CN109704954B - 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的衍生物、均相酶免疫检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3‑(3‑羟基苯基)‑3‑羟基丙酸(HPHPA)的衍生物、均相酶免疫检测试剂及其制备方法，涉及生物检测技术领域。使用该HPHPA衍生物制备免疫原性强的HPHPA免疫原及其抗体，其抗体特异性强、效价高，与常见的92种干扰物无任何交叉反应，用该抗体制备的HPHPA均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对HPHPA高通量、快速化的检测，检测的准确度高，特异性强，检测效率显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的衍生物、均相酶免疫检测试剂及其制备方法，更具体涉及一种3-(3-羟基苯基)-3- 羟基丙酸的衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法。
背景技术
3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸(3-(3-Hydroxyphenyl)-3-hydroxypropionicAcid，HPHPA)，其结构式如式(Ⅳ)所示：
HPHPA是一种3-羟基苯丙氨酸(酪氨酸类似物)的代谢产物，也是一种梭状芽孢杆菌的代谢产物，通过尿液排出。它能够通过消耗大脑中的儿茶酚胺，引起如刻板行为、极度活跃高度-反应性的自闭症样行为。
自闭症谱系障碍(autism spectrum disorders，ASD)也称广泛性发育障碍或孤独症，被定义为以社会交往和沟通障碍、兴趣范围狭窄及重复刻板行为为主要特征的发育障碍。ASD是遗传与外部环境相互作用引起的疾病，不符合哈迪-温伯格平衡，环境因素对其影响远大于遗传因素。自闭症患者存在明显的胃肠道症状及肠道菌群改变情况，自闭症与肠道微生物失衡及肠-脑轴异常密切相关。如果肠道微生物失衡，很可能伴随出现大脑功能与行为异常,菌群异常得不到及时纠正，就可能会发生ASD、多动症、抽动症、甚至青春期会出现精神分裂症，由于肠脑发育与头脑发育同步，因而在婴幼儿发育的关键期肠道微生物发育异常可增加自闭症风险。肠道微生物可通过代谢产物、免疫、神经内分泌以及迷走神经等途径影响大脑的功能与行为。失衡的细菌可作为ASD疾病发生发展的潜在生物标记物，迄今为止的研究表明，与健康人群相比，ASD患者肠道梭菌属含量显著增加，拟杆菌与厚壁菌比率下降，乳酸菌属和脱硫弧菌属含量升高。
目前，自闭症的实验室筛查诊断主要是利用气相色谱-质谱(GC-MS)分析检测尿液中的代谢产物。检测的代谢物一般是肠道生态失调的一般标志性有机酸，包括：HPHPA、2-羟基苯乙酸、4-羟基苯甲酸、马尿酸、3-吲哚乙酸等。Xiyue Xiong等(2016)的研究表明，在自闭症儿童尿液样本中HPHPA、3-羟基苯乙酸和3-羟基马尿酸含量显著升高，这三种化合物可作为检测或预测ASD主要指标。
等(2014)在“Investigation of the relationbetween anaerobic bacteria genus clostridium and late-onset autism etiologyin children”中公开了一种利用 GC-MS检测分析ASD患者的尿液样本中的HPHPA含量的方法，表明儿童孤独症与胃肠道梭菌属厌氧菌有关，HPHPA含量的增加表明胃肠道中梭菌属厌氧菌的存在和数量，尿液样本中HPHPA含量的增加被诊断为自闭症。William Shaw 等(2010)在“Increased urinary excretion of a 3-(3-hydroxyphenyl) 3-hydroxypropionic acid(HPHPA)，an abnormal phenylalanine metabolite ofClostridia spp.in the gastrointestinal tract,in urine samples from patientswith autism and schizophrenia”中公开了一种利用GC-MS检测分析自闭症和精神分裂症患者的尿液样本中的HPHPA含量的方法，发现HPHPA含量显著增加。
目前，检测HPHPA的常用方法为气相色谱-质谱法(GC-MS)和酶联免疫分析法(ELISA)等，但是这些方法操作复杂，在临床大规模推广应用方面均具有一定的局限性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的HPHPA检测试剂，尤其是质量好的高通量自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的HPHPA检测试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对HPHPA的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的衍生物、均相酶免疫检测试剂及其制备方法，为了克服现有技术存在的缺陷，该均相酶免疫检测试剂与常见的92种干扰物无任何交叉反应，检测方法简单、迅速、特异性强、实现大批量样品全自动检测。
本发明提供了一种3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，其结构式如式(Ⅰ) 所示：
本发明还提供了一种式(Ⅰ)所示的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)化合物3的合成：将化合物1和化合物2溶解于二甲基甲酰胺中，加入K2CO3，搅拌12小时，加入纯化水，经二氯甲烷萃取3次，将萃取得到的有机相通过Na2SO4干燥，浓缩，通过硅胶干燥柱纯化，得到化合物3；
(2)HPHPA衍生物的合成：将化合物3和苄基三乙基氯化铵溶解于CHCl3中，逐滴加入NaOH溶液，56℃搅拌2.5小时，HCl调节至pH＝4，用乙酸乙酯萃取3次，将萃取得到的有机相干燥，浓缩，经制备级高效液相色谱仪纯化，得到白色固体状化合物，即为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物；
具体地，所述的HPHPA衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)化合物3的合成：称取20g的化合物1与33.2g的化合物2，共同溶解于300mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，然后加入36.4g 的K2CO3制成反应混合溶液，将反应混合溶液在室温下搅拌12小时，反应结束后，在反应溶液中加入200mL纯化水，再将此溶液用300mL二氯甲烷 (dichloromethane，DCM)进行萃取，萃取步骤重复3次，将萃取得到有机相通过Na2SO4进行干燥处理，在进行浓缩，将浓缩后得到的剩余物通过硅胶干燥柱 (PE:EA＝5:1，即石油醚∶乙酸乙酯的体积比＝5:1)进行纯化，得到化合物3；
