CN109718374A - Irf3抑制剂在制备yap过度激活的癌症的治疗或预防药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及IRF3抑制剂在制备YAP过度激活的癌症的治疗或预防药物中的用途。本发明发现，IRF3可以激活YAP，这为YAP引发的肿瘤的治疗提供了靶标和更为精确的治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及IRF3抑制剂在制备YAP过度激活的 癌症的治疗或预防药物中的用途。
背景技术
Hippo-YAP信号通路在组织器官大小调控和稳态维持中具有重要作用，该 信号通路的功能紊乱已被证实与多种癌症相关。由于在部分肿瘤病人的临床样 本中检测到YAP的过度激活，因而YAP目前已被作为肿瘤治疗的一个靶标。 YAP被上游激酶LAT1/2磷酸化后，滞留于细胞质中。入核后，与转录因子 TEAD4结合，形成转录激活复合物调控目标基因的转录。然而，其入核及激活 的机制并不明晰。
IRF3(干扰素调节因子3)的经典功能是响应细胞质中的病毒核酸的刺激， 调控抗病毒免疫反应。在TLR信号通路中，IRF3上游TBK1对其的磷酸化对 于IRF3的二聚化及激活是必须的，磷酸化的IRF3被激活，诱导产生I型干扰 素。
氨来呫诺(Amlexanox)，CAS编号68302-57-8，分子式：C16H14N2O4， 为苯并吡喃-吡啶羧酸衍生物。氨来呫诺具有抗炎、抗过敏的作用，能抑制化学 介质引起的迟发性过敏反应，有拮抗白三烯等炎性物质的作用。目前已知其生 物学功能包括TBK1抑制剂。目前，国家食品药品监督总局(CFDA)的国产 药品目录中共有九条记录，包括：氨来呫诺口腔贴片2条，适用于治疗免疫系 统正常的成人及12岁以上青少年的口腔溃疡；氨来呫诺糊剂3条，适用于治 疗免疫系统正常的阿弗他口腔溃疡；氨来呫诺4条，为原料药。现有技术当中， 未曾报道氨来呫诺在治疗胃癌中的作用。
发明内容
本发明提供IRF3抑制剂在制备治疗或预防YAP介导的疾病的药物中的应 用。
在某些实施方案中，所述YAP介导的疾病为癌症，优选为YAP过度激活 的癌症。
在某些实施方案中，所述癌症为实体瘤或血液肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症选自：胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、宫颈 癌、白血病、乳腺癌和淋巴瘤。
在某些实施方案中，所述IRF3抑制剂为核酸分子、蛋白分子或化合物； 其中，所述核酸分子选自基因敲除载体、siRNA和干扰RNA的表达载体，所 述蛋白分子为IRF3的特异性抗体。
在某些实施方案中，所述IRF3抑制剂为TBK1抑制剂。
在某些实施方案中，所述TBK1抑制剂为核酸分子、蛋白分子或化合物； 其中，所述核酸分子选自基因敲除载体、siRNA和干扰RNA的表达载体，所 述蛋白分子为IRF3的特异性抗体，所述化合物选自氨来呫诺和BX795。
在某些实施方案中，所述IRF3抑制剂选自氨来呫诺和BX795，所述YAP 介导的疾病为YAP过度激活的胃癌。
本发明还提供IRF3的检测试剂和任选的YAP的检测试剂在制备诊断试剂 盒中的应用，其中，所述诊断试剂盒用于诊断患有YAP介导的疾病的病患的 生存率。
在某些实施方案中，所述检测试剂为mRNA表达水平的检测试剂和/或蛋 白的检测试剂。
在某些实施方案中，所述YAP介导的疾病为癌症，优选为YAP过度激活 的癌症，更优选为为实体瘤或血液肿瘤，更优选地，所述癌症选自：胃癌、非 小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌、白血病、乳腺癌和淋巴瘤。
附图说明
图1：胃癌中YAP与IRF3的表达水平正相关。(A)散点图表明不同胃 癌细胞系中YAP与IRF3的转录水平正相关。YAP的mRNA水平与IRF3的 mRNA水平的相关性通过斯皮尔曼等级相关衡量。(B)胃癌细胞系中YAP与IRF3的免疫印迹实验。(C)胃癌细胞系中免疫共沉淀实验检测YAP/IRF3与 TEAD4的相互作用。(D)箱形图表征的MNNG/幽门螺旋杆菌诱导的小鼠胃癌模型中YAP与IRF3的mRNA水平。(E)数据库中，胃癌中YAP，IRF3 以及TAZ表达水平的热点图。(F)胃癌数据库GSE13911中YAP的mRNA 水平与IRF3的mRNA水平的散点图。(G)胃癌中YAP与IRF3的mRNA水 平。(H)胃癌样本中IRF3的磷酸化水平。(I)YAP与IRF3代表性的组化染色。(J)组化染色中，正常结肠样本以及结肠癌样本中YAP以及IRF3染色水 平以阴性(-)、弱(+)、一般(++)、强(+++)表征。(K)生存分析 Kaplan-Meier法表征病人生存情况与组织样本中YAP/IRF3的mRNA表达水平 的相关性。
图2：靶向IRF3抑制胃肿瘤增长。(A)氨来呫诺的化学结构式。(B)HGC27， BGC-823以及MKN45细胞系以不同剂量氨来呫诺处理后，细胞的增殖水平。 (C)氨来呫诺处理后的细胞克隆形成。(D)氨来呫诺处理对移植胃癌细胞系 的增殖的影响。(E)氨来呫诺处理对移植胃癌细胞系后的肿瘤大小。(F)YAP 下游靶基因的mRNA水平。(G)MNNG/幽门螺旋杆菌诱导的胃癌小鼠模型以 不同剂量氨来呫诺处理后的肿瘤数目。(H)Ki-67对腺瘤的染色。(I)不同胃癌细胞系以不同剂量氨来呫诺处理后的细胞活力。
