CN109730998A - 米铂白蛋白纳米粒组合物及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及米铂白蛋白纳米粒组合物及其制法。具体地说，本发明涉及一种包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物，该组合物中包含100重量份的米铂以及100～1000重量份的白蛋白。所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的；所述白蛋白是选自下列的白蛋白：卵白蛋白、牛血白蛋白、人血白蛋白、重组人白蛋白等，优选的是人血白蛋白或重组人白蛋白。本发明还提供了所述组合物的制备方法。本发明组合物具有如说明书所述的优点。

Description

米铂白蛋白纳米粒组合物及其制法

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种包含米铂的药物组合物，特别是涉及一种包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物，本发明还涉及它们的制备方法。

背景领域

米铂(Miriplatin)为脂溶性铂类金属络合物，是由日本住友制药株式会社研发并开发上市的新型铂(II)类抗肿瘤药物，代号为SM-11355，商品名：临床上以其一水合物的形式提供，用于治疗肝癌。米铂的化学名称为：顺-[(1R,2R)-1,2-环己二胺-N,N’]双十四酰氧基合铂，英文化学名为(SP-4-2)-[(1R,2R)-1,2-Cyclohexanediamine-kappaN,kappaN'])bis(myristato-kappa O)platinum(II)，其一水合物的化学式为：C34H68N2O4Pt·H2O，分子量：782.01，CAS登记号：141977-79-9，化学结构式见式(I)：

米铂一水合物为白色至微黄色结晶性粉末，在氯仿、二氯甲烷中溶解，在乙醇中微溶，在甲醇中极微溶，在水、乙腈中几乎不溶。

米铂可用于治疗或辅助治疗肝细胞癌、恶性淋巴瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌或表面膀胱癌等病症。米铂作为一种脂溶性铂类络合物，极低的水溶性使其难以制备成常规注射剂。在治疗肝癌时，将米铂用碘化油(罂粟籽油的脂肪酸酯的碘加成物，以下简称为碘化油)混悬后，用导管经肝动脉灌注后，可达到良好的治疗效果。由于肝细胞癌的血液供应与正常肝组织不同，其肿瘤血液供应的90％以上来源于肝动脉，10％左右来源于门静脉；而正常肝组织血液供应80％以上来源于门静脉。米铂采用碘化油混悬后，经导管肝动脉灌注，大部分药物直接进入肿瘤血管，仅有小部分药物进入正常肝组织血管。由于肿瘤组织的血管缺乏弹力层和肌层，常发生不规则扭曲，不能冲刷出粘滞的碘化油，且肿瘤组织缺乏能清除碘化油的单核巨噬系统和淋巴系统，使得碘化油选择性聚集于肝癌组织，既能有效阻断肝细胞癌的血液供应，也可将药物靶向地输送至肿瘤细胞中，保持肿瘤部位较高的局部药物浓度，而正常组织中较低的药物浓度，提高抗肿瘤疗效，降低毒副作用。

临床试验显示，肝细胞癌患者经米铂治疗，患者的TEV(肿块消失或肿瘤100％坏死率)达26.5％(22/83)；2年生存率达75.9％，3年生存率达58.4％。且由于给药操作未发生肝血管损伤，可以多次给药(J.Clin.Oncol.2009，27(15s)：4583)。另一组16例患者参加的临床试验数据显示，肝癌患者CR率达56％(9/16)(Invest.New.Drug.2004，22(2)：169-176)，耐受性好。

米铂是无菌注射制剂，通过混悬入碘化油中而给药。因此，需要将非无菌原料通过制剂工艺处理为无菌制剂。JP3255025A公开了采用叔丁醇和氯仿制备米铂冻干制剂的方法，该制剂混悬于碘化油(罂粟籽油的脂肪酸酯的碘加成物)中，长时间放置时出现粘度随时间延长而增加、混悬液分离成两层的问题。

CN1571666A公开了一种注射用冻干制剂及制备方法，该冻干制剂是通过将顺[((1R,2R)-1,2-环己烷二胺-N,N’)二(R1)]铂(II)溶解在2-甲基-2-丙醇中并冻干该溶液而获得的，所述制剂具有大约3～25μm的中心粒径分布和至多40μm的D90％值。该制剂采用2－甲基－2－丙醇(即叔丁醇)作为溶剂冻干样品，通过添加一定量的水(1.0～6.0mg/mL)，使得冻干的样品呈近似球形的颗粒，在混悬入碘化油中给药时，药物在碘化油中均匀混悬不易分层，可使药物有足够的时间不沉降，以进入肿瘤病灶而不在正常血管中滞留。但在冻干过程中，含水量需精确的控制，过低的含水量导致冻干产品为无定形粉末，过高含水量则使产品形成针状结晶，这两种形态，均会导致药物在碘化油中不能很好的混悬而分层。由于药物对水非常敏感，在含水量稍高时会立即析出针状结晶，冻干过程需加入极微量的水(1.0～6.0mg/mL)，在与叔丁醇混匀之前，水在局部过浓会导致针状晶体的形成，进而影响药物的混悬。同时需要在装瓶后瞬时冷冻样品以保证粒径的均匀性，这些都导致了制备过程中可操作性降低、风险增加。

CN1571666A公开的方法中，叔丁醇的熔点为25.5℃，在生产过程中，为了防止米铂溶液发生凝固或者局部凝固，需要控制生产环境温度为28～35℃。另外，叔丁醇易吸湿，在配料过程中，环境湿度要求在5～40％之间。生产所需的这种温湿度环境，既不符合制药行业GMP(温度应控制在18～26℃；相对湿度控制在45％～65％)规范的要求，又不适合操作人员长时间工作，该生产方式还会导致生产成本异乎寻常的增高。

CN102266297A公开了一种米铂冻干制剂的制备方法，通过使用叔丁醇和无水乙醇的混合溶剂，可降低对生产环境的温度要求，保证米铂溶液在生产过程中于室温环境下不发生凝固或局部凝固；同时产品中心粒径分布为10～25μm，混悬在碘化油注射液中后24h内沉降系数及粘度均无明显变化。但本发明人采用该专利描述方法制备冻干样品，将所得冻干样品加入碘化油混悬，将混悬液放置3h后，仍有分为两层的趋势，不能达到所述的技术效果。

CN104546722A公开了一种米铂脂质体组合物，据信该脂质体呈现包封率等方面的优良效果。脂质体呈物理囊泡的形式，在制剂加工方面不理想，例如不能方便地制成冻干制剂形式；而前述其它制备米铂制剂的方法多呈油状给药制剂。因此，提供一种可以采用水性溶媒溶解/稀释的注射用米铂制剂仍然是本领域技术人员迫切期待的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种米铂组合物，特别是提供一种包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物，特别是期望该包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物可以采用水性溶媒溶解/稀释并直接用于静脉注射。本发明人出人意料地发现，当采用本发明配方时能够获得如本发明说明书所述一个或多个方面的有益效果，本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物，该组合物中包含100重量份的米铂以及100～1000重量份的白蛋白。