(2)HPHPA衍生物的合成：称取3g的化合物3与0.15g苄基三乙基氯化铵，共同溶解于30mL的CHCl3中制成反应溶液，称取15g的NaOH溶解于15 mL H2O中，制成NaOH溶液，将此NaOH溶液在56℃条件下逐滴加入上述反应溶液中，制成反应混合液，然后将反应混合液在56℃条件下搅拌2.5小时，反应后得到的剩余物用1mol/L的HCl调节至pH＝4，进行酸化处理，然后用30mL EA进行萃取，萃取步骤重复3次，将萃取得到的有机相进行干燥与浓缩处理，将上述处理后得到的剩余物通过制备级高效液相色谱仪(pre-HPLC)进行纯化，最终得到白色固体状的化合物，即为HPHPA衍生物。
本发明还提供了一种3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测试剂，所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测试剂包括试剂A和试剂B；
所述的试剂A中包含抗HPHPA特异性抗体和均相酶底物；
所述的试剂B包含HPHPA酶标偶联物和Tris缓冲液，其中HPHPA酶标偶联物可作为用于检测HPHPA的一种指示试剂的主要成分，指示试剂可选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂；
所述的均相酶底物由葡萄糖-6-磷酸、氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Tris 缓冲液配制而成；
所述的抗HPHPA特异性抗体是通过HPHPA免疫原免疫实验动物后获得的，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与HPHPA特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马；
优选地，所述实验动物为兔。
所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原是由所述的3-(3-羟基苯基)-3- 羟基丙酸衍生物或上述的制备方法制备得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物与载体连接而成的化合物，其结构如式(Ⅱ)所示：
其中，所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；
更优选地，所述的载体为血清蛋白；进一步优选地，所述的载体为牛血清白蛋白(BSA)。
所述的HPHPA酶标偶联物是由上述的HPHPA衍生物或上述的制备方法制备得到的HPHPA衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式 (Ⅲ)所示：
本发明还提供了一种HPHPA均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
(a1)试剂A的制备：将抗HPHPA特异性抗体加入均相酶底物中，得到试剂A，所述的试剂A中抗HPHPA特异性抗体与均相酶底物的体积比为 1:100-1:10000；
(a2)试剂B的制备：将HPHPA酶标偶联物溶于Tris缓冲液中，得到试剂 B，所述的试剂B中HPHPA酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100-1:10000。
优选地，所述的试剂A中抗HPHPA特异性抗体与均相酶底物的体积比为 1:250-1:1250；所述的试剂B中HPHPA酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为 1:500-1:2500。
进一步优选地，所述的试剂A中抗HPHPA特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:750；所述的试剂B中HPHPA酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1: 1500。
上述的均相酶免疫检测试剂的制备方法中所述的抗HPHPA特异性抗体的制备步骤如下：
(b1)用PBS缓冲液稀释式(II)所示的HPHPA免疫原，得到抗原溶液，将抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，对实验动物进行注射；
(b2)2-5周后，再用上述抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，对上述实验动物进行注射，之后每隔2-5周注射一次，共计注射3-8次；
(b3)对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗HPHPA特异性抗体。
具体地，所述的抗HPHPA特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
(b1)用PBS缓冲液(pH＝7.2-7.6)将上述式(Ⅱ)所示的HPHPA免疫原稀释至1.0-3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用1-3mL抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，对实验动物进行注射；
(b2)2-5周后，再用1-3mL上述抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，对上述实验动物进行注射，之后每隔2-5周注射一次，共计注射3-8次；
(b3)对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:50000-1:80000的抗HPHPA特异性抗体。
上述的抗HPHPA特异性抗体的制备步骤中所述的HPHPA免疫原的制备步骤如下：
(c1)配制缓冲液A：按照重量份数计，2.3-3.2份磷酸二氢钾、3.8-4.5份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节 pH至8.0-8.5，制得缓冲液A；
(c2)将载体溶解于缓冲液A中，制成载体溶液；
(c3)将式(Ⅰ)所示的HPHPA衍生物，溶解于缓冲液A中，制成HPHPA 衍生物溶液；
(c4)将HPHPA衍生物溶液逐滴加入上述载体溶液中，搅拌得到混合溶液 A；
(c5)将混合溶液A用上述缓冲液A进行透析，得到式(Ⅱ)所示的HPHPA 免疫原溶液。
具体地，所述的HPHPA免疫原的制备方法包括以下步骤：
