CN109734797B - 糖化血红蛋白提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖化血红蛋白提取试剂盒及提取方法，涉及生物技术领域。该提取试剂盒由清洗液A、清洗液B、洗脱液和储存液组成，其中：所述清洗液A的成分如下：缓冲液PH7.0、氯化钠、氯化钾、叠氮钠；所述清洗液B的成分如下：HEPS Buffe、氯化锂、硫酸镁、TCEP；所述洗脱液的成分如下：硫酸铵、氯化铵、曲拉通、乙二醇；所述储存液的成分如下：甘油、TCEP、稳定剂、叠氮钠。本发明对操作设备要求低，且提取的糖化血红蛋白可以长期保存。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白提取试剂盒及提取方法。
背景技术
正常人血液中血红蛋白共有三种形式：HbA，HbF，HbA2，一般成人红细胞中HbA是主要成分。通过使用层析法进行血红蛋白分离，可分离出三种含糖血红蛋白：HbAla、HbAlb和HbAlc，这三种糖化血红蛋白共同组成了糖化血红蛋白。糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白和血糖结合产生，当糖化血红蛋白值越高，表明血红蛋白和血糖结合越多，糖尿病病情愈发严重。人体内红细胞一般能够持续存在120天，糖化血红蛋白水平一般情况下反应了检测前120天平均血糖水平。
目前针对糖化血红蛋白提取方法主要是有非固定化胶条与聚丙烯酰胺等电聚焦的融合技术分离纯化糖化血红蛋白，离子交换层析分离提取糖化血红蛋白，自由流等电聚焦技术提取糖化血红蛋白等。但是上述三种技术对设备的要求高，并且提取的糖化血红蛋白回收后不可长时间保存，不利于科学研究。
发明内容
本发明提供一种对操作设备要求低，且提取的糖化血红蛋白可以长期保存的糖化血红蛋白提取试剂盒及提取方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
本发明提供一种糖化血红蛋白提取试剂盒，由清洗液A、清洗液B、洗脱液和储存液组成，其中：
所述清洗液A的成分和含量如下：
所述清洗液B的成分和含量如下：
所述洗脱液的成分和含量如下：
所述储存液的成分和含量如下：
进一步的，所述清洗液A和清洗液B的最终PH值为6.95。进一步的，所述清洗液A的成分和含量如下：
进一步的，所述缓冲液为磷酸钠或磷酸钾。
进一步的，所述清洗液B的成分和含量如下：
本发明还提供一种糖化血红蛋白提取方法，采用权利要求1至5中任一所述的糖化血红蛋白提取试剂盒，所述提取方法包括：
步骤1：对采取的血液进行室温放置半小时；
步骤2：在采取的血浆中加入所述清洗液A进行37度处理，之后加入所述清洗液B，颠倒混匀进行离心弃上清，重复操作至上清无色，得到第一沉淀物，其中，所述血浆、清洗液A和清洗液B三者之间的体积比为：血浆：清洗液A：清洗液B＝1:2：3；
步骤3：在所述第一沉淀物中加入清洗液B进行混匀处理，之后进行离心弃上清，得到第二沉淀物，其中，所述第一沉淀物与清洗液之间的体积比为1：2；
步骤4：在所述第二沉淀物中加入所述洗脱液进行混匀处理，离心上清，得到第三沉淀物，其中，所述第二沉淀物与洗脱液的比例为1:3；
步骤5：在所述第三沉淀物中加入储存液进行37度处理，离心保留上清，其中，所述第二沉淀物与洗脱液的比例为1:10；
步骤6：对所述步骤5中的上清进行混匀操作，离心保留上清，最后得到的上清即为糖化血红蛋白溶液。
进一步的，所述步骤2和步骤3中的离心条件为5000转/分，15～25min。
进一步的，所述步骤4中的离心条件为2000转/分，8～15min。
进一步的，所述步骤5中的离心条件为8000转/分，15～25min。
进一步的，所述步骤6中的离心条件为12000转/分，15～25min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的糖化血红蛋白提取试剂盒及提取方法，通过制备一种提取糖化血红蛋白检测试剂盒，利用分子间压力涨破红细胞释放糖化血红蛋白，并利用洗脱液将糖化血红蛋白洗脱下来，利用储存液进行溶解，得到的糖化血红蛋白组分均一，能够达到检测要求。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1：
本发明的糖化血红蛋白提取试剂盒主要有由清洗液A、清洗液B、洗脱液和储存液组成，其中：
清洗液A的成分和含量如下：