图3：靶向IRF3抑制胃肿瘤增长依赖与对YAP水平的调控。(A)氨来 呫诺处理细胞后，QPCR检测IFNB以及CTGF的mRNA水平。(B)氨来呫 诺处理后细胞克隆形成。(C)HGC27，BGC-823以及MKN45以不同剂量 BX795处理后细胞的增殖。(D)不同癌细胞系中YAP的转录水平以及氨来呫 诺的半抑制浓度(IC50)。(E)MKN细胞中过表达YAP后，以氨来呫诺处 理细胞，检测细胞活力。(F)HGC27细胞中敲除YAP后，以氨来呫诺处理细 胞，检测细胞活力。(G)胃癌细胞系中ChIP-QPCR检测IRF3的抗体水平。
具体实施方式
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
YAP(Yes-associated protein)，即Yes相关蛋白，是一种多功能的细胞内 连接蛋白和转录共激活因子。YAP蛋白是Hippo信号通路中一个起中心作用的 开关蛋白，在细胞正常生长发育过程中YAP结合转录因子TEAD促进下游目 的基因的表达，从而促进细胞生长、抑制细胞凋亡。
IRF3(干扰素调节因子3)是干扰素调节因子家族成员之一，与病毒感染 时干扰素基因的表达密切相关。IRF3组成型表达在多种细胞中，主要存在于细 胞浆中。
本发明发现，天然免疫中的关键分子IRF3，在生理及病理条件下均激活 YAP。IRF3可以增加YAP的入核与激活。一方面，IRF3直接结合YAP，使 LATS不能结合并磷酸化YAP，使YAP由细胞质转入细胞核中。另一方面，IRF3 与YAP及YEAD4均可以相互作用，以稳定该转录复合物，加强YAP对目的 基因的调控。同时，癌细胞中IRF3的过量表达进一步加剧YAP介导的细胞增 殖，而敲除IRF3可以下调YAP的激活进而抑制肿瘤的增长。IRF3可以激活 YAP，这为YAP引发的肿瘤的治疗提供了靶标和更为精确的治疗方法。
因此，本发明经由抑制IRF3的激活而以YAP为靶标治疗和预防YAP介 导的疾病。本文中，YAP介导的疾病尤其指癌症，包括实体瘤和血液肿瘤，如 胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌、白血病、乳腺癌和淋巴瘤。优选的是， 所述YAP介导的疾病尤其指那些YAP被过度激活(YAP过表达)的疾病。在 某些实施方案中，YAP过表达的疾病也表现出IRF3过表达。
本文中，“过表达”、“过度激活”与“高表达”可互换使用，意指YAP 或IRF3的表达(mRNA水平或蛋白水平)高于正常组织的正常表达水平，如 高至少1倍、2倍或3倍以上。在某些实施方案中，本文所述的过表达或高表 达指与同类患病组织的细胞(例如胃癌细胞)中YAP或IRF3的表达相比，同 一类别但可能由不同病因导致的患病组织的细胞(例如由不同原因导致的其它 胃癌细胞)中YAP或IRF3的表达高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％，甚至高1倍、2倍或3倍以上。
YAP或IRF3的表达水平可通过检测YAP或IRF3的转录拷贝数表征。可 采用本领域常规的方法检测转录拷贝数。例如，可参照本申请实施例1的实验 方法(1)，通过逆转录检测。通常，若样本中的YAP或IRF3的转录拷贝数 高于正常值1倍以上，即可认为“过表达”、“过度激活”与“高表达”。所 述正常值可以是正常人群相应组织中YAP或IRF3的表达水平，或者也可以是 患病组织的周边组织(如癌旁组织)中YAP或IRF3的表达水平。
在某些实施方案中，采用本文所述方法测试所得的YAP转录拷贝数≥600 时，可以认为YAP过表达；优选地，YAP转录拷贝数≥700、≥800、≥900、 ≥1000、≥1100、≥1200时，可以认为YAP过表达。在某些实施方案中，采 用本文所述方法测试所得的IRF3转录拷贝数≥500时，可以认为IRF3过表达； 优选地，YAP转录拷贝数≥600、≥700、≥800或≥900时，可以认为IRF3过 表达。
因此，所述YAP介导的疾病优选是YAP过表达的癌症，更优选是YAP 和IRF3都过表达的癌症，如YAP过表达以及任选的IRF3过表达的胃癌。
基于本发明的发现，可使用IRF3的抑制剂抑制IRF3的激活，从而减少 YAP的激活，以治疗或预防本文所述的YAP介导的各类疾病。IRF3抑制剂可 以是本领域周知的各种抑制剂，包括能从基因水平减少IRF3表达的抑制剂以 及能从蛋白水平抑制IRF3活性的抑制剂。本文中，IRF3活性通常指其结合YAP 的活性。可通过给予合适的核酸分子，用以减少IRF3的表达。例如，合适的 核酸分子可以是合适的基因敲除载体，用以从基因组中敲除IRF3的基因序列， 从而使得感兴趣的细胞不表达IRF3；或在IRF3基因序列中引入突变，从而使 得感兴趣的细胞表达无活性或弱活性的IRF3。合适的核酸分子还可以是能抑制 IRF3表达的siRNA以及IRF3基因的RNA干扰载体。可采用本领域常规的方 法构建合适的基因敲除载体、siRNA以及RNA干扰载体。在某些实施方案中， IRF3的抑制剂还可以是蛋白类抑制剂，如IRF3的特异性抗体。