(c1)配制缓冲液A：称取2.3-3.2g磷酸二氢钾、3.8-4.26g磷酸氢二钠、8.0-9.0 g氯化钠、0.7-1.3g氯化镁，共同溶解于0.9-1.1L去离子水中，调节pH至8.0-8.5，制得缓冲液A；
(c2)将载体在-2～-8℃下溶解于缓冲液A中，制成0.5-2mg/mL的载体溶液；
(c3)将式(Ⅰ)所示的HPHPA衍生物在-2～-8℃下溶解于缓冲液A中，制成8-12mg/mL的HPHPA衍生物溶液；
(c4)将HPHPA衍生物溶液逐滴加入上述载体溶液中，然后将此混合溶液在-2～-8℃下搅拌2-5小时，得到混合溶液A；
(c5)将混合溶液A用上述缓冲液A进行透析，透析后所得溶液即为HPHPA 免疫原溶液，加入质量分数0.05-0.15％的NaN3，于-18～-22℃下储存。
上述的均相酶免疫检测试剂的制备方法中所述的HPHPA酶标偶联物的制备步骤如下：
(d1)制备缓冲液B：按照重量份数计，0.85-1.30份磷酸二氢钾、1.2-2.0 份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节pH至8.0-8.5，制得缓冲液B；
(d2)将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于缓冲液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
(d3)将式(I)所示的HPHPA衍生物溶解于缓冲液B中，制成HPHPA衍生物溶液；
(d4)将HPHPA衍生物溶液逐滴加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，搅拌得到混合溶液B；
(d5)将混合溶液B用缓冲液B进行透析，透析后所得溶液即为式(Ⅲ) 所示的HPHPA酶标偶联物溶液。
具体地，所述的HPHPA酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
(d1)缓冲液B的制备：称取0.85-1.30g磷酸二氢钾、1.21-2.0g磷酸氢二钠、 8.0-9.0g氯化钠、0.7-1.3g氯化镁，共同溶解于0.9-1.1L去离子水中，调节pH至 8.0-8.5，制得缓冲液B；
(d2)将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶于-2～-8℃溶解于缓冲液B中，制成 0.5-2mg/mL的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
(d3)将式(Ⅰ)所示的HPHPA衍生物于-2～-8℃溶解于缓冲液B中，制成 8-12mg/mL的HPHPA衍生物溶液；
(d4)将HPHPA衍生物溶液逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，然后将此混合溶液在-2～-8℃下搅拌2-5小时，得到混合溶液B；
(d5)将混合溶液B用上述缓冲液B进行透析，透析后所得溶液即为HPHPA 酶标偶联物溶液，加入质量分数0.3-1.0％的BSA和质量分数0.05-0.15％的NaN3，于2～8℃下储存。
一种利用HPHPA均相酶免疫检测试剂检测HPHPA含量的方法，所用均相酶免疫检测试剂为上述的HPHPA均相酶免疫检测试剂；所述检测方法包括以下步骤：
A.将待测样本与抗HPHPA特异性抗体接触；
B.根据待测样本中HPHPA与抗HPHPA特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中HPHPA的含量；
所述待测样本为生物样本，所述生物样本为血清、血浆、尿液、唾液或乳汁；优选地，所述的生物样本为尿液。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种如式(I)所示的全新的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，由该衍生物制备的免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗体特异性强、效价高，并且与常见的92种干扰物无任何交叉反应，用该衍生物制备出的酶标偶联物和抗体制备的HPHPA均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对HPHPA高通量、快速化的检测，检测的准确度高，特异性强，检测效率显著提高，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是本发明的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸ELISA检测反应标准曲线；
图2是本发明的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测反应标准曲线；
图3是本发明的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫法与高效液相色谱法相关性分析图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的合成
3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的合成路线如下：
3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的制备过程如下：
(1)化合物3的合成：
称取20g的化合物1，即3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸(购自Sigma公司) 和33.2g的化合物2(购自Sigma公司)，共同溶解于300mL DMF中，然后加入36.4g的K2CO3，制成反应混合溶液，将上述反应混合溶液在室温下搅拌12 小时，反应结束后，在上述反应溶液中加入200mL纯化水，再将此溶液用300mL DCM进行萃取，萃取步骤重复3次，将萃取得到的有机相通过Na2SO4进行干燥处理，在进行浓缩，将浓缩后得到的剩余物通过硅胶干燥柱(PE:EA＝5:1)进行纯化，得到31.5g化合物3，产率79.6％。
(2)3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的合成：
称取3g的化合物3与0.15g苄基三乙基氯化铵，共同溶解于30mL的 CHCl3中制成反应溶液，称取15g的NaOH溶解于15mL H2O中，制成NaOH 溶液，将此NaOH溶液在56℃条件下逐滴加入上述反应溶液中，制成反应混合液，然后将此反应混合液在56℃条件下搅拌2.5小时，反应后得到的剩余物用 1mol/L的HCl调节至pH＝4，进行酸化处理，然后用30mL EA进行萃取，萃取步骤重复3次，然后将萃取得到的有机相进行干燥与浓缩处理。将上述处理后得到的剩余物通过pre-HPLC进行纯化，最终得到0.5g白色固体状的化合物，即为 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，产率15.9％。