根据本发明第一方面的组合物，其中包含100重量份的米铂以及150～800重量份的白蛋白。

根据本发明第一方面的组合物，其中包含100重量份的米铂以及150～600重量份的白蛋白。

根据本发明第一方面的组合物，其中包含100重量份的米铂以及200～500重量份的白蛋白。

根据本发明第一方面的组合物，其中所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的。

在本发明中，提及米铂时，如未另外说明均是指其一水合物。在本发明中，提及米铂的量时，均是折算成其无水物的量。

根据本发明第一方面的组合物，其中所述白蛋白是选自下列的白蛋白：卵白蛋白、牛血白蛋白、人血白蛋白、重组人白蛋白等，优选的是人血白蛋白或重组人白蛋白。

根据本发明第一方面的组合物，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇、磷脂、卵磷脂、PEG化磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、甘油磷脂酸(PA)、合成磷脂等类型的磷酯。

根据本发明第一方面的组合物，以每100重量份的米铂计，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇2～10重量份、磷脂5～20重量份、卵磷脂5～20重量份、PEG化磷脂5～20重量份、磷脂酰胆碱(PC)5～20重量份、磷脂酰甘油(PG)5～20重量份、磷脂酰乙醇胺(PE)5～20重量份、磷脂酰丝氨酸(PS)5～20重量份、磷脂酰肌醇(PI)5～20重量份、甘油磷脂酸(PA)5～20重量份、合成磷脂5～20重量份。

根据本发明第一方面的组合物，以每100重量份的米铂计，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇2～5重量份、磷脂5～10重量份、卵磷脂5～10重量份、PEG化磷脂5～10重量份、磷脂酰胆碱(PC)5～10重量份、磷脂酰甘油(PG)5～10重量份、磷脂酰乙醇胺(PE)5～10重量份、磷脂酰丝氨酸(PS)5～10重量份、磷脂酰肌醇(PI)5～10重量份、甘油磷脂酸(PA)5～10重量份、合成磷脂5～10重量份。

根据本发明第一方面的组合物，其中所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合。

根据本发明第一方面的组合物，其中还包含聚乙二醇修饰的磷脂。其在本发明中亦可称为PEG化磷脂。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(可缩写为PEG-DSPE)。例如，所述PEG化磷脂选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(可缩写为PEG1000-DSPE，其余亦可类似表述)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000。

根据本发明第一方面的组合物，其中还任选的包含注射制剂辅料，例如酸碱调节剂、渗透压调节剂、冻干赋形剂等。

根据本发明第一方面的组合物，其中所述酸碱调节剂的量是，使该组合物在用注射用水稀释制成米铂浓度为1mg/ml的溶液时，溶液的pH值为6.0～7.5，例如6.5～7.5。酸碱调节剂优选常规的酸碱调节剂，例如盐酸、氢氧化钠以及它们的水溶液尤其是浓的水溶液。

根据本发明第一方面的组合物，其中所述渗透压调节剂当存在时，其用量是，使该组合物在用注射用水稀释制成米铂浓度为1mg/ml的溶液时，溶液的渗透压与浓度为0.9～2％氯化钠溶液的渗透压相当。

根据本发明第一方面的组合物，以每100重量份的米铂计，其中的冻干赋形剂的量为0～1000重量份，例如0～500重量份，例如0～200重量份。冻干赋形剂可以选自：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷、甘氨酸等。

根据本发明第一方面的组合物，其中还包含中链脂肪酸，在一个实施方案中，所述中链脂肪酸选自：己酸、辛酸、癸酸、月桂酸，例如的是辛酸或癸酸。根据本发明第一方面的组合物，以每100重量份的米铂计，其中中链脂肪酸的量为2～50重量份，例如2～40重量份，例如2～30重量份，例如2～20重量份。由于中链脂肪酸为脂溶性，因此本领域技术人员当然地会将其与米铂一起加至有机溶剂中溶解以便进行制剂配制。已经出人意料地发现，当在本发明组合物中添加微量中链脂肪酸时能够显著增加纳米微粒的稳定性特别是以其粒径表征的物理稳定性。

根据本发明第一方面的组合物，其是通过如下操作制备得到的：将水溶性物料溶解于水中制成水相，将水不溶性物料溶解于有机溶剂中制成油相，将水相和油相混合分散制成粗乳液，进一步将粗乳液在高压均质机中均质至微粒的平均粒径小于200nm，蒸发除去溶剂，得到纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

根据本发明第一方面的组合物，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(例如乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿、二氯甲烷等；优选的溶剂可以是氯仿；溶剂的用量是本领域技术人员根据技术经验容易确定的，并且通常是至少应保证各物料完全溶解的程度(但又不宜过量以减轻后续的蒸发除溶剂的工作量))溶解，作为油相；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于200nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于100ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

根据本发明第一方面的组合物，其中例如步骤(1)所得水相中白蛋白的浓度为3～15％，例如5～10％。

根据本发明第一方面的组合物，其中例如步骤(2)所得油相中米铂的浓度为2～20％，例如5～10％。

根据本发明第一方面的组合物，当存在时，所述胆固醇和各类磷脂与所述米铂一起添加至所述有机溶剂中制成油相。

根据本发明第一方面的组合物，其中例如步骤(1)和步骤(2)是在35～70℃(例如40～50℃)的温度下使各物料溶解。使各物料溶解的时间是根据操作经验容易确定的，通常可以在2小时以内达到溶解，更通常的可以在1小时以内达到溶解，例如可以在0.5小时以内达到溶解。

根据本发明第一方面的组合物，其中例如步骤(3)中所述分散是在分散器中于5000-15000rpm下分散1-20min，例如于8000-10000rpm下分散2-10min。

根据本发明第一方面的组合物，其中步骤(4)中，在均质机中以5000～50000psi的压力均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力均质处理20～45min，例如以15000psi的压力均质处理30min。

根据本发明第一方面的组合物，其中例如步骤(5)中，所述的蒸发是旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的。

根据本发明第一方面的组合物，当存在时，所述酸碱调节剂是在步骤(3)制备粗乳液前添加并调节pH值；必要时所述酸碱调节剂还在步骤(3)制得粗乳液后添加并调节pH值；必要时还在步骤(4)制得均质乳液后添加并调节pH值；必要时还在步骤(5)制得均质乳液后添加并调节pH值；或者，必要时还在步骤(5)冷冻干燥前添加并调节pH值。

根据本发明第一方面的组合物，当存在时，所述渗透压调节剂在预先用注射用水溶解并除菌过滤后，添加至步骤(5)过滤除菌所得米铂白蛋白纳米粒组合物中。

根据本发明第一方面的组合物，当存在时，所述冻干赋形剂在预先用注射用水溶解并除菌过滤后，添加至步骤(5)过滤除菌所得米铂白蛋白纳米粒组合物中，任选的调节药液pH值后，再进行冷冻干燥。