或者，可给予能抑制IRF3的蛋白活性的抑制剂。这类抑制剂可以是本领 域已知的IRF3的小分子抑制剂。在某些实施方案中，由于TBK1(TANK结合 激酶1)对IRF3的磷酸化对于IRF3的二聚化及激活是必须的，因此，抑制TBK1 也能抑制IRF3的活性。因此，本发明中，IRF3抑制剂也包括TBK1活性(尤 其指其磷酸化IRF3的活性)的小分子抑制剂(化合物)以及能抑制或减少TBK1 表达的抑制剂。可使用本领域已知的TBK1抑制剂来实施本发明，这类抑制剂 包括但不限于，例如CN103748086A、CN103119025A、CN103596938A、 CN103930416A等中公开的化合物。在某些实施方案中，本发明的TBK1抑制 剂为BX795和氨来呫诺。能抑制或减少TBK1表达的抑制剂可以是核酸或蛋白 类分子，例如基因敲除载体、siRNA、RNA干扰载体以及TBK1的特异性抗体。
在某些具体实施例中，本发明特别涉及使用氨来呫诺来治疗或预防YAP 介导的疾病，如本文所述的癌症，优选是YAP过表达的癌症，更优选是YAP 和IRF3都过表达的癌症，如YAP过表达以及任选的IRF3过表达的胃癌。
因此，本申请提供IRF3抑制剂在制备用于治疗或预防本文所述的YAP介 导的疾病的药物中的应用。本申请还提供用于治疗或预防本文所述的YAP介 导的疾病的IRF3抑制剂。
在某些方面，本发明还提供一种治疗或预防本文所述的YAP介导的疾病 的方法，所述方法包括给予需要的对象治疗有效量的IRF3抑制剂或其药物组 合物。
本文中，“患者”和“对象”可互换使用，指待治疗的哺乳动物，尤其指 人。本文所述的“治疗有效量”或“有效量”指在疾病的预防或治疗中能有效 进行治疗的抑制剂或药物组合物的量。“治疗有效量”或“有效量”可根据多 肽、给药方式、疾病及其严重程度、健康、年龄、体重、家族史、基因组成、 病理发展阶段、用药前的和同时进行的治疗的类型等，以及待治疗对象的其它 个体特征而变化。
虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定药物组合物中每个部 分的最佳剂量。一般情况下，所述抑制剂为小分子化合物时，对哺乳动物每天 口服给药的药量可按照约0.0025到200毫克/公斤体重。但最好是每公斤口服 给药约1到150毫克/公斤。单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是 约0.1到100毫克的所述抑制剂。单位剂量可给予一次或多次，每天为一片或 多片，每片含有约0.1到50毫克，有些为约0.25到10毫克的所述抑制剂。
可采用本领域周知的给药方式给予抑制剂或其药物组合物。给药可以是局 部给药、肺部给药、表皮给药、经皮给药、口服或肠胃外给药。肠胃外给药包 括静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注，或颅内，如鞘内或心室内给药。 可根据不同的给药方式将药物组合物制备成合适的剂型，包括但不限于片剂、 胶囊、凝胶胶囊、粉末或颗粒、溶液、悬液、乳液或混合介质。
药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体” 指无活性成分，如固体，半固体，或液体填充剂，稀释剂，包衣材料，制剂佐 料，赋形剂或载体，与治疗剂合用，一起构成用于给予对象的“药物组合物”。 药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度对于受试者而言是无毒的，且与制剂 中的其他成分相容。药学上可接受的载体对于所采用的制剂而言是适当的。例 如，如果治疗剂将口服给药，则载体可以是凝胶胶囊。如果治疗剂将皮下给药， 则理想的是，载体对皮肤无刺激，且不引起注射位点反应。
药学上可接受的载体可包括如缓冲剂(如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸)； 抗氧化剂(如抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵、 氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基 酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3- 戊醇和m-甲酚)；低分子量(如低于约10个残基)的多肽；蛋白质(如血清 白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸 (如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸)；单糖；二糖； 和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类， 如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子型表面活 性剂，如聚乙二醇(PEG)。
