CN109640960A - 来自粗制膜的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒及文库 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡的混合物；b)在液体环境中使步骤a)的混合物与脂质结合多肽相接触；以及c)进行所述颗粒的自组装。本发明还提供了制备纯化的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法，其包括根据上述方法制备文库的步骤以及f)从该文库中纯化出鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的附加步骤。此外，本发明提供了能够根据本发明的方法得到的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库以及鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。这些物质可用于医药，特别是用于预防、治疗疾病或减轻疾病的严重程度，或用于诊断方法、美容处理或用作疫苗接种制剂或作为以下方面的工具：药物研发、药物筛选、药物探索、抗体研发、治疗性生物制剂研发、膜或膜蛋白纯化、膜蛋白表达、膜和/或膜蛋白研究，特别是脂质组学和蛋白质组学，优选膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或蛋白质组数据库。

Description

来自粗制膜的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒及文库

技术领域

本发明涉及制备来自细胞膜或细胞器膜的脂蛋白颗粒文库并从中纯化脂蛋白颗粒的方法，本发明还涉及脂蛋白颗粒文库和纯化的脂蛋白颗粒本身以及它们的用途。

背景技术

在过去十年中，在生命科学(特别是药物探索)方面的研究已迅速发生变化。随着分子生物学、计算、基因组学、蛋白质组学和脂质组学的进展，新型研究方法和药物探索得以发展。

在这一研究领域中，已证实细胞或细胞器的基因组、蛋白质组或脂质组的文库在研究基因、蛋白质或脂质功能以及探索基因、蛋白质或脂质药物靶标方面非常有用。虽然基因组和DNA文库领域进展良好，但仍迫切需要开发用于制备膜蛋白质组和/或脂质组文库的改进方法。

药物探索基于对在某些疾病中具有特定生理活性的先导化合物的探索、选择和进一步研发和/或(如果可得到化合物文库)对疾病所涉及的细胞中的新药物靶标的鉴定。药物靶标通常是脂质、脂质结构域或膜蛋白，例如，嵌入靶细胞的细胞膜或细胞器膜中的受体或转运蛋白。因此，通常在生命科学中，并且特别是在新型药物的研发中，非常需要阐明嵌入其天然膜环境中的脂质、脂质结构域和膜蛋白的结构和功能，以及针对可能的脂质和膜蛋白靶标的复杂文库而筛选化合物或化合物文库的可能性。

对于细胞或细胞器的可溶性蛋白质，通过简单地分离可溶性蛋白质部分，可以容易地制备可溶性细胞或细胞器蛋白质组的文库。遗憾的是，在通常用于药物筛选方法和生命科学研究中采用的大多数功能检验的无去垢剂系统中，细胞膜(以及其中所含的膜蛋白和脂质)是不溶的。因此，目前的膜蛋白质组或脂质组文库大多处于去垢剂溶解状态或处于变性状态。后者可用于蛋白质或脂质鉴定技术，如质谱，但不适合进行膜蛋白或脂质在其天然环境中的功能分析，而此类分析是该领域中成功研究和药物研发的基本要求。

在纯化、分离和功能分析中的这些困难延误了对膜脂质组和膜蛋白质组的研究。

脂质组学是对生物系统中细胞脂质的途径、组成和网络的大规模研究，并涉及对细胞脂质分子种类的鉴定和量化以及细胞脂质分子与其他脂质、蛋白质和其他代谢物的相互作用。“脂质组”一词用于描述细胞、组织、生物体或生态系统的所有脂质和/或脂质谱的总和，并且是“代谢物组”的子集，代谢物组还包括其他主要类别的生物分子：蛋白质、氨基酸、糖类和核酸。脂质组学是一个相对较新的研究领域，其发展受到以下方面的推动：质谱法(MS)、核磁共振(NMR)谱学、荧光光谱学和计算方法等技术的快速发展以及对脂质在肥胖、动脉粥样硬化、中风、高血压和糖尿病等许多代谢疾病中的作用的认知。这个快速发展的领域补充了基因组学和蛋白质组学方面的巨大发展，所有这些构成了系统生物学家族。

脂质组非常复杂，并且脂质在膜动力学、能量代谢和信号转导中起重要作用，其中脂质结构是生物效应的关键决定因素。脂质组学等分析方法对于提高目前对基础研究和药物探索和研发中的生物学相关脂质的生物学理解至关重要。为此，希望能够提供这样的脂质组文库，其中脂质处于尽可能接近其在细胞膜或细胞器膜中的天然环境的状态。

脂质组学研究方法适用于所有治疗领域，包括心血管疾病、糖尿病、癌症、神经性疾病和自身免疫，以及炎性疾病。成功的脂质组学研究的基本要求是足够的预分析样品，优选能够快速生产、容易处理且储存时间短的脂质组文库，这是因为一些脂质和天然存在的脂质结构域可能是不稳定的。

在许多领域中，脂质还提供了新型生物标志物解决方案的前景。此外，脂质还可以作为实验性疗法或现有疗法的潜在药效学读出(pharmacodynamic read-out)。因此，脂质也可以促进成对诊断发展从而支持更为个性化的治疗方法。同样在这方面，期望提供用于制备脂质组文库的方便且有力的方法。脂质组学也可用于研究各种实验性疾病模型，而这可以为转化医学提供巨大的帮助。

另一方面，蛋白质组学是对蛋白质，特别是蛋白质的结构和功能的大规模研究。由于蛋白质是细胞生理代谢和信号转导途径的主要成分，因而蛋白质是活生物体的重要组成部分。蛋白质组是生成并包含在生物体、细胞、细胞器或系统中的一组蛋白质。膜蛋白质组是生成并包含在生物体、细胞、细胞器或系统的膜中的一组膜蛋白和膜相关蛋白。蛋白质组van随着时间和细胞或生物体所经历或体验的条件或应激(例如，在疾病中)而变化。

膜蛋白质组是一个特别有趣的研究对象，因为膜蛋白在细胞系统和疾病中发挥了许多功能。由于包含给定细胞膜或细胞器膜的膜蛋白质组的文库富含潜在的药物靶标，因此其对于筛选方法是非常需要的。此外，未知膜蛋白的分离和鉴定提供了探索新的药物靶标和鉴定关键生化受体的前景。如上所述，迄今为止，膜蛋白质组文库的制备和随后的用途受到膜和膜成分在无去垢剂系统中的不溶性的阻碍。由于膜蛋白在无去垢剂系统中的不溶性，使得难以在体外研究膜蛋白靶标与可溶性配体之间的相互作用。

膜蛋白和脂质等疏水性化合物非常难以处理，并且制药和生命科学研究和应用中具有两个主要的挑战：(i)为脂质等不可溶的疏水性化合物或膜蛋白提供在水溶液中的可溶性，以及(ii)将这类疏水性物质作为治疗、研究或诊断制剂进行处理和施用。

膜蛋白由全部ORF的大约30％编码(参见文献“Wallin和von Heijne,ProteinScience 1998Apr；7(4):1029-38”)，并且由于大部分(即，大于60％)药物实际上靶向这类蛋白，因此其代表了一类重要的药物靶点(参见文献“Overington等人,Nature ReviewsDrug Discovery 5,993-996(December 2006)”)。膜蛋白在许多生物过程中发挥重要作用，如信号转导、分子和能量运输、识别和细胞通讯。然而，当将膜蛋白从其天然脂双层环境中提取出来后，膜蛋白由于其不溶性和趋于聚集的性质而难以研究。为了维持膜蛋白的完整性，需要人造的疏水环境。在此，去垢剂胶束是最常使用的，然而其会对生物相容性产生负作用，能够对膜蛋白的活性产生不利影响，并且可能会干扰检验的实验条件。

另一个主要的药理学挑战是，施用和递送疏水性蛋白和/或脂质作为治疗剂或诊断剂。由于这些疏水性试剂的溶解度有限，它们趋于聚集，这将导致局部药物颗粒浓度高，从而会导致高的毒性、不希望的免疫反应，并且会使药物失活(参见文献“Allen和Cullis,SCIENCE,303(5665):1818-1822,MAR 19,2004”)。

因此，非常需要将诸如膜蛋白或脂质等疏水试剂纳入可溶性的颗粒中的应用。目前，解决这两个挑战的方法主要涉及脂质体和重组高密度脂蛋白(rHDL)颗粒(参见文献“Chan和Boxer,Current Opinion in chemical Biology 11:1-7,2007”)。

EP1596828B1公开了盘状生物活性试剂递送颗粒，包含以双带样形式紧密包围脂双层的载脂蛋白。上述颗粒的内部由脂双层的疏水区域形成。这与具有含水内部的封闭球状双层壳的脂质体不同。EP 1596828B1中公开的盘状生物活性试剂递送颗粒的斯托克斯直径约为10nm，并且提出了将其用作疏水性药物如两性霉素B或喜树碱的递送载体。

EP 1345959B1公开了相似类型的直径约10nm、高度约5.5nm的纳米颗粒。该颗粒为盘状，并且由(i)人工膜脚手架蛋白、(ii)磷脂双分子层和(iii)至少一种疏水性或部分疏水性膜蛋白组成。参见下文的图1a。所述膜脚手架蛋白也以双带样式包围脂双层，并且是人载脂蛋白A-1的衍生物或截短形式，缺少人载脂蛋白A-1的N-末端球状结构域，其是两亲性的并且形成至少一个α螺旋，并且在水环境中会与磷脂或磷脂的混合物自组装成所述盘状的纳米颗粒。这种工程化的膜脚手架蛋白(MSP)将为纳米级盘状脂蛋白颗粒提供稳定性、尺寸均匀性以及有用的功能性。

然而，目前可用的纳米盘技术存在一些缺点，例如，在颗粒的组装过程中需要去除去垢剂。除此之外，在现有技术的方法中，由载脂蛋白衍生的MSP的紧密双带样形式提供的尺寸均匀性似乎导致了这样的代价：最小颗粒尺寸固定并且限制了可获得的最大直径。

最近，已经提出了涉及鞘脂激活蛋白(saposin)家族的脂质结合蛋白的新型纳米颗粒技术(参见“Qi等人(2009)Clin Cancer Res 15(18):5840-5851；Popovic等人,PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912；WO 2014/095576 A1和WO 2015/036549A1”)。

鞘脂激活蛋白家族包括4种小(大约80个氨基酸)蛋白，包括鞘脂激活蛋白A到D，其与脂结合和/或相互作用，并且在鞘脂代谢中作为几种溶酶体酶的重要辅因子(参见“Bruhn,Biochem J.(2005)389,249-257”和其所引用的文献)。据描述，鞘脂激活蛋白更偏好带负电荷的脂质和低pH值，在酸性pH环境中显示出明显提高的活性，最佳pH值为溶酶体内4.75的pH值。鞘脂激活蛋白A、B、C和D由单一的大的前体蛋白，即鞘脂激活蛋白原(prosaposin)通过蛋白水解作用水解而得。已经报道了鞘脂激活蛋白A、B、C和D的完整氨基酸序列、以及鞘脂激活蛋白原的基因组结构和cDNA序列(请参见“O'Brien等人(1988)Science 241,1098-1101；Furst等人(1992)Biochim Biophys Acta 1126:1-16”)。

鞘脂激活蛋白C在酸性环境中能够诱导含磷脂的囊泡发生膜融合(参见“Archivesof Biochemistry and Biophysics 2003Jul 1；415(1):43-53”)，其他鞘脂激活蛋白没有表现出该特征。文献“Qi等人(2009)Clin Cancer Res 15(18):5840–5851”报道了鞘脂激活蛋白C偶联的二油酰基磷脂酰丝氨酸纳米囊泡(SapC-DOPS)，其具有含水内部、大约190nm的平均直径，并且在体内表现出肿瘤靶向活性。在SapC-DOPS中，鞘脂激活蛋白C或其衍生肽作为其结合的脂质体的导向肽(homing peptide)。鞘脂激活蛋白C而后靶向脂质体到细胞膜外叶暴露有磷酯酰丝氨酸的癌细胞。作者认为，由于溶酶体酶的细胞外泄漏而导致的癌细胞周围的独特酸性微环境使得肿瘤组织成为鞘脂激活蛋白C的最佳靶标。根据Qi等人所述，SapC-DOPS溶酶体通过以下方法制备：在N₂(g)下干燥溶剂溶解的纯化的磷脂，将干燥的磷脂分散在含有纯化的鞘脂激活蛋白C的酸性缓冲液(pH 5)中，在生理水溶液中将混合物稀释50倍，以及通过后续的超声处理促进纳米囊泡组装。