实施例2. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的合成
本实施例中的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原由实施例1得到的3-(3- 羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物与BSA连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
其中载体为BSA。
该3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的合成方法具体步骤如下：
(1)称取2.72g磷酸二氢钾、4.26g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁，共同溶解于1L去离子水中，调节pH至8.2，制成缓冲液A；
(2)称取3mg BSA，-4℃下溶解于3mL上述缓冲液A中，制成1mg/mL 载体溶液；
(3)称取3mg实施例1得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，-4℃下溶解于300μl上述缓冲液A中，制成10mg/mL的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(4)当上述3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体溶液中，然后将此混合溶液在-4℃下搅拌3小时；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲液A进行透析，透析后所得溶液即为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液，在3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液中加入质量分数0.1％的NaN3，于-20℃下储存。
实施例3. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的合成
本实施例中的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原由实施例1得到的3-(3- 羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物与卵清蛋白连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所
其中载体为卵清蛋白。
该3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的合成方法具体步骤如下：
(1)称取2.3g磷酸二氢钾、3.8g磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.7g氯化镁，共同溶解于0.9L去离子水中，调节pH至8.0，制成缓冲液A；
(2)称取6mg卵清蛋白，-4℃下溶解于3mL上述缓冲液A中，制成2mg/mL 载体溶液；
(3)称取2.4mg实施例1得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，-4℃下溶解于300μl上述缓冲液A中，制成8mg/mL的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(4)当上述3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体溶液中，然后将此混合溶液在-5℃下搅拌5小时；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲液A进行透析，透析后所得溶液即为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液，在3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液中加入质量分数0.05％的NaN3，于-22℃下储存。
实施例4. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的合成
本实施例中的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原由实施例1得到的3-(3- 羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物与血蓝蛋白连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
其中载体为血蓝蛋白。
该3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的合成方法具体步骤如下：
(1)称取3.2g磷酸二氢钾、4.5g磷酸氢二钠、9.0g氯化钠、1.3g氯化镁，共同溶解于1.1L去离子水中，调节pH至8.5，制成缓冲液A；
(2)称取1.5mg血蓝蛋白，-4℃下溶解于3mL上述缓冲液A中，制成 0.5mg/mL载体溶液；
(3)称取3.6mg实施例1得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，-4℃下溶解于300μl上述缓冲液A中，制成12mg/mL的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(4)当上述3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体溶液中，然后将此混合溶液在-8℃下搅拌2小时；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲液A进行透析，透析后所得溶液即为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液，在3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液中加入质量分数0.15％的NaN3，于-18℃下储存。
实施例5.抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体的制备