示例性的药物载体还可包括粘合剂，如预糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷 酮或羟丙基甲基纤维素等；填充剂，如乳糖或其它糖类，微晶纤维素，果胶， 明胶，硫酸钙，乙基纤维素，聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等；润滑剂，如硬脂酸镁， 滑石粉，二氧化硅，胶态二氧化硅，硬脂酸，金属硬脂酸盐，氢化植物油，玉 米淀粉，聚乙二醇，苯甲酸钠，乙酸钠等；崩解剂，如淀粉，羟基乙酸淀粉钠 等；和润湿剂，如十二烷基硫酸钠等。
在某些方面，本发明还提供IRF3的检测试剂和任选的YAP的检测试剂在 制备用于诊断癌症病人生存率的诊断试剂盒中的应用。检测试剂可以是mRNA 表达水平的检测试剂，也可以是蛋白的检测试剂。mRNA表达水平的检测试剂 可包括根据IRF3或YAP的编码序列涉及的引物和探针序列。蛋白的检测试剂 可以是IRF3蛋白或YAP蛋白的特异性抗体。优选地，所述癌症是本文所述的 YAP介导的癌症，更优选是胃癌。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述 性的，并非限制本发明。实施例中提及的方法和材料，除非另有说明，否则为 本领域常规的方法和材料。
基本实验方法：
1、免疫印迹
根据实验要求制备蛋白样品，100℃变性10分钟，13200rpm离心2分钟， 取等量的上清加到SDS-PAGE胶的上样孔中。蛋白样品在浓缩胶中时电压为 80V，在分离胶中时电压为120V。电泳结束后，取下凝胶，按以下顺序安装转 膜装置：(负极)、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、(正极)。将转膜装 置放入4℃冷库，100V恒压转1h。转膜完成后，取出硝酸纤维素膜，将膜浸泡 在用TBST缓冲溶液配制的5％的脱脂牛奶中，室温下在摇床上孵育1h。用TBST 缓冲溶液洗膜，5min×3次。
加入按规定比例用5％BSA溶液稀释的一抗，在4℃冷库的摇床上孵育过 夜。用TBST缓冲溶液洗膜，10min×3次。加入按规定比例用5％牛奶稀释的 二抗，室温下在摇床上孵育40-60min。用TBST缓冲溶液洗膜，10min×3次。 将显色底物覆盖在硝酸纤维素膜上，室温显色2分钟。用LAS4000冷光/生物 发光影像分析仪进行拍摄。
所需试剂的配制：5％BSA溶液：称取5g BSA粉末溶于100ml 1×PBS溶 液中，再加入0.02％的叠氮钠，贮存于4℃。10×Western blot转膜缓冲液：称 取30.3g Tris碱和144g甘氨酸，加入300ml甲醇，再用去离子水定容到1L。
2、RNA的抽提
将转染后的细胞弃去培养基，并用预冷的PBS将细胞清洗一遍。六孔板的 每个孔加入500μl Trizol Reagent，室温处理5分钟。将细胞裂解液转移到1.5ml Eppendorf管中。每份样品加入100μl的氯仿，vortex低速混匀后静置5分钟。 4℃，12000g离心15分钟，转移240μl的上层水相至新的Eppendorf管中。每 份样品加入240μl的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。4℃、12000g离心 15分钟，弃去上清，留下白色的RNA沉淀。每份样品加入500μl的75％乙醇， 颠倒混匀。4℃、12000g离心5分钟，弃尽上清。室温晾干。加入适量DEPC处 理过的去离子水，充分溶解。用NanoDrop ND1000测定所提取的RNA的浓度， 260nm的吸光值与280nm的吸光值的比值应维持在1.9-2.0之间。将所提取的 RNA用于逆转录或直接冻到-80℃保存。
所需试剂的配制：磷酸缓冲盐溶液(PBS)：800ml蒸馏水溶解0.2g KCl， 8g NaCl，0.24g KH2PO4和1.44g Na2HPO4。用HCl调节溶液的pH值至7.4，定 容至1L。高压蒸汽灭菌或过滤除菌。
3、免疫沉淀
将转染后的细胞弃去培养基，并用预冷的PBS将细胞清洗一遍。加入适量 的细胞裂解缓冲液RIPA(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min，将细胞裂解液 于4℃，最大转速离心30min后取上清。取所需量的protein A/G琼脂糖珠，用 适量裂解缓冲液洗3次。取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液中 加入20μl预处理过的protein A/G琼脂糖珠和1μg相应的抗体，在4℃冷库的搅 拌器上缓慢旋转孵育过夜。免疫沉淀反应完成后，在4℃以7000rpm的速度离 心1min，将琼脂糖珠离心至EP管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用300μl裂 解缓冲液洗2次，再用300μl PBS洗2次。最后加入20μl的2×SDS上样缓冲 液，100℃煮10分钟。利用SDS-PAGE和Western blot分析与抗体结合的蛋白。
所需试剂的配制：RIPA缓冲液：150mM NaCl,100mM Tris pH 8.0,1％ TritonX-100,5mM EDTA,10mM NaF。
