CN109721642B

CN109721642B - 一种i群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN109721642B
Application number: CN201811599362.1A
Authority: CN
Inventors: 王增福; 李跃; 崔松奇; 吴宗学; 史张艳; 程海波
Original assignee: Qyh Biotech Co ltd
Current assignee: Qyh Biotech Co ltd
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109721642A

Abstract

本发明公开了一种I群血清4型‑血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法，其包含具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的4型禽腺病毒纤维蛋白和具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的8型禽腺病毒纤维蛋白。本发明采用禽腺病毒血清4型和血清8型全长的纤维蛋白为免疫原制备二价亚单位疫苗，经特定的密码子优化方式优化后，血清4型和血清8型的纤维蛋白的表达量和可溶性表达量显著提高。本发明提供的二价亚单位疫苗的具有较高的安全性，能够快速诱导免疫动物产生高水平的中和抗体，实现禽腺病毒血清4型和血清8型的高效免疫保护，且疫苗的制备过程简单，成本低，易于大规模生产。

Description

一种I群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种I群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV-I)属于腺病毒科，禽腺病毒属。禽腺病毒是常见的传染病病原，在世界范围内广泛存在于多种禽类的呼吸道和消化道，仅少数禽腺病毒具有致病性，多数腺病毒可在禽体内复制，但并不表现出临床症状或症状非常轻微，在混合感染时，腺病毒可成为条件性病原，可以使鸡群呈隐性感染或作为继发病原引起鸡群发病和死亡。

禽腺病毒根据群特异性抗原的不同分为I、II、III三个亚群，目前I亚群中有5个种、12个血清型，分别为A(血清1型)、B(血清5型)、C(血清4型)、D(血清2型、血清3型、血清9型和血清11型)、E(血清6型、血清7型和血清8型)。临床上I亚群禽腺病毒可引起鸡包涵体肝炎和心包积液-肝炎综合征(安卡拉病)，其中，心包积液-肝炎综合症(安卡拉病)是由I亚群禽腺病毒中的血清4型所导致的传染性疾病；包涵体肝炎则是由I亚群禽腺病毒中的其余血清型所引起。目前，大多数禽腺病毒I型病毒的致病性还未完全明确，不同血清型的致病性有较大差异。II亚群是火鸡出血性肠炎和鸡大脾病的病原，III亚群引起鸡产蛋下降综合症。

由血清4型禽腺病毒引起的心包积液－肝炎综合症(hydropericardium-hepatitis syndrome(HHS))，又称“安卡拉病”，该病一年四季均能发生，夏秋季节多发。病毒主要存在于鸡的眼、上呼吸道以及消化道，通过种蛋、鸡胚垂直感染，也能通过粪便、飞沫水平传播。死亡鸡90％以上有明显的心包积水，积水量可多达20毫升，颜色淡黄而澄清，心包呈水囊状，心脏畸形，松弛柔软。肝脏肿大，质脆，外观呈浅黄至深黄色，并有坏死灶，肝细胞可见有嗜碱性核内包涵体。肾脏苍白，肿大，上面有突起的小管，肾小管上皮细胞变性。气管出血，肺脏出血、肿大，呈紫黑色。皮下脂肪变黄。胸腺肿大、出血。腺胃出血，肌胃糜烂，肠黏膜出血，脾脏肿大。

血清8型禽腺病毒也是禽腺病毒主要流行的血清型之一，主要引起鸡的包涵体肝炎。血清8型禽腺病毒主要感染3-8周龄的各种鸡只。血清8型禽腺病毒毒力弱于血清4型禽腺病毒，因此总体死亡率通常在10％以下，但有时可达到30％。该病的特征性病理变化为包涵体肝炎，表现为肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆易碎，肿胀、呈脂肪变性，表面有不同程度的出血点或出血斑，伴发局灶性坏死，在肝细胞核内可见嗜碱性或嗜酸性的包涵体，边缘较大而清晰，呈圆形或形状不规则。

虽然心包积液-肝炎综合征和包涵体肝炎在病理组织变化上十分相似，但引起这两种疾病的禽腺病毒血清4型和血清8型并不相同，在流行规律和病变特征上也存在一定差异，而且禽腺病毒不同血清型之间交叉保护比较弱。因此仍需要结合流行病学资料研制对型的I群禽腺病毒疫苗。目前，尚未有血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位灭活疫苗的报道。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种I群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

首先，本发明通过PCR扩增和测序分析获得分离得到的禽腺病毒毒株QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白编码基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列：禽腺病毒毒株QYHFADV-4的纤维蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；禽腺病毒毒株QYHFADV-8的纤维蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。其中，QYHFADV-8的纤维蛋白与NCBI数据库公开的所有已知的禽腺病毒纤维蛋白的氨基酸序列同源性为93.4-99.4％。