(1)用PBS缓冲液将实施例2制备得到的HPHPA免疫原稀释至2.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用2.0mL的抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
(2)3周后，再用2.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物兔注射一次，之后每隔3周注射一次，共计注射5次；
(3)取免疫后的实验动物兔血液，分离纯化得到效价为1:80000的抗3-(3- 羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体。
实施例6.抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体的制备
(1)用PBS缓冲液将实施例3制备得到的HPHPA免疫原稀释至1.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用1.0mL的抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
(2)2周后，再用1.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物兔注射一次，之后每2周注射一次，共计注射3次；
(3)取免疫后的实验动物兔血液，分离纯化得到效价为1:50000的抗3-(3- 羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体。
实施例7.抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体的制备
将实施例4制备得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
(1)用PBS缓冲液将实施例4制备得到的HPHPA免疫原稀释至3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用3.0mL的抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射；
(2)5周后，再用3.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物兔注射一次，之后每5周注射一次，共计注射8次；
(3)取免疫后的实验动物兔血液，分离纯化得到效价为1:60000的抗3-(3- 羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体。
实施例8. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸ELISA检验
(1)建立HPHPA的ELISA检测标准曲线
标准品的制备：将HPHPA粉末(购自Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/mL的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为40.00μg/mL、20.00 μg/mL、10.00μg/mL、5.00μg/mL、2.50μg/mL和0.00μg/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris，145mMNaCl和质量分数为0.25％的BSA。
绘制标准曲线：用PBS将实施例5中所制备的抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸抗体稀释成1:5000的终浓度溶液，100μl/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h，用PBS将包被有上述抗体的96孔酶联板洗涤3次，加入200μl/孔的质量分数为0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h，用PBS洗涤3次，加入20μl/ 孔的标准品，再加入100μl/孔工作浓度的辣根过氧化物酶(HRP)-3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸偶联物，室温下孵育30min，PBS洗板5次，然后每孔加入 100μl四甲基联苯胺(TMB)底物，室温孵育30min，再每孔加入100μl终止液 (即2M硫酸)。在波长为450nm下测定吸光值，制作标准曲线，结果如图1所示。
(2)待测样品中HPHPA含量的检测
待测样品的制备：将HPHPA粉末(购自Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成 1mg/mL的储存液，并将此储存液稀释于尿液中，至终浓度分别为0.00，7.50， 15.00，40.00μg/mL，形成空白、低、中、高浓度的尿液样本。该尿液为不含HPHPA 的健康人尿液。
检测待测样品：利用上述步骤(1)中的检验方法，将空白、低、中、高浓度的尿液样本代替标准品，每个样本进行3个复孔测定，检测空白、低、中、高浓度的尿液样本的吸光值。根据图1所示的标准曲线，计算每个样本中HPHPA 的含量，根据样本中HPHPA的实际含量计算回收率，回收率＝检测浓度/样品浓度×100％，结果如表1所示。
表1：HPHPA的ELISA检测结果
| 尿液样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
| 样品浓度(μg/mL) | 0.00 | 7.50 | 15.00 | 40.00 |
| 检测浓度1(μg/mL) | 0.00 | 7.73 | 15.52 | 39.41 |
| 检测浓度2(μg/mL) | 0.01 | 7.69 | 15.97 | 38.95 |
| 检测浓度3(μg/mL) | 0.00 | 7.43 | 14.68 | 41.88 |
| 平均值(μg/mL) | 0.00 | 7.61 | 15.39 | 40.08 |
| 平均回收率(％) | - | 101.56 | 102.60 | 100.20 |
由表1可知：采用本发明3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的HPHPA回收率都较高，均为95％＜回收率＜105％，说明本发明提供的抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体可以用于样本中HPHPA 的检测，并且结果准确度高。
实施例9. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物的制备
(1)称取1.09g磷酸二氢钾、1.70g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁，共同溶解于1L去离子水中，调节pH至8.2，制成缓冲液B；