4、细胞培养
HEK293FT、HeLa、MCF-7、SW480以及HCT116细胞培养于 DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养液中，培养液中添加10％血清，100ug/mL 盘尼西林，100μg/mL。细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。
A549，Jurkat，Raji，HGC-27，MGC-803，KATOIII，SNU-1，ZGC-1，BGC-823， SGC-7901，MKN-1，GES，ZGC-2，NCI-N87，MKN-45，AGS，SNU-216，ZGC-3， ZGC-4细胞培养于RPMI1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养液中，培养液中添 加10％血清，100ug/mL盘尼西林，100μg/mL。细胞于37℃培养，二氧化碳浓 度为5％。
5、实时定量荧光PCR
实时定量荧光PCR采用Applied Biosystems公司两步法实时PCR (Realtime-PCR)系统，检测相对CT值。使用定量荧光PCR预混液(Toyobo 公司提供2x GreenRealtime PCR reagent)配置反应体系检测并定量目 标基因的表达水平，GAPDH作为内参。
6、免疫组化
组织样本按照BD PharmingenTMIHC Zinc Fixative手册(手册编号：550523)， 采用锌剂固定(BD Biosciences)并进行石蜡包埋。组织切片(厚度5μm)通 过加热固定，切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二 甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90％乙醇5分钟，两次，70％乙醇5 分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片 放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0， 或10mM Tris,pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。 加入5％脱脂牛奶封闭60分钟。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则 极易产生较高的背景。适当比例稀释一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗， 加入PBST，洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗 涤3次。按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性 磷酸酯酶(AP)标记的二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入PBST洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤 液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。选用DAB进行后续检测。 DAB染色后进行HE染色。最后进行脱水，透明，中性树脂封片。
7、细胞增殖实验
使用ATP细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖(Promega公司Luminescent Cell Viability Assay)。在一块壁不透明的96孔板上准备好带培养 基的细胞，100μl/孔，同时准备只含培养基不含细胞的对照孔，以得到背景发 光值。在实验孔中加入待测化合物，按合适的条件进行孵育。
将平板及其内容物平衡到室温，大约需要30分钟。向每孔中加入与细胞培 养基体积相等的试剂100μl。在一个定轨振荡器上混合内容物2分 钟，诱导细胞裂解，然后将平板室温孵育10分钟，使萤光信号值稳定，记录发 光信号。
8、软琼脂糖细胞克隆形成实验
转染相应质粒的细胞在细胞密度达到104后，接种至6孔板中的软琼脂糖 上，14天后对直径大于0.05毫米的克隆进行计数。
9、肿瘤移植实验
六周雄性裸鼠(BALB/cA-nu/nu)购自上海实验动物中心并培养于无菌环 境中。裸鼠分为四组分别通过皮下注射胃癌细胞系。注射的细胞量HGC-27为 1×106；BGC-823为1×106；MKN-45为2×106，细胞注射于小鼠侧腹。肿瘤 形成后，小鼠通过胃内灌服法每天给予包被于玉米油中的氨来呫诺。小鼠随机 注射5mg/kg/天或50mg/kg/天的氨来呫诺。此外，小鼠静脉50mg/kg/天的5-氟 尿嘧啶作为阳性对照。四周后，处死小鼠，测量其肿瘤大小。本实验采取双盲 实验的实验方法。动物培养及动物实验遵照中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所动物管理委员会相关章程和动物福利政策。