清洗液B的成分和含量如下：
洗脱液的成分和含量如下：
储存液的成分和含量如下：
实施例2：
本发明的糖化血红蛋白提取试剂盒主要有由清洗液A、清洗液B、洗脱液和储存液组成，其中：
清洗液A的成分和含量如下：
清洗液B的成分和含量如下：
洗脱液的成分和含量如下：
储存液的成分和含量如下：
实施例3：
本发明的糖化血红蛋白提取试剂盒主要有由清洗液A、清洗液B、洗脱液和储存液组成，其中：
清洗液A的成分和含量如下：
清洗液B的成分和含量如下：
洗脱液的成分和含量如下：
储存液的成分和含量如下：
采用上述三个实施例的试剂盒对糖化血红蛋白进行提取，提取方法可以采用以下步骤：
步骤1：对采取的血液进行室温放置半小时；
步骤2：在采取的血浆中加入所述清洗液A进行37度处理，之后加入所述清洗液B，颠倒混匀进行离心弃上清，重复操作至上清无色，得到第一沉淀物，其中，所述血浆、清洗液A和清洗液B三者之间的体积比为：血浆：清洗液A：清洗液B＝1:2：3；
该步骤中离心条件优选为5000转/分，离心时间15～25min，优选20min。步骤2一般重复两次，两次之后如果发现上清显示红色可以增加次数。
步骤3：在所述第一沉淀物中加入清洗液B进行混匀处理，之后进行离心弃上清，得到第二沉淀物，其中，所述第一沉淀物与清洗液B之间的体积比为1：2；
该步骤中离心条件优选为5000转/分，离心时间15～25min，优选20min。
步骤4：在所述第二沉淀物中加入所述洗脱液进行混匀处理，离心上清，得到第三沉淀物，其中，所述第二沉淀物与洗脱液的比例为1:3；
步骤4中的离心条件优选为2000转/分，离心时间8～15min，优选为10min。
步骤5：在所述第三沉淀物中加入储存液进行37度处理，离心保留上清，其中，所述第二沉淀物与洗脱液的比例为1:10；
步骤5中的离心条件优选为8000转/分，离心时间15～25min，优选20min。
步骤6：对所述步骤5中的上清进行混匀操作，离心保留上清，最后得到的上清即为糖化血红蛋白溶液。
步骤6中的离心条件优选为12000转/分，离心时间15～25min，优选20min。
糖化血红蛋白均一性检测：
对采用上述3个实施例的提取试剂盒提取的糖化血红蛋白分别进行均一性分析，利用全自动生化分析仪日立7180进行操作，糖化血红蛋白检测试剂盒为日本藤仓糖化血红蛋白检测试剂盒(胶乳增强法)，具体操作按照说明书进行，得到的结果如表1所示：
表1
由表1可以看出，实施例1～3提取的糖化血红蛋白的变异系数均不超过0.5％，则提取的糖化血红蛋白组分均一，能够达到检测标准要求。
糖化血红蛋白稳定性能检测：
对采用上述3个实施例提取的糖化血红蛋白进行稳定性检测，对照物层析法提取的糖化血红蛋白，两者均在2-8度条件下放置，利用全自动生化分析仪日立7180进行操作，糖化血红蛋白检测试剂盒为日本藤仓糖化血红蛋白检测试剂盒(胶乳增强法)，具体操作按照说明书进行。检测结果如表2所示:
表2本发明的提取试剂盒提取的糖化血红蛋白稳定性检测结果
由表2可以看出，实施例1～3提取的糖化血红蛋白在2-8度条件下放置，可放置150天基本不发生变化，层析法提取物放置不到50天的时间就能发生约20％幅度的降低，进而表明本发明试剂盒取的糖化血红蛋白的稳定性超过了其他方式提取物。
稳定性检测
通过购买的糖化血红蛋白标准品，将实施例1～2中的提取试剂盒放在不同条件下处理的进行统一处理和操作，分别对复融后的糖化血红蛋白标准品进行提取，为了保证检测结果准确性，我们将试剂盒按照统一校准品进行校准，然后检测标准品提取回收率，检测结果如表3、表4所示：
表3本发明的提取试剂盒37度和零下-20度处理后检测结果
表4本发明的提取试剂盒2-8度处理后检测结果
由表3和表4可以看出，本发明的提取试剂盒，经过37度处理一周的时间后，回收率在96％以上，实施例2达到99％以上；处理10天后，回收率在94％以上，实施例2达到95％以上；在-20度条件下处理10天时间回收率达到98％以上，实施例2没有发生变化；2-8度条件下本发明的提取试剂盒放置500天的时间，回收率仍然控制在95％以上，通过以上数据充分表明本发明的提取试剂盒能够应对市场上不良环境条件。