进一步地，发明人利用上述获得的QYHFADV-4的纤维蛋白和QYHFADV-8的纤维蛋白作为免疫原制备禽腺病毒血清4型-血清8型二价亚单位疫苗。经过大量研究，发明人发现采用全长的禽腺病毒纤维蛋白作为亚单位疫苗的免疫原，能够使得亚单位疫苗实现更好的免疫保护，因为全长蛋白具有完整的三维结构，而具有更稳定和更好的免疫原性。然而，在表达制备抗原蛋白时，大部分的全长禽腺病毒纤维蛋白以包涵体形式存在，且表达量较低，提取纯化制备大量的抗原蛋白十分困难，全长的禽腺病毒纤维蛋白的表达量提高和可溶性表达一直是本领域面临的技术难题，本发明采用特定的密码子优化方式，经过大量的筛选和对比实验，得到了具有显著提高的表达量和可溶性表达水平的QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白编码基因序列，并利用得到的大量可溶性表达的QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白制备禽腺病毒血清4型-血清8型二价亚单位疫苗。

第一方面，本发明提供一种禽腺病毒纤维蛋白，所述纤维蛋白具有如下任意一种的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供编码所述纤维蛋白的基因。

优选地，所述基因具有如下任意一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的缺失、替换或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供禽腺病毒纤维蛋白编码基因，所述基因具有如SEQ ID NO.4所示或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明中，如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过特定的密码子优化得到。

本发明中，如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列经过特定的密码子优化得到。

第四方面，本发明提供含有所述禽腺病毒纤维蛋白编码基因的生物材料，所述生物材料包含表达盒、载体、宿主细胞。

本发明中，所述载体和宿主细胞可理解为本领域技术人员在进行基因克隆或表达时使用的各种载体和宿主细胞。随着科技发展，所述载体和宿主细胞的选择也许会发生变化，但只要含有本发明所述的禽腺病毒纤维蛋白编码基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围之内。

第五方面，本发明提供编码所述禽腺病毒纤维蛋白的基因或含有所述基因的生物材料在制备治疗或预防禽腺病毒药物中的应用。

所述治疗或预防禽腺病毒药物包括但不限于疫苗。

第六方面，本发明提供一种禽腺病毒亚单位疫苗，其包含血清4型禽腺病毒纤维蛋白和/或血清8型禽腺病毒纤维蛋白；

所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述血清8型禽腺病毒纤维蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白由如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码；所述血清8型禽腺病毒纤维蛋白由如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列编码。

进一步地，本发明提供含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的4型禽腺病毒纤维蛋白和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的8型禽腺病毒纤维蛋白的禽腺病毒二价亚单位疫苗。

本发明中，所述亚单位疫苗中4型禽腺病毒纤维蛋白和8型禽腺病毒纤维蛋白的质量比为1：1～1：3。

优选地，本发明中所述亚单位疫苗中4型禽腺病毒纤维蛋白和8型禽腺病毒纤维蛋白的质量比为1：1。

第七方面，本发明提供一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，包括表达具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列的4型禽腺病毒纤维蛋白和/或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的8型禽腺病毒纤维蛋白的步骤。

所述表达为通过分别将如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列连接至表达载体实现。

优选地，所述表达的宿主为肠杆菌属细菌。

所述表达载体为pET28、pET30、pET32系列载体中的一种。

本发明中，所述亚单位疫苗的制备方法还包括宿主细胞的培养、收集、破碎、抗原蛋白的提取、纯化，以及将得到的抗原蛋白与佐剂混合制备亚单位疫苗的步骤。

具体地，本发明中，所述禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：

(1)对所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白的编码基因进行密码子优化，分别得到具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的基因；

(2)分别构建含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的表达载体；

(3)将所述表达载体转化肠杆菌属细菌，得到分别表达血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白的重组菌；

(4)培养所述重组菌，表达所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白；

(5)提取所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白和8血清型禽腺病毒纤维蛋白，利用得到的抗原蛋白制备禽腺病毒亚单位疫苗。