(2)称取3mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)，-4℃下溶解于3mL缓冲液 B中，制成1mg/mL G6PDH溶液；
(3)称取3mg实施例1得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，-4℃下溶解于300μl上述缓冲液B中，制成10mg/mL的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(4)当上述3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述G6PDH溶液中，然后将此混合溶液在-4℃下搅拌5小时；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲液B进行透析，透析后所得溶液即为HPHPA酶标偶联物溶液，在HPHPA酶标偶联物溶液中加入质量分数为0.5％的BSA和质量分数0.1％的NaN3，于2-8℃下储存。
实施例10. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物的制备
(1)称取0.85g磷酸二氢钾、1.21g磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.7g氯化镁，共同溶解于0.9L去离子水中，调节pH至8.0，制成缓冲液B；
(2)称取1.5mg的G6PDH，-4℃下溶解于3mL缓冲液B中，制成0.5mg/mL 的G6PDH溶液；
(3)称取2.4mg实施例1得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，-4℃下溶解于300μl上述缓冲液B中，制成8mg/mL的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(4)当上述3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述G6PDH溶液中，然后将此混合溶液在-2℃下搅拌2小时；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲液B进行透析，透析后所得溶液即为HPHPA酶标偶联物溶液，在HPHPA酶标偶联物溶液中加入质量分数0.3％的BSA和质量分数0.05％的NaN3，于2-8℃下储存。
实施例11. 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物的制备
(1)称取1.30g磷酸二氢钾、2.0g磷酸氢二钠、9.0g氯化钠、1.3g氯化镁，共同溶解于1.1L去离子水中，调节pH至8.5，制成缓冲液B；
(2)称取6mgG6PDH，-4℃下溶解于3mL缓冲液B中，制成2mg/mL的 G6PDH溶液；
(3)称取3.6mg得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，-4℃下溶解于300μl上述缓冲液B中，制成12mg/mL的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(4)当上述3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述G6PDH溶液中，然后将此混合溶液在-8℃下搅拌3小时；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲液B进行透析，透析后所得溶液即为HPHPA酶标偶联物溶液，在HPHPA酶标偶联物溶液中加入质量分数1.0％的BSA和质量分数0.15％的NaN3，于2-8℃下储存。
实施例12.HPHPA均相酶免疫检测试剂的制备
(1)试剂A的制备：将5.0g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2.5g的葡萄糖-6-磷酸用1L、55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；再将实施例5得到的抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体加入到上述均相酶底物中，得到试剂A，其中抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:10000；
(2)试剂B的制备：将实施例9得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物用120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液溶解，得到试剂B，其中3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:10000。
实施例13.HPHPA均相酶免疫检测试剂的制备
与实施例12的区别仅在于抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:1250；3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris 缓冲液的体积比为1:2500。
实施例14.HPHPA均相酶免疫检测试剂的制备
与实施例12的区别仅在于抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:750；3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:1500。
实施例15.HPHPA均相酶免疫检测试剂的制备
与实施例12的区别仅在于抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:250；3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:500。
实施例16.HPHPA均相酶免疫检测试剂的制备
与实施例12的区别仅在于抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100；3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100。
实施例17.HPHPA均相酶免疫检验
(1)建立HPHPA均相酶免疫检验标准曲线
标准品的制备：制备方法与实施例8中的ELISA检测标准品制备方法相同。