综上所述，本发明的糖化血红蛋白提取试剂盒及提取方法在糖化血红蛋白提取技术上，属于首次以试剂盒的形式出现，并且避免了使用技术要求高的技术设备，只需采用现有技术中的离心机等设备即可，降低了对设备的要求，使得提取的糖化血红蛋白在符合检测标准的前提下，还能提高提取的糖化血红蛋白的保存时间，为研究糖化血红蛋白提供了强有力的帮助。本发明的糖化血红蛋白提取试剂盒应对极端环境的能力对于产品在市场的运输和流通提供了保障。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种糖化血红蛋白提取试剂盒，其特征在于，由清洗液A、清洗液B、洗脱液和储存液组成，其中：
所述清洗液A的成分和含量如下：
所述清洗液B的成分和含量如下：
所述洗脱液的成分和含量如下：
所述储存液的成分和含量如下：
所述缓冲液为磷酸钠或磷酸钾。
2.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液A和清洗液B的最终PH值为6.95。
3.根据权利要求2所述的糖化血红蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液A的成分和含量如下：
4.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液B的成分和含量如下：
5.一种糖化血红蛋白提取方法，其特征在于，采用权利要求1至4中任一所述的糖化血红蛋白提取试剂盒，所述提取方法包括：
步骤1：对采取的血液进行室温放置半小时；
步骤2：在采取的血浆中加入所述清洗液A进行37度处理，之后加入所述清洗液B，颠倒混匀进行离心弃上清，重复操作至上清无色，得到第一沉淀物，其中，所述血浆、清洗液A和清洗液B三者之间的体积比为：血浆：清洗液A：清洗液B＝1:2：3；
步骤3：在所述第一沉淀物中加入清洗液B进行混匀处理，之后进行离心弃上清，得到第二沉淀物，其中，所述第一沉淀物与清洗液B之间的体积比为1：2；
步骤4：在所述第二沉淀物中加入所述洗脱液进行混匀处理，离心上清，得到第三沉淀物，其中，所述第二沉淀物与洗脱液的比例为1:3；
步骤5：在所述第三沉淀物中加入储存液进行37度处理，离心保留上清，其中，所述第二沉淀物与洗脱液的比例为1:10；
步骤6：对所述步骤5中的上清进行混匀操作，离心保留上清，最后得到的上清即为糖化血红蛋白溶液。
6.根据权利要求5所述的糖化血红蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中的离心条件为5000转/分，15～25min。
7.根据权利要求5所述的糖化血红蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤4中的离心条件为2000转/分，8～15min。
8.根据权利要求5所述的糖化血红蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤5中的离心条件为8000转/分，15～25min。
9.根据权利要求5所述的糖化血红蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤6中的离心条件为12000转/分，15～25min。
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| 糖化白蛋白测定及其在临床的应用进展;李三喜等;《标记免疫分析与临床》;20161130;第23卷(第11期);1355-1358 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109734797A (zh) | 2019-05-10 |
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Denomination of invention: Glycated hemoglobin extraction kit and extraction method Effective date of registration: 20230628 Granted publication date: 20220329 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shandong branch Pledgor: BIOBASE BIODUSTRY (SHANDONG) Co.,Ltd. Registration number: Y2023980045843 |
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