本发明中，利用得到的抗原蛋白制备禽腺病毒亚单位疫苗的方法可以采用本领域疫苗制备的常用方法，如加入本领域允许的佐剂与抗原蛋白混合制备得到。

本发明中，所述佐剂可以选择疫苗制备领域允许的常用佐剂，包括但不限于各种铝盐，如硬脂酸铝、氢氧化铝等。

作为本发明的优选实施方式，本发明中，所述利用得到的抗原蛋白制备禽腺病毒亚单位疫苗的方法包括如下步骤：

(1)油相制备：取矿物油、硬脂酸铝，混合均匀、加热后加入司本80，加热混匀，冷却后得到油相；

(2)水相制备：将血清4型禽腺病毒毒株QYHFADV-4的纤维蛋白和血清8型禽腺病毒毒株QYHFADV-8的纤维蛋白按1：1混合后与灭菌的吐温80充分混匀；

(3)乳化制备：将油相和水相乳化后得到二价亚单位疫苗。

本发明的有益效果在于：本发明采用血清4型禽腺病毒毒株QYHFADV-4和血清8型禽腺病毒毒株QYHFADV-8的全长的纤维蛋白为免疫原制备血清4型-血清8型二价亚单位疫苗，经特定的密码子优化方式优化后，血清4型和血清8型的纤维蛋白的宿主表达量显著提高，且可溶性表达蛋白占总表达量的80％以上，经简单纯化就可以得到高纯度的抗原蛋白。本发明提供的经特定密码子优化处理的纤维蛋白编码基因序列较未经密码子优化的序列以及采用密码子优化软件等常用的密码子优化方法得到的序列具有显著提高的可溶性表达效果。

利用得到的血清4型和血清8型的纤维蛋白作为抗原蛋白制备的亚单位疫苗具有安全性高、免疫效力高的优势，在免疫动物后，能够快速诱导高水平的中和抗体的产生，实现鸡禽腺病毒血清4型和血清8型的高效免疫保护，且疫苗的制备过程简单，成本低，易于大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中血清4型毒株QYHFADV-4和血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白的序列同源性和系统进化树分析结果；其中A为血清4型毒株QYHFADV-4的纤维蛋白与NCBI公开的部分禽腺病毒纤维蛋白的序列同源性分析结果；B为血清4型毒株QYHFADV-4的纤维蛋白与NCBI公开的部分禽腺病毒纤维蛋白的进化树分析结果；C为血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白与NCBI公开的部分禽腺病毒纤维蛋白的序列同源性分析结果；D为血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白与NCBI公开的部分禽腺病毒纤维蛋白的进化树分析结果。

图2为本发明实施例2中I群禽腺病毒血清4型毒株QYHFADV-4和血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白的诱导表达SDS-PAGE电泳检测结果图，其中泳道1-3分别为3个不同PET30a-QYHFADV-4 fiber克隆诱导表达收获的全菌，泳道4为Marker，Marker条带的分子量大小从上至下依次为245kD，180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，20kD和17kD，泳道5-7分别为3个不同PET30a-QYHFADV-8 fiber克隆诱导表达收获的全菌。箭头所指为纤维蛋白目的条带。

图3为本发明实施例2中I群禽腺病毒血清4型毒株QYHFADV-4和血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白的诱导表达SDS-PAGE电泳检测结果图，其中，泳道1为Marker，Marker条带的分子量大小从上至下依次为245kD，180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，20kD和17kD，泳道2-4分别为0.5mg/ml、1mg/ml BSA和2mg/ml BSA标准，泳道5-7分别为PET30a-QYHFADV-4 fiber低温诱导表达的全菌、超声上清和超声沉淀，泳道8-10为PET30a-QYHFADV-8 fiber低温诱导表达的全菌、超声上清和超声沉淀。箭头所指为纤维蛋白目的条带。

图4为本发明实施例2中I群禽腺病毒血清4型毒株QYHFADV-4和血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白在未经密码子优化前和经密码子优化后的诱导表达SDS-PAGE电泳检测结果图，其中，泳道1为Marker，Marker条带的分子量大小从上至下依次为245kD，180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，20kD和17kD，泳道2为未经密码子优化的QYHFADV-8纤维蛋白基因表达菌株PET30a-QYHFADV-8/fiber的诱导表达的上清，泳道3为未经密码子优化的QYHFADV-4纤维蛋白基因表达菌株PET30a-QYHFADV-4/fiber的诱导表达的上清，泳道4为未经密码子优化的QYHFADV-8纤维蛋白基因表达菌株PET30a-QYHFADV-8/fiber的诱导表达的上清，泳道5为经密码子优化的QYHFADV-4纤维蛋白基因表达菌株PET30a-QYHFADV-4 fiber的诱导表达的上清，泳道5为经密码子优化的QYHFADV-8纤维蛋白基因表达菌株PET30a-QYHFADV-8 fiber的诱导表达上清；箭头所指为纤维蛋白目的条带。

