CN109689079A - 牛成纤维细胞生长因子21和乳畜中的酮病 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了PEG修饰的bFGF‑21多肽变体，含有bFGF‑21多肽变体的组合物，以及用于治疗和/或预防酮病的方法，其施用变体或含有所述bFGF‑21变体的组合物。
Description
对相关申请的参考
本申请要求于 2016年8月22日提交的美国临时申请No. 62/377,869的利益。
序列表
本申请含序列表，该序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式提交，并且整体引入本文作为参考。所述ASCII拷贝于2017年8月15日创建，命名为204257_0027_WO_563187_SL.txt，且大小为15,591字节。
公开了用聚（乙二醇）（PEG）修饰的牛成纤维细胞生长因子21（bFGF-21）变体，以及使用这种分子治疗乳畜中酮病的方法。
高水平的酮，一种称为酮酸中毒的状况，是有害的并且可能危及动物的生命。乳畜特别容易患酮酸中毒，也简称酮病。在妊娠晚期和产后早期哺乳期，奶牛经历急剧的代谢变化，并且经常没有足够的可用葡萄糖来满足其能量需要，从而导致酮病。为了满足能量需求，储存的脂肪分子作为非酯化脂肪酸（NEFA）释放。酮病的特征在于缺乏食欲、或昏睡或兴奋、体重减轻、乳产量减少、运动不协调、免疫抑制和神经障碍。奶牛可能具有更高的乳腺炎风险，其可能进一步影响乳产量。
酮病的过去治疗包括膳食中葡萄糖量的增加、诸如地塞米松的糖皮质激素的施用以诱导高血糖、可增加酮代谢的胰岛素施用以及通过提供丙二醇、维生素B12和有机磷酸来源刺激葡糖异生。联合治疗也常见。然而，这些治疗是在治疗上进行的，以在酮病症状出现后减少所述酮病症状。由于有害作用，这种治疗不能预防性地进行以预防酮病的发展。
成纤维细胞生长因子（FGF）-21是一种调节葡萄糖和脂质体内稳态代谢的激素。人FGF-21 cDNA序列于2000年8月3日提交至GenBank，且登记号为AB021975。FGF-21通过结合FGF受体亚群和共同受体β-Klotho起作用。例如，在WO2013/131091、WO2013/184958和WO2013/188182中已经提议使用人FGF-21变体来治疗人类的肥胖和糖尿病。已发现bFGF-21的血浆浓度在分娩时和早期哺乳期期间增加。Schoenberg等人，（2011）Endocrinology152：4652-61。然而，之前未报道过bFGF-21影响乳畜中的酮病。
野生型bFGF-21于2013年8月5日提交至GenBank，且具有GenBank登记号XP_002695246.1的序列。报道的野生型bFGF-21的序列是：
。
牲畜且尤其是乳畜中的酮病需要新的治疗，特别是可以预防性地或在亚临床的酮病病例中施用的治疗。因此，如本文所公开的，加入聚乙二醇的bFGF-21变体可以在分娩时或分娩前施用以在没有有害影响的情况下减少酮病。需要修饰bFGF-21以增加其血清半衰期、水溶性、生物利用率、治疗半衰期或循环时间，或调节免疫原性或生物活性。这种修饰可包括亲水性聚合物聚（乙二醇）（缩写为PEG）的共价附着。为了使PEG的所期望的性质最大化，与生物活性分子附着的PEG聚合物或多个聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予一般与PEG聚合物附着相关的有利特征，例如增加的水溶性和循环半衰期，同时不有害地影响PEG聚合物所附着的分子的生物活性。
PEG衍生物经常通过反应性化学官能团与生物活性分子连接，例如氨基酸残基、N-末端和/或碳水化合物部分。WO 99/67291公开了一种使蛋白质与PEG缀合的方法，其中蛋白质上的至少一个氨基酸残基被合成氨基酸取代，并且蛋白质与PEG在足以实现与蛋白质缀合的条件下接触。
蛋白质和其他分子经常具有有限数目的可用于聚合物附着的反应活性部位。最适合经由聚合物附着进行修饰的部位可能在受体结合中起重要作用，并且这种部位可能是保留分子的生物活性所必需的，因此使它们不适合用于聚合物附着。结果，聚合物链不加区别地附着到生物活性分子上的这种反应活性部位经常导致聚合物修饰的分子的生物活性的显著降低或甚至完全丧失。PEG附着可以指向蛋白质内的特定位置，从而使得PEG部分不干扰该蛋白质的功能。指导PEG附着的一种方法是将合成氨基酸引入蛋白质序列中。可以改变原核生物大肠杆菌（E. coli）的蛋白质生物合成机器，以响应于琥珀密码子UAG将合成氨基酸有效且以高保真度并入蛋白质中。参见，例如，J. W. Chin等人，（2002），J. Amer. Chem. Soc. 124: 9026-9027；J. W. Chin, ＆ P. G. Schultz，（2002），ChemBioChem 3（11）：1135-1137；J. W. Chin等人，（2002），PNAS USA 99：11020-11024；和L. Wang, ＆ P. G.Schultz，（2002），Chem. Comm.，1：1-11。用真核生物啤酒糖酵母（S. cerevisiae）可以实现类似的方法（例如，J. Chin等人，Science 301：964-7（2003））。使用该方法，可以将合成氨基酸对乙酰基苯丙氨酸（pAF）并入bFGF-21中以充当PEG的附着部位。参见WO2010/011735。
被包括进来以提供对所公开主题的进一步理解的附图被并入并构成本说明书的一部分。附图还举例说明了所公开的主题的实施方案，并且与详述一起用于解释所公开的主题的实施方案的原理。没有试图比对所公开的主题和可以实践其的各种方式的基本理解所必需的更详细地示出结构细节。