根据本发明第一方面的组合物，当存在时，所述中链脂肪酸与所述米铂一起添加至所述有机溶剂中制成油相。

根据本发明第一方面的组合物，其用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml时，pH值为6.0～7.5，例如6.5～7.5。

根据本发明第一方面的组合物，其为冷冻干燥粉针剂，其照水分测定法(中国药典2015年版四部附录第103页第0832节第一法A)测定，含水分低于3.0％。此项目可称为水分或水分含量。

根据本发明第一方面的组合物，其加入0.9％氯化钠溶液使米铂浓度为1mg/ml时的量，轻轻振摇，在15分钟内显示完全分散均匀，并且无未分散的固体物。此项目可称为分散时间。

根据本发明第一方面的组合物，其用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml后，用中国药典2005年版二部附录IX C显微计数法测定，每100mg米铂白蛋白纳米粒组合物中含10μm以上的微粒少于1000粒例如少于500粒，含25μm以上的微粒少于100粒例如少于50粒。本项目可称为不溶性微粒。

根据本发明第一方面的组合物，其用蒸馏水分散均匀或稀释至米铂浓度为1mg/ml后，必要时再用蒸馏水适当稀释，用纳米粒度仪测定，平均粒径小于200nm(例如平均粒径为20～200nm，例如平均粒径为30～200nm，例如平均粒径为40～200nm，例如平均粒径为50～200nm，例如平均粒径为30～180nm，例如平均粒径为30～150nm)，粒径小于10nm的微粒少于5％(例如粒径小于15nm的微粒少于5％)，粒径大于500nm的微粒少于5％(例如粒径大于400nm的微粒少于5％，粒径大于300nm的微粒少于5％)。本项目可称为粒径及粒径分布。

根据本发明第一方面的组合物，其用蒸馏水分散均匀或稀释至米铂浓度为1mg/ml后，必要时再用蒸馏水适当稀释，用纳米粒度仪测定并计算纳米粒的粒径D10、D50、和D90值(通常亦分别理解为10％粒子小于此值的粒径、50％粒子小于此值的粒径或称中值粒径、90％粒子小于此值的粒径)，以下式计算供试品纳米粒的径距Span值：Span＝(Dv90-Dv10)/Dv50；该组合物的Span小于5，特别是小于3，更特别的是小于2.5，更特别的是小于2。Span越小表示微粒的粒度分布越窄，并且越是本领域期待的，本领域公知的是，对于注射用的纳米微粒制剂，Span小于3通常认为是可接受的，Span小于2.5通常认为是满意的，Span小于2通常认为是非常满意的。已经出人意料地发现，本发明方法制备的组合物其纳米粒的平均粒径小于200nm，Span值均小于2.5，并且一些组合物在经历长时间放置后平均粒径和Span值呈现基本不变化的效果。

进一步的，本发明第二方面提供了制备包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物例如本发明第一方面任一项所述包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物的方法，该组合物中包含100重量份的米铂以及100～1000重量份的白蛋白；该方法包括如下步骤：将水溶性物料溶解于水中制成水相，将水不溶性物料溶解于有机溶剂中制成油相，将水相和油相混合分散制成粗乳液，进一步将粗乳液在高压均质机中均质至微粒的平均粒径小于200nm，蒸发除去溶剂，得到纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

根据本发明第二方面的方法，其包括如下步骤：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(例如乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿、二氯甲烷等；优选的溶剂可以是氯仿；溶剂的用量是本领域技术人员根据技术经验容易确定的，并且通常是至少应保证各物料完全溶解的程度(但又不宜过量以减轻后续的蒸发除溶剂的工作量))溶解，作为油相；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于200nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于100ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中包含100重量份的米铂以及150～800重量份的白蛋白。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中包含100重量份的米铂以及150～600重量份的白蛋白。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中包含100重量份的米铂以及200～500重量份的白蛋白。

根据本发明第二方面的方法，所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的。

根据本发明第二方面的方法，所述白蛋白是选自下列的白蛋白：卵白蛋白、牛血白蛋白、人血白蛋白、重组人白蛋白等，优选的是人血白蛋白或重组人白蛋白。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇、磷脂、卵磷脂、PEG化磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、甘油磷脂酸(PA)、合成磷脂等类型的磷酯。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中以每100重量份的米铂计，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇2～10重量份、磷脂5～20重量份、卵磷脂5～20重量份、PEG化磷脂5～20重量份、磷脂酰胆碱(PC)5～20重量份、磷脂酰甘油(PG)5～20重量份、磷脂酰乙醇胺(PE)5～20重量份、磷脂酰丝氨酸(PS)5～20重量份、磷脂酰肌醇(PI)5～20重量份、甘油磷脂酸(PA)5～20重量份、合成磷脂5～20重量份。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中以每100重量份的米铂计，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇2～5重量份、磷脂5～10重量份、卵磷脂5～10重量份、PEG化磷脂5～10重量份、磷脂酰胆碱(PC)5～10重量份、磷脂酰甘油(PG)5～10重量份、磷脂酰乙醇胺(PE)5～10重量份、磷脂酰丝氨酸(PS)5～10重量份、磷脂酰肌醇(PI)5～10重量份、甘油磷脂酸(PA)5～10重量份、合成磷脂5～10重量份。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中还包含聚乙二醇修饰的磷脂。其在本发明中亦可称为PEG化磷脂。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿。在一个实施方案中，所述PEG化磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(可缩写为PEG-DSPE)。例如，所述PEG化磷脂选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000(可缩写为PEG1000-DSPE，其余亦可类似表述)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中还任选的包含注射制剂辅料，例如酸碱调节剂、渗透压调节剂、冻干赋形剂等。

根据本发明第二方面的方法，所述酸碱调节剂的量是，使该组合物在用注射用水稀释制成米铂浓度为1mg/ml的溶液时，溶液的pH值为6.0～7.5，例如6.5～7.5。酸碱调节剂优选常规的酸碱调节剂，例如盐酸、氢氧化钠以及它们的水溶液尤其是浓的水溶液。

根据本发明第二方面的方法，所述渗透压调节剂当存在时，其用量是，使该组合物在用注射用水稀释制成米铂浓度为1mg/ml的溶液时，溶液的渗透压与浓度为0.9～2％氯化钠溶液的渗透压相当。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中以每100重量份的米铂计，其中的冻干赋形剂的量为0～1000重量份，例如0～500重量份，例如0～200重量份。冻干赋形剂可以选自：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷、甘氨酸等。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物中还包含中链脂肪酸，在一个实施方案中，所述中链脂肪酸选自：己酸、辛酸、癸酸、月桂酸，例如的是辛酸或癸酸。根据本发明第一方面的组合物，以每100重量份的米铂计，其中中链脂肪酸的量为2～50重量份，例如2～40重量份，例如2～30重量份，例如2～20重量份。