图5为本发明实施例3中用于二价亚单位疫苗制备的I群禽腺病毒血清4型毒株QYHFADV-4和血清8型毒株QYHFADV-8的纤维蛋白的诱导表达SDS-PAGE电泳检测结果图，其中，泳道1为Marker，Marker条带的分子量大小从上至下依次为245kD，180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，20kD和17kD，泳道2-4分别为0.5，0.75，1mg/mLBSA蛋白标准，泳道5-6分别为PET30a-QYHFADV-4 fiber低温诱导表达的全菌和超声上清，泳道7-8分别为PET30a-QYHFADV-8 fiber低温诱导表达的全菌和超声上清和超声沉淀。箭头所指为纤维蛋白目的条带。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1禽腺病毒毒株QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白序列分析

由患禽腺病毒病的发病鸡中分离得到的禽腺病毒毒株QYHFADV-4和QYHFADV-8，通过PCR扩增获得的其纤维蛋白编码基因，经测序分析得到编码基因的核苷酸序列及其对应的蛋白的氨基酸序列，其中，禽腺病毒毒株QYHFADV-4的纤维蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；禽腺病毒毒株QYHFADV-8的纤维蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。对上述得到的来源于QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白与现有技术中公开的禽腺病毒纤维蛋白进行序列同源性和系统进化树分析，结果表明，QYHFADV-4的纤维蛋白与NCBI数据库公开的已知禽腺病毒纤维蛋白的序列同源性为88.1-100％(如图1的A所示)，其进化树分析如图1的B所示；QYHFADV-8的纤维蛋白与NCBI数据库公开的已知禽腺病毒纤维蛋白的氨基酸序列同源性为93.4-99.4％(如图1的C所示)；其进化树分析如图1的D所示。

实施例2血清4型和血清8型禽腺病毒纤维蛋白的可溶性表达

为提高纤维蛋白的表达量和可溶性表达水平，首先对血清4型禽腺病毒毒株QYHFADV-4的纤维蛋白编码基因(如SEQ ID NO.3所示)和血清8型禽腺病毒毒株QYHFADV-8的纤维蛋白编码基因(如SEQ ID NO.5所示)进行密码子优化。参考大肠杆菌宿主菌的密码子偏好性，经过大量筛选和对比实验，最终确定QYHFADV-4的纤维蛋白基因的密码子优化如下(括号内为优化后的同义密码子)：精氨酸6个位点，分别4处AGA(CGC)，1处AGG(CGC)和CGA(CGC)(分别对应SEQ ID NO.1的第7、8、34、85、338和第440位)；亮氨酸6个位点，CTA(CTG)(分别对应SEQ ID NO.1的第65、210、231、255、264和第444位)；脯氨酸16个位点CCC(CCG)(分别对应SEQ ID NO.1的第15、50、64、79、93、109、117、178、244、282、291、364、374、384、431和第468位)；异亮氨酸2个位点ATA(ATC)(分别对应SEQ ID NO.1的第319位和第425位)；一处限制性酶切位点突变CTC(CTG)(对应SEQ ID NO.1的第188位)。

QYHFADV-8的纤维蛋白基因的密码子优化如下：精氨酸5个位点优化，分别3处AGA(CGC)，1处AGG(CGC)和CGA(CGC)(分别对应SEQ ID NO.2的第17、27、182、363和第379位)；亮氨酸4个位点，CTA(CTG)(分别对应SEQ ID NO.2的第172、288、359和第417位)；脯氨酸15个位点CCC(CCG)(分别对应SEQ ID NO.2的第38、55、84、87、102、133、168、171、206、209、230、283、308、373和第403位)；异亮氨酸2个位点ATA(ATC)(分别对应SEQ ID NO.2的第144和第304位)优化；一处限制性酶切位点突变CTC(CTG)(对应SEQ ID NO.2的第119位)。经密码子优化前和优化后的QYHFADV-4纤维蛋白基因序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。密码子优化前和优化后的QYHFADV-8纤维蛋白基因序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

合成上述经密码子优化的QYHFADV-4和QYHFADV-8纤维蛋白基因，将密码子优化后的QYHFADV-4和QYHFADV-8纤维蛋白基因分别经Nde I/Xho I酶切后克隆到pET-30a载体中，得到的重组表达载体分别命名为pET30a-QYHFADV-4 fiber和pET30a-QYHFADV-8 fiber。将pET30a-QYHFADV-4 fiber和pET30a-QYHFADV-8 fiber重组质粒转化至大肠杆菌BL21。将得到的重组菌(PET30a-QYHFADV-4 fiber和PET30a-QYHFADV-8 fiber)接种至卡那抗性培养基，37℃震荡培养4-5h，至OD₆₀₀达到0.8左右后加入IPTG，16℃诱导15h。收获菌体，超声破碎后离心，SDS-PAGE电泳分析表达情况。