10、MNNG/幽门螺旋杆菌诱导建立小鼠胃癌模型
小鼠饲养于传染性疾病动物模型专用的培养室内，接受12小时光照，12 小时黑暗的日夜节律。刮取培养与固体培养基中的幽门螺旋杆菌SS1，注射于 小鼠，单次胃内注射量为1×107CFU/ml。对照组小鼠注射等量生理盐水，隔离 饲养。
11、目的基因的克隆
针对所需的目的基因设计引物，用PCR的方法将该目的基因从包含此目的 基因的质粒或Hela细胞的cDNA中克隆出来，目的基因片段两边带有两个不同的 酶切位点。用琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物的大小是否与所需的目的基 因大小一致，并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对该片段进行回收。在胶回收 产物中加入与PCR产物两边酶切位点相对应的酶以及合适的缓冲液进行双酶切， 37℃孵育过夜。同时，用相同的酶双酶切该片段所要连接的载体。利用普通DNA 产物纯化试剂盒对酶切后的片段进行回收，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对 酶切后的载体进行回收，然后用T4连接酶将片段与载体连接起来，并将该连接 产物转化DH5α。利用抗性筛选，验证及测序获得目的基因的克隆。
12、转染
使用Invitrogen公司(San Diego,CA)的转染试剂对 细胞进行瞬时转染，24小时后检测过表达对细胞的影响，48小时后检测基因 敲除对细胞的影响。
13、染色质免疫沉淀技术(ChIP)
细胞悬浮于5倍体积的细胞裂解液中(10mM Hepes-KOH,pH 7.8,10mM KCl,0.1mMEDTA,0.1％NP-40)，冰上孵育5分钟。裂解液700g离心3分钟， 使用3倍体积的细胞裂解液重悬。再次700g离心3分钟，获得沉淀的细胞核， 重悬于9.5ml的PBS中。加入0.5ml的20mMDSP，25℃混合30分钟，固定 细胞核。190g离心3分钟，获得细胞核，加入1％甲醛，25℃固定10分钟。加 入0.5ml的2.5M甘氨酸，混合5分钟，终止反应。700g离心3分钟，将沉淀 重悬于0.3ml加入了蛋白酶抑制剂的细胞核裂解液中(10mM Tris-HCl,pH 7.5, 200mM NaCl,10mMEDTA,1％SDS)。将裂解液超声，获得300～1,000bp DNA 片段。通过离心除去细胞残片后，加入1.8ml的ChIP稀释缓冲液，而后与10μl protein A-Sepharose(50％浓度)填料于4℃混合30分钟。2～5μg的YAP抗体 以及IRF3抗体与其孵育用于获得交联的染色质进行免疫沉淀，使用相关基因 的ChIP引物进行Q-PCR检测。
14、数据分析
采用SAS数据软件分析包(9.1.3)对数据进行分析，统计数据的平均数± 标准差。单因子变异数分析(ANOVA)以及Student’s t-test用于分析连续变量。 置信区间为P<0.05。
实施例1：IRF3是YAP相关的胃癌诊断靶标
1.实验目的：确定胃癌中IRF3与YAP表达水平的关联性
2.实验方法：
(1)YAP与IRF3的mRNA表达水平检测：细胞抽提总RNA方法如基本 实验方法2所述，AMV逆转录酶合成第一链，并以其为模板，在DNA taq酶 的作用下用对应的引物进行PCR扩增；逆转录体系见表1，逆转录反应程序见 表2，细胞样品扩增PCR引物见表3，Realtime-PCR反应体系见表4， Realtime-PCR扩增程序见表5。
表1：逆转录反应体系
表2：逆转录程序
| 37℃ | 15min | 50℃ | 5min | 95℃ | 5min | 4℃ | 20min |
表3：引物序列
表4：Realtime-PCR反应体系
表5：PCR反应体系程序设定
(2)YAP与IRF3的蛋白水平检测以及IRF3的磷酸化水平检测：如基本 实验方法1所述。
(3)检测YAP以及IRF3与TEAD4的结合水平的免疫共沉淀检测：如基 本实验方法3所述。
(4)IRF3与YAP的表达水平免疫组化染色：如基本实验方法6所述。
3.实验结果及分析：
由于癌细胞中YAP的表达水平对氨来呫诺具有敏感性，我们研究了YAP 与IRF3在肿瘤中是否存在关联性。
我们首先检测了不同细胞系中YAP与IRF3的表达谱。在胃癌细胞系中， YAP与IRF3的mRNA表达水平相关，在其他的癌细胞，如A549(非小细胞 肺癌)、HCT116(结肠癌)、SW480(结肠癌)、Hela(宫颈癌)、Jurkat(白 血病)、MCF-7(乳腺癌)以及Raji(淋巴瘤)中也获得了相同的结果(图1， A)。此外，IRF3的蛋白水平与YAP也有相关性(图1，B)。
由于YAP的激活不仅需要其入核，还需要与转录因子TEAD4结合，因而 IRF3可能起到稳定YAP-TEAD4转录复合物的作用。我们检测了胃癌细胞中YAP以及IRF3与TEAD4的结合水平。co-IP实验表明，在胃癌细胞系HGC-27、 MGC-803、MKN-1、BGC-823以及MKN-45细胞中，TEAD4特异性抗体内源 IP获得的YAP的量与免疫共沉淀获得的IRF3的量相关，这表明IRF3是YAP 的激活子(图1，C)。