根据本发明第二方面的方法，其中例如步骤(1)所得水相中白蛋白的浓度为3～15％，例如5～10％。

根据本发明第二方面的方法，其中例如步骤(2)所得油相中米铂的浓度为2～20％，例如5～10％。

根据本发明第二方面的方法，当存在时，所述胆固醇和各类磷脂与所述米铂一起添加至所述有机溶剂中制成油相。

根据本发明第二方面的方法，其中例如步骤(1)和步骤(2)是在35～70℃(例如40～50℃)的温度下使各物料溶解。使各物料溶解的时间是根据操作经验容易确定的，通常可以在2小时以内达到溶解，更通常的可以在1小时以内达到溶解，例如可以在0.5小时以内达到溶解。

根据本发明第二方面的方法，其中例如步骤(3)中所述分散是在分散器中于5000-15000rpm下分散1-20min，例如于8000-10000rpm下分散2-10min。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤(4)中，在均质机中以5000～50000psi的压力均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力均质处理20～45min，例如以15000psi的压力均质处理30min。

根据本发明第二方面的方法，其中例如步骤(5)中，所述的蒸发是旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的。在一个实施方案中，所述的旋转蒸发在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的。

根据本发明第二方面的方法，当存在时，所述酸碱调节剂是在步骤(3)制备粗乳液前添加并调节pH值；必要时所述酸碱调节剂还在步骤(3)制得粗乳液后添加并调节pH值；必要时还在步骤(4)制得均质乳液后添加并调节pH值；必要时还在步骤(5)制得均质乳液后添加并调节pH值；或者，必要时还在步骤(5)冷冻干燥前添加并调节pH值。

根据本发明第二方面的方法，当存在时，所述渗透压调节剂在预先用注射用水溶解并除菌过滤后，添加至步骤(5)过滤除菌所得米铂白蛋白纳米粒组合物中。

根据本发明第二方面的方法，当存在时，所述冻干赋形剂在预先用注射用水溶解并除菌过滤后，添加至步骤(5)过滤除菌所得米铂白蛋白纳米粒组合物中，任选的调节药液pH值后，再进行冷冻干燥。

根据本发明第二方面的方法，当存在时，所述中链脂肪酸与所述米铂一起添加至所述有机溶剂中制成油相。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml时，pH值为6.0～7.5，例如6.5～7.5。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物为冷冻干燥粉针剂，其照水分测定法(中国药典2015年版四部附录第103页第0832节第一法A)测定，含水分低于3.0％。此项目可称为水分或水分含量。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物加入0.9％氯化钠溶液使米铂浓度为1mg/ml时的量，轻轻振摇，在15分钟内显示完全分散均匀，并且无未分散的固体物。此项目可称为分散时间。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml后，用中国药典2005年版二部附录IX C显微计数法测定，每100mg米铂白蛋白纳米粒组合物中含10μm以上的微粒少于1000粒例如少于500粒，含25μm以上的微粒少于100粒例如少于50粒。本项目可称为不溶性微粒。

根据本发明第二方面的方法，所述组合物用蒸馏水分散均匀至米铂浓度为1mg/ml后，必要时用蒸馏水适当稀释，用纳米粒度仪测定，平均粒径小于200nm(例如平均粒径为20～200nm，例如平均粒径为30～200nm，例如平均粒径为40～200nm，例如平均粒径为50～200nm，例如平均粒径为30～180nm，例如平均粒径为30～150nm)，粒径小于10nm的微粒少于5％(例如粒径小于15nm的微粒少于5％)，粒径大于500nm的微粒少于5％(例如粒径大于400nm的微粒少于5％，粒径大于300nm的微粒少于5％)。本项目可称为粒径及粒径分布。

进一步的，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一项所述组合物或者本发明第二方面任一项所述方法制备的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。例如，所述癌症例如但不限于肝癌、胰腺癌。

在本发明的任一方面，所制备的呈液体形式的药物组合物或者进一步制成冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物，其可以通过控制制备工艺的方式，将该组合物制成供无菌方式使用的无菌制剂。这种工艺的控制是容易的，例如先控制方式，即将各原辅料经无菌处理，再以全程无菌操作制备成无菌制剂；还可以是后控制的方式，即将制备得到的呈液体形式的组合物经例如但不限于微孔滤膜过滤的方式除菌。因此，根据本发明的任一方面，所制备的呈液体形式的药物组合物或者进一步制成冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物是无菌制剂。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明中如未另外说明，涉及的％是重量/重量百分数。本文各种具体实施例中使用到的各种白蛋白均是从市售途径获得的并且符合相应品种的质量标准，例如重组白蛋白符合美国药典NF35相应品种的规定，人血白蛋白符合中国药典2015年版相应品种的规定。

首次将米铂推向市场的是大日本住友公司的Miripla(miriplatin)制剂，剂型为冻干粉针剂，并配有专利溶媒(专用混悬液)，其用于肝细胞癌(HCC)的治疗，商品名为：英文名：Miriplatin Hydrate，日文名：ミリプラチン水和物，化学名：(SP-4-2)-[(1R,2R)-1,2环己二氨-N,N′]二(十四酸-O)合铂一水合物，CAS登记号：141977-79-9，分子式：C34H68N2O4Pt·H2O，相对分子量：782.01，结构式为：

的用法用量为：将70mg本品溶于3.5mL本品专用混悬液中，通过插入肝动脉内的导管注射进肝脏，直至药液充满肿瘤血管内时结束。给药上限为每次6mL(含本品120mg)，且需重复给药时要设4周以上的观察期。由于此种给药方式为肝动脉内给药且药液为油性混悬液，给药方式复杂，本发明制成可以微小粒子分散于水中的纳米粒制剂，可以方便地通过静脉内注射给药，比之于现有给药方法更方便，并且本发明制剂和给药方法还可以适用于其它肿瘤而非局限于肝癌。

Miriplatin Hydrate是大日本住友制药株式会社开发的脂溶性铂复合物抗癌药，于2009年10月16日获得日本厚生劳动省批准，用于治疗肝细胞癌。本品专用混悬液已于同年8月20日获得批准。2010年1月20日，Miriplatin Hydrate及其专用混悬液同时上市销售。