绘制标准曲线：按照表2设置Hitachi(日立)7180全自动生化分析仪反应参数。所用HPHPA均相酶免疫检验试剂为实施例14制备得到的检测试剂。先加试剂A，再加入HPHPA标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，在波长为 340nm处测定不同时间点吸光值，计算出不同标准品浓度时的反应速率，绘制反应标准曲线图，如图2所示。
表2：全自动生化分析仪反应参数
(2)待测样本检测
待测样品的制备：将HPHPA粉末(购自Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成 1mg/mL的储存液，并将此储存液稀释于尿液中，至终浓度分别为7.50，15.00， 40.00μg/mL，形成低、中、高浓度的尿液样本。该尿液为不含HPHPA的健康人尿液。
检测待测样品：利用上述步骤(1)中的检验方法，将低、中、高浓度的尿液样本代替标准品，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，根据图2所示的标准曲线，计算每个样本中HPHPA的含量，根据样本中HPHPA的实际含量计算回收率，回收率＝检测浓度/样品浓度×100％，结果如表3所示。
(3)利用不同配方的HPHPA均相酶免疫检验试剂检测待测样品：用实施例12-16制备的HPHPA均相酶免疫检验试剂分别编号为试剂1-5，分别利用上述试剂1-5按照上述步骤(1)和(2)的方法检测待测样品中HPHPA的含量，分别计算回收率与精密度，结果如表4所示。
表3：HPHPA均相酶免疫检验结果
| 血液样品 | 低 | 中 | 高 |
| 样品浓度(μg/mL) | 7.50 | 15.00 | 40.00 |
| 1 | 7.32 | 15.62 | 41.57 |
| 2 | 7.77 | 15.13 | 42.20 |
| 3 | 7.50 | 15.43 | 40.69 |
| 4 | 7.34 | 14.25 | 39.45 |
| 5 | 7.65 | 15.09 | 39.84 |
| 6 | 7.87 | 14.74 | 41.53 |
| 7 | 7.66 | 14.98 | 42.02 |
| 8 | 7.59 | 15.86 | 41.07 |
| 9 | 7.40 | 15.26 | 40.76 |
| 10 | 7.61 | 14.70 | 38.91 |
| 平均值(μg/mL) | 7.57 | 15.11 | 40.80 |
| 标准差(SD) | 0.181 | 0.473 | 1.104 |
| 精密度(CV％) | 2.39 | 3.13 | 2.71 |
| 回收率(％) | 100.93 | 100.65 | 102.00 |
表4：不同配方的HPHPA均相酶免疫检验试剂检测待测样品的回收率与精密度
由表3和表4可知：试剂3检测结果的回收率最接近100％，精密度最高。说明利用实施例14制备得到的HPHPA均相酶免疫检验试剂检测待测样品，回收率和精密度最高。
本发明提供的均相酶免疫检测试剂测定HPHPA的准确度高，回收率处于 95％-105％的范围之内，精密度高，CV均低于5％。
实施例18.药物与激素干扰试验
选取62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物进行干扰检测，调整待测干扰物浓度至1.00μg/mL，采用实施例17的均相酶免疫检测方法进行检测。
将待测干扰物与实施例14制备的试剂A接触反应，再加入试剂B；检测 340nm处的吸光值，根据如图2所示的标准曲线得到相应物质的浓度。62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物名称以及测定结果具体参见表5。
表5：常见干扰物HPHPA均相酶免疫检验结果
测定结果显示：上述62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物等价于HPHPA的浓度均小于0.10μg/mL。由此可见，本发明提供的HPHPA均相酶免疫检验试剂，特异性强，与常见的92种干扰物无交叉反应。
实施例19.相关性分析
对100例临床样本分别使用气相色谱-质谱(GC-MS)分析法和本发明实施例14制备的HPHPA均相酶免疫试剂进行检测，检测结果进行相关性分析，测定的数据见表6。
表6:两种方法检测临床样本中HPHPA含量的相关性比较
根据表6中的数据绘制的GC-MS检测和均相酶免疫检测相关性分析图，见图3，得到的线性方程为：y＝1.0015x+0.1286，相关系数R2＝0.9951，表明本发明提供的均相酶免疫检测试剂测定3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸临床样本的准确度较高。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
2.根据权利要求1所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)化合物3的合成：将化合物1和化合物2溶解于二甲基甲酰胺中，加入K2CO3，搅拌12小时，加入纯化水，经二氯甲烷萃取3次，将萃取得到的有机相通过Na2SO4干燥，浓缩，通过硅胶干燥柱纯化，得到化合物3；
(2)3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物的合成：将化合物3和苄基三乙基氯化铵溶解于CHCl3中，逐滴加入NaOH溶液，56℃搅拌2.5小时后，HCl调节至pH＝4，用乙酸乙酯萃取3次，将萃取得到的有机相干燥，浓缩，经制备级高效液相色谱仪纯化，得到白色固体状化合物，即为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物；
3.一种3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测试剂包括试剂A和试剂B；
所述的试剂A中包含抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体和均相酶底物；
所述的试剂B包含3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物和Tris缓冲液；
所述的均相酶底物由葡萄糖-6-磷酸、氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Tris缓冲液配制而成；
所述的抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体是通过3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原免疫实验动物后获得的，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马；