图1. 如在db/db小鼠模型中所证实的，在位置G170处具有不同取代的bFGF-21变体的体内葡萄糖降低活性。
图2. 含有bFGF-21变体和必要的遗传信息的表达载体的图谱，以指导合成氨基酸在琥珀终止密码子（UAG）部位的生物合成并入。
这里提供了具有以下氨基酸序列的bFGF-21变体：
或
其中在170位的甘氨酸（G）被改变为谷氨酸（E）。G170E突变在上面的SEQ ID NOs 1和2中以粗体并加下划线显现。与SEQ ID NO：1相比，SEQ ID NO：2在肽的起始处也不含甲硫氨酸（M）。对特定氨基酸的提及是基于在起始位置没有M的肽序列的，即编号从氨基末端组氨酸残基开始。合成氨基酸在SEQ ID NOs：1或2任一个中的选自G77、K91、Q108和R131的残基处被取代。在这四个位置的每一个中取代的合成氨基酸可以是对乙酰基苯丙氨酸（pAF）。bFGF-21变体可以在位于指示的位置（即，G77、K91、Q108和R131）之一的合成氨基酸处加入聚乙二醇。
这里提供了具有以下氨基酸序列的bFGF-21变体：
其中在170位的甘氨酸（G）被改变为谷氨酸（E）。G170E突变在上面的序列中以粗体并加下划线显现。合成氨基酸对乙酰基苯丙氨酸（pAF）在残基Q108处被取代。bFGF-21变体在合成氨基酸处加入聚乙二醇。
使用的PEG部分可具有10 kDa-100 kDa，或20 kDa-50 kDa的平均分子量。例如，PEG部分可具有约20-约40 kDa的分子量。PEG部分可具有约30 kDa的分子量。PEG分子可以是分子量为30 kDa的线性分子。PEG分子可具有能够与合成氨基酸上的乙酰基反应的氨基氧基（aminooxy）。PEG分子可以是30 kDa氨基氧基活化的线性PEG，其能够与pAF的乙酰基侧链形成肟键。PEG可以是例如线性30 kDa PEG（例如，30 KPEG）α-甲基-ω-氨基氧基乙基氨基甲酰基，聚氧乙烯。
提供了药物组合物，其包含加入聚乙二醇的bFGF-21变体和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
加入聚乙二醇的bFGF-21变体及其制剂可用于治疗。加入聚乙二醇的bFGF-21变体可用于治疗牛的酮病。使用的PEG部分可具有10 kDa-100 kDa，或20 kDa-50 kDa的平均分子量。例如，PEG部分可具有约20-约40 kDa的分子量。PEG部分可具有约30 kDa的分子量。PEG分子可以是分子量为30 kDa的线性分子。牛可以是奶场奶牛，或牛可以是怀孕的奶场奶牛。该治疗可包括向牛施用约20-200μg/ kg动物重量的bFGF-21变体。该治疗可包括向牛施用约25-100μg/ kg动物重量，或约50μg/ kg动物重量的bFGF-21变体。加入聚乙二醇的bFGF-21变体可以在产犊前7天或更短时间施用至少一次，或在产犊时施用。治疗可以由在产犊后7天或更短时间给予的第二次施用组成。
加入聚乙二醇的bFGF-21变体可用于制备治疗牛的酮病的药物。使用的PEG部分可具有10 kDa-100 kDa，或20 kDa-50 kDa的平均分子量。例如，PEG部分可具有约20-约40kDa的分子量。PEG部分可具有约30 kDa的分子量。PEG分子可以是分子量为30 kDa的线性分子。牛可以是奶场奶牛，或牛可以是怀孕的奶场奶牛。该治疗可包括向牛施用约20-200μg/kg动物重量的bFGF-21变体。该治疗可包括向牛施用约25-100μg/ kg动物重量，或约50μg/kg动物重量的bFGF-21变体。加入聚乙二醇的bFGF-21变体可以在产犊前7天或更短时间施用至少一次，或在产犊时施用。治疗可以由在产犊后7天或更短时间给予的第二次施用组成。
用于治疗牛的酮病的方法可包括将治疗有效量的加入聚乙二醇的bFGF-21变体施用给有需要的牛。牛可能是奶场奶牛。牛可能是怀孕的奶场奶牛。该方法中加入聚乙二醇的bFGF-21的治疗有效量可为约20-200μg/ kg动物体重，约25-100μg/ kg动物体重，或约50μg/ kg动物体重。加入聚乙二醇的变体的施用可以在怀孕的奶牛产犊前7天或更短时间发生至少一次。加入聚乙二醇的变体的施用可以发生至少两次，其中在产犊时或产犊前给予第一次施用，并且在产犊后约7天或更短时间给予所述奶牛第二次施用。两次施用可以相隔约5-约28天，或相隔约7-21天，或相隔约14天。
提供了一种用于减少牛中非酯化脂肪酸（NEFA）的量和/或β-羟丁酸（BHBA）水平的量的方法，包括将加入聚乙二醇的bFGF-21变体施用给有需要的牛。NEFA的血清浓度可低于0.6 mg/L。BHBA的血清浓度可低于1.2 mg/L。加入聚乙二醇的变体的施用可在产犊前发生至少一次。
编码G170E取代和Q108位的琥珀终止密码子的bFGF-21变体由下述核苷酸序列编码：
（SEQ ID NO：4）。
野生型bFGF-21多肽如下修饰。长度为28个氨基酸的信号序列被单个甲硫氨酸残基置换，且甘氨酸-170被谷氨酸置换。修饰的多肽的氨基酸序列是：
。
上面的粗体/加下划线的氨基酸分别对应于Q108（从肽的成熟野生型形式的N-末端组氨酸编号，例如，如在SEQ ID NO：2中）和G170E的取代。Q108可以用合成氨基酸如pAF取代。多肽可以在pAF或其他并入的合成氨基酸上加入聚乙二醇，例如乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸和N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸。
SEQ ID NO：3对应于具有Q108pAF和G170E取代的bFGF-21。
。
序列中的粗体字母分别对应于Q108pAF和G170E的取代。多肽可以在pAF部位加入聚乙二醇。