肝细胞癌是世界上最常见的、复发率很高的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位，死因第3位，且呈逐年增长趋势，已超过62.6万人/年，我国发病人数约占全球总发病人数的55％，日本2005年肝细胞癌患者约6.6万人。肝细胞癌的发病特点多为丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒持续感染导致慢性肝炎、肝硬化而最终发展为肝细胞癌。临床上通常采用肝脏切除、移植等外科手术治疗；射频消融术、经皮微波凝固疗法、经皮无水乙醇注射疗法等内科局部治疗；经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)、经导管的动脉灌注治疗；全身化疗。其中，TACE尽管只在无法实施外科手术或内科局部治疗的时候才使用，但在首次治疗中的比例却为29.6％，在肝内复发治疗中占53.3％，其重要地位可见一斑。TACE是将抗癌药物与碘化罂粟子油的混合物从肝动脉内注入病灶，同时注入明胶海绵等栓塞物质堵塞动脉，切断动脉血流，达到致肿瘤坏死的目的。用于TACE的抗癌药物有盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、丝裂霉素、顺铂、净司他丁斯酯等。其中，铂类抗癌药物顺铂因其高效抗癌活性与广谱抗癌效果而被广泛使用，对肝细胞癌也表现出良好的临床效果，但其水溶性的特点使得它利用碘化罂粟子油为载体的物理稳定性受到严重影响；净司他丁斯酯是唯一作为以碘化罂粟子油脂肪酸乙酯(ethyl ester of iodinated poppy-seed oil fatty acid)为载体、由肝动脉注射给药的抗癌药物获得批准的，自1994年上市后抗肿瘤效果获得首肯，但该药存在可能导致肝动脉血管损伤、对肝胆系统的影响不可逆转等问题，对以后治疗及预后有影响，用药安全存在隐患。因此，寻找与碘化罂粟子油脂肪酸乙基酯亲和性高、抗癌效果不逊于净司他丁斯酯、预后安全、隐患小的药物成为药物研发的新目标。

Miriplatin Hydrate是日本国立癌症中心研究所前田等人研发的脂溶性铂复合物，与碘化罂粟子油脂肪酸乙酯的亲和性高，能稳定溶于碘化罂粟子油脂肪酸乙酯构成缓释药物，经肝动脉给药后选择性地、长时间滞留在癌症部位，缓慢地释放药物，抗癌效果出色。住友以前田等人的研究为基础，从20世纪90年代开始有关本品的合成、物理性质、制剂化的探讨以及非临床试验，并以获得的非临床试验结果为依据，从1994年开始在日本对肝细胞癌患者进行临床试验。1994年10月开始Ⅰ期临床试验，1998年7月开始Ⅱ期A阶段临床试验，2002年4月开始Ⅱ期B阶段临床试验。临床试验表明，不仅对首次接受治疗患者，而且对一些曾接受过肝切除术等其他方法治疗又再次复发的肝细胞癌患者，本品都显示出良好的抗肿瘤效果。而且本品的不良反应都是本疗法已知的一般性不良反应，患者只要在精通本疗法的医疗机构接受本品治疗，这些不良反应可耐受。基于这3次临床试验的成绩以及Ⅱ期B阶段临床试验的后续给药试验成绩，本品最终获得了日本厚生劳动省的批准。

利用肝脏内移植鼠肝癌细胞株AH109A或人肝癌细胞株Li-7的鼠移植肝癌模型，评价本品混悬液在体内对癌细胞增殖的抑制作用。结果显示，本品混悬液以剂量相关方式抑制癌细胞增殖，且当混悬液中的本品为20mg/mL时肿瘤细胞增殖率明显降低。本品混悬液单剂量给药，对同一肝癌模型也呈剂量相关地抗肿瘤作用。

是溶于专用碘化罂粟子油脂肪酸乙酯、肝动脉内给药的抗癌药物，其与碘化罂粟子油脂肪酸乙酯的亲和性高，且肝动脉内给药后滞留于肿瘤部位，混悬液中的铂成分可长时间缓慢释放进入血液或组织中，铂二价化合物与DNA结合，通过阻止DNA合成抑制癌细胞增殖，提高了抗癌效果。

Ⅰ期临床试验结果表明，最大耐受量为20mg/mL以上(给药量最多6mL)；给药后血中总铂浓度极低，可长时间维持；不良反应程度较轻，可控且在耐受范围。1年生存率为63.6％，2年生存率为38.2％。

Ⅱ期A阶段临床试验结果表明，给药后血中总铂浓度(ng)等级极低，属微量且维持时间长，给药后约1年Cmax大约降至17％。未见等级4的严重不良反应，所见不良反应几乎都在给药后4～6周消失，可控且在耐受范围。对肝细胞癌的疗效(TE)良好，CR率达60％。

Ⅱ期B阶段临床试验结果表明，与净司他丁斯酯疗效相当，且更安全。血中总铂质量浓度(平均值)：首次及第2次给药后分别为9.6、12.9ng/mL，甲醇分离出的铂质量浓度(平均值)分别为1.17、1.19ng/mL。1、2、3年的生存率分别为90.1％、75.9％、58.4％；对照药组1、2、3年的生存率分别为97.4％、70.3％、48.7％。

临床试验显示，不论是首次接受此项治疗肝细胞癌患者，还是一些接受过肝切除等其他治疗方法的复发患者，本品都表现出良好的抗癌效果。而且产生副作用均为这类治疗中常见的副作用，在精通这类疗法的医疗机构接受本品治疗，这些副作用都控制在耐受范围。

尽管米铂制剂已经在临床上取得了良好的效果，然而由于其给药方式的特殊性(插入肝动脉内的导管注射进肝脏)，这在临床上将严重限制它的使用范围。另外，由于其制剂的特殊性(使用有机溶剂的特殊冻干工艺，以及使用特殊的油作为专用溶媒)，使得制剂的制造成工艺非常复杂并且生产成本极高。因此将米铂制成类似于本发明的白蛋白纳米粒制剂，以便像其它抗癌药制剂那样从血管经全身给药是极为有利的。

附图说明

图1是本发明米铂白蛋白纳米粒组合物的典型粒子形态图。

图2是本发明米铂白蛋白纳米粒组合物的典型粒径测量图。

图3是本发明米铂白蛋白纳米粒组合物的典型zeta电位测量结果图。

图4是采用HPLC法测定本发明米铂白蛋白纳米粒组合物的典型色谱图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

在以下具体实例部分，如未另外提及，提供的呈液体形式的药物组合物或者呈冷冻干燥组合物形式的配方是每100mg米铂所制得的药物组合物中各物料的用量来表示的；在实际制备时，以制备包含10g米铂的药物组合物的量投料。如未另外提及，所述米铂是以其一水合物的形式添加的。如未另外提及，涉及米铂的量时，均是折算成其无水物的量。当需要调节药液pH值时，使用2M盐酸溶液或2M氢氧化钠溶液。以下各实施例步骤(5)所得纳米粒组合物药液的渗透压均与浓度为1.1～1.5％氯化钠溶液的渗透压相当，因此未特别地进行渗透压的调节。以下各实施例在对组合物进行冷冻干燥时，经检测，所得冷冻干燥粉中有机溶剂含量低于检测限。

实施例1：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

人血白蛋白400mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度7.5％)；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(三氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度7.5％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于70nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于60ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物；

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在45℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以9000rpm下分散6min；

步骤(4)在均质机中以15000psi的压力均质处理30min；

步骤(5)蒸发是在40℃的温度下减压至0.075Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.8～7.2。