所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原是由权利要求1所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物或权利要求2所述的制备方法制备得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物与载体连接而成的化合物，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；
所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物是由权利要求1所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物或权利要求2所述制备方法制备得到的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：
4.根据权利要求3所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的载体为血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白；所述的实验动物为兔。
5.一种权利要求3所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a1)试剂A的制备：将抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体加入均相酶底物中，得到试剂A，所述的试剂A中抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100-1:10000；
(a2)试剂B的制备：将3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物溶于Tris缓冲液中，得到试剂B，所述的试剂B中3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100-1:10000。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的试剂A中抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:250-1:1250；
所述的试剂B中3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:500-1:2500。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的试剂A中抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:750；
所述的试剂B中3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:1500。
8.根据权利要求5-7任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述的抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体的制备步骤如下：
(b1)用PBS缓冲液稀释式(II)所示的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原，得到抗原溶液，将抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，对实验动物进行注射；
(b2)2-5周后，再用上述抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，对上述实验动物进行注射，之后每隔2-5周注射一次，共计注射3-8次；
(b3)对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸特异性抗体。
9.根据权利要求8所述的均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原的制备步骤如下：
(c1)配制缓冲液A：按照重量份数计，2.3-3.2份磷酸二氢钾、3.8-4.5份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节pH至8.0-8.5，制得缓冲液A；
(c2)将载体溶解于缓冲液A中，制成载体溶液；
(c3)将式(Ⅰ)所示的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物，溶解于缓冲液A中，制成3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(c4)将3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液逐滴加入上述载体溶液中，搅拌得到混合溶液A；
(c5)将混合溶液A用上述缓冲液A进行透析，得到式(Ⅱ)所示的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸免疫原溶液。
10.根据权利要求5-7任意一项所述的均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物的制备步骤如下：
(d1)制备缓冲液B：按照重量份数计，0.85-1.30份磷酸二氢钾、1.2-2.0份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节pH至8.0-8.5，制得缓冲液B；
(d2)将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于缓冲液B中，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
(d3)将式(I)所示的3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶解于缓冲液B中，制成3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液；
(d4)将3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸衍生物溶液逐滴加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，搅拌得到混合溶液B；
(d5)将混合溶液B用缓冲液B进行透析，透析后所得溶液即为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸酶标偶联物溶液。
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