这里使用冠词“a”和“an”指该冠词的语法对象的一个或多于一个（即至少一个）。举例来说，“要素”表示一个要素或多于一个要素。
术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上取决于其使用的上下文而变化。如本文所用的，“约”意欲包括±10％、±5％或±1％的变化。
如本文所用的，术语“治疗（treating）”、“治疗（to treat）”或“治疗（treatment）”包括抑制、放慢、停止、减少、改善或逆转现有症状、病症、状况或疾病的进展或严重性。可以预防性地或治疗性地应用治疗。
术语“治疗有效量”是指如本文所述的变体的量或剂量，其在对受试者单剂或多剂施用时提供所期望的治疗。
“合成氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸（pyrrolysine）或硒代半胱氨酸之一的氨基酸。这种合成氨基酸的实例包括但不限于对乙酰基苯丙氨酸（pAF）、乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸和N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸。关于这种合成氨基酸及其并入和修饰的额外细节，参见WO2010/011735和WO2005/074650。
本发明的bFGF-21变体可以容易地在多种细胞中产生，包括哺乳动物细胞，细菌细胞如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence），和/或真菌或酵母细胞。可以使用本领域众所周知的技术培养宿主细胞。含有目标多核苷酸序列（例如，FGF-21的变体和表达控制序列）的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，这些方法取决于细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转化方法通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他真核宿主细胞。可以采用各种蛋白质纯化方法，且这种方法是本领域已知的，并描述于例如，Deutscher，Methods in Enzymology182：83-89（1990）和Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Springer，NY（1994）。
可以根据已知方法配制加入聚乙二醇的bFGF-21变体以制备药学上有用的组合物。所期望的制剂是稳定的冻干产品，其用合适的稀释剂或高纯度水溶液和任选的药学上可接受的载体、防腐剂、赋形剂或稳定剂重构[Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995]。
可以将加入聚乙二醇的bFGF-21变体与药学上可接受的缓冲液一起配制，并调节pH以提供可接受的稳定性和施用可接受的pH。此外，可将本发明的加入聚乙二醇的bFGF-21组合物置于容器中，例如小瓶、药筒、笔递送设备、注射器、静脉内施用管或静脉内施用袋。
以下实验实施例是举例说明选择非加入聚乙二醇的前体bFGF-21变体、产生bFGF-21的加入聚乙二醇的变体以及加入聚乙二醇的bFGF-21变体在治疗乳畜方面的功效的。
实施例1
用STEADY-GLO® Elk1萤光素酶报道分子测定（Promega）测量加入聚乙二醇的bFGF-21（PEG-bFGF-21）蛋白质的生物活性。PEG-bFGF-21与在专有稳定细胞系（HEK293）的细胞表面上表达的βKlotho和FGFR1c（成纤维细胞生长因子受体同种型1c）结合，从而起始信号级联放大，这导致Elk1融合蛋白的磷酸化。然后，活化的（例如，磷酸化的）Elk1融合蛋白移位至细胞核，与报道盒中的上游激活序列结合并驱动萤光素酶的表达。根据制造商的说明通过添加底物来定量萤光素酶。产生的发光量与PEG-bFGF-21的活性成比例。PEG-bFGF-21变体的效价通过将其从剂量反应曲线的4-参数S形拟合获得的半最大有效浓度（EC50）值与在相同的测定板上运行的比较蛋白质野生型（WT）bFGF-21的EC50值进行比较来计算。通过将其最大相对光单位（RLU）信号与WT bFGF-21的最大RLU信号进行比较来计算PEG-bFGF-21的最大功效（Emax）。
使用Elk1萤光素酶报道分子测定测试四种30 kDa PEG(30KPEG)-bFGF-21变体的活性。基于人FGF-21晶体结构的分析选择用于引入琥珀终止密码子的部位。选定的部位远离FGF-21的受体结合区。通过定点聚合酶链反应（PCR）诱变产生具有用于在每个选择的位置取代pAF合成氨基酸的TAG密码子的bFGF-21变体。将相应的bFGF-21 pAF部位变体质粒转化到含有用于pAF并入的扩展遗传密码系统组分的大肠杆菌细胞中。转化的细胞在补充有pAF的培养基中生长，并被诱导以表达pAF并入所示部位的bFGF-21。收获细胞并分离和纯化靶bFGF-21 pAF部位变体。活化的30 kDa线性氨基氧基-PEG与并入的pAF位点特异性地缀合。通过层析使PEG-bFGF-21缀合物纯化不含过量的PEG和未缀合的bFGF-21。
在取代了bFGF-21的Q108、G77、K91或R131的pAF处的30 kDa PEG的缀合有差别地影响体外活性。表1总结了PEG缀合部位实验的结果。在四种测试的变体中，bFGF-21-Q108-30KPEG在STEADY_GLO萤光素酶测定中相对于WT非加入聚乙二醇的bFGF-21保留了最多的生物活性，具有效价的4x丧失，和最高Emax（73％）。结果，选择Q108作为关于pAF取代和PEG缀合测试的四种的最佳位置。