文献“Popovic等人,PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912”报道了鞘脂激活蛋白A去垢剂盘的结构。鞘脂激活蛋白A以可溶的、脂质/去垢剂-结合的状态存在。在脂质缺乏时，鞘脂激活蛋白A采取封闭的无配体(apo)构象。相反，Popovic等报道的鞘脂激活蛋白A去垢剂盘结构显示了开放构象的鞘脂激活蛋白A的两条链，其包裹了40个内部结合的去垢剂分子，它们被组织在高度有序的双层样疏水核心中。

除了鞘脂激活蛋白A去垢剂盘的结晶作用，Popovic等还描述了可溶性脂质-鞘脂激活蛋白A复合物的制备，其在4.75的pH下通过需要多步的方法进行。首先，通过如下方式制备均匀级分的大单层脂质体囊泡：在N₂(g)下干燥用氯仿溶解的纯化的脂质，通过涡旋混合将干燥的脂质分散在酸性缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.8，150mM NaCl)中，对悬浮液进行10个冻融循环，在涡旋混合器中混合5分钟，将混合物挤压通过200nm过滤器。在酸性缓冲液中将由此制备的大单层人造脂质体囊泡与纯化的鞘脂激活蛋白A混合，由此获得可溶性脂质-鞘脂激活蛋白A颗粒。该颗粒表现出窄的尺寸分布，即，大约平均3.2nm的流体动力学(斯托克斯)半径，并且每个鞘脂激活蛋白A链含有大约5:1的脂质分子。颗粒的精确大小仅适度地受到脂质与蛋白的摩尔比以及脂质体的组成的影响。无论在脂质体混合物中是否存在阴离子磷脂、胆固醇或鞘糖脂，作者均观察到了相似的3.2nm的颗粒。在所有情况下，在3.2nm斯托克斯半径的尺寸范围内观察到了单一的峰，这提示了相对窄的种类分布。因此，该文献公开的技术限制于4.75的pH值、上述颗粒大小以及包括繁复的上游脂质体制备步骤。

WO 2014/095576 A1首次表明，可以使用去垢剂溶解的且纯化的脂质将纯化的、去垢剂溶解的疏水性货物分子或纯化的、去垢剂溶解的膜蛋白纳入鞘脂激活蛋白脂质颗粒中(参见下文的图1b)。因此，WO 2014/095576 A1中描述的方法使用了纯化的、去垢剂溶解的成分，并且由此与Popovic等人的方法中由纯化的脂质制备的合成脂质体形成对比。

WO 2015/036549 A1将WO 2014/095576 A1中描述的方法扩展到纳入来自定义明确且纯化的HIV-1病毒样颗粒(VLP)的溶解的抗原分子(示于病毒膜蛋白)。根据WO 2015/036549 A1的例子，将预纯化的VLP裂解，利用去垢剂溶解HIV-1膜刺突蛋白，然后使其与鞘脂激活蛋白A相接触。概括而言，WO 2015/036549 A1也提出原则上可以使用来自细菌、真菌、原生动物、寄生虫、或者人或动物赘生物/肿瘤的溶解的抗原分子，然而，没有提供实验细节。并且，又仅使用了去垢剂溶解状态中的纯化的成分，即没有保持天然膜环境。

多种疏水剂(如膜蛋白或脂质)能够潜在地从现有技术中记载的载脂蛋白-或鞘脂激活蛋白-衍生的纳米盘技术中获益。可以容易地想象到，脂质组和膜蛋白质组文库的制备将需要使纳米盘状颗粒在尺寸和货物(cargo)相容性方面极其灵活。然而，由于Popovic等人报道的鞘脂激活蛋白A衍生颗粒具有3.2nm大小的限制，似乎(如果有的话)只有小分子可以在其中所公开的酸性pH值下被纳入所述颗粒。尽管体积大的疏水性化合物和大的生物分子如(寡聚)膜蛋白能够被纳入现有技术中的载脂蛋白A衍生的纳米盘，但是可行的最大直径仍然受到这些颗粒的双带样载脂蛋白A的周长的限制。此外，10nm的载脂蛋白A衍生纳米盘对于某些应用而言可能过大。

此外，在所有上述与载脂蛋白或鞘脂激活蛋白相关的现有技术中描述的方法在其实验细节的水平上都是复杂的，并且依赖于去垢剂溶解的纯化成分的定义明确的系统。因此，当直接使用其特征在于高度复杂的结构和组成的粗制膜作为起始材料时，预期其不起作用。如果首先要对来自细胞膜或细胞器膜的膜脂质组和蛋白质组进行纯化和溶解，则可以从其天然环境和背景中去除膜蛋白和脂质，然而这会导致功能丧失、内容物损失、文库组成的复杂性和相应的偏置。此外，这种方法将是复杂且精细的，因为并非所有膜蛋白和膜脂质对处理、去垢剂溶解和稳定性均具有相同的要求。

此外，现有技术的上述方法(其显示了细菌或真核生物膜蛋白的纳入)使用合成或纯化的脂质来重构脂蛋白颗粒。因此，脂蛋白颗粒中存在的脂质和膜蛋白来自不同的来源，并且不反映天然存在的环境。然而，非常需要这种对天然存在环境的模拟，以得到将在研究和筛选中产生有意义结果的文库，从而增强在其天然细胞环境和可能的疾病环境中的可转移和可验证的可能性。

总之，用于将原核生物或真核生物的膜成分(如蛋白质和脂质)纳入纳米颗粒结构中的现有技术方法主要包括成分的提取、溶解和重新组装成颗粒，特别是其中使用了合成脂质或纯化自完全不同的来源的脂质。这些颗粒与获得它们的天然存在的膜不相似。这使得不可能对天然存在的膜环境进行研究。此外，这些已知的方法在纯化和提取期间具有蛋白质变性或脂质和脂质结构域不稳定的风险。此外，不能排除蛋白质和/或脂质在脱离其天然环境时会失去其天然结构和功能。

与鞘脂激活蛋白相关的现有技术仅教导了纳入原核生物或真核生物来源的去垢剂纯化的和/去垢剂溶解的膜蛋白或来自纯化的人造病毒样颗粒中的溶解的抗原的方法。这些方法提供了高度均匀的纳米盘群(nanodisc population)，其含有在脂质环境中所关注的重组装的纯化的膜蛋白，该脂质环境是定义明确的，但通常完全不同于原核生物、古细菌和真核生物的天然存在的膜。

相比之下，这些原核生物、古细菌和真核生物的天然存在的膜非常复杂，并且包含高度多样化的一系列蛋白质和脂质，这些蛋白质和脂质相互作用以形成具有调节各种细胞过程的能力的复杂的上层结构。在没有现有技术方法中教导的去垢剂溶解和纯化步骤的情况下，似乎几乎不可能进行处理和纳入这种复杂的膜，因为预期复杂的天然膜结构不像纯化的成分那样容易处理。特别地，天然膜还包含复杂的混合物和各种脂质成分的结构域，所述脂质成分主要由不同类型的磷脂组成，包括POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、POPS(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸)和鞘磷脂以及其他脂质，包括胆固醇。此外，膜形成诸如脂筏之类的结构域，其可以(例如)含有显著高于促进蛋白质信号转导的常规质膜的百分比的胆固醇和鞘磷脂。给定的膜蛋白可能仅在其给定的天然膜环境中正常发挥作用。

总之，原核生物、古细菌和真核生物的膜表现出高度的复杂性，这是由于在膜蛋白的天然环境中，膜蛋白与围绕它们的各种脂质之间错综复杂的相互作用而产生的。

现有技术没有考虑，因而当然也没有教导或建议用于制备鞘脂激活蛋白衍生的颗粒形式的天然状态的膜蛋白质组和脂质组文库的可行方案。

然而，如上所述，非常需要这样的文库，其中膜蛋白质组或脂质组成分仍然保存在其天然环境中。例如，阐明膜蛋白在其天然存在的环境(即嵌入该膜蛋白在体内存在于且发挥作用的膜的脂质中)中的体外结构、功能和相互作用，将有助于鉴定药物靶标和理解潜在的机制以及在细胞膜和细胞器膜的水平发生的反应。因此，需要研发用于制备来自细胞膜或细胞器膜的文库的新方法，该方法使得膜脂质和膜蛋白能够保留在其天然环境中，以便所述膜脂质和膜蛋白保持其各自的结构和功能。提供反映粗制膜的脂质和蛋白质组成的文库将使得能够以迄今无法达到的水平研究某种细胞、细胞器或生物体的脂质组、蛋白质组或膜结构。

发明内容

在此背景下，可以看出本发明要解决的问题是提供改进的脂蛋白颗粒和改进的脂蛋白颗粒文库以及它们的制备方法。

通过本发明的方法可解决该问题，所述方法采用粗制膜囊泡作为起始材料来制备包含脂质结合多肽和细胞膜或细胞器膜的至少部分或成分的脂蛋白颗粒文库，其中脂质结合多肽是鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物或截短形式。

本发明提供了一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡的混合物；

b)在液体环境中使步骤a)的所述混合物与脂质结合多肽相接触；

c)进行所述颗粒的自组装。

本发明的方法可以扩展到特定类型的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的纯化方法，该方法包括根据上述方法制备文库的步骤以及以下附加步骤：

f)从所述文库中纯化出至少一种类型的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。

本文所述的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒包含膜成分，特别是膜脂质以及任选的膜蛋白，它们均衍生自细胞膜或细胞器膜。本文所述的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒还包含脂质结合多肽，所述脂质结合多肽属于可以通过本发明的方法得到的脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白(SAPLIP)或其衍生形式。本文所述的这些鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒在本文中也被称为“Salipro颗粒”、“鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒”或“本发明的颗粒”。可以通过本发明的方法得到并且包含不同的Salipro颗粒的混合物的文库在本文中也被称为“Salipro颗粒文库”。

根据本发明的方法具有以下优点：该方法相对容易进行并且令人惊讶地产生了这样的Salipro颗粒文库，该文库反映了用作起始材料的粗制膜的多样性和复杂性，并且将其中所含的脂质和膜蛋白成分纳入且维持在它们的天然膜环境中。在根据本发明的方法中可以使用多种膜。步骤a)中使用的粗制膜囊泡由细胞或细胞器的粗制膜制备而成。可以使用得自许多生物体的细胞膜和/或细胞器膜的粗制膜囊泡。令人惊讶的是，当采用真核生物、原核生物或古细菌细胞的复杂的膜作为起始材料来代替现有技术制备方法中所需的高度纯化的、去垢剂溶解的起始材料时，也可以得到Salipro颗粒。

通过本发明的方法得到的文库中存在的Salipro颗粒在尺寸和组成上有所不同，并且包含不同的膜成分混合物，从而反映了用作起始材料的粗制膜的膜脂质组和蛋白质组。另外，可将得自细胞器的粗制膜的成分纳入Salipro颗粒中。

本领域技术人员知道，得自细胞和细胞器的膜表现为复杂且非常异质的成分混合物，预期所述混合物还与脂质结合多肽以及脂蛋白颗粒的制备方法中使用的其他试剂相互作用。预计这样会得到很少的产品、低质量的产品或十分不确定的产品。在此背景下，令人惊讶的是，可以使用复杂的粗制膜并且容易地将其多种成分纳入Salipro颗粒中，以形成相应的膜蛋白质组/脂质组文库。与采用粗制膜囊泡的本发明的方法相反，采用鞘脂激活蛋白样蛋白以及真核生物或原核生物的膜蛋白的现有技术方法主要使用能够与高度纯化的蛋白质重组装的纯化的脂质或合成脂质，或者以具有受控条件的方式进行。

根据本发明的方法提供了能够直接从复杂的细胞膜中有效捕获膜成分(特别是膜脂质和膜蛋白)的文库。由于根据本发明的方法使用粗制膜囊泡，即完整的生理膜的部分和/或成分，其不像现有技术方法那样经过提取或纯化，因而仍包含其天然脂质以及其天然膜蛋白的全部功能，因此通过根据本发明的方法得到的Salipro颗粒文库包含复杂的一系列膜成分。这使得能够提供描述来自特定细胞或细胞器的脂质组和/或膜蛋白质组的文库。

特别地，根据本发明的方法使得能够制备包含Salipro颗粒以及不同的膜脂质和任选的膜蛋白组成的异质混合物的文库。如上所述，提供了这样的文库，其包含由一系列异质膜成分(即嵌入其天然环境中的膜脂质和/或膜蛋白)组成的一系列Salipro颗粒，这是药物探索、抗体生成、膜(蛋白质或脂质)研究、脂质组学、蛋白质组学或医药、化妆品和诊断应用中非常有用的工具。