实施例2：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

人血白蛋白150mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度6％)；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(三氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度9％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于160nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于90ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在50℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以8500rpm下分散8min；

步骤(4)在均质机中以10000psi的压力均质处理45min；

步骤(5)蒸发是在45℃的温度下减压至0.06Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.9～7.3。

实施例3：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

人血白蛋白600mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度9％)；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(三氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度6％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于180nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于100ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在40℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以90000rpm下分散4min；

步骤(4)在均质机中以20000psi的压力均质处理20min；

步骤(5)蒸发是在35℃的温度下减压至0.09Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝7.1～7.5。

实施例4：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

重组人白蛋白200mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度10％)；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(叔丁醇)溶解，作为油相(米铂浓度5％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于80nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于80ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在45℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以8000rpm下分散10min；

步骤(4)在均质机中以12000psi的压力均质处理40min；

步骤(5)蒸发是在40℃的温度下减压至0.07Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.7～7.1。

实施例5：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

牛血白蛋白500mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度5％)；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(二氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度10％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于60nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于50ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在45℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以10000rpm下分散2min；

步骤(4)在均质机中以18000psi的压力均质处理25min；

步骤(5)蒸发是在40℃的温度下减压至0.08Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.5～6.8。

实施例6：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

人血白蛋白400mg，

胆固醇4mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度7.5％)；

(2)将处方量的米铂和胆固醇用有机溶剂(三氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度7.5％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于100nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于60ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物；

额外地，将一半的组合物加入甘露醇(100mg/100mg米铂)，分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在45℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以9000rpm下分散6min；

步骤(4)在均质机中以15000psi的压力均质处理30min；

步骤(5)蒸发是在40℃的温度下减压至0.075Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.8～7.2。

实施例7：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

人血白蛋白150mg，

胆固醇5mg，

PEG4000-DSPE 10mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度6％)；

(2)将处方量的米铂、胆固醇、PEG4000-DSPE用有机溶剂(三氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度9％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于160nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于90ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物加入乳糖(50mg/100mg米铂)，分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在50℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以8500rpm下分散8min；

步骤(4)在均质机中以10000psi的压力均质处理45min；

步骤(5)蒸发是在45℃的温度下减压至0.06Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.9～7.3。

实施例8：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

人血白蛋白800mg，

胆固醇2mg，

PEG2000-DSPE 5mg，

PC 8mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度9％)；

(2)将处方量的米铂、胆固醇、PEG2000-DSPE、PC用有机溶剂(三氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度6％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于180nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于100ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物加入乳糖(50mg/100mg米铂)，分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在40℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以90000rpm下分散4min；

步骤(4)在均质机中以20000psi的压力均质处理20min；

步骤(5)蒸发是在35℃的温度下减压至0.09Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝7.1～7.5。

实施例9：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

重组人白蛋白200mg，

PEG5000-DSPE 8mg，

磷脂酰甘油(PG)4mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度10％)；

(2)将处方量的米铂、PEG5000-DSPE、磷脂酰甘油(PG)用有机溶剂(叔丁醇)溶解，作为油相(米铂浓度5％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于80nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于80ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在45℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以8000rpm下分散10min；

步骤(4)在均质机中以12000psi的压力均质处理40min；

步骤(5)蒸发是在40℃的温度下减压至0.07Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.7～7.1。

实施例10：制备米铂白蛋白纳米粒组合物

配方：

米铂100mg，

牛血白蛋白500mg，

胆固醇4mg，

卵磷脂6mg

磷脂酰乙醇胺(PE)6mg。

制法：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相(白蛋白浓度5％)；

(2)将处方量的米铂、胆固醇、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)，用有机溶剂(二氯甲烷)溶解，作为油相(米铂浓度10％)；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于60nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于50ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，

额外地，将一半的组合物分装到玻璃瓶中，接着进行冷冻干燥以除去水分(至水分含量小于3％)。

操作条件：

步骤(1)和步骤(2)在45℃的温度下使各物料溶解(0.5小时以内溶解)；

步骤(3)分散器以10000rpm下分散2min；

步骤(4)在均质机中以18000psi的压力均质处理25min；

步骤(5)蒸发是在40℃的温度下减压至0.08Mpa旋转蒸发；

在制得粗乳液以后的操作过程中随时监测pH值并在需要时调节至pH＝6.5～6.8。

实施例11：分别参照实施例1～实施例10的配方和制法制备米铂白蛋白纳米粒组合物，不同的仅是在参照实施例1～实施例3时分别随米铂一起添加10mg辛酸(相当于每100重量份的米铂而言，下同)，在参照实施例4～实施例5时分别随米铂一起添加2mg辛酸，在参照实施例6～实施例7时分别随米铂一起添加20mg辛酸，在参照实施例8～实施例10时分别随米铂一起添加10mg己酸、10mg癸酸、10mg月桂酸。参照实施例1～实施例3所得组合物可分别称为实施例111组合物、实施例112组合物、实施例113组合物，其它依此类推。

试验例1：纳米粒的粒子形态、粒径和表面电位

利用扫描电子显微镜，观察米铂白蛋白纳米粒的粒子形态。

使用马尔文Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪测定米铂白蛋白纳米粒的粒径，并对数据进行统计。各实施例步骤(5)所得水悬液必要时用蒸馏水稀释，步骤(5)所得冷冻干燥粉针剂用蒸馏水分散必要时稀释(通常分散/稀释至米铂浓度为1mg/ml即可)，再进行测定。测定各种样品的粒度及其分布，包括平均粒径、D10、D50、和D90等参数，计算Span值；另外还测定米铂白蛋白纳米粒的表面电位(zeta电位)。

典型的，实施例1所得米铂白蛋白纳米粒组合物(步骤(5)所得混悬液)的粒子形态结果见图1，粒径测量结果见图2，zeta电位测量结果见图3，步骤(5)所得冷冻干燥品用蒸馏水复溶后所得混悬液的粒子形态、粒度分布、zeta电位测量结果与图1～图3基本相同。实施例2～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物(包括步骤(5)所得混悬液、以及经冷冻干燥品用蒸馏水复溶后所得混悬液)的粒子形态、粒度分布、zeta电位测量结果与图1～图3基本相同。