QYHFADV-4纤维蛋白的分子量大小为58kD，QYHFADV-8纤维蛋白的分子量大小为48kD；纤维蛋白的诱导表达结果如图2和图3所示，其中，图2的1-3泳道分别为3个不同PET30a-QYHFADV-4 fiber克隆诱导表达收获的全菌，4泳道为Marker，5-7泳道分别为3个不同PET30a-QYHFADV-8 fiber克隆诱导表达收获的全菌。图3的1泳道为Marker，2-4泳道分别为0.5mg/ml、1mg/ml BSA和2mg/ml BSA标准，5-7泳道分别为PET30a-QYHFADV-4 fiber诱导表达的全菌、超声上清和超声沉淀，8-10泳道为PET30a-QYHFADV-8 fiber诱导表达的全菌、超声上清和超声沉淀。结果表明，经密码子优化的血清4型和血清8型禽腺病毒的纤维蛋白主要以可溶性表达形式存在，可溶性蛋白约占总表达量的80％以上。

将未经密码子优化的QYHFADV-4纤维蛋白基因(如SEQ ID NO.3所示)和QYHFADV-8纤维蛋白基因(如SEQ ID NO.5所示)，分别经Nde I/Xho I酶切后克隆到pET-30a载体中，得到的重组表达载体分别命名为pET30a-QYHFADV-4/fiber和pET30a-QYHFADV-8/fiber。将pET30a-QYHFADV-4/fiber和pET30a-QYHFADV-8/fiber重组质粒转化至大肠杆菌BL21。将密码子优化前PET30a-QYHFADV-4/fiber和PET30a-QYHFADV-8/fiber及密码子优化后PET30a-QYHFADV-4 fiber和PET30a-QYHFADV-8 fiber接种至卡那抗性培养基中，37℃震荡培养4-5h，至OD₆₀₀达到0.8左右后加入IPTG，16℃诱导15h，收获菌体，SDS-PAGE电泳分析表达情况。SDS-PAGE结果如图4所示，结果表明，未经密码子优化前，禽腺病毒QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白的表达量极低，而经密码子优化后，禽腺病毒QYHFADV-4和QYHFADV-8的可溶性蛋白表达量显著提高，经灰度分析计算，禽腺病毒QYHFADV-4蛋白表达量提高10倍以上，QYHFADV-8表达量提高6倍以上。

实施例3血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗的制备

1、血清4型和血清8型禽腺病毒QYHFADV-4和QYHFADV-8的纤维蛋白抗原的表达：

(1)基因工程菌活化，取实施例2构建的工程菌PET30a-QYHFADV-4 fiber和PET30a-QYHFADV-8 fiber的甘油菌10μL接种于5ml卡那抗性LB培养基，震荡培养过夜；

(2)按1:200比例接种200mL卡那抗性培养基，37℃震荡培养4-5h，至OD₆₀₀值达到0.8左右；

(3)按1:2000加入IPTG，16℃诱导15h；

(4)收集菌体；

(5)用20mL专用buffer重悬细菌；

(6)超声破碎细菌；

(7)12000rpm离心10min，离心2次；

(8)SDS-PAGE电泳检测，分析抗原含量。

SDS-PAGE电泳检测结果如图5所示，其中，1泳道为Marker，2-4泳道分别为0.5，0.75，1mg/ml BSA蛋白标准，5-6泳道分别为PET30a-QYHFADV-4 fiber低温诱导表达的全菌和超声上清，7-8泳道为PET30a-QYHFADV-8 fiber低温诱导表达的全菌和超声上清和超声沉淀。经过灰度分析测算，计算FADV-4和FADV-8抗原浓度。

2、抗原蛋白的纯化和鉴定

由于可溶性蛋白表达量较大，可达100μg/mL诱导后菌液，杂蛋白含量较低，不需进行粗纯化。1mL上述步骤1的诱导后菌液经破碎后可配制10羽份疫苗。

3、血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗的制备

(1)油相制备：取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后，再加入5份司本80，至温度达到115℃时维持30分钟，冷却后完成油相制备；

(2)水相制备：分别将上述制备的4型和8型禽腺病毒亚单位抗原定量到1mg/mL后，按1：1比例混合；取混合抗原液95份，加入灭菌的5份吐温80，充分混匀；

(3)乳化：取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，3500r/min搅拌5分钟，8000r/min搅拌15分钟，完成乳化制备，得到二价亚单位疫苗。