表1：PEG-bFGF-21部位变体的体外活性
实施例2
在血清中，天然人FGF-21（hFGF-21）在C-末端易受蛋白酶剪切，从而导致hFGF-21效价的显著丧失。产生bFGF-21的170位（G170）处的甘氨酸的四种氨基酸取代，以潜在地防止C-末端修剪。用Elk1萤光素酶报道分子测定测量bFGF-21-Q108-30KPEG G170变体的体外活性。Elk1萤光素酶测定（参见实施例1）方法利用组织培养基，因此预期在这个测定中不发生C-末端修剪和相关的bFGF-21-Q108-30KPEG的活性丧失。表2总结了如上所述通过定点PCR诱变产生并在大肠杆菌中表达的bFGF-21-Q108-30KPEG G170变体的对比体外活性。G170S和G170A变体相对于bFGF-21-Q108-30KPEG G170保留了最多的体外活性，效价丧失分别仅为1x或2x。
表2：bFGF-21-Q108-30KPEG G170变体的体外活性
实施例3
在高血糖小鼠模型（称为“db/db”）中测定四种bFGF-21-Q108-30KPEG G170变体的体内活性，以评估每种变体对平均血糖水平的影响。在研究的第1天，将bFGF-21变体以0.75 mg/kg体重施用于每组五只小鼠的5个组中的每一组，第六组仅接受载体作为阴性对照。在研究开始时小鼠为8周龄。一直到研究的第7天每天测量血糖和体重。
这个研究的结果在图1中图解说明。图1表明G170A和G170E变体提供了相对于阴性对照的显著差异。图1绘制了平均血糖浓度与时间的关系曲线（在研究日期中测量的）。误差棒表示一个标准差。如图1中所图解说明的，与载体处理的动物（例如，单独用具有20 mMtris，250mM蔗糖，pH 8.5的缓冲液处理的动物）相比，在施用bFGF-21-Q108-30KPEG G170变体的小鼠中观察到葡萄糖水平的统计学显著的改善。
基于上述数据，以及关于用于生产的大肠杆菌菌株表达每种变体的效率的信息，选择在第170位用谷氨酸取代甘氨酸的变体（SEQ ID NO：1）。
实施例4
表达bFGF-21Q108pAF-G170E的克隆细胞系（称为AXID2492）从单集落分离物转化平板分离，所述平板含有修饰的大肠杆菌K-12 W3110菌株，所述菌株含有指导人工改造的bFGF-21-Q108pAF-G170E表达的表达质粒。表达质粒含有所有必需的遗传信息，以指导pAF生物合成并入bFGF-21氨基酸序列的108位（图2）。在大肠杆菌中表达的bFGF-21-Q108pAF-G170E的形式具有氨基末端甲硫氨酸（M），其在肽的成熟形式（SEQ ID NO：3）中被切除。在其他生物中，例如酵母或哺乳动物细胞，甲硫氨酸可能不像在下述氨基酸序列中那样存在：
。
上述序列中关于pAF或E的粗体和加下划线字母分别指Q108pAF取代或G170E取代的部位。
AXID2492包括通过在含有硫酸卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培养基（50μg/mL卡那霉素）上生长而维持在其大肠杆菌宿主中的表达质粒。大肠杆菌K-12菌株是W3110衍生物，如WO2010/011735中所述，其被基因修饰以含有修饰的bFGF-21 DNA序列，其在氨基酸位置108具有代替内源谷氨酰胺密码子（CAG）的琥珀终止密码子（TAG）。某些细菌菌株如詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）不识别琥珀终止密码子。可以将与合成氨基酸如pAF缀合的tRNA添加到细菌菌株中，从而将合成氨基酸并入在细菌中表达的新生肽中。此外，引入G170E取代以防止修饰的bFGF-21蛋白质的蛋白酶解修剪。修饰的bFGF-21的核苷酸序列是：
（SEQ ID NO：4）。琥珀终止密码子加下划线，且G170E密码子加双下划线。
表达质粒还含有来自詹氏甲烷球菌菌株DSM 2661的酪氨酰转移RNA（tRNA）和酪氨酸氨酰-tRNA合成酶（aa-RS）对的基因。该tRNA/tRNA合成酶对经过修饰和遗传选择，以响应于琥珀终止密码子将pAF并入由特异性人工改造的测试基因编码的蛋白质中。参见WO2010/011735。进行高密度发酵研究以通过SDS-PAGE凝胶分析证实bFGF-21-Q108pAF-G170E蛋白质的表达。
现在描述产生W3110B60细胞系和AXID2492克隆的逐步过程。野生型大肠杆菌K-12W3110菌株购自ATCC®（目录号27325）。为了确保用阿拉伯糖正确诱导基因表达，通过用来自BL21-AI株（BL21-AI；Invitrogen, Carlsbad, CA）的g1-tetA基因盒对araB基因的染色体拷贝进行普遍性转导，消除了细胞代谢阿拉伯糖的能力，以产生W3110B2菌株。来自B2细胞系的T7 RNA聚合酶基因盒（g1-tetA）被PCR扩增。使用同源重组（Kang, Y.等人，Systematic Mutagenesis of the Escherichia coli Genome，J. Bacteriology，2004：4921-4930）将该PCR产物整合到野生型W3110菌株（ATCC®# 27325）的染色体中。这个程序产生了细胞系W3110B42。经由对W3110B42基因组DNA的PCR分析和所得PCR产物的测序确定T7 RNA聚合酶基因（g1）已在araB基因座上精确整合的证实。
fhu/tonA基因编码大肠杆菌中的噬菌体受体，其允许噬菌体附着并感染大肠杆菌。重要的是从生产宿主中缺失fhu/tonA基因以使宿主具有噬菌体抗性，且从而避免潜在的制造过程期间的污染。从W3110基因组DNA PCR扩增fhuA“左”和fhuA“右”区域。将这两种PCR产物消化并与dhfr基因连接在一起。从连接的产物PCR扩增fhuA::dhfr最终敲除产物，并经由同源重组整合到W3110B42的染色体中，结果产生菌株W3110B55。W3110B55中fhuA::dhfr的存在进行序列确认。W3110B60的基因型是F-IN(rrnD-rrnE)λ-araB::g1-tetAfhuA::dhfr。