具体的结果如下：实施例1所得米铂白蛋白纳米粒组合物悬液的平均粒径为60.1nm，电位约-20mv，Span值为1.53；实施例1所得冷冻干燥粉的平均粒径为60.3nm，电位约-20mv，Span值为1.49；实施例2～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液和冷冻干燥粉的电位均在-11～-23mv的较低范围内，表明它们将具有较稳定的电位势；并且同一实例所得悬液和冷冻干燥粉之间的电位值几乎相同，表明冷冻干燥对本发明纳米粒组合物的电位值无影响；实施例2～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液和冷冻干燥粉的平均粒径均在50～200nm范围内，Span值均在1.23～2.07；并且同一实例所得悬液和冷冻干燥粉之间的平均粒径和Span值几乎相同，表明冷冻干燥对本发明纳米粒组合物的粒度无影响。本发明人在一个补充试验中，分别参照本发明实施例1和实施例111的配方和制法，不同的仅是将其中的米铂用紫杉醇替代，结果平均粒径为253nm和271nm，Span值为4.71和4.26。本发明人在一个补充试验中，分别参照本发明实施例1和实施例111的配方和制法，不同的仅是将其中的米铂用顺铂替代，结果平均粒径为223nm和186nm，Span值为5.24和5.83。依据上述结果可对米铂白蛋白纳米粒的质量进行评价：其平均粒径小于200nm，符合纳米制剂的标准，粒径分布均匀，分散性较好且电位较低，比较稳定。

使实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液置室温放置6个月，测定6月时的zeta电位和粒度分布，比较每一试样6月与该试样0月结果的差异，结果：全部试样的zeta电位未出现变化；全部试样的平均粒径均稍有增加但均未超过250nm，各组间未显示变化的差异；不同试样的Span值呈现明显不同程度的增加，实施例1～实施例10所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液的Span增加百分数在167～192％范围内，实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液的Span增加百分数在23～31％范围内。使实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物冷冻干燥粉置40℃放置6个月，测定6月时的zeta电位和粒度分布，比较每一试样6月与该试样0月结果的差异，结果：全部试样的zeta电位未出现变化；全部试样的平均粒径均稍有增加但均未超过250nm，各组间未显示变化的差异；不同试样的Span值呈现明显不同程度的增加，实施例1～实施例10所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物冷冻干燥粉的Span增加百分数在153～186％范围内，实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物冷冻干燥粉的Span增加百分数在21～29％范围内。可见，实施例11所得纳米粒在粒度分布稳定性方面显著优于基本实例的纳米粒；尽管实施例1～实施例10纳米粒在临床应用上尚可接受，然而从稳定性角度讲，实施例11纳米粒是优选的。在本文中，Span增加百分数的计算式为：Span增加百分数＝[(6月Span值-0月Span值)÷0月Span值]×100％。

试验例2：米铂白蛋白纳米粒中米铂的含量测定方法

使用高效液相色谱仪测定米铂白蛋白纳米粒的米铂含量，并计算其回收率。色谱条件如下：AgilentC₈(250nm×4.6nm，5μm)；流动相：甲醇-水(92:8)；流速1.0mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；进样量20μL。

米铂对照品溶液：精密称取5mg米铂，置于100mL容量瓶中，加入甲醇少量，超声使米铂完全溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得米铂对照品溶液(50μg/mL)。

供试品溶液的制备：精密称取/量取米铂白蛋白纳米粒混悬液或其冻干品适量置10mL量瓶中，加入甲醇3mL甲醇溶解或稀释，加甲醇稀释至刻度、摇匀、离心，上清液即为供试品溶液。

实施例1所得米铂白蛋白纳米粒组合物经本含量测定方法所得典型的色谱图见图4，米铂保留时间约17.7min，HPLC测定的方法学优良。

经测定，本发明实施例1～11全部米铂白蛋白纳米粒组合物的混悬液或其冻干品中米铂含量均在理论投料量的98～101％范围内，表明本发明制备纳米粒组合物的过程中基本没有活性成分的损失。

使实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液置室温放置6个月，使实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物冷冻干燥粉置40℃放置6个月，测定这些混悬液或冷冻干燥粉在0月时以及6月时的米铂含量，对于每一试样，以其6月含量除以0月含量再乘以100％所得百分数，作为在此6月处置后的米铂残余百分数，结果：实施例1～实施例11所得全部混悬液的米铂残余百分数均在96～98％范围内，实施例1～实施例11所得全部冷冻干燥粉的米铂残余百分数均在97～99％范围内，表明本发明各种组合物呈现优异的活性成分化学稳定性。

试验例3：米铂白蛋白纳米粒组合物的性质考察

实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液和冷冻干燥粉，将其用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml时，pH值均在6.5～7.5范围内。

实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物冷冻干燥粉，其照水分测定法(中国药典2015年版四部附录第103页第0832节第一法A)测定，水分含量均在1.2～1.8％范围内。

实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物冷冻干燥粉，其加入0.9％氯化钠溶液使米铂浓度为1mg/ml时的量，轻轻振摇，均在6～9分钟内显示完全分散均匀，并且无未分散的固体物。

实施例1～实施例11所得全部米铂白蛋白纳米粒组合物悬液和冷冻干燥粉，用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml后，用中国药典2005年版二部附录IX C显微计数法测定，每100mg米铂白蛋白纳米粒组合物中含10μm以上的微粒少于200粒，含25μm以上的微粒少于15粒。

Claims (10)

1.一种包含米铂的白蛋白纳米粒制剂组合物，该组合物中包含100重量份的米铂以及100～1000重量份的白蛋白。

2.根据权利要求1的组合物，其中包含100重量份的米铂以及150～800重量份的白蛋白；例如，其中包含100重量份的米铂以及150～600重量份的白蛋白；例如，其中包含100重量份的米铂以及200～500重量份的白蛋白。

3.根据权利要求1的组合物，其中：

所述米铂是以其无水物或者一水合物的形式添加的；

所述白蛋白是选自下列的白蛋白：卵白蛋白、牛血白蛋白、人血白蛋白、重组人白蛋白等，优选的是人血白蛋白或重组人白蛋白；

其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇、磷脂、卵磷脂、PEG化磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、甘油磷脂酸(PA)、合成磷脂等类型的磷酯；

以每100重量份的米铂计，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇2～10重量份、磷脂5～20重量份、卵磷脂5～20重量份、PEG化磷脂5～20重量份、磷脂酰胆碱(PC)5～20重量份、磷脂酰甘油(PG)5～20重量份、磷脂酰乙醇胺(PE)5～20重量份、磷脂酰丝氨酸(PS)5～20重量份、磷脂酰肌醇(PI)5～20重量份、甘油磷脂酸(PA)5～20重量份、合成磷脂5～20重量份；

以每100重量份的米铂计，其中还任选的包含一种或多种选自下列的辅料：胆固醇2～5重量份、磷脂5～10重量份、卵磷脂5～10重量份、PEG化磷脂5～10重量份、磷脂酰胆碱(PC)5～10重量份、磷脂酰甘油(PG)5～10重量份、磷脂酰乙醇胺(PE)5～10重量份、磷脂酰丝氨酸(PS)5～10重量份、磷脂酰肌醇(PI)5～10重量份、甘油磷脂酸(PA)5～10重量份、合成磷脂5～10重量份；或者其中还包含中链脂肪酸；

所述磷脂选自：蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(即DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(即DMPG)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、及其组合；和/或