4、二价亚单位疫苗的检验

①性状

外观：乳白色均匀乳剂。

剂型：油包水型，取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，除第一滴外，均未扩散。

稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5mL。

②无菌检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明，无菌生长。

实施例4血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗的效力分析

1、二价亚单位疫苗的安全性检验

(1)最小使用日龄、不同途径一次单剂量接种的安全性试验

将70只7日龄SPF鸡分成4组，1～3组免疫组各为20只，第4组对照组10只，1～3组免疫组每组再分成两小组，每小组各10只SPF鸡，通过不同的免疫途径(肌肉注射或颈部皮下注射)分别接种禽腺病毒血清4型-血清8型二价亚单位灭活疫苗(批次分别为20170712，20170805和20170820，制备方法同实施例3)，剂量为0.5mL/只；对照组10只SFP鸡颈部皮下注射灭菌生理盐水，剂量为0.5mL/只。各组鸡在同条件下分别饲养管理，连续观察14日；如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变；观察活鸡有无不良反应。接种后14天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。

最小使用日龄不同途径单剂量接种的安全试验，结果见表1。

表1最小使用日龄、不同途径单剂量接种的安全性试验结果

(2)单剂量重复接种的安全性试验

将40只14日龄SPF鸡分成4组，每10只，实验组1、实验组2和实验组3分别通过颈部皮下注射禽腺病毒血清4型-血清8型二价亚单位灭活疫苗(批次分别为20170712，20170805和20170820，，制备方法同实施例3)，剂量为0.5mL/只；对照组的10只SPF鸡颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日；观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。于第一次免疫后14天再以同样剂量重复接种，继续观察14天，观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。对鸡只的局部炎症、组织病变等进行评判。第二次免疫后14天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。单剂量重复接种安全性试验，结果见表2。

表2单剂量重复接种的安全性试验结果

(3)一次超剂量接种安全性试验

将40只14日龄SPF鸡分成4组，每10只，实验组1、实验组2和实验组3分别通过颈部皮下注射批号为20170712、20170805和20170820的禽腺病毒血清4型-血清8型二价亚单位灭活疫苗，剂量为2.0mL/只；对照组10只颈部皮下注射2.0mL/只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日，将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。超剂量接种的安全性试验，结果见表3。

表3超剂量接种的安全性试验结果

疫苗批号	免疫日龄	试验鸡数	免疫剂量	免疫途径	结果判定
						20170712	21	10只	2mL	颈部皮下	正常
20170805	21	10只	2mL	颈部皮下	正常
						20170820	21	10只	2mL	颈部皮下	正常
对照	21	10只	2mL	颈部皮下	正常

2、二价亚单位疫苗的免疫效力分析

取10日龄SPF鸡80只，分成8组，每10只，1～6组分别于颈部皮下接种3批禽腺病毒4、8型二价亚单位灭活疫苗(批号分别为20170712、20170805和20170820)，每只0.3mL。同时设置非免疫攻毒对照组，颈部皮下注射0.3mL/只PBS。免疫后21天采集血清，用琼脂凝胶免疫扩散方法检测抗体水平，同时，按10^6.0TCID50/只的剂量肌肉注射禽腺病毒4型QYHFADV-4株，按10^6.0TCID50/只的剂量静脉注射禽腺病毒8型QYHFADV-8株，连续观察14日。如有死亡，对死亡鸡只进行剖检，攻毒14天后将全部存活鸡只逐一剖检，观察内脏病变情况。血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗的免疫效力检测结果如表4所示，结果表明，采用实施例3的方法制备的二价亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够快速、有效地诱导高水平中和抗体的产生，攻毒后，疫苗免疫鸡均没有发病，实现了100％的免疫保护，而未免疫鸡发病率很高，并且具有明显的临床症状。

表4二价疫苗免疫效力的检验

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 乾元浩生物股份有限公司

<120> 一种I群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法

<130> KHP181117127.9

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr

260 265 270

Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser

275 280 285

Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ala Asn Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln

305 310 315 320

Gly Leu Leu Val Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met

325 330 335

Gly Asn Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr

340 345 350

Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln

355 360 365

Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro

370 375 380

Met Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly

385 390 395 400

Tyr Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val

405 410 415

Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val

420 425 430

Pro Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu

435 440 445

Gln Cys Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met

450 455 460

Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro

465 470 475

<210> 2

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Ser Thr Pro His Ala Phe Ser Phe Gly Gln Ile Gly Ser