随后，我们检测了YAP以及IRF3在幽门螺旋杆菌感染的小鼠胃癌模型中 的表达谱，我们发现YAP的表达水平显著上升(图1，D)，且IRF3的表达 水平同样也明显上升，与YAP水平的变化正相关(r＝0.612,p<0.001)(图1， D)。通过对Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gds)中临床样本数据的分析，我们发现在胃癌病人中，YAP以及IRF3的 mRNA水平均显著上调(图1，E)。此外，在胃癌病人的样本中IRF3的mRNA 水平与YAP正相关(p＝0.002)(图1，F)。
为进一步验证IRF3与YAP的相关性，我们检测了90例胃癌患者的临床 样本，单变量分析表明在胃癌患者的样本中有50％的样本YAP的mRNA水平 上调，39％的样本IRF3的mRNA水平上调(图1，G)。且，IRF3的上调与 YAP相关(表6)。此外，我们检测了两例临床样本中IRF3的磷酸化水平， 胃癌样本中IRF3与YAP的蛋白水平较正常样本均升高，而IRF3的磷酸化在 胃癌样本中也提高，YAP被过度激活(图1，H)。
表6
为研究IRF3表达水平与临床的相关性，我们对88例有长期随访的胃癌病 人的组织芯片样本进行了免疫组化染色，检测IRF3与YAP的表达水平。通过 分析比较同一病人癌症组织和正常组织的胃部组织染色的代表性图像，我们发 现IRF3以及YAP的蛋白水平在细胞质与细胞核中都明显上调(图1，I)。同 时，我们收集并处理了病人信息，并提取了其中的临床背景(年龄,性别)以 及肿瘤分期信息(肿瘤大小,淋巴结转移率,远端转移,肿瘤分期)。我们的结 果表明IRF3的染色与肿瘤大小显著相关(p<0.05)，而与年龄、性别、淋巴 结转移、肿瘤转移与分期没有显著相关性(图1，J，表7)。在YAP的检测中， 我们也发现了类似的结果(图1，J)。Kaplan-Meier生存分析表明，IRF3与 YAP的表达水平与胃癌病人的5年生存率负相关(图1，K)。以上数据表明 IRF3是对胃癌病人整体生存率判断的诊断指标(相对危险度:0.589,95％置信 区间[CI]:0.351–0.960,p＝0.037)。
表7
实施例2：以IRF3为治疗靶点可以抑制胃癌细胞增殖
1.实验目的：研究以IRF3为治疗靶点对胃癌细胞增殖的影响。
2.实验方法：
(1)细胞增殖的检测：如基本实验方法7所述。
(2)YAP下游靶基因的转录水平的检测，即IFNB，CTGF的表达水平检 测：如实施例1所示，扩增引物见表6。
表6：引物序列
(3)ChIP实验：：如基本实验方法13所述。ChIP引物见表7。
表7：引物序列
3.实验结果及分析：
由于IRF3的磷酸化和激活可以促进YAP的入核以及激活，我们推测IRF3 上游激酶TBK1可以调控IRF3的激活进而调控YAP的活性，抑制YAP引起 的胃癌细胞增殖。为验证这一假设，我们使用TBK1的抑制剂氨来呫诺。氨来 呫诺是一种具有免疫调节功能的小分子化合物，临床上用于治疗复发性口腔溃 疡。我们的结果表明使用氨来呫诺可以显著抑制胃癌细胞系HGC-27以及 BGC-823细胞的增殖，但对MKN-45细胞系没有抑制作用(图2，B)。同时， 氨来呫诺不仅抑制了IRF3信号通路，通过检测YAP下游靶基因的转录水平， 我们发现氨来呫诺还阻断了YAP的激活(图3，A)。同样的，氨来呫诺减少 了HGC-27以及BGC-23细胞的克隆形成(图2，C)。此外，以小分子BX795 (同样是TBK1抑制剂)处理HGC-27以及BGC-823细胞，可以显著抑制细活 力，但对MKN-45没有明显作用(图3，C)：
进一步的移植实验表明，与传统的胃癌治疗药物5-FU的效果相同，氨来 呫诺可以抑制YAP过度激活的胃癌细胞系，即HGC-27以及BGC-823的细胞 增殖，并具有剂量依赖效应(图2，D、E)。YAP目标基因CTGF以及CYR61 的转录水平在氨来呫诺处理的肿瘤组织中下调(图2，F)。与移植实验结果一 致，氨来呫诺可以减少肿瘤的数量，并具有剂量依赖效应(图2，G)，在幽门 螺旋杆菌诱导的小鼠胃癌模型中使用Ki67染色也验证了这一结果(图2，H)。
为进一步验证氨来呫诺在不同的YAP表达水平下对胃癌细胞增殖的抑制 效果，我们在12个胃癌细胞系和4个胃癌原代细胞系(ZGC-1,ZGC-2,ZGC-3, ZGC-4)中(图2，I)检测了氨来呫诺对细胞活力的影响。如图2(I)所示,氨 来呫诺可以显著抑制HGC-27(IC50＝3.90μM),MGC-803(IC50＝3.2μM), KATOIII(IC50＝8.7μM),SNU-1(IC50＝7.6μM)以及ZGC-1(IC50＝4.3μM) 的细胞活力，对BGC-823(IC50＝33.0μM),SGC-7901(IC50＝31.5μM),MKN-1 (IC50＝12.4μM),GES(IC50＝17.3μM)以及ZGC-2(IC50＝21.7μM)的细胞 活力有一定的抑制作用；但在NCI-N87、MKN-45、AGS、SNU-216、ZGC-3 以及ZGC-4细胞(IC50>100μM)细胞系中细胞活力仅略有下降。