以类似的方式，产生proS-W375R（色氨酸375转化为精氨酸的点突变）-cat盒，并通过同源重组并入W3110B55染色体中。这个程序产生了温度敏感的（Ts）细胞系W3110B60。脯氨酰-tRNA合成酶（proS W375R）基因中的这个点突变赋予在≥37℃的温度致死的宿主表型。通过W3110B60基因组DNA的PCR和对所得PCR产物进行测序，在表型（使用氯霉素抗性）和基因型上证实proS-W375R-cat整合到染色体中。W3110B60的基因型是F-IN(rrnD-rrnE)λ-araB::g1 tetA fhuA::dhfr proSW375R-cat。
构建AXID2492克隆后，使用单集落分离物生成研究细胞库（Research Cell Bank）（RCB）。进行高细胞密度发酵研究以通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶分析证实bFGF-21-Q108pAF-G170E蛋白质的表达。还使用生存力、DNA测序、表型分析和噬菌体测试实验来表征和证实这个RCB的同一性和纯度。
将琥珀终止密码子（TAG）插入对应于成熟野生型bFGF-21蛋白质的108氨基酸位置的谷氨酰胺密码子（CAG）。将170残基处的甘氨酸密码子（GGT）突变为谷氨酸密码子（GAA），以最小化bFGF-21蛋白质在C-末端的蛋白酶解修剪。为了证实克隆已按预期进行而没有引入突变，对AXID2492的整个质粒序列进行测序。为了制备质粒DNA，用10μl的甘油原种细胞穿刺接种10 mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养液培养物，并在37℃于250 rpm生长过夜。根据制造商的说明，使用QIAGEN MINIPREP KIT®分离质粒DNA样品。序列分析后证实DNA序列。将野生型大肠杆菌K-12 W3110 proS基因在BglII限制酶切位点亚克隆到这个载体中。
为了证实AXID2492 RCB能够产生修饰的bFGF-21蛋白质，从三个单独的小瓶解冻进行三次高细胞密度发酵。生产发酵罐在化学成分确知培养基中生长，并由分批和补料分批阶段组成。发酵批次的起始甘油浓度为48 g/L。当在分批阶段期间OD600达到35时诱导发酵，并且在诱导时恢复以15 mL/L/h的速率恒定进料主要包含甘油的溶液。对于产生bFGF-21 Q108pAF-G170E蛋白质的三次发酵，发酵最终湿细胞密度为172、172和169 g/L。所有三次发酵都在诱导时产生修饰的全长bFGF-21-Q108pAF-G170E蛋白质。活化的30 kDa线性氨基氧基-PEG与在Q108并入的pAF位点特异性地缀合。通过层析使PEG-bFGF-21缀合物纯化不含过量的PEG和未缀合的bFGF-21。
实施例5
评价加入聚乙二醇的bFGF-21 Q108-G170E变体在酮病治疗中的功效。在下面的实验中使用牛（Bos taurus），非哺乳，怀孕，多胎的Holstein奶牛。产犊前，奶牛饲喂接近全混合日粮（total mixed rations）（TMR）。所提供的新鲜TMR饲料体积在产犊日（研究第0天）减少约15％或30％以诱导生酮状态。在个体预期的产犊日期之前约7天选择动物进行治疗。产生三个实验组，如下表3所举例说明的。
表3：奶牛中的实验治疗组
治疗组1和2中的奶牛在第-7天接受它们的个别治疗。治疗组3中的奶牛在第0天接受它们的个别治疗。使用具有在Q108的pAF取代和稳定化G170E突变的bFGF-21加入聚乙二醇的变体的治疗根据表3中列出的量基于奶牛被分配的治疗组在颈部前肩胛区域中通过皮下注射施用。在第-7天、第0天、第7天、第14天和第21天对所有动物进行由兽医进行的身体检查，包括对所有主要身体系统、直肠温度、心率和呼吸率以及体重的检查。
在研究第-7天、第0天（产犊日）、第3天、第7天、第10天、第14天和第21天，使用具有20号针的注射器，在移除粪便后，从尾静脉获得血液样品（约5 mL）。在每天饲喂之前以使动物应激最小化的方式收集血液样品。允许血液样品凝固。通过离心收获血清。血清样品用于检测非酯化脂肪酸（NEFA）和β-羟丁酸（BHBA）水平。如果出现以下情况，则将奶牛鉴定为临床酮病的：
（1）产犊后任何时间点血清BHBA水平≥12 mg/dL且NEFA水平≥0.6 mEq/L；
（2）产犊后任何时间点血清BHBA水平≥12 mg/dL；和/或
（3）产犊后任何时间点血清NEFA水平≥0.6 mEq/L被认为是酮病的。
还在第3天、第7天和第10天的每个时间点测定酮病状态。如果相对于对照组的发病率有统计学显著性的（p<0.1）降低，则认为PEG bFGF-21的剂量水平是有效的。
统计学分析通过使用SAS®软件（版本9.2或更高版本，SAS® Institute Inc.，Cary，NC，USA）进行。对于关键功效终点的统计学分析，显著性水平设定为α = 0.10。单侧检验用于将bFGF-21变体的组平均值与分析中的对照平均值进行比较。使用费希尔精确检验（Fisher's Exact test）分析酮病发病率日期，该检验是SAS®系统的Proc Freq选项。
使用重复测量的方差或协方差分析来分析NEFA和BHBA水平，其中治疗前观察结果的平均值（BASELINE）被认为是每个变量的可能的协变量。
如果存在显著的按日治疗相互影响（α = 0.10），则每天内治疗的比较在α = 0.10进行。