1 5 10 15

Arg Lys Arg Pro Ala Gly Gly Asp Gly Glu Arg Asp Ala Ser Lys Val

20 25 30

Pro Lys Met Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Asn Asp

35 40 45

Glu Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Trp Leu Gln Asn Gly Ser Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro

65 70 75 80

Phe Leu Asp Pro Asn Gly Pro Leu Thr Val Gln Asn Asn Leu Leu Lys

85 90 95

Val Asn Thr Thr Ala Pro Ile Gly Val Thr Asn Lys Ala Leu Thr Leu

100 105 110

Ala Tyr Asp Pro Glu Ser Leu Glu Leu Thr Asp Gln Gln Gln Leu Ala

115 120 125

Val Lys Ile Asp Pro Glu Gly Pro Leu Lys Ala Thr Thr Glu Gly Ile

130 135 140

Gln Leu Ser Val Asp Pro Thr Thr Leu Glu Val Asp Asp Val Asp Trp

145 150 155 160

Glu Leu Thr Val Lys Leu Asp Pro Asn Gly Pro Leu Asp Ser Ser Ala

165 170 175

Thr Gly Ile Thr Val Arg Val Asp Asp Thr Leu Leu Val Glu Asp Asp

180 185 190

Gly Ser Gly Gln Gly Lys Glu Leu Gly Val His Leu Asn Pro Asp Gly

195 200 205

Pro Ile Thr Ala Asp Gln Asn Gly Leu Asp Leu Glu Ile Asp Asn Gln

210 215 220

Thr Leu Lys Ile Thr Pro Gly Ser Ala Gly Gly Val Leu Ser Val Gln

225 230 235 240

Leu Lys Pro Gln Gly Gly Leu Asn Ser Gln Ser Asp Gly Ile Gln Val

245 250 255

Val Thr Gln Asn Ser Ile Glu Val Asp Asn Gly Ala Leu Asp Val Lys

260 265 270

Val Val Ala Asn Gly Pro Leu Ser Thr Thr Pro Asn Gly Leu Thr Leu

275 280 285

Asn Tyr Asp Thr Gly Asp Phe Thr Val Asn Ala Gly Thr Leu Ser Ile

290 295 300

Leu Arg Asn Pro Ser Leu Val Ala Asn Ala Tyr Leu Thr Ser Gly Ala

305 310 315 320

Ser Thr Leu Gln Gln Phe Thr Ala Lys Gly Glu Asn Ser Ser Gln Phe

325 330 335

Ser Phe Pro Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Leu Ser Asp Gly Leu

340 345 350

Ile Phe Ser Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Arg Thr Arg Phe Thr Gly

355 360 365

Met Ser Ser Asp Pro Ser Tyr Gln Asn Ala Arg Tyr Phe Thr Phe Trp

370 375 380

Val Gly Gly Gly Ala Ala Met Asn Leu Ser Gln Leu Ser Thr Pro Thr

385 390 395 400

Ile Thr Pro Ser Thr Thr Glu Trp Thr Ala Val Cys Ser Arg Pro Lys

405 410 415

Leu Leu Arg Cys Ala Arg Leu Arg Leu

420 425

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgctccggg cccctaaacg ccgccattcc gaaaacggga agccggagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtgc gcgcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccg gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac cgctggtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatccgatc 240

atcatcaaga accgctcggt ggacttggcc cacgacccga gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgacccggaa ggggccctgg acatcacccc ggatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg accgatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaacctg aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctgcagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc cgagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctggggct gaagtacgac 780

actaataccc tggcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acaccgatcg ctacttttgt ctcgggaagt ccgagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatccag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cgtccgggat tcaagcggga acggtcagcc cgtccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac cgatggccaa tcgcagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatcgggat ccgcgtcctc ccggtgccgg tttcggcctc cggagagcgc 1320

tacacccttc tgtgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg accggtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 5

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcgacct cgactccgca cgccttctcc tttggccaaa tcggctccag aaaacgccct 60

