC移植后第7天大鼠血清中炎症因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等均较前降低，hASC治疗组几乎恢复正常水平；而hASC-HLC治疗组抑炎因子IL-13和趋化因子仍处于较高水平(见图10)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 苏州睿健思腾生物技术有限公司

<120> 人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞及其制备方法和应用

<130> P2017-2051

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaagaaggt ggtgaagcag g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

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<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

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<210> 4

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<212> DNA

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 7

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<212> DNA

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<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

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<400> 8

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgccggaagg cttcttcttt 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

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Claims (27)

1.一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1) 利用含Activin A的培养基培养人源脂肪干细胞；

2) 利用肝分化培养基诱导步骤(1)所得的经培养的人源脂肪干细胞分化成肝细胞样细胞；和

3) 利用肝成熟培养基使得步骤(2)所得的肝细胞样细胞成熟，从而得到高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞；

其中，所述肝分化培养基由以下成分组成：

HGF、EGF、IGF、FGF4、胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠添加剂、地塞米松、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、DMEM-F12培养基；

所述肝成熟培养基由以下成分组成：

HGF、EGF、IGF、FGF4、ITS、地塞米松、尼克酰胺、抑瘤素M (OSM)、BSA、青霉素-链霉素溶液、DMEM-F12培养基；

得到高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞具备以下一种或多种特征：

1) 有40%以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA的表达增加30%以上；

2) 有20%以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加10%以上；

3) 有10%以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4) 有5%以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和

5) 与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加10%以上。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，得到高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞具备以下一种或多种特征：

1) 有50%以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA的表达增加50%以上；

2) 有50%以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加20%以上；

3) 有30%以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4) 有20%以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和

5) 与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加20%以上。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，得到高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞具备以下一种或多种特征：

1) 有60%以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA的表达增加70%以上；

2) 有75%以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加30%以上；

3) 有60%以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4) 有30%以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和

5) 与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加30%以上。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进行18-30小时；所述步骤2)进行5-9天；所述步骤3)进行5-9天。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进行22-26小时；所述步骤2)进行6-8天；所述步骤3)进行6-8天。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进行24小时；所述步骤2)进行7天；所述步骤3)进行7天。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)之前利用DNA甲基化酶抑制剂预处理人源脂肪干细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基化酶抑制剂包括5-氮杂胞苷。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基化酶抑制剂进行预处理的剂量为10ug/L，时间为24小时。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，在中央静脉周围出现人Alb抗体阳性细胞。

11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子IL-1ra、IL-13升高20%以上。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子IL-1ra、IL-13升高100%以上。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子IL-1ra、IL-13升高300%以上。

14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每100个初始人源脂肪干细胞得到40个以上高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，每100个初始人源脂肪干细胞得到50个以上高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，每100个初始人源脂肪干细胞得到50-60个高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞。

17.一种高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述肝细胞样细胞群体具备以下一种或多种特征：

1) 有40%以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA的表达增加30%以上；

2) 有20%以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加10%以上；

3) 有10%以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4) 有5%以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和；

5) 与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加10%以上；

所述肝细胞样细胞群体通过权利要求1-16中任一项所述的方法制备得到。

18.如权利要求17所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述肝细胞样细胞群体具备以下一种或多种特征：

1) 有50%以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA的表达增加50%以上；

2) 有50%以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加20%以上；

3) 有30%以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4) 有20%以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和；

5) 与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加20%以上。

19.如权利要求18所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述肝细胞样细胞群体具备以下一种或多种特征：

1) 有60%以上的所述肝细胞样细胞表达ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中ALB、AFP、HNF1α、HNF4α、CYP3A4 mRNA的表达增加70%以上；

2) 有75%以上的所述肝细胞样细胞表达Alb和AFP蛋白；或者，与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中Alb和AFP蛋白的表达增加30%以上；

3) 有60%以上的所述肝细胞样细胞为细胞糖原染色阳性细胞；

4) 有30%以上的所述肝细胞样细胞摄取ICG；和；

5) 与诱导前相比，所述肝细胞样细胞中尿素的表达增加30%以上。

20.如权利要求17所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述的肝细胞样细胞群体在移植后第1天，在中央静脉周围出现人Alb抗体阳性细胞。

21.如权利要求17所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子IL-1ra、IL-13升高20%以上。

22.如权利要求21所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子IL-1ra、IL-13升高100%以上。

23.如权利要求22所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，所述的肝细胞样细胞在移植后第1天，抑炎因子IL-1ra、IL-13升高300%以上。

24.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求17-23中任一项所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体或通过权利要求1-16中任一项所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞，以及任选的药学上可接受的载体。

25.一种试剂盒，所述试剂盒装有权利要求17-23中任一项所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体，或通过权利要求1-16中任一项所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞，或权利要求24所述的药物组合物，以及任选的所述试剂盒的使用说明书。

26.权利要求17-23中任一项所述的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞群体或通过权利要求1-16中任一项所述的方法制备的高度成熟的人源脂肪干细胞来源的肝细胞样细胞在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括急性肝衰竭、肝纤维化或肝硬化。

27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述疾病是急性肝衰竭。