表4显示PEG bFGF-21-Q108pAF-G170E变体对每日平均血清非酯化脂肪酸（NEFA）水平的影响。
表4. PEG bFGF-21对平均每日NEFA水平的影响的统计学分析
1斯氏t-检验的概率值。
在所有三个治疗组的动物产犊后3-7天血清NEFA水平达到峰值。在产犊前7天或产犊日施用PEG bFGF-21相对于盐水对照显著降低了第3天的NEFA血清水平。相对于盐水对照，产犊后第7天的值也显著降低。对于两种不同的PEG bFGF-21变体给药方案，动物的反应没有显著差异。
β-羟丁酸（BHBA）测定的结果表明，在产犊前和产犊日，所有三个治疗组中的所有动物均显示血清BHBA低于12 mg/dL。对于盐水对照，在第7天观察到峰值血清BHBA水平。在产犊日用PEG bFGF-21治疗的动物相对于盐水对照表现出朝向降低的血清BHBA水平的趋势，但这些差异在统计学上不显著。在第-7天用PEG bFGF-21变体治疗的动物在产犊后第0-10天表现出相对于盐水对照类似的血清BHBA水平，以及在第14天和第21天朝向稍更高水平的统计学上不显著的趋势。
用盐水治疗的大约85％的奶牛在产犊日的血清NEFA水平≥0.6 mEq/L；在产犊后第3天，该百分比增加至100％。与显示出与盐水对照相似百分比的在第0天治疗的奶牛相比，在第-7天用PEG bFGF-21变体治疗的大约65％的奶牛在产犊日的血清NEFA水平≥0.6mEq/L。在第14天，血清NEFA值≥0.6 mEq/L的治疗的奶牛的百分比显著（p=0.0302）高于盐水对照动物。在PEG bFGF-21变体治疗组之间没有显著差异。
研究中没有一只动物在产犊前或产犊日表现出升高的血清BHBA水平。86％的用盐水治疗的动物在产犊后第3天和第7天具有≥12 mg/dL的血清BHBA水平，且然后在研究的剩余时间期间BHBA水平逐渐下降。在产犊前7天用加入聚乙二醇的bFGF-21治疗的动物表现出在所有取样时间点与盐水对照没有显著差异的血清BHBA水平。比较起来，在产犊日用加入聚乙二醇的bFGF-21治疗的奶牛在所有取样时间点表现出相对于盐水对照降低的血清BHBA水平。在第0天，盐水对照和用PEG bFGF-21治疗的动物之间血清BHBA水平的差异是统计学显著的（p=0.0472）。在第0天用PEG bFGF-21变体治疗的动物中BHBA水平下降的速率在产犊后的前10天相对于盐水对照似乎稍微更快。
监控每个治疗组中异常日常健康观察结果的发生率。在整个治疗过程中观察到异常的健康观察结果，且这些观察结果是在过渡期奶场奶牛中正常观察到的那些的典型，并且以与商业奶场中正常观察到的类似的频率发生。
所有治疗组中的动物在研究过程自始至终都具有典型的乳产量增加。治疗组之间的乳产量没有统计学上显著的差异（p=0.3579）。
这个研究的结果提示，在产犊前7天或产犊日单次施用PEG bFGF-21变体相对于盐水对照对血清NEFA水平具有小的影响。具有处于或高于一般用于定义酮病（NEFA >0.6mEq/L）的阈值的血清NEFA水平的奶牛的百分比在所有三个治疗组之间没有显著差异。有可能在哺乳期早期阶段期间使用过肥的（over-conditioned）奶牛和限制其获得饲料的组合压倒了奶牛及时响应蛋白质以影响NEFA水平的能力。
结果证实，直到产犊后3天血清BHBA水平不升高。在产犊日用PEG bFGF-21 Q108-G170E变体治疗的动物表现出朝向血清BHBA水平比盐水对照的较小增加的趋势，并且这种趋势在整个研究持续期间自始至终是明显的。类似地，具有升高的血清BHBA水平的产犊日用加入聚乙二醇的bFGF-21变体治疗的奶牛的百分比在产犊后的前两周期间倾向于低于盐水对照。比较起来，在产犊前7天施用PEG bFGF-21变体相对于盐水对照不改变血清BHBA水平或酮病动物的百分比。
加入聚乙二醇的bFGF-21变体的施用对乳产量没有显著影响。在这项研究中，加入聚乙二醇的bFGF-21的施用可能通过代谢肝脏中的脂肪储备来限制奶牛补偿其负能量平衡的能力。此外，由于在这项研究中，在哺乳期的前3周内期间饲料受到限制，所以奶牛不能增加其食物消耗。因此，缺乏增加的乳产量可能是实验条件的人为现象。然而，可以断定加入聚乙二醇的bFGF-21变体的施用对乳产量没有负面影响。
选择用于上述实验的42头奶牛组（42头Holstein雌性，在第-7天各自体重范围从629到905 kg）代表目标奶场奶牛群体。基于第-7天或第-1天体重（取决于治疗组）和上述实验的结果，皮下施用一次的bFGF-21-Q108pAF-30KPEG-G170E的实际剂量为约50μg/kg动物体重。没有观察到与用bFGF-21-Q108pAF-30KPEG-G170E的治疗相关的异常临床观察结果。
序列表
SEQ ID NO：1 具有单个M作为单个序列和G170E突变的bFGF-21（没有内部终止密码子）
SEQ ID NO：2 没有M的SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：3 在Q108终止，G170E，无M
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3的肽的核苷酸序列
SEQ ID NO：5 编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列
SEQ ID NO：6 在G77的琥珀终止
SEQ ID NO：7 编码SEQ ID NO：6的核苷酸序列
SEQ ID NO：8 在K91的琥珀终止
SEQ ID NO：9 编码SEQ ID NO：8的核苷酸序列
SEQ ID NO：10 在R131的琥珀终止
SEQ ID NO：11 编码SEQ ID NO：10的核苷酸序列
序列表
<110> Eli Lilly and Company
Ambrx, Inc.