gcgggcggcg atggcgagcg agacgcctcc aaagtgccga aaatgcagac ccccgcgccg 120

agcgcgaccg ccaacggaaa tgacgagctg gacctggtct accccttttg gctccaaaac 180

ggctctaccg gaggaggcgg cggcggcggt tccggtggaa acccgtccct caacccgccg 240

tttttggacc ccaacggacc cctgaccgtc caaaacaacc tcctgaaggt caataccacg 300

gcccccatcg gcgtcaccaa taaggccctg acactcgcct atgatccgga gagtctcgag 360

ctcactgacc agcagcaact ggcggtcaaa atcgaccccg aaggacctct gaaggccact 420

accgagggaa tacagctgtc ggtcgaccct acgacgttgg aggttgatga cgtcgactgg 480

gagttaaccg tgaaactcga ccccaacggc cccctagatt cctcagccac aggaatcacg 540

gtcagagtcg atgacacctt gctcgtcgag gatgacggtt ccggtcaagg caaagaactg 600

ggcgtacacc ttaaccccga cggacccatt acggcagacc aaaacggtct cgacctggaa 660

atcgacaacc agactcttaa aatcaccccc ggctcggcgg gcggtgttct ttcggtgcag 720

ctgaaaccac agggaggtct gaattcccaa tccgatggta tccaggtggt aacccagaac 780

agtatcgaag ttgataacgg cgcactcgat gttaaggtag tcgctaacgg tccactgtct 840

acaactccca acggtcttac cctaaactac gataccggtg acttcaccgt aaatgccggg 900

accttaagca tacttcggaa cccctctctc gtcgccaatg cctatcttac gtccggggca 960

tctacactgc aacagttcac cgctaaaggg gaaaactcta gtcagttttc ctttccatgt 1020

gcttattatc ttcaacagtg gttatcggat ggactcattt tcagttccct ctacctaaag 1080

ttagatagga cgcgcttcac agggatgtcc agcgatccct cctatcaaaa cgccagatat 1140

ttcacgttct gggtaggggg cggcgcggct atgaatctct cccagttaag tacaccgacg 1200

attaccccca gtactaccga gtggactgca gtttgctccc gccctaaact actccggtgc 1260

gcccgccttc gtttatga 1278

<210> 6

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcgacct cgactccgca cgccttctcc tttggccaaa tcggctcccg caaacgccct 60

gcgggcggcg atggcgagcg cgacgcctcc aaagtgccga aaatgcagac cccggcgccg 120

agcgcgaccg ccaacggaaa tgacgagctg gacctggtct acccgttttg gctccaaaac 180

ggctctaccg gaggaggcgg cggcggcggt tccggtggaa acccgtccct caacccgccg 240

tttttggacc cgaacggacc gctgaccgtc caaaacaacc tcctgaaggt caataccacg 300

gccccgatcg gcgtcaccaa taaggccctg acactcgcct atgatccgga gagtctggag 360

ctcactgacc agcagcaact ggcggtcaaa atcgacccgg aaggacctct gaaggccact 420

accgagggaa tccagctgtc ggtcgaccct acgacgttgg aggttgatga cgtcgactgg 480

gagttaaccg tgaaactcga cccgaacggc ccgctggatt cctcagccac aggaatcacg 540

gtccgcgtcg atgacacctt gctcgtcgag gatgacggtt ccggtcaagg caaagaactg 600

ggcgtacacc ttaacccgga cggaccgatt acggcagacc aaaacggtct cgacctggaa 660

atcgacaacc agactcttaa aatcaccccg ggctcggcgg gcggtgttct ttcggtgcag 720

ctgaaaccac agggaggtct gaattcccaa tccgatggta tccaggtggt aacccagaac 780

agtatcgaag ttgataacgg cgcactcgat gttaaggtag tcgctaacgg tccactgtct 840

acaactccga acggtcttac cctgaactac gataccggtg acttcaccgt aaatgccggg 900

accttaagca tccttcggaa cccgtctctc gtcgccaatg cctatcttac gtccggggca 960

tctacactgc aacagttcac cgctaaaggg gaaaactcta gtcagttttc ctttccatgt 1020

gcttattatc ttcaacagtg gttatcggat ggactcattt tcagttccct ctacctgaag 1080

ttagatcgca cgcgcttcac agggatgtcc agcgatccgt cctatcaaaa cgcccgctat 1140

ttcacgttct gggtaggggg cggcgcggct atgaatctct cccagttaag tacaccgacg 1200

attaccccga gtactaccga gtggactgca gtttgctccc gccctaaact gctccggtgc 1260

gcccgccttc gtttatga 1278

Claims

1.一种禽腺病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括表达核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的4型禽腺病毒纤维蛋白的编码基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的8型禽腺病毒纤维蛋白的编码基因的步骤。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达为通过分别将如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列连接至表达载体实现。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达的宿主为肠杆菌属细菌；

所述表达载体为pET28、pET30、pET32系列载体中的一种。

4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白的编码基因进行密码子优化，分别得到如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的纤维蛋白编码基因；

（2）分别构建含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的表达载体；

（3）将所述表达载体转化肠杆菌属细菌，得到分别表达血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白的重组菌；

（4）培养所述重组菌，表达所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白；

（5）提取所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白和血清8型禽腺病毒纤维蛋白，制备禽腺病毒亚单位疫苗。