这些结果表 明，氨来呫诺抑制肿瘤细胞生长是具有选择性的。而YAP的表达水平与肿瘤 细胞对氨来呫诺处理的敏感性直接相关(图2，I；3，D)。即，HGC-27、MGC-803 以及ZGC-1细胞系中，YAP高表达，其对氨来呫诺处理的敏感性较MKN-45 以及ZGC-4等YAP低表达的细胞系高。为进一步验证，氨来呫诺敏感性与 YAP表达水平的相关性，我们在MKN-45细胞系中过表达YAP，YAP的表达 使得MKN-45细胞系对氨来呫诺的敏感性提高(图3，E)。同样，在HGC-27 细胞系中转染shRNA敲除YAP，可以降低HGC-27细胞系对氨来呫诺的敏感 性(图3，F)。此外，ChIP实验表明在HGC-27、BGC-823和MKN-45cells 中，通过检测IRF3结合CTGF启动子的水平，表明IRF3对YAP的激活取决 于YAP的表达水平(图3，G)。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> IRF3抑制剂在制备YAP过度激活的癌症的治疗或预防药物中的用途
<130> 176650
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgatctg ccctaaggc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaccgccga gtacaccat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaggctcgt gatggtcaag 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtccacag tattctccag g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaagtgcat ccgtactccc a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgtcggtac atactccaca g 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaccaaca agtgtctcct cc 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaatccaag caagttgtag ctc 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttcttggtg ttgtgctgga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gattgatcct gaccccttga 20
Claims (10)
1.IRF3抑制剂在制备治疗或预防YAP介导的疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，所述YAP介导的疾病为癌症，优选为YAP过度激活的癌症。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述癌症为实体瘤或血液肿瘤。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述癌症选自：胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌、白血病、乳腺癌和淋巴瘤。
5.如权利要求1－4中任一项所述的应用，其特征在于，所述IRF3抑制剂为核酸分子、蛋白分子或化合物；其中，所述核酸分子选自基因敲除载体、siRNA和干扰RNA的表达载体，所述蛋白分子为IRF3的特异性抗体。
6.如权利要求1－4中任一项所述的应用，其特征在于，所述IRF3抑制剂为TBK1抑制剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述TBK1抑制剂为核酸分子、蛋白分子或化合物；其中，所述核酸分子选自基因敲除载体、siRNA和干扰RNA的表达载体，所述蛋白分子为IRF3的特异性抗体，所述化合物选自氨来呫诺和BX795。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述IRF3抑制剂选自氨来呫诺和BX795，所述YAP介导的疾病为YAP过度激活的胃癌。
9.IRF3的检测试剂和任选的YAP的检测试剂在制备诊断试剂盒中的应用，其中，所述诊断试剂盒用于诊断患有YAP介导的疾病的病患的生存率。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为mRNA表达水平的检测试剂和/或蛋白的检测试剂；
所述YAP介导的疾病为癌症，优选为YAP过度激活的癌症，更优选为为实体瘤或血液肿瘤，更优选地，所述癌症选自：胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌、宫颈癌、白血病、乳腺癌和淋巴瘤。
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