<120> 牛成纤维细胞生长因子21和乳畜中的酮病
<130> 204257-0027-00-WO-563187
<150> US 62/377,869
<151> 2016-08-22
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽-具有氨基末端Met和G170E突变的bFGF-21，其中编号
从第一个氨基末端组氨酸残基开始
<400> 1
Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gly Pro Asp
65 70 75 80
Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Lys Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Thr
100 105 110
Leu Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Pro Gln Arg Ser Ser Asn Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Ala Ala Pro Pro Asp Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Ser Tyr Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Thr Ser
180
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽-具有G170E突变的bFGF-21
<400> 2
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gly Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Lys Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Pro Gln Arg Ser Ser Asn Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Pro Asp Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Ser Tyr Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Thr Ser
180
<210> 3
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽-具有Q108pAF和G170E的bFGF-21
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (108)..(108)
<223> Xaa是对乙酰基苯丙氨酸（pAF）
<400> 3
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gly Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Lys Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Xaa Ser Glu Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Pro Gln Arg Ser Ser Asn Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Pro Asp Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Ser Tyr Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Thr Ser
180
<210> 4
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-编码SEQ ID NO: 3
<400> 4
catcctattc ctgattcttc tcctctgctg caatttgggg gtcaggtgcg ccaacgttac 60
ctgtacaccg acgatgcgca agaaactgag gctcacctgg agatccgtgc tgacgggact 120
gtcgtggggg ctgcccgtca atccccagag tcactgctgg aactgaaagc cctgaagcct 180
ggggtcattc agatcctggg cgtaaagacg agtcgtttcc tgtgccaagg ccctgacggg 240
aaactgtatg gctcgctgca ttttgatcct aaagcttgta gttttcgcga actgctgctg 300
gaagatggtt acaatgtgta ttagagtgaa actctgggtc tgcctctgcg tctgcctcct 360
caacgtagta gcaaccgtga ccctgccccg cgcggtccgg cccgttttct gccactgcct 420
ggcctgcctg ctgcaccacc tgacccaccg ggtattctgg ctccggaacc tccagacgtc 480
gggagttcag atcctctgtc gatggtagaa ccgtcatacg gtcgctctcc tagttacact 540
tca 543
<210> 5
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-编码SEQ ID NO: 1
<400> 5
atgcatccta ttcctgattc ttctcctctg ctgcaatttg ggggtcaggt gcgccaacgt 60
tacctgtaca ccgacgatgc gcaagaaact gaggctcacc tggagatccg tgctgacggg 120
actgtcgtgg gggctgcccg tcaatcccca gagtcactgc tggaactgaa agccctgaag 180
cctggggtca ttcagatcct gggcgtaaag acgagtcgtt tcctgtgcca aggccctgac 240
gggaaactgt atggctcgct gcattttgat cctaaagctt gtagttttcg cgaactgctg 300
ctggaagatg gttacaatgt gtatcagagt gaaactctgg gtctgcctct gcgtctgcct 360
cctcaacgta gtagcaaccg tgaccctgcc ccgcgcggtc cggcccgttt tctgccactg 420
cctggcctgc ctgctgcacc acctgaccca ccgggtattc tggctccgga acctccagac 480
gtcgggagtt cagatcctct gtcgatggta gaaccgtcat acggtcgctc tcctagttac 540
acttcataa 549
<210> 6
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽-具有G77pAF和G170E突变的bFGF-21
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是对乙酰基苯丙氨酸（pAF）
<400> 6
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Xaa Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Lys Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Pro Gln Arg Ser Ser Asn Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Pro Asp Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Ser Tyr Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Thr Ser
180
<210> 7
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-编码SEQ ID NO: 6
<400> 7
atgcatccta ttcctgattc ttctcctctg ctgcaatttg ggggtcaggt gcgccaacgt 60
tacctgtaca ccgacgatgc gcaagaaact gaggctcacc tggagatccg tgctgacggg 120
actgtcgtgg gggctgcccg tcaatcccca gagtcactgc tggaactgaa agccctgaag 180
cctggggtca ttcagatcct gggcgtaaag acgagtcgtt tcctgtgcca atagcctgac 240
gggaaactgt atggctcgct gcattttgat cctaaagctt gtagttttcg cgaactgctg 300
ctggaagatg gttacaatgt gtatcagagt gaaactctgg gtctgcctct gcgtctgcct 360
cctcaacgta gtagcaaccg tgaccctgcc ccgcgcggtc cggcccgttt tctgccactg 420
cctggcctgc ctgctgcacc acctgaccca ccgggtattc tggctccgga acctccagac 480