还包含聚乙二醇修饰的磷脂；例如，所述PEG化磷脂中的聚乙二醇的分子量为1000～10000道尔顿。

4.根据权利要求1的组合物，其中：

还任选的包含注射制剂辅料，例如酸碱调节剂、渗透压调节剂、冻干赋形剂等；

所述酸碱调节剂的量是，使该组合物在用注射用水稀释制成米铂浓度为1mg/ml的溶液时，溶液的pH值为6.0～7.5，例如6.5～7.5；

所述渗透压调节剂当存在时，其用量是，使该组合物在用注射用水稀释制成米铂浓度为1mg/ml的溶液时，溶液的渗透压与浓度为0.9～2％氯化钠溶液的渗透压相当；和/或

以每100重量份的米铂计，其中的冻干赋形剂的量为0～1000重量份，例如0～500重量份，例如0～200重量份；冻干赋形剂可以选自：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇、右旋糖苷、甘氨酸等。

5.根据权利要求1～4的组合物，其是通过如下操作制备得到的：将水溶性物料溶解于水中制成水相，将水不溶性物料溶解于有机溶剂中制成油相，将水相和油相混合分散制成粗乳液，进一步将粗乳液在高压均质机中均质至微粒的平均粒径小于200nm，蒸发除去溶剂，得到纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

6.根据权利要求1～4的组合物，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(例如乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿、二氯甲烷等；优选的溶剂可以是氯仿；溶剂的用量是本领域技术人员根据技术经验容易确定的，并且通常是至少应保证各物料完全溶解的程度(但又不宜过量以减轻后续的蒸发除溶剂的工作量))溶解，作为油相；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于200nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

7.根据权利要求5或6的组合物，其中：

步骤(1)所得水相中白蛋白的浓度为3～15％，例如5～10％；

步骤(2)所得油相中米铂的浓度为2～20％，例如5～10％；

当存在时，所述胆固醇和各类磷脂与所述米铂一起添加至所述有机溶剂中制成油相；

步骤(1)和步骤(2)是在35～70℃(例如40～50℃)的温度下使各物料溶解；

步骤(3)中所述分散是在分散器中于5000-15000rpm下分散1-20min，例如于8000-10000rpm下分散2-10min；

步骤(4)中，在均质机中以5000～50000psi的压力均质处理10～60min，例如以10000～20000psi的压力均质处理20～45min，例如以15000psi的压力均质处理30min；

步骤(5)中，所述的蒸发是旋转蒸发；

所述的旋转蒸发是在30～50℃(例如35～45℃)的温度下旋转蒸发；

所述的旋转蒸发在减压下进行的；和/或

所述的旋转蒸发在减压0.05～0.1Mpa的压力下进行的，或者在减压0.06～0.09Mpa的压力下进行的。

8.根据权利要求5或6的组合物，其中：

当存在时，所述酸碱调节剂是在步骤(3)制备粗乳液前添加并调节pH值；必要时所述酸碱调节剂还在步骤(3)制得粗乳液后添加并调节pH值；必要时还在步骤(4)制得均质乳液后添加并调节pH值；必要时还在步骤(5)制得均质乳液后添加并调节pH值；或者，必要时还在步骤(5)冷冻干燥前添加并调节pH值；

当存在时，所述渗透压调节剂在预先用注射用水溶解并除菌过滤后，添加至步骤(5)过滤除菌所得米铂白蛋白纳米粒组合物中；

当存在时，所述冻干赋形剂在预先用注射用水溶解并除菌过滤后，添加至步骤(5)过滤除菌所得米铂白蛋白纳米粒组合物中，任选的调节药液pH值后，再进行冷冻干燥；

当存在时，所述中链脂肪酸与所述米铂一起添加至所述有机溶剂中制成油相；

其用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml时，pH值为6.0～7.5，例如6.5～7.5；

其为冷冻干燥粉针剂，其照水分测定法(中国药典2015年版四部附录第103页第0832节第一法

A)测定，含水分低于3.0％；

其加入0.9％氯化钠溶液使米铂浓度为1mg/ml时的量，轻轻振摇，在15分钟内显示完全分散均匀，并且无未分散的固体物；

其用0.9％氯化钠溶液分散均匀至米铂浓度为1mg/ml后，用中国药典2005年版二部附录IX C显微计数法测定，每100mg米铂白蛋白纳米粒组合物中含10μm以上的微粒少于1000粒例如少于500粒，含25μm以上的微粒少于100粒例如少于50粒；

其用蒸馏水分散均匀或稀释至米铂浓度为1mg/ml后，必要时再用蒸馏水适当稀释，用纳米粒度仪测定，平均粒径小于200nm(例如平均粒径为20～200nm，例如平均粒径为30～200nm，例如平均粒径为40～200nm，例如平均粒径为50～200nm，例如平均粒径为30～180nm，例如平均粒径为30～150nm)，粒径小于10nm的微粒少于5％(例如粒径小于15nm的微粒少于5％)，粒径大于500nm的微粒少于5％(例如粒径大于400nm的微粒少于5％，粒径大于300nm的微粒少于5％)；和/或

其用蒸馏水分散均匀或稀释至米铂浓度为1mg/ml后，必要时再用蒸馏水适当稀释，用纳米粒度仪测定并计算纳米粒的粒径D10、D50、和D90值(通常亦分别理解为10％粒子小于此值的粒径、50％粒子小于此值的粒径或称中值粒径、90％粒子小于此值的粒径)，以下式计算供试品纳米粒的径距Span值：Span＝(Dv90-Dv10)/Dv50；该组合物的Span小于5，特别是小于3，更特别的是小于2.5，更特别的是小于2。

9.制备权利要求1～8任一项所述组合物的方法，该方法包括如下步骤：将水溶性物料溶解于水中制成水相，将水不溶性物料溶解于有机溶剂中制成油相，将水相和油相混合分散制成粗乳液，进一步将粗乳液在高压均质机中均质至微粒的平均粒径小于200nm，蒸发除去溶剂，得到纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分；或者，其包括如下步骤：

(1)将处方量的白蛋白用水溶解，作为水相；

(2)将处方量的米铂用有机溶剂(例如乙醚、乙酸乙酯、叔丁醇、氯仿、二氯甲烷等；优选的溶剂可以是氯仿；溶剂的用量是本领域技术人员根据技术经验容易确定的，并且通常是至少应保证各物料完全溶解的程度(但又不宜过量以减轻后续的蒸发除溶剂的工作量))溶解，作为油相；

(3)将水相与油相混合后，使用分散器分散制得粗乳液；

(4)将粗乳液转入高压均质机中于均质直至均匀且微粒的平均粒径小于200nm；

(5)在旋转蒸发器上旋蒸将残余的有机溶剂蒸发除去(直至有机溶剂残余量小于100ppm)，接着用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌，制成米铂白蛋白纳米粒组合物，任选地将其冷冻干燥除去水分。

10.权利要求1～8任一项所述组合物或者权利要求所述方法制备的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途；例如，所述癌症例如但不限于肝癌、胰腺癌。