实际实验表明，Salipro颗粒的尺寸可根据纳入的膜成分的性质而自我调节，例如根据纳入的膜蛋白的尺寸而自我调节。令人惊讶地，Salipro颗粒在尺寸方面是灵活的，因此，与目前的膜文库技术中采用的其他脚手架蛋白和试剂相比，Salipro颗粒可以在类似于文库的膜脂质组或蛋白质组中使不同的脂质(并且任选地使膜)的特异性具有更大的灵活性和/或变化。

不受理论的束缚，似乎根据本发明的方法能够使Salipro颗粒根据纳入的膜成分的性质而调节颗粒尺寸。这优于其他现有技术颗粒的尺寸限制。这种灵活性显然也使得能够纳入在其天然环境中的膜蛋白，例如膜脂质或与膜蛋白相关并且可能是维持蛋白质的结构和/或功能所必需的其他细胞成分。还令人惊讶地发现，尽管在本发明的方法之后成功地将这种尺寸和组成不同的复杂膜部分和成分纳入Salipro颗粒中，但是由此得到的文库仍然是稳定的，并且可以进一步进行加工、处理、纯化和/或分析而没有困难。利用本发明的方法得到的Salipro颗粒易于生产，并且可以随时间推移而保持一致的品质和组成，从而提供了得到能够进行其他步骤和应用的稳定且有价值的文库的可能性。

不受理论的束缚，似乎本发明的步骤b)中的粗制膜囊泡与鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物或截短形式相接触以及步骤c)中的自组装提供了强固的结构，该结构在宽的pH范围(特别是在生理pH下)的水性溶液中是稳定的，从而能够得到比根据Popovic等人的现有技术教导而得自合成制备的脂质体的3.2nm鞘脂激活蛋白A衍生的脂蛋白颗粒更大的颗粒。

如在背景技术中所述，膜蛋白在治疗性研发中的重要性使得需要探索用于在无细胞培养基中(优选在无去垢剂的环境中)查询(interrogating)膜蛋白的创新方法。

可以通过本发明的方法得到的文库和Salipro颗粒满足该要求。所述文库和Salipro颗粒一经获得，则在无细胞培养基和无去垢剂的环境中是稳定的。在一个实施方案中，在该方法中使用去垢剂不是强制性的。

粗制膜包含众多的不同膜蛋白和脂质成分。与预期的没有去垢剂的情况相反，膜蛋白不溶于无去垢剂的缓冲液体系并且会聚集，从而导致在SEC分析中形成大的空隙峰，实际实验表明，膜蛋白和膜脂质成分一旦嵌入Salipro颗粒，则可保持溶于无去垢剂的缓冲液体系。

在本发明的另一个方面，Salipro颗粒文库可用于进一步纯化特定类型的Salipro颗粒，即该Salipro颗粒包含特定的目的膜蛋白或脂质组成。

此外，可以通过本发明的方法得到的文库和颗粒可用作以下方面的工具：药物研发、药物筛选、药物探索、抗体研发、治疗性生物制剂研发、膜或膜蛋白纯化、膜蛋白表达、膜和/或膜蛋白研究，特别是脂质组学和蛋白质组学，优选膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或蛋白质组数据库。

最后，Salipro颗粒文库或Salipro颗粒可用于医药，特别是用于预防、治疗疾病或减轻疾病的严重程度，或用于诊断方法、美容处理或用作疫苗接种制剂。

具体实施方式

本发明提供了一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡；

b)在液体环境中使步骤a)之后得到的混合物与脂质结合多肽相接触；

c)进行所述颗粒的自组装。

根据本发明的方法特别提供了Salipro颗粒文库，其中每个Salipro颗粒均包含脂质结合多肽、膜脂质，以及任选的膜蛋白。如本文所用的术语“膜蛋白”不包括本发明的脂质结合多肽。如本文所用的“膜脂质”是膜脂质的混合物，特别是天然存在的膜脂质的混合物。如本文所用的“膜脂质”源自制备粗制膜囊泡的粗制细胞膜或细胞器膜。因此，本文所用的膜脂质不包括预纯化的脂质或脂质混合物。

如本文所用的“粗制细胞膜或细胞器膜”是细胞膜或细胞器膜或它们的一部分，其不再完全完整但仍然实质上包含天然膜组分，特别是包含膜脂质和膜蛋白。例如，在细胞或细胞器的细胞破裂或裂解之后得到的粗制膜部分是根据本发明的“粗制细胞膜或细胞器膜”。“粗制细胞膜或细胞器膜”必须包含存在于细胞和细胞器中的天然膜成分。具体而言，“粗制细胞膜或细胞器膜”包含膜脂质以及膜蛋白两者。在一个优选实施方案中，存在于本发明的Salipro颗粒中的膜脂质和膜蛋白或存在于本发明的Salipro颗粒文库中的膜脂质和膜蛋白得自相同的细胞膜和/或细胞器膜。

由于粗制细胞膜或细胞器膜不再是完全完整的细胞膜或细胞器膜，因而基于两个给定的膜破裂位点之间的疏水相互作用而自发形成粗制膜囊泡泡。因此，在一个实施方案中，“粗制细胞膜或细胞器膜”包括“粗制膜囊泡泡”或将这两个术语同义使用。

根据本发明的术语“文库”是指一组(复杂的多个)不同的Salipro颗粒。特别地，差异可以在于颗粒的尺寸和组成，特别是在于其中所含的膜成分的组成，即膜脂质和任选的膜蛋白。通常，文库是“仅脂质颗粒”(参见图2a和2b)和包含膜蛋白的不同种类的Salipro颗粒的混合物(参见图2c至2f)。文库中的颗粒也可以在其不同的膜脂质的含量和组成方面有所不同。优选地，文库中的一些颗粒的不同之处在于它们是否含有膜蛋白以及含有哪种膜蛋白。

Salipro颗粒中的膜脂质和/或膜蛋白得自某种细胞的膜、某种细胞的全部膜、某种细胞器的膜、某种细胞器的全部膜、某个个体或生物体的全部膜、或来自细胞或细胞的细胞器的含有膜的任意其他可能的膜样品。优选地，文库中所含的Salipro颗粒的膜脂质和/或膜蛋白组成有所不同。优选地，它们的膜蛋白组成有所不同。

在一个优选实施方案中，Salipro颗粒为盘状。在另一个优选实施方案中，Salipro颗粒不包含水性或亲水核心。在另一个实施方案中，Salipro颗粒为盘状并且不包含水性或亲水核心。

因此，本发明还提供了制备盘状鞘脂激酶蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含膜脂质以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白的SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中，所述颗粒不包含亲水或水性核心，并且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡泡；

b)在液体环境中使步骤a)之后得到的混合物与脂质结合多肽相接触；

c)进行所述颗粒的自组装，特别优选在以下pH进行：2.0至10.0，特别是6.0至10.0，优选6.0至9.0，特别优选7.0至9.0，最优选7.0至8.0。

已证明本发明的颗粒能够纳入多种膜脂质和任选的膜蛋白，从而产生在水性环境中可溶且稳定的纳米级复合物。特别地，根据本发明的颗粒是纳米级颗粒，其包含脂质结合多肽、膜脂质和任选的膜蛋白。膜脂质和任选的膜蛋白优选得自相同的细胞膜和/或细胞器膜，特别是得自相同的多种细胞膜和/或细胞器膜。

在一个优选实施方案中，通常认为本发明的颗粒为盘状。特别地，本发明的颗粒的斯托克斯半径(流体动力学半径)R_S在2nm至200nm、特别是3nm至150nm、优选3nm至100nm的范围内。本领域技术人员知道如何确定斯托克斯半径。这优选通过分析用凝胶过滤(尺寸排阻色谱))，并与标准的已知斯托克斯半径进行比较的方式来实施。特别地，可以在室温下用例如Superdex 200HR10 30凝胶过滤柱，并且用合适的缓冲液在7.5的pH以及0.5ml/分钟下进行洗脱，由此对颗粒进行凝胶过滤步骤。在280nm下监测蛋白的吸光度。使用已知斯托克斯半径的蛋白标准品混合物来校准该柱，所述蛋白标准品混合物例如为(例如)甲状腺球蛋白669kDa(R_S＝8.5nm)、铁蛋白440kDa(R_S＝6.1nm)、过氧化氢酶232kDa(R_S＝4.6nm)、乳酸脱氢酶140kDa(R_S＝4.1nm)、牛血清白蛋白66kDa(R_S＝3.55nm)和马心细胞色素c12.4kDa(R_S＝1.8nm)。标准蛋白的R_S值跨度应当涵盖高于和低于所关注的颗粒的R_S值。通过绘制与标准蛋白的R_S对应的洗脱位置来生成标准曲线。通常会产生近似线性的图，但若不是这样，则可以根据所关注的蛋白在标准曲线上的洗脱位置通过在两点之间画线来读取其R_S。

在一些实施方案中，例如当颗粒中存在体积大的疏水试剂(如膜蛋白)或更多量的脂质时，斯托克斯半径会大于3.2nm，具体地，至少3.5nm，至少5.0nm或至少10.0nm。

本发明的颗粒还可以通过透射电子显微镜来检测，或者，如果颗粒足够大，可以通过负染色电子显微镜和单颗粒分析来检测。

结构分析表明，在许多情况种，在本发明的颗粒中，膜脂质在颗粒内部组装成不连续尺寸的盘状双分子层样结构(参见图2a和2b)。脂质结合多肽成分大体上限定盘状双分子层的边界，并为颗粒提供了结构及稳定性。在大多数实施方案中，颗粒的内部包括疏水区域(如，由脂质脂肪酰链组构成)。与脂质体相反，本发明的颗粒优选不包含亲水或水性核心。颗粒优选为盘状，具有扁平的、盘状、近似圆形的脂双层，该脂双层被由两个或更多个脂质结合多肽提供的两亲性α螺旋限制，该α螺旋围绕盘外周与所述双层的疏水表面结合。图2a至2f中示意性地描绘了本发明的盘状颗粒的说明性实例。

在一些实施方案中，本发明的颗粒的盘状形状可以近似柱体，其最大高度与最大直径(长轴长度)之比为至少1.0:1.1，特别地为1.0:1.5或1.0:2.0。盘状颗粒的最大高度通常为至少3.5nm，特别地为至少5nm，该尺寸通过透射电子显微镜确定，或者如果颗粒足够大，则通过负染色电子显微镜和单颗粒分析确定。优选地，本发明的颗粒有顶面、底面和周向侧表面，顶面和底面的最大直径(长轴长度)大于周向侧表面的高度。在本发明的颗粒的一些实施方案中，脂质结合多肽至少部分地定位成围绕颗粒的周向侧表面。

在本发明的一些实施方案中，本发明的盘状颗粒的最大直径(长轴长度)(通过透射电子显微镜确定，或者如果颗粒足够大，则通过负染色电子显微镜和单颗粒分析确定)为2nm至200nm，特别地为3nm至150nm，优选为3nm至100nm。在另一个实施方案中，盘状颗粒的最大直径(长轴长度)为3nm至80nm，特别地为3nm至60nm。实际实验表明，利用本发明的方法特别容易得到最大直径(长轴长度)为3nm至20nm的颗粒。

在本发明的优选实施方案中，颗粒由基本上单分散的盘状结构群限定，如(例如)通过HiLoad Superdex^TM 200 16/60GL柱得到的凝胶过滤洗脱图谱所评估的那样。

通常，在颗粒中，脂质结合多肽与脂双层之间的主要相互作用是，脂质结合多肽分子的两亲性α螺旋的疏水面上的残基与在位于生物活性试剂递送颗粒的外周的所述双层的边缘上的脂质的疏水面(如磷脂脂肪酰链)之间的相互作用。脂质结合多肽分子的两亲性α螺旋包括与位于颗粒外周的脂双层的疏水表面接触的疏水表面，以及面向颗粒外部并且在颗粒悬浮在水性介质中时与水性环境接触的亲水表面。

在一些实施方案中，根据本发明的文库和颗粒在水性溶液中是稳定的，并且可以被冻干以长期储存，而后在水性溶液中重构。如本文所用的“稳定性”或“稳定的”是指在颗粒的制备、运输和储存过程中，颗粒破裂的程度为低水平至检测不到，聚集或品质劣化的程度为低水平至检测不到。

在一个优选实施方案中，本发明的文库和颗粒在pH为2.0至10.0、特别是6.0至10.0、优选6.0至9.0、特别优选7.0至9.0并且最优选7.0至8.0的水性溶液中是稳定的。在另一个实施方案中，如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析用凝胶过滤(少于50％、具体为1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，根据本发明的文库和颗粒在水性溶液中在-210℃至80℃、特别是-210℃至40℃、-210℃至30℃或-210℃至4℃的温度下保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少6个月或至少12个月。实际实验表明，如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析用凝胶过滤(少于50％、具体为1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒在水性溶液中，在4℃至40℃的温度、5.0至8.0的pH下也保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月或至少3个月。如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析用凝胶过滤(少于50％、具体为1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒还被证明可在水性溶液中，在5.0至8.0的pH以及40℃至75℃的温度下，保持稳定达至少10分钟。在一些实施方案中，颗粒可以被冻干以长期储存，而后在水性溶液中重构。在一些实施方案中，如在pH 7.5的合适的缓冲液中重构后通过(例如)分析凝胶过滤(少于50％、具体为少于40％或1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，本发明的颗粒在冻干形式下在-210℃至80℃，特别是-210℃至40℃、-210℃至30℃或-210℃至4℃下保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少6个月或至少12个月。如本文所用，“破裂”是指在凝胶过滤洗脱图谱中，与新制备的本发明的颗粒的峰尺寸相比，对应于本发明的颗粒的峰尺寸(即峰高)降低，而出现了游离的非脂质结合的SAPLIP和/或游离脂质和/或聚集体的峰尺寸。因此，例如40％的破裂意为，与储存前的峰尺寸(100％)相比，峰尺寸(即凝胶过滤洗脱图谱中峰的高度)降低了40％。

实际实验表明，本发明的颗粒在基本上无去垢剂的水性溶液中也是特别稳定的。基本上无去垢剂意为，基于水性溶液的总体积而言，水性溶液包含少于0.001％(w/v)的去垢剂。

根据本发明(即在Salipro颗粒中)所用的脂质结合多肽是鞘脂激活蛋白样蛋白(SAPLIP)或其衍生物或截短形式。本文所用的术语“鞘脂激活蛋白样蛋白”(SAPLIP)是本领域熟知的，并且包括脂质相互作用蛋白的鞘脂激活蛋白样蛋白(SAPLIP)家族的所有成员。SAPLIP家族的特征是具有鞘脂激活蛋白折叠，其为通过高度保守的分子内二硫键保持稳定的保守的α螺旋三维结构(参见文献“Munford等人(1995),Journal of Lipid Research,vol.36,no.8,1653-1663”和“Bruhn(2005),Biochem J 389(15):249-257”)。本发明所述的鞘脂激活蛋白样蛋白(SAPLIP)家族的成员的例子在文献“Munford等人(1995),Journal ofLipid Research,vol.36,no.8,1653-1663”和“Bruhn(2005),Biochem J 389(15):249-257”中有所描述，在此通过引用的方式将其全部内容并入本文。

在无配体(即，无去垢剂/无脂质)的“封闭”状态下，SAPLIP采取单体紧凑四螺旋束型结构，即，鞘脂激活蛋白折叠。该折叠可以列举以下结构：人脂激活蛋白A的封闭无配体形式的结构(蛋白数据库(PDB)ID编号:2DOB,参见“Ahn等人(2006)Protein Sci.15:1849-1857”)或鞘脂激活蛋白C的结构(PDB ID编号:1M12；参见“de Alba等人(2003)Biochemistry 42,14729-14740”)、NK-细胞溶素的结构(PDB ID编号:1NKL；参见“Liepinsh等人(1997)Nat.Struct.Biol.4,793-795”)、阿米巴穿孔素A(amoebapore A)的结构(PDBID编号:1OF9)和颗粒溶素(granulysin)的结构(PDB ID编号:1L9L；参见“Anderson等人(2003)J.Mol.Biol.325,355-365”)，它们的结构均几乎相同并且易于重叠(super-imposable)。

SAPLIP在结合至配体(例如脂质或去垢剂分子)后发生构象变化。在配体结合“开放”构象中，SAPLIP采取V形或飞旋标形构象，暴露出与所结合的脂质接触的疏水表面。该开放构象可列举以下结构：现有技术中的鞘脂激活蛋白A去垢剂盘结构(PDB ID编号:4DDJ；参见“Popovic等人,PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912”)、和结合至SDS去垢剂胶束的鞘脂激活蛋白C的结构(PDB ID编号:1SN6；参见“Hawkins等人(2005)J.Mol.Biol.346:1381-1392”)。

在本发明的颗粒中，脂质结合多肽优选为两亲性的，其结构的一部分或多或少是亲水的并且面向水性溶剂，另一部分或多或少是疏水的并且面向所述颗粒的包含脂质的疏水中心。脂质结合多肽优选具有如下特点：具有这样的两亲性α螺旋，其具有更多的主要位于螺旋的一面上的疏水残基(如A、C、F、G、I、L、M、V、W或Y)、以及更多的位于螺旋的另一面上的极性或带电荷的残基(如D、E、N、Q、S、T、H、K或R)。

本文所述氨基酸残基的缩写如下：A,Ala,丙氨酸；V,Val,缬氨酸；L,Leu,亮氨酸；I,lie,异亮氨酸；P,Pro,脯氨酸；F,Phe,苯丙氨酸；W,Trp,色氨酸；M,Met,甲硫氨酸；G,Gly,甘氨酸；S,Ser,丝氨酸；T,Thr,苏氨酸；C,Cys,半胱氨酸；Y,Tyr,酪氨酸；N,Asn,天冬酰胺；Q,Gln,谷氨酰胺；D,Asp,天冬氨酸；E,Glu,谷氨酸；K,Lys,赖氨酸；R,Arg,精氨酸；和H,His,组氨酸。

与现有技术中的载脂蛋白衍生纳米盘不同，本发明所述脂质结合多肽不以双带样形式包封脂质，相反，本发明所述颗粒通过包含脂质的核心保持在一起，所述脂质被两个或更多个近似V形或飞旋标形状的以头-尾方向排列的脂质结合多肽围绕，并且在本发明所述颗粒中，每个所述脂质结合多肽之间实质上没有直接的蛋白与蛋白的接触(参见图1a至1f)。希望不限于理论，认为本发明的颗粒中的脂质结合多肽和脂质的这种排列方式提供了尺寸可变性，这在体积大的疏水试剂或量增加的脂质被纳入本发明的颗粒中时可以观察到。

尽管SAPLIP具有与脂质相互作用的能力以及上述的两亲性性质，并且三维结构高度保守，但是它们在氨基酸序列水平上是高度多变的，其序列同一性低于定义同源性通常所用的25％至30％同一性的阈值范围(参见“Bruhn(2005),Biochem J 389(15):249-257”的图4A和4B中的序列比对，其在下文的图12a和12b中再现，图12a和12b示出的序列构成了本发明的公开内容的一部分)。

在本发明所述脂蛋白颗粒中，脂质结合多肽主要作为结构蛋白，为本发明的脂蛋白颗粒的结构(例如，盘状结构)提供框架。由于这个原因，与仅仅为序列决定相比，结构特征、特别是SAPLIP的鞘脂激活蛋白折叠这一特征对于限定本发明的脂质结合多肽更加重要。

本发明所述SPLIP的例子为鞘脂激活蛋白A、B、C或D(例如以下来源的：人(Homosapiens)[参见SEQ ID NO.1-4]、马(Equus caballus)、牛(Bos taurus)、小家鼠(Musmusculus)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、大家鼠(Rattus norvegicus)或非洲爪蟾(Xenopus laevis))；表面活性蛋白B(例如以下来源的：人、家犬(Canis familiaris)、小家鼠、家兔、绵羊(Ovis aries)或大家鼠)；粒溶素(例如人源的，参见SEQ ID NO.5)；NK溶素(如野猪(Sus scrofa)源的；参见SEQ ID NO.6)；NK溶素直系同源物(orthologues)(如马或牛来源的)；阿米巴穿孔素(如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)来源的)；阿米巴穿孔素直系同源物(如迪斯帕内阿米巴(Entamoeba dispar)或侵袭内阿米巴(Entamoebainvadens)来源的)；阿米巴穿孔素样蛋白(如肝片吸虫(Fasciola hepatica)来源的)；耐格里属阿米巴穿孔素(Naegleriapores)(如福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)来源的)；Clornorin(如华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)来源的)；鞘脂激活蛋白原(如人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾来源的)和MSAP(如人源的)。

本发明所用的特定的SAPLIP的序列在文献“Bruhn(2005)，Biochem J 389(15)：249-257”的图4A和4B中给出，其中所述的附图和序列构成了本发明的公开内容的一部分，并由此相同地再现于下文的图12a和12b。本发明所用的特定SAPLIP的序列在如下序列中给出：SEQ ID NO.1鞘脂激活蛋白A[人]；SEQ ID NO.2鞘脂激活蛋白B[人]；SEQ ID NO.3鞘脂激活蛋白C[人]；SEQ ID NO.4鞘脂激活蛋白D[人]；SEQ ID NO.5颗粒溶素[人]；SEQ IDNO.6NK-细胞溶素[野猪]。

本发明所用SAPLIP也可以是包含鞘脂激活蛋白折叠作为多结构域蛋白的一部分的多肽。例如以下情况：酸性鞘磷脂酶(来自人、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、疟蚊(Anopheles)、果蝇(Drosophila)、小家鼠或大家鼠)；GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu)脂酶，如酰氧基水解酶(人或大家鼠来源)；Countin(盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)来源)；J3-晶状体蛋白(加勒比海箱形水母(Tripedaliacystophora)来源)和植物天冬氨酸蛋白酶(植物界(Viridiplantae)来源)。本发明所用SAPLIP还可以是细菌素AS-48。细菌素AS-48具有抗菌活性，也能够结合脂质并且与其他SAPLIP家族成员具有相同的折叠，但是缺乏二硫键桥。

尽管以下本发明更加详细地描述了鞘脂激活蛋白A或其衍生物或截短形式作为脂质结合多肽，以及尽管鞘脂激活蛋白A或其衍生物或截短形式作为脂质结合多肽是优选实施方案，但是本发明不限于此。实际上，本发明明确地延及鞘脂激活蛋白样蛋白(SAPLIPs)的整个家族作为本发明的脂质结合多肽。由于SAPLIP之间的高度的结构和功能保守性，因此可以预期的是，本发明中一些使用鞘脂激活蛋白A作为脂质结合多肽的实施方案的特征和优点也适用于使用其他SAPLIP或其衍生物或截短形式作为本发明所述脂质结合多肽的实施方案。

根据优选的实施方案，SAPLIP是鞘脂激活蛋白A、B、C或D，特别地为选自(人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾)鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C或鞘脂激活蛋白D中的鞘脂激活蛋白。在一个实施方案中，SAPLIP是(人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾)鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B或鞘脂激活蛋白D。

鞘脂激活蛋白C的特殊性在于其能够诱导膜融合，其他鞘脂激活蛋白没有显示该特征。并不总是希望具有膜融合活性。根据本发明特定的实施方案，脂质结合多肽为鞘脂激活蛋白样蛋白(SAPLIP)或其衍生物或截短形式，前提是SAPLIP不是鞘脂激活蛋白C，或者前提是SAPLIP不是鞘脂激活蛋白C或其衍生物或截短形式。

在一个实施方案中，SAPLIP是人源的(即，人SAPLIP)。

在一个优选实施方案中，SAPLIP是鞘脂激活蛋白A，优选为(人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾)鞘脂激活蛋白A，特别优选为人鞘脂激活蛋白A，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。鞘脂激活蛋白A为已知的蛋白。其作为LDAO-去垢剂复合物的表达、纯化和结晶在(例如)文献“PNAS,Vol.109,No.8(2012)2908-2912(Popovic等人)”中有所描述。

根据本发明一实施方案，脂质结合多肽包含SAPLIP的全长序列。在另一实施方案中，脂质结合多肽是SAPLIP的衍生物，具体为包含与相应的SAPLIP的全长序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％、优选至少75％同一性的氨基酸序列的多肽。特别地，脂质结合多肽可以包含与SAPLIP的全长序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的序列。

本文使用的术语“序列同一性”是指蛋白之间的相同程度，其可以使用诸如文献“Henikoff S.和Henikoff JG.,P.N.A.S.USA 1992,89:10915-10919”中描述的Blosum62矩阵等得分矩阵，通过序列最佳比对来计算。可以使用Genetics Computer Group(GCG,Madison,WI,USA)的GAP程序，使用该程序的默认参数进行利用Blosum62相似矩阵和Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.1970,48:443-453)所作的两个序列的百分同一性计算和最佳比对。

作为氨基酸比对的比较，使用了EMBL在线工具“EMBOSS Stretcher”(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/)，使用程序的默认设置。

在另一实施方案中，SAPLIP衍生物为包含这样的序列的多肽，在相应的SAPLIP的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或替换。例如，SAPLIP衍生物可以为包含特定的SAPLIP序列的多肽，所述特定的SAPLIP序列中有1到40个、优选1到30个、以及特别为1到20个或1到15个氨基酸被删除、添加、插入和/或替换。

本文所用术语“缺失”是指从各自的起始序列中移除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。

本文所用术语“插入”或“添加”是指向各自起始序列中插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。

本文所用术语“替换”是指将位于某一位点的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。

根据本发明另一个实例方案，脂质结合多肽是包含一个或多个SEQ ID NO.1的片段的鞘脂激活蛋白A衍生物。优选的片段对应于鞘脂激活蛋白A的螺旋α1、α2、α3和α4，其中螺旋α1由以下氨基酸“SLPCDICKDVVTAAGDMLK”的连续序列形成；其中螺旋α2由以下氨基酸“ATEEEILVYLEKTCDWL”的连续序列形成；其中螺旋α3由以下氨基酸“PNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMS”的连续序列形成；其中α4螺旋由以下氨基酸“PGEVCSAL”的连续序列形成。根据本发明的特定实施方案，鞘脂激活蛋白A的衍生物为包含选自鞘脂激活蛋白A的螺旋α1、α2、α3、α4及其组合中的序列的多肽，特别地，其中所述多肽包含鞘脂激活蛋白A的螺旋α1、α2和α3的序列。鞘脂激活蛋白A的片段(例如其螺旋α1、α2、α3、α4)可以在氨基酸序列中具有一或多个氨基酸删除、添加、插入和/或替换。

根据本发明，当鞘脂激活蛋白A的衍生物或截短形式被用作脂质结合多肽时，所述衍生物或截短形式应当是两亲性的，形成至少一个α螺旋，并且当应用于以下详细描述的本发明所述的制备方法时，能够与溶解的脂质一起自组装成脂蛋白颗粒。本文所用术语“两亲性”是指多肽或分子既具有亲水区域又具有疏水区域。

优选地，如果使用SAPLIP的衍生物，应当存在与SAPLIP的基础成员鞘脂激活蛋白A中的六个半胱氨酸相对应的六个半胱氨酸残基。这方面可参见文献“B ruhn(2005),Biochem J 389(15):249-257”的图4A和4B的序列比对中的半胱氨酸的位置，特别将其附图以引用方式并入本文。

本发明所述脂质结合多肽也可以包含一个或多个非天然氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物(peptidomimetic)结构(其中肽键被更加耐受代谢降解的结构取代)。

本发明方法的步骤a)

在根据本发明方法的步骤a)中，提供了得自细胞膜和/或细胞器膜的粗制膜囊泡泡。粗制膜囊泡泡通常是不同的粗制膜囊泡泡的混合物。通常，粗制膜囊泡泡不是得自单一种类的细胞，而是得自多种特定的细胞类型和/或细胞器。例如，某些真核生物、原核生物或古细菌的细胞可用于获得粗制膜囊泡泡。如本文所用的术语“多种”是指至少两种或更多种细胞。还可以使用不同的真核生物、原核生物或古细菌的细胞的混合物来制备粗制膜囊泡。然而，优选地，粗制膜囊泡得自一种类型的细胞或细胞器。在另一个实施方案中，粗制膜囊泡得自单一种类的(与单数同义)细胞。在该实施方案中，该方法可以在单一细胞水平上进行。

如本文所用的术语“粗制”是指膜囊得自粗制膜部分，即未经进一步纯化或提取。因此，粗制膜仍含有来自原始细胞膜或细胞器膜的膜蛋白和膜脂质。这与主要使用分离的和/或纯化的蛋白质或脂质的现有技术方法形成鲜明对比。通过在细胞或细胞器破裂或裂解后将不溶性成分与可溶性成分分离，可以得到粗制膜部分。根据本发明，不溶性部分是可被使用的粗制膜部分的一种形式。

术语“囊泡”是技术人员的技术术语。通常，囊泡是小的圆形结构，其实质上由封闭的球形脂双层包围的水性流体组成。然而，粗制膜囊泡的尺寸和含量通常非常多样且异质。粗制膜囊泡可以是特别制备的，也可以是在细胞/细胞器破裂或裂解后自发形成的。在该方法的步骤a)中提供的囊泡得自细胞膜或细胞器膜。因此，囊泡通常包含细胞膜或细胞器膜，特别是来自所用的细胞或多种细胞的膜脂质和任选的膜蛋白的混合物。

步骤a)中提供的囊泡是多种不同的囊泡，即混合物。囊泡的结构、尺寸和/或组成可以有所不同。囊泡的结构可以是单层的或多层的。囊泡的组成取决于获得囊泡的细胞膜或细胞器膜以及制备所用的方法(如果有的话)。

然而，可以采用技术人员已知的从粗制膜得到囊泡的特定方法，(例如超声处理)，本发明人已经观察到，在破裂或裂解以及制备粗制膜部分期间，通常在天然存在的细胞膜或细胞器膜的破裂或裂解时有足够量的粗制膜囊泡进行自组装。

根据本发明的方法所用的膜选自细胞膜和细胞器膜。“膜”、“细胞器膜”或“细胞膜”是指包含脂质层的任意的膜。优选地，膜是脂双层。有时，本文所用的术语“膜”可与“细胞膜”和/或“细胞器膜”互换。

基本上，细胞膜是将细胞内部与外部环境分开的生物膜。文献“Alberts等人,“TheCell”,第4版，Macmillian Magazines Ltd,2002,第583至614页”和“Campbell等人,“Biologie”,第6版,Spektrum Verlag,2003,第163至177页”中也详细描述了复杂的结构和细胞膜所含的多种成分，如膜脂质和膜蛋白。根据本发明方法的步骤a)中所用的提供粗制膜囊泡的细胞膜或细胞器膜通常包含不同脂质和膜蛋白的异质混合物。因此，步骤a)中提供的囊泡的组成可以在膜脂质和膜蛋白的混合物方面有所不同，并且通常取决于获得它们的特定的膜。

如本文所用的术语“脂质”或“膜脂质”是本领域公知的，并且是指生物来源的天然物质，其在有机溶剂中可溶或部分可溶，或者当存在水相时其分层进入疏水环境中。有时“脂质”和“膜脂质”在本文中可互换使用。如本文所用的术语“脂质”或“膜脂质”并非意味着本发明的颗粒中只有合成的或单一类型的脂质分子。实际上，其是指细胞膜或细胞器膜中存在多个至少两种不同种类的脂质分子。本发明的Salipro颗粒所纳入的脂质是细胞膜或细胞器膜中天然存在的膜脂质。因此，本发明的颗粒通常包含获得它们的细胞膜或细胞器膜中天然存在的膜脂质的混合物。在一个实施方案中，根据本发明得到的颗粒包含至少3种、5种、10种或20种不同的脂质。通常，这些膜脂质形成双层，膜蛋白嵌入该双层中。对于可用于本发明方法的一些古细菌膜存在例外，因为一些古细菌包含单层。下文将更详细地描述古细菌的细胞膜结构。

细胞膜或细胞器膜基本上包含作为膜脂质的三种两亲性脂质：磷脂、糖脂和甾醇。每种脂质的量取决于细胞、细胞膜或细胞器膜的类型。磷脂具有在水中溶解的极性部分(磷酸盐“头部”)以及在水中不溶的疏水性非极性部分(“脂质尾部”)。这些部分通过甘油部分连接。在水中，磷脂可以以头部面向水而尾部背向水的方式构成簇。磷脂和糖脂中的脂肪链通常含有偶数个碳原子，通常为16至20个。16碳和18碳的脂肪酸是最常见的。脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。双键的构型通常是所谓的顺式构型。根据Cahn-Ingold-Prelog规则(CIP；Cahn,R.S.&Ingold,C.K.；Prelog,V.,"Specification of Molecular Chirality".Angewandte Chemie International Edition,5(4),p.385-415,1966)，顺式和反式异构是有机化学中用于指分子内官能团的相对取向所产生的立体异构现象的术语。文献“Alberts等人,“The Cell”,第4版,Macmillian Magazines Ltd,2002,第61页和62页”中也描述了细胞膜中存在的典型脂肪酸。膜脂质的其他实例为磷脂，如磷脂酰胆碱(如POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱))、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸(如POPS(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸))、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。

糖脂是其上通过糖苷键连接有碳水化合物的脂质。碳水化合物通常存在于真核生物细胞膜的外表面上。它们从磷脂双层延伸到细胞外的水性环境中。糖脂的实例为甘油糖脂、半乳糖脂、硫脂、糖鞘脂、葡糖脑苷脂、硫脑苷脂、神经节苷脂、红细胞糖苷脂、糖磷脂神经鞘脂和糖磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositols)。固醇是类固醇的亚群。作为膜的一部分的固醇通常存在于真核生物细胞膜中，如植物、动物和真菌。固醇的实例为胆固醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇和麦角固醇。根据优选实施方案，膜脂质是脂双层形成脂质和/或生物相容性脂质。如本文所用，术语“生物相容的”表示生物学上相容的，其在活的组织中不产生毒性、损伤、或者免疫反应。

如本文所用，“脂双层形成脂质”指的是能够形成具有疏水内部和亲水外部的脂双层的脂质。根据本发明，可以使用任何能够与SALIP或其衍生物或截短形式结合以组装成颗粒结构的脂双层形成脂质。脂双层形成脂质包括，但不限于，磷脂、鞘脂、糖脂、烷基磷脂、醚脂和缩醛磷脂。可以使用一种类型的脂双层形成脂质，或者可以使用两种或多种的混合物。颗粒还可以包含不属于脂双层形成脂质的那些脂质。这样的脂质包括，但不限于，胆固醇、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺(在某些条件下该脂质可能形成双分子层)、氧固醇(oxysterol)、植物甾醇、麦角固醇、谷甾醇、阳离子脂质、脑苷脂、鞘氨醇、神经酰胺、二酰基甘油、单酰基甘油、三酰甘油、神经节苷脂、醚脂、烷基磷脂、缩醛磷脂、前列腺素和溶血磷脂。

本发明的Salipro颗粒所含的膜脂质可以是上文列出的膜脂质的混合物，但不限于此。通常，根据本发明的颗粒所含的膜脂质至少包含磷脂、糖脂、胆固醇以及它们的混合物。根据优选实施方案，膜脂质为真核生物的脂质和/或原核生物的脂质，特别是通常存在于真核生物或原核生物的细胞中的任意一种膜中存在的脂质。优选的脂质(例如)为磷脂、鞘糖脂、固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸(PS)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-甘油(POPG)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、二酰基甘油、胆固醇、鞘磷脂、半乳糖神经酰胺、神经节苷脂、磷脂酰肌醇和和硫代半乳糖神经酰胺或者它们的组合。

在另一个实施方案中，膜脂质包含磷脂。合适的磷脂的实例包括，但不限于，DMPC、DMPG、POPC、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、心磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬酯酰磷脂酰甘油(DSPG)、卵黄磷脂酰胆碱(卵PC)、大豆磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸、鞘磷脂和阳离子磷脂。根据本发明的颗粒中的膜脂质通常是存在于细胞膜或细胞器膜中的脂质的异质混合物。但是本发明的颗粒中还可以进一步包含这样的脂质，其可以为含有一个或多个键合的功能部分(如靶向部分或生物活性部分)的经修饰的脂质。

靶向部分可以(例如)用于将本发明的颗粒靶向至特定的细胞或组织类型，或靶向至感染物。靶向部分还可用于对颗粒进行纯化、研究或鉴定。在一些实施方案中，颗粒包括与脂质结合多肽或脂质成分或膜蛋白成分连接的靶向部分。

靶向部分可以例如具有受体识别性质，由此颗粒能够靶向到特定的细胞表面受体。举例来说，例如通过调整颗粒的脂质结合多肽成分以便为其提供与位于靶标细胞类型表面的受体相互作用的能力，本发明所述颗粒可以靶向到已知具有特定类型的感染物的特定细胞类型。在一个实施方案中，靶向部分选自由天然或合成的配体、抗体和抗体片段或其他适用于靶向目的的生物分子组成的组中。

生物活性部分可以选自(例如)药物、细胞毒性试剂、酶、标签、荧光基团、造影剂和放射性标签。

除了细胞膜或细胞器膜的膜脂质之外，本发明的Salipro颗粒还可以包含其他脂质。这些脂质可选自天然存在的脂质、合成的脂质、经修饰的脂质、脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二甘油酯、甘油三酯、磷脂、脂肪酸、甘油脂(glycerolipids)、甘油磷脂(glycerophospholipid)、鞘脂、糖脂(saccharolipid)、聚酮、固醇脂和戊烯醇脂(prenollipid)或者它们的组合。

根据本发明的Salipro颗粒可以缺乏膜蛋白，即实质上仅包含脂质结合多肽以及来自粗制膜囊泡的膜脂质(“空的”Salipro颗粒)。然而，根据本发明的Salipro颗粒优选还包含膜蛋白(“满的”Salipro颗粒)。膜蛋白是天然嵌入膜中的蛋白质，或者任选地，也可以是仅与膜有关的蛋白质。膜蛋白可以表现出多种功能。例如，膜受体蛋白在细胞的内部和外部环境之间传递信号，而转运蛋白使分子和离子跨膜移动。膜蛋白也可以充当可能具有许多活性(如氧化还原酶、转移酶或水解酶的活性)的酶。膜蛋白也可以(例如)为细胞粘附分子。

根据一个实施方案，本发明的Salipro颗粒不包含膜蛋白或每个颗粒包含数目为1至10个或1至5个的膜蛋白。根据一个实施方案，文库也可以被定义为包含这样的颗粒，其中每个颗粒的膜蛋白的平均数目为1至10个或1至5个。

本发明的颗粒中的膜蛋白(例如)可以选自膜蛋白、整合跨膜蛋白、单向整合膜蛋白(integral monotopic membrane protein)、外周膜蛋白、处于脂质结合状态的双向性蛋白(amphitropic protein)、脂质锚定蛋白和具有融合的疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白。

整合膜蛋白是持久地结合到脂双层的膜蛋白，其通常需要去垢剂或非极性溶剂才能从膜上移除。跨膜蛋白是跨膜至少一次的整合膜蛋白。能被纳入本发明所述颗粒的跨膜蛋白的例子是G蛋白偶联受体(GPCR)、搬运蛋白(porter)(如单向搬运蛋白、同向搬运蛋白或逆向搬运蛋白)、通道(如铁离子通道)或酶。

单向整合膜蛋白仅在一侧持久地结合到膜上并且不横跨膜。这类蛋白包括通过α螺旋跨膜锚而被束缚到膜上的膜蛋白。例子包括细胞色素P450氧化酶和血型糖蛋白A。

外周膜蛋白只暂时或间接地结合脂双层或纳入脂双层中的整合膜蛋白。外周膜蛋白通常在伴随提高的pH或高盐浓度的条件下用极性试剂处理后会从膜上分离。外周膜蛋白的例子包括磷脂酶A2或C、脂肪氧合酶和细胞色素c。

脂锚定蛋白通过脂化、特别是异戊二烯化、或GPI锚定氨基酸残基而结合到脂双层。例子包括细菌脂蛋白、G蛋白和某些激酶。

双向性蛋白是这样的蛋白，其以至少两种构象状态存在，即：不含脂的可溶于水的状态以及脂质结合状态。通过与脂质结合，双向性蛋白发生构象改变，这使得它们变为可逆或不可逆的膜结合状态。双向性蛋白的例子为成孔毒素和抗菌肽。

步骤a)中提供的囊泡可以得自细胞和/或细胞器。本文使用的术语“一种”表示“一个”或“多个”某种对象。例如，“一种细胞”是指一个某种细胞或多个某种细胞。通常，在根据本发明的方法中使用多个一种细胞和/或一种细胞器。根据本发明的方法不限于采用一种细胞和/或一种细胞器。还可以使用不同的细胞或细胞器的混合物来制备囊泡。

在本发明的一个特定实施方案中，步骤a)的粗制膜囊泡是通过以下步骤的至少一个、两个、三个或全部而制备的：

a.1)提供细胞和/或细胞器；

a.2)使所述细胞和/或所述细胞器裂解或破裂；

a.3)得到粗制膜部分；以及

a.4)由步骤a.3)中得到的所述粗制膜部分制备粗制膜囊泡。

在步骤a.1)中提供了细胞和/或细胞器。如本文所用的术语“细胞”应被理解为通常用于生物学中的细胞。细胞是所有已知生物体的基本结构单元、功能单元及生物学单元。细胞是可以独立复制的最小生命单位。如本文所用的“细胞”还包括真核生物、原核生物和古细菌。如本文所用的“细胞”不包括病毒。

细胞包含由细胞膜包围的细胞质，细胞膜包含如上所述的生物分子，如蛋白质和脂质。生物体可以被分类为单细胞生物体(即由单个细胞组成，如原核生物)或多细胞生物体(如真核生物，例如动物、植物或真菌)。

获得根据本发明的方法所用的膜的细胞不限于某种细胞类型。该细胞可以是天然存在的细胞、转染细胞、基因工程细胞或疾病细胞，例如癌细胞。据发现，各种细胞类型均适合于根据本发明的方法。

优选地，该细胞为古细菌、真核生物或原核生物的细胞。优选的细胞器为真核生物的细胞器。

古细菌、真核生物和原核生物的细胞膜各自包含如上所述的膜脂质和任选的膜蛋白。然而，本领域技术人员知道，古细菌、真核生物和原核生物的细胞彼此不同。各种标准教科书中描述了古细菌、真核生物或原核生物的细胞的结构、功能和差异，如文献“Alberts等人,“The Cell”,第4版,Macmillian Magazines Ltd,2002”或“Campbell等人,“Biologie”,第6版,Spektrum Verlag,2003”。

真核生物是这样的任意细胞或生物体，该细胞或生物体的细胞包含细胞核，并且可任选地进一步包含由细胞膜包围的细胞器。在一个实施方案中，根据本发明的方法所用的膜是来自真核生物的膜，例如细胞膜和/或源自细胞器的膜。细胞器的实例为高尔基体、线粒体、过氧化物酶体、内质网、叶绿体、细胞核等。

真核生物的实例为植物、动物和真菌(如酵母菌和霉菌)。可用于本发明方法的优选真核生物的细胞选自由下列组成的组：哺乳动物细胞(特别是动物和人的细胞)、昆虫细胞、禽类细胞、真菌细胞(如酵母菌细胞)、植物细胞以及它们的混合物。特别地，术语哺乳动物细胞还包括保存于培养基中的动物和人的细胞。

原核生物是缺乏细胞核的单细胞生物体。原核生物的细胞比真核生物的细胞更简单且更小，并且缺乏膜细胞器。原核生物的实例为细菌。示例性细菌门为酸杆菌门、放线菌门、产水菌门、装甲菌门、拟杆菌门、嗜热丝菌门、衣原体门、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝细菌门、脱铁杆菌门、异常球菌-栖热菌门、网团菌门、迷踪菌门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋菌门、互养菌门、无壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门和疣微菌门。可用于本发明方法的优选原核生物的细胞为细菌，特别是致病细菌以及它们的混合物。

古细菌与原核生物和真核生物只有很远的关系。例如在文献“De Rosa等人,“Structure,Biosynthesis,and Physicochemical Properties of ArchaebacterialLipids”,MICROBIOLOGICAL REVIEWS,第70-80页Vol.50,No.1,1986”或“Albers等人,“Thearchaeal cell envelope”,Nature Reviews Microbiology,9,第414-426页,2011”中给出了详细的概述。

De Rosa等人报道了古细菌的膜包含的分子与原核生物和真核生物的分子显著不同。原核生物和真核生物包含的膜主要含有甘油酯脂，而古细菌包含的膜含有甘油醚脂。醚键比酯键的化学耐受性更强。这种稳定性可能有助于古细菌在极端温度和强酸性或强碱性环境中存活。原核生物和真核生物可以包含醚脂，但与古细菌相反，这些脂质仅在膜成分中占少量或没有。

此外，古细菌的脂质基于类异戊二烯侧链。类异戊二烯侧链是含有20个、25个或最多40个碳原子的长链，其任选地具有多个支链。类异戊二烯侧链还可包含环丙烷或环己烷的环。这与如上所述在其他生物体的膜中发现的脂肪酸形成对比。虽然类异戊二烯在许多生物体的生物化学中起着重要作用，但只有古细菌才会用它们来制造磷脂。在一些古细菌中，脂双层可以被单层取代。

古细菌的实例为产甲烷古细菌、嗜盐细菌和热嗜酸古细菌。可用于本发明方法的优选古细菌是嗜极微生物古细菌和不同的嗜极微生物古细菌的混合物。

使用可能包含来自其宿主的脂质或蛋白质的病毒不是本发明的一部分，本发明仅涉及源自细胞膜或细胞器膜的膜囊和颗粒。术语细胞或细胞器不包括病毒。病毒结构和病毒的膜成分(如果适用的话)不同于真核生物、原核生物和古细菌的膜。这在例如文献“Lorizate等人,“Comparative lipidomics analysis of HIV-1particles and theirproducer cell membrane in different cell lines”,Cellular Microbiology,15(2),第292-304页,2013”和“Brügger等人,“The HIV lipidome:A raft with an unusualcomposition”,PNAS,Vol.103,No.8,第2641-2646页,2006”中被更详细地报道。

Lorizate等人报道了各种研究表明HIV-1膜与生产细胞的质膜不同，从而表明病毒从已存在的亚结构域出芽或病毒介导的特化出芽膜的诱导作用。从两种不同细胞系纯化的质膜和HIV-1的脂质分析显示，与宿主细胞质膜相比，病毒膜的脂质组成显著不同，其与所研究的细胞类型无关。与生产细胞的宿主细胞质膜相比，病毒颗粒明显富集有磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、己糖神经酰胺和饱和磷脂酰胆碱类物质。病毒颗粒表现出不饱和磷脂酰胆碱类物质、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇水平的降低。观察到缩醛磷脂-磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油的HIV-1和供体质膜的脂质组成的细胞类型特异性差异，其仅在源自MT-4细胞的HIV-1中显著富集。源自MT-4细胞的HIV-1还包含二氢鞘磷脂。总之，由Lorizate等人报道的这些数据支持了HIV-1选择特定的脂质环境用于其形态形成，并且不与其宿主的细胞膜相同或相似。通常，本文所述的本发明的颗粒和文库不包含病毒蛋白和/或病毒膜。

可将步骤a.1)中的细胞以例如纯化的或未纯化的细胞部分的形式来提供，例如在细胞悬浮液或生长培养基中。也可以以细胞培养物的形式提供细胞，其中细胞通常在受控条件(如在其天然环境的内部或外部)下生长。本领域技术人员知道细胞系中的细胞非常相似，但它们通常不会完全相同。然而，提供得自一种细胞系的多个细胞也属于步骤a.1)中提供细胞的含义。步骤a.1)中所述的细胞或细胞器也可以成为该步骤中所用的大规模的、较复杂的细胞和/或细胞器的组的一部分。

在步骤a.1)中，还可以提供粗制生物样品(如组织、器官或任意其他的含有生物细胞的样品)形式的细胞。然而，本领域技术人员还可以从细胞培养物、组织、组织悬浮液等样品或任意其他的生物样品中分离细胞、细胞器或多个细胞、多个细胞器。

有几种方法可用于从混合的细胞悬浮液中分离不同的细胞类型。可以利用物理性质的差异。例如，通过离心可以将大细胞与小细胞分离，以及将致密细胞与轻质细胞分离。

另一种方法是基于一些细胞类型倾向于牢固地粘附于玻璃或塑料，这使得这些细胞能够与粘附较弱的细胞分离。另一种细胞分离技术使用与靶向特定细胞的染料、标签或标记偶联的抗体。然后可以(例如)通过FACS或其他方法将经标记的细胞与未经标记的细胞分离。通过从组织切片中仔细地检查也可以得到某些细胞。显微切片技术使得能够从组织切片中分离所选择的细胞。该方法可以(例如)包括激光束以切除目标区域并将其射入容器中，并且其甚至能够使单个细胞与组织样品分离。

本发明的方法可以采用用于分离、纯化或分离细胞、细胞器的各种技术。上述关于细胞的方法也适用于获得细胞器。

在步骤a.2)中，使细胞和/或细胞器的至少一部分破裂或裂解。术语“裂解”或“破裂”是指分解细胞膜或细胞器膜的至少一部分。可以通过化学或物理方式使细胞和/或细胞器裂解/破裂。根据所使用的裂解/分裂技术，可以使全部、一些或仅一部分的膜裂解/破裂。例如，如果仅使细胞膜裂解/破裂，则可以使用梯度离心来收集某些细胞器。

裂解或破裂可能受到酶、化学试剂或物理方面的影响。细胞膜或细胞器膜的物理裂解(如通过反复冷冻和解冻、超声波等超声处理、压力、通过低渗透压冲击破裂、或过滤)也可被称为裂解。将刚裂解之后的、但在任何进一步的提取或纯化步骤之前的未加工的溶液称为粗制裂解物。从粗制裂解物中，可以分离出粗制膜部分，其包含存在于裂解物中的膜。典型地，这可以通过以下方法实现：(例如)通过离心将裂解物的不溶部分(粗制膜部分)与可溶部分分离。在本发明的一个优选实施方案中，粗制膜囊泡得自粗制膜部分，而没有任何其他的囊泡生成、纯化或提取步骤。

在步骤a.3)中，得到粗制膜部分。在本发明的一个实施方案中，步骤a.2)和a.3)两者可以同时进行。这可以通过以下方法完成：例如通过裂解细胞和/或细胞器，从而提供粗制膜囊泡。

在步骤a.4)中，在步骤a.3)之后或在步骤a.2)和a.3)之后，由粗制膜部分获得粗制膜囊泡。可以通过在溶剂、缓冲液、去垢剂或它们的混合物中部分地溶解或搅拌粗制膜部分来得到粗制囊膜。合适的水性溶剂的实例为水(如去离子水、去矿物质水或无菌水)、盐水溶液(如NaCl溶液)以及含有磷酸盐、乙酸盐、甘氨酸、铵盐、钙盐、镁盐、钾盐或它们的混合物的溶液。优选的缓冲液是生理学上可耐受的缓冲液。合适的缓冲液的实例为(例如)磷酸盐缓冲剂、ACES、PIPES、咪唑/HCl、BES、MOPS、HEPES、TES、TRIS、HEPPS或TRICIN。

在本发明的另一个实施方案中，同时进行步骤a.2)、a.3)和/或a.4)。通过裂解细胞和/或细胞器，使得裂解物中存在粗制膜部分。本发明人已经观察到，通常，会自发形成足够的粗制膜囊泡以用于本发明的方法中。

本发明方法的步骤b)

在本发明方法的步骤b)中，在液体环境中使步骤a)之后得到的混合物(即粗制膜囊泡)与脂质结合多肽相接触。还可将本发明方法的步骤b)设置为“在液体环境中使粗制膜囊泡与脂质结合多肽相接触”。粗制膜囊泡是在步骤a)和/或a.4)中获得的。

脂质结合多肽和脂质可以为如上所述的形式。

在某些实施方案中，液体环境为水性溶液。水性溶剂可以为缓冲溶液。步骤b)中的液体环境的pH可以为2.0至10.0，特别是6.0至10.0，优选6.0至9.0，特别优选7.0至9.0，并且最优选7.0至8.0。步骤b)中的液体环境还可任选地包含去垢剂。

步骤b)和/或c)的持续时间非常依赖于具体的实验设置，特别是Salipro颗粒中存在的脂质和/或膜蛋白的类型以及进行这些步骤的温度。当步骤b)和c)各自彼此独立地持续10秒至24小时、10秒至2小时、10秒至30分钟和10秒至15分钟时，通常可得到良好的结果。优选地，步骤b)和/或c)在以下温度进行：10℃至60℃，优选15℃至42℃，特别优选30℃至40℃。然而，当延长培养时间时，也可以在低温下运行，例如2℃至10℃。所示的温度是进行这些步骤的液体环境的温度。

在根据本发明方法的一个具体实施方案中，在步骤a)、b)和/或c)中使粗制膜囊泡与去垢剂相接触。

本文所用的术语“去垢剂”是本领域熟知的，并且不包括在本文所用的“脂质”或“膜脂质”的定义中。

虽然许多脂质具有与去垢剂相似的两亲性的总体结构，即，极性亲水头部基团和非极性疏水尾部，但是脂质在单体的形状、在溶液中所形成的聚集体的类型、以及聚集所需的浓度范围这些方面与去垢剂并不相同。脂质在结构上通常基本上为柱状；疏水尾部所占体积与极性头部基团所占体积相似。去垢剂单体通常更像圆锥状；疏水尾部所占体积比极性头部基团所占体积小。去垢剂倾向于聚集成球形或椭圆形的水溶性胶束，并且在缺乏脂质时不形成双层结构(参见Anatrace的手册"Detergents and their uses in membraneprotein science",www.anatrace.com)。

本发明的方法可采用的去垢剂可以是阴离子去垢剂、阳离子去垢剂、非离子去垢剂、两性离子去垢剂以及它们的混合物。

本文所用的去垢剂优选选自由下列组成的组：烷基苯磺酸盐或胆汁酸、阳离子去垢剂和非离子或两性离子去垢剂(如十二烷基-二甲胺-氧化物(LDAO))、Fos-胆碱、CHAPS/CHAPSO、烷基糖苷如短、中或长链烷基麦芽糖苷，特别是正十二烷基β-D-麦芽糖苷、葡糖苷，麦芽糖-新戊二醇(MNG)两亲化合物、两亲性聚合物(amphipols)、基于苯酚和醛的羟烷基化产物的大环化合物或环状低聚物(杯芳烃)以及它们的混合物。

典型的阴离子去垢剂为烷基苯磺酸盐。这些阴离子的烷基苯部分是亲脂性的，而磺酸盐是亲水性的。阴离子去垢剂可以(例如)包含支链烷基或直链烷基。合适的阴离子去垢剂的实例为胆汁酸(如脱氧胆酸(DOC))、烷基苯磺酸盐(如支化的十二烷基苯磺酸钠、直链十二烷基苯磺酸钠)以及它们的混合物。

阳离子去垢剂与阴离子去垢剂相似，其具有疏水性成分，但是，阳离子表面活性剂以季铵代替阴离子磺酸盐基团而作为极性末端。铵中心带正电荷。

非离子去垢剂的特征在于其不带电荷的亲水头部基团。典型的非离子去垢剂(例如)基于聚氧乙烯或糖苷。前者的常见例子包括Tween、Triton和Brij系列。这些物质也被称为乙氧基化物或PEG化物，而其代谢物被称为壬基酚。糖苷具有糖作为其不带电荷的亲水头部基团。实例包括辛基硫代葡糖苷和麦芽糖苷。HEGA和MEGA系列去垢剂是相似的，均含有糖醇作为头部基团。可用于本发明方法的合适的非离子去垢剂的实例为烷基糖苷，如短链、中链或长链烷基麦芽糖苷，如正十二烷基-β-麦芽糖苷(DDM)、癸酰基-N-羟乙基葡糖酰胺(HEGA)、正癸酰基-N-甲基-D-葡糖酰胺(MEGA)，以及它们的混合物。

两性离子去垢剂由于存在相同数量的相反带电化学基团而具有净零电荷，即总体上负电荷和正电荷的数量相等，从而使得总电荷为净零。实例包括Fos-胆碱、CHAPS/CHAPSO、十二烷基-二甲胺-氧化物(LDAO)以及它们的混合物。

实际实验表明，使用具有短链至中链疏水尾部的去垢剂是有利的。如果将膜蛋白作为疏水试剂而纳入，则尤其如此。如本文所用的“短链疏水尾部”是指C2至C9，诸如(例如)正壬基-β-麦芽糖苷(NM)中的疏水尾部；如本文所用的“中链疏水尾部”是指C10至C15，诸如(例如)正癸基-β-麦芽糖苷(DM)或正十二烷基-β-麦芽糖苷(DDM)中的疏水尾部。在一个实施方案中，用于纯化和/或溶解疏水试剂去垢剂在其疏水的尾部具有2至12个碳原子，优选在其疏水的尾部具有2至10个碳原子，并且最优选具有2至9个碳原子。

步骤a)或a.1)、a.2)、a.3)和/或a.4)中的任一步骤中的膜囊泡可以处于去垢剂溶解状态。实际实验表明，广泛种类的去垢剂均可以用来使本发明的方法中所用的粗制膜囊泡进一步溶液化。例如，根据本发明的方法在粗制膜囊泡溶解在包含0.01％至5.0％(特别是0.1％至1.0％)的烷基糖苷(如短或较长链的烷基麦芽糖苷和葡糖苷)的溶液中时非常有效。然而，根据所用的膜或粗制膜囊泡的类型，也可以使用其他合适的去垢剂。给定的去垢剂使给定的膜或粗制膜囊泡溶解的能力可以通过视觉观察形成了没有聚集体、沉淀或相分离的澄清溶液而容易地检测出来。不受理论束缚，似乎添加去垢剂可使膜结构松散并有助于颗粒自组装(即，将粗制膜成分纳入Salipro颗粒中)。

在本发明的一个实施方案中，用于使步骤b)中的混合物溶解的去垢剂不以实质的量被载入本发明的最终的颗粒中。特别地，在能够通过本发明的方法获得的颗粒中，去垢剂的量可以低至检测不到。在一个实施方案中，本发明的颗粒不包含任何实质量的去垢剂，基于颗粒的重量，去垢剂的量特别为小于0.1重量％,优选小于0.01重量％，特别优选小于0.001重量％。颗粒中存在的去垢剂的量可以通过例如质谱法检测。

实际实验表明，本发明的脂质结合多肽在纯化、储存或处理过程中一般不需要去垢剂或其他溶剂。然而，可选择地，步骤b)所用的脂质结合多肽也可以为去垢剂溶解状态。

在一些实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽与膜囊泡的摩尔比为至少1:1，优选至少2:1或至少5:1，特别优选至少10:1。在另一个实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽与膜囊泡的摩尔比为1:1至1,000,000:1，特别是1:1至100,000:1或10,000:1至500:1。

在一些实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽与膜囊泡的重量比为至少1:1，优选至少2:1或至少5:1，特别优选至少10:1。在另一个实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽与膜囊泡的重量比为1:1至1,000,000:1，特别是1:1至100,000:1或10,000:1至500:1。

在一个实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽相比于粗制膜囊泡为摩尔过量的。在另一个实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽的量相比于粗制膜囊泡为过量的(每次计算基于步骤b中混合物的总重量计为重量％)。

对于大多数待纳入本发明的颗粒中的膜蛋白来说，如果步骤b)中，脂质与膜蛋白的摩尔比为100,000:1至1000:1，特别为100:1至1:1，则会获得最优结果。

在根据本发明方法的一个实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽与膜囊泡的摩尔比为至少1:1，特别是至少3:3，优选至少5:1或10:1。在根据本发明方法的另一个实施方案中，在步骤b)中，脂质结合多肽与膜囊泡的重量比为至少1:1，特别是至少3:3，优选至少5:1或10:1。

在另一个实施方案中，使步骤a)与步骤b)同时进行。在另一个实施方案中，使步骤a.1)至a.4)中的至少一个步骤与步骤b)同时进行。在该实施方案中，还可以使步骤a.1)至a.4)中的至少两个步骤与步骤b)同时进行。在一个特定实施方案中，使步骤a.1)至a.4)的所有步骤与步骤b)同时进行。在优选的实施方案中，使步骤a.3)、步骤a.4)和步骤b)同时进行

在本发明的另一个实施方案中，所述方法还包括步骤a)和步骤b)之间的以下步骤：

b.1)在液体环境中使粗制膜囊泡与去垢剂相接触。

去垢剂可以如上定义。

在进行步骤b.1)的情况中，在步骤c)中，使步骤b.1)之后得到的混合物(即粗制膜囊泡和去垢剂的混合物)与脂质结合多肽相接触。任选地，在步骤b.1)和步骤b)之间还可以存在步骤b.2)，其中在步骤b)中与脂质结合多肽相接触之前，将步骤b.1)中得到的粗制膜囊泡和去垢剂的混合物纯化。下文将更详细地描述该纯化，并且该纯化可包括(例如)去除去垢剂，特别是去除过量的或几乎全部的去垢剂，或去除非囊成分。该纯化的实例为通过超速离心去除碎片和/或蛋白质聚集体。在进行步骤b.2)的情况中，在步骤c)中，使步骤b.2)之后得到的混合物(即纯化的粗制膜囊泡混合物)与脂质结合多肽相接触。

该纯化步骤也可以作为步骤c.1)而在步骤b)和步骤c)之间进行，在该纯化步骤中对步骤a)和步骤b)之后得到的混合物进行纯化。

可以在存在去垢剂的情况下进行步骤a)、步骤b)和/或步骤c)。优选地，去垢剂选自上述去垢剂。可以添加液态、固态、液-固态等合适形式的去垢剂。

在一个实施方案中，可任选地对步骤a)、步骤a.4)、步骤b)或步骤b.1)之后得到的混合物进行纯化。这些纯化步骤(例如)被描述为上述步骤b.2)和步骤c.1)。

合适的纯化方法为色谱法，特别是尺寸排阻色谱法、超速离心、透析、接触去垢剂结合型生物珠子、使用浓缩器、亲和层析、磁珠和/或膜/过滤器，从而除去未结合/未纳入的脂质和/或疏水性化合物。本领域技术人员能够根据要实现的纯化目标而选择合适的纯化方法。

本发明方法的步骤c)

在根据本发明方法的步骤c)中，发生颗粒的自组装。步骤c)无需成为单独的步骤，其也可以与步骤b)同时发生。通常，在使粗制膜与本发明的脂质结合多肽相接触时，会直接发生颗粒的自组装。步骤c)通常在液体环境中进行，该液体环境可与步骤b)所用的液体环境相同或不同。

在步骤b)中，颗粒的自组装也可以称为粗制膜或粗制膜囊泡破碎成本发明的Salipro颗粒。在与本发明的脂质结合多肽相接触时，会引发该破碎或自组装。

优选地，本发明的步骤c)包括在以下pH发生颗粒的自组装：2.0至10.0，特别是6.0至10.0，优选6.0至9.0，特别优选7.0至9.0，并且最优选7.0至8.0。这些pH范围也可以应用于上述步骤b)，这与步骤c)中采用的pH无关。本文所述的pH范围使得在步骤b)中彼此相接触的成分能够在步骤c)中特别有效地自组装成本发明的颗粒。

与Salipro颗粒应当在或接近于鞘脂激活蛋白的最佳4.75的天然pH下发生最佳组装的预期不同，发现当在颗粒的自组装期间保持更加中性或碱性的pH时，也可以得到这样的文库，该文库的Salipro颗粒表现出改进的性质和更广泛的应用范围。令人惊讶的是，发现在5.0至10(特别是6.0至10，更优选6.0至8.5，并且最优选7.0至8.0)的pH下以及粗制膜囊泡的存在下，纯化的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物或截短形式可以自组装成稳定的脂蛋白颗粒，而不需要对于待纳入的脂质或膜蛋白成分进行费力的上游纯化方法。

本发明方法的步骤c)可包括使用液体稀释步骤b)中得到的混合物，或者步骤c)由使用液体稀释步骤b)中得到的混合物构成，所述液体特别是不含去垢剂或去垢剂的含量比步骤b)中得到的混合物少的液体。实际实验表明，这样的稀释步骤进一步诱导并促进了本发明的颗粒自组装。不希望限于该理论，认为这样的稀释步骤有效地从脂质结合多肽和粗制膜囊泡的疏水表面去除了杂质、溶剂和/或去垢剂分子，由此通过各成分的增强的疏水相互作用而进一步促进本发明的颗粒自组装过程。

虽然步骤c)中的颗粒自组装可以完全就在步骤b)所制备的组合物中进行，但是步骤c)也可包括添加有机溶剂、去除去垢剂、纯化或稀释步骤，或由上述步骤构成。步骤c)可以(例如)为凝胶过滤步骤。在该情况中，在步骤c)中，将步骤b)之后得到的混合物纯化并利用所使用的凝胶过滤缓冲液进行稀释。在某些实施方案中，对步骤b)获得的混合物进行凝胶过滤步骤，由此凝胶过滤缓冲液或其他溶液为不含去垢剂或去垢剂含量比步骤b)获得的混合物中的去垢剂含量少的液体。

根据特定实施方案，上述步骤，特别是步骤a)、步骤b)和/或步骤c)和/或其分别描述的分步骤a.1)至a.4、b.1)至b.2)和/或c.1)中的一者，均在4℃至85℃、特别是20℃至70℃、特别优选在30℃至70℃的温度下进行。对于大多数应用而言，温度为30℃至40℃就足够了。然而，通过本文教导的方法，本领域技术人员能够根据所用的膜、化合物、脂质和蛋白质的温度稳定性来确定最佳孵育温度。

在另一个实施方案中，该方法在步骤c)中或作为后续步骤d)而包括通过至少部分除去游离膜脂质、游离膜蛋白、游离脂质结合多肽、不溶性物质或聚集物质和/或去垢剂来进行颗粒的纯化，其中，任选地，通过下列方法进行纯化：色谱法，特别是尺寸排阻色谱；超速离心；透析；接触去垢剂结合型生物珠子；使用浓缩器；亲和纯化方法，包括但不限于色谱法、磁珠、免疫纯化和/或膜/过滤器，从而除去未结合/未纳入的脂质和/或疏水性化合物。

上述方法产生了根据本发明的salipro颗粒文库。这些文库反映并包含在步骤a)中用作起始材料的粗制膜囊泡的膜蛋白质组和脂质组(即，制备这些粗制膜囊泡的细胞或细胞器的膜蛋白质组和脂质组)的全部或部分，优选为绝大部分。Salipro颗粒文库可直接用于(例如)生命科学研究、系统生物学(以研究给定的细胞或细胞器的膜蛋白质组和/或脂质组)、药物研发(特别是药物筛选方法)、抗体研发和各种医学或美容应用。

然而，通过本发明的方法得到的文库也特别有益于用作起始材料，由该起始材料可以纯化出特定选择或特定类型的Salipro颗粒。

因此，本发明还提供了制备纯化的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法，其包括根据上述方法制备文库的步骤以及以下附加步骤：

f)由文库纯化得到至少一种类型的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。

可以通过任意的纯化、提取或分离方法进行步骤f)中至少一种类型的Salipro颗粒的纯化，优选通过本文所述的方法进行。

由文库纯化得到至少一种类型的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒可以通过亲和纯化进行，包括但不限于亲和色谱法和/或免疫纯化，特别是通过在待纯化的颗粒中存在的膜蛋白上使用抗原或标签。另外或可选择地，可以通过下列方法进行纯化：色谱法，特别是尺寸排阻色谱法；超速离心；透析；接触去垢剂结合型生物珠子；或使用浓缩器。

优选地，步骤f)中的至少一种类型的Salipro颗粒的纯化通过诸如亲和色谱法之类的亲和纯化进行。优选地，抗原或标签(本文中也称为“亲和标签”)存在于至少一种待纯化的Salipro颗粒中所存在的膜蛋白或脂质上。优选地，抗原或标签存在于至少一种待纯化的Salipro颗粒中的膜蛋白上。然而，用于纯化的标签或抗原也可以存在于Salipro颗粒中的脂质结合多肽上。以这种方式，在步骤f)中对整个文库进行亲和纯化。

优选地，将识别实体用于亲和纯化，其中识别实体能结合Salipro颗粒中存在的抗原或亲和标签。

如本领域技术人员已知的，亲和纯化涉及待纯化的成分(例如Salipro颗粒)上的抗原或亲和标签以及用于从混合物中纯化所述成分的相应的识别实体(例如，抗原情况中的抗体，或者His标签情况中的Ni-NTA实体)。基本上，蛋白质亲和纯化技术领域的技术人员已知的各种抗原或亲和标签/识别实体对可用于在步骤f)中纯化根据本发明的至少一种类型的Salipro颗粒。

发展亲和标签/识别实体对相互作用有助于蛋白质的纯化和固定。在基因水平上，可以利用某些能够与已知的识别实体相结合的肽序列(称为亲和标签)对蛋白质进行修饰。亲和标签通常分为三类：a)能结合小分子的肽序列；b)能结合小分子的融合蛋白；以及c)能结合抗体的肽标签或融合蛋白。亲和标签也可以是具有方便的结合配偶体的小分子。亲和标签可以共价连接至本发明方法的步骤a)中使用的粗制膜囊泡中存在的靶蛋白、肽或脂质。以这种方式，可以将亲和标记的Salipro颗粒固定在(例如)具有亲和标签的结合配偶体或识别实体的基质或树脂上。例如，当与Ni²⁺(NTA-Ni²⁺)络合时，次氮基三乙酸定义了一种识别实体，该识别实体与用一段组氨酸(称为组氨酸标签)修饰的蛋白质相结合，从而定义了亲和标签。

“亲和标签”具有其在本领域中的普通含义。亲和标签是能够容易地连接至靶标生物材料或化学材料的任意生物材料或化学材料。亲和标签可以通过任意合适的方法连接至靶标生物分子或化学分子上。例如，在一些实施方案中，可以使用遗传方法将亲和标签连接至靶分子。例如，可将编码亲和标签的核酸序列插入编码粗制膜囊泡中所存在的生物分子的序列附近；该序列可位于核酸内的任意位置，以使得亲和标签能够与生物分子一起表达，例如，在其内、相邻或附近。在其他实施方案中，还可以在分子已经生成(例如，表达或合成)之后，将亲和标签连接至靶标生物分子或化学分子。作为一个实例，可以将生物素等亲和标签化学偶联(例如共价偶联)至靶蛋白或靶肽，以促进靶标与链霉亲和素的结合。

亲和标签包括(例如)金属结合标签，如组氨酸标签、GST(在谷胱甘肽/GST结合中)、链霉亲和素(在生物素/链霉亲和素结合中)。其他亲和标签包括Myc/Max对中的Myc或Max、或聚组氨酸等聚氨基酸。在本文的各处，描述了与结合相互作用有关的特定亲和标签。与亲和标签相互作用(例如相结合)的分子(其可以为已知的生物或化学结合配偶体)是“识别实体”。应理解，在任何使用亲和标签的实施方案中，本发明涉及一系列单独的实施方案，每个实施方案涉及选择本文所述的任意的亲和标签。

识别实体可以是能够结合亲和标签的任何化学或生物材料。识别实体可以为(例如)小分子，如麦芽糖(其能结合MBP或麦芽糖结合蛋白)、谷胱甘肽、NTA/Ni²⁺、生物素(其可以结合链霉亲和素)或抗体。亲和标签/识别实体相互作用可以促进靶标分子与(例如)另一种生物或化学材料或基底的附连。亲和标签/识别实体相互作用的实例包括聚组氨酸/NTA/Ni²⁺、谷胱甘肽S转移酶/谷胱甘肽、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、链霉亲和素/生物素、生物素/链霉亲和素、抗原(或抗原片段)/抗体(或抗体片段)等。

在本发明的步骤f)中有用的亲和标签或抗原/识别实体对为(例如)抗体/肽相互作用、抗体/抗原相互作用、抗体/抗原的片段的相互作用、核酸/核酸相互作用、蛋白质/核酸相互作用、肽/肽相互作用、蛋白质/蛋白质相互作用、小分子/蛋白质相互作用、谷胱甘肽/GST相互作用、麦芽糖/麦芽糖结合蛋白相互作用、碳水化合物/蛋白质相互作用、碳水化合物衍生物蛋白质相互作用、肽标签/金属离子-金属螯合物相互作用、肽/NTA-Ni相互作用、表位标签(例如，V5标签、Myc标签、FLAG标签或HA标签)/抗体相互作用、蛋白A/抗体相互作用、蛋白G/抗体相互作用、蛋白L/抗体相互作用、荧光蛋白(例如，GFP)/抗体相互作用、Fc受体/抗体相互作用、生物素/亲和素相互作用、生物素/链霉亲和素相互作用、锌指/核酸相互作用、小分子/肽相互作用、小分子/靶标相互作用以及金属离子/螯合剂/聚氨基酸相互作用。

任意的上述亲和标签可以存在于本发明的Salipro颗粒(特别是步骤f)中待纯化的Salipro颗粒类型)中的膜蛋白、脂质或脂质结合多肽上。任意的上述识别实体可用于在步骤f)中纯化Salipro颗粒。

在本发明的一个实施方案中，标签为荧光标签。特别地，Salipro颗粒或通过本发明的方法获得的Salipro颗粒文库中存在的一种Salipro颗粒可以载有荧光标签。在优选的实施方案中，Salipro颗粒中存在的脂质、膜蛋白或脂质结合多肽载有荧光标签。在本发明方法中，这种荧光标签可用于在特定膜蛋白或特定类型(种类)的Salipro颗粒的生成期间(以