gtcgggagtt cagatcctct gtcgatggta gaaccgtcat acggtcgctc tcctagttac 540
acttcataa 549
<210> 8
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽-具有K91pAF和G170E突变的bFGF-21
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (91)..(91)
<223> Xaa是对乙酰基苯丙氨酸（pAF）
<400> 8
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gly Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Xaa Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Pro Gln Arg Ser Ser Asn Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Pro Asp Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Ser Tyr Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Thr Ser
180
<210> 9
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-编码SEQ ID NO: 8
<400> 9
atgcatccta ttcctgattc ttctcctctg ctgcaatttg ggggtcaggt gcgccaacgt 60
tacctgtaca ccgacgatgc gcaagaaact gaggctcacc tggagatccg tgctgacggg 120
actgtcgtgg gggctgcccg tcaatcccca gagtcactgc tggaactgaa agccctgaag 180
cctggggtca ttcagatcct gggcgtaaag acgagtcgtt tcctgtgcca aggccctgac 240
gggaaactgt atggctcgct gcattttgat ccttaggctt gtagttttcg cgaactgctg 300
ctggaagatg gttacaatgt gtatcagagt gaaactctgg gtctgcctct gcgtctgcct 360
cctcaacgta gtagcaaccg tgaccctgcc ccgcgcggtc cggcccgttt tctgccactg 420
cctggcctgc ctgctgcacc acctgaccca ccgggtattc tggctccgga acctccagac 480
gtcgggagtt cagatcctct gtcgatggta gaaccgtcat acggtcgctc tcctagttac 540
acttcataa 549
<210> 10
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽-具有R131pAF和G170E突变的bFGF-21
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (131)..(131)
<223> Xaa是对乙酰基苯丙氨酸（pAF）
<400> 10
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gly Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Lys Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Pro Leu Arg Leu Pro Pro Gln Arg Ser Ser Asn Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Xaa Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Pro Asp Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Ser Tyr Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Thr Ser
180
<210> 11
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-编码SEQ ID NO: 10
<400> 11
atgcatccta ttcctgattc ttctcctctg ctgcaatttg ggggtcaggt gcgccaacgt 60
tacctgtaca ccgacgatgc gcaagaaact gaggctcacc tggagatccg tgctgacggg 120
actgtcgtgg gggctgcccg tcaatcccca gagtcactgc tggaactgaa agccctgaag 180
cctggggtca ttcagatcct gggcgtaaag acgagtcgtt tcctgtgcca aggccctgac 240
gggaaactgt atggctcgct gcattttgat cctaaagctt gtagttttcg cgaactgctg 300
ctggaagatg gttacaatgt gtatcagagt gaaactctgg gtctgcctct gcgtctgcct 360
cctcaacgta gtagcaaccg tgaccctgcc ccgtagggtc cggcccgttt tctgccactg 420
cctggcctgc ctgctgcacc acctgaccca ccgggtattc tggctccgga acctccagac 480
gtcgggagtt cagatcctct gtcgatggta gaaccgtcat acggtcgctc tcctagttac 540
acttcataa 549
Claims (29)
1.牛成纤维细胞生长因子21（bFGF-21）变体，其由下述序列组成：
并且
其中存在于108位的对乙酰基苯丙氨酸（pAF）合成氨基酸共价附着到聚（乙二醇）（PEG）。
2.权利要求1的bFGF-21变体，其中所述PEG具有约10 kDa-约100 kDa的分子量。
3.权利要求1的bFGF-21变体，其中所述PEG具有约20 kDa-约50 kDa的分子量。
4.权利要求1的bFGF-21变体，其中所述PEG具有约30 kDa的分子量。
5.权利要求1-4中任一项的bFGF-21变体，其中所述PEG是线性的。
6.牛成纤维细胞生长因子21（bFGF-21）变体，其由下述序列组成：
并且
其中存在于108位的pAF合成氨基酸共价附着至30 kDa线性PEG。
7.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的bFGF-21变体，和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.权利要求1-7中任一项的bFGF-21变体在制备用于治疗牛的酮病的药物中的用途。
9.权利要求1-6中任一项的bFGF-21变体，其用于治疗。
10.权利要求1-6中任一项的bFGF-21变体，其用于治疗牛的酮病。
11.一种治疗牛的酮病的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-7的bFGF-21变体施用给有需要的牛。
12.权利要求11的方法，其中所述牛是奶场奶牛。
13.权利要求12的方法，其中所述奶场奶牛是怀孕的奶场奶牛。
14.权利要求11的方法，其中所述bFGF-21的治疗有效量是约20-200μg/kg动物体重。
15.权利要求11的方法，其中所述bFGF-21的治疗有效量是约25-100μg/kg动物体重。
16.权利要求11的方法，其中所述bFGF-21的治疗有效量是约50μg/kg动物体重。
17.权利要求11的方法，其中所述施用在产犊前7天或更短时间发生至少一次。
18.权利要求11的方法，其中所述施用在产犊时发生。
19.权利要求17和18中任一项的方法，进一步包括产犊后7天或更短时间的第二次施用。
20.一种降低牛中非酯化脂肪酸（NEFA）和/或β-羟丁酸（BHBA）血清浓度水平的方法，包括将权利要求1至12中任一项的bFGF-21变体施用给有需要的牛。
21.核酸，其编码牛成纤维细胞生长因子21（bFGF-21）变体，其中所述核酸包含下述核苷酸序列：
。
22.根据权利要求10的用于使用的bFGF-21变体，其中所述牛是奶场奶牛。
23.根据权利要求22的用于使用的bFGF-21变体，其中所述奶场奶牛是怀孕的奶场奶牛。
24.根据权利要求10或22或23的用于使用的bFGF-21变体，其中所述bFGF-21变体以20-200μg/kg动物重量的剂量施用。
25.根据权利要求24的用于使用的bFGF-21变体，其中所述bFGF-21变体以25-100μg/kg动物体重的剂量施用。
26.根据权利要求25的用于使用的bFGF-21变体，其中所述bFGF-21变体以约50μg/kg动物体重的剂量施用。
27.根据权利要求10或22-26中任一项的用于使用的bFGF-21变体，其中所述bFGF-21变体在产犊前7天或更短时间施用至少一次。
28.根据权利要求27的用于使用的bFGF-21变体，其中所述bFGF-21变体在产犊时施用。
29.根据权利要求27或28的用于使用的bFGF-21变体，其中所述bFGF-21变体在产犊后7天或更短时间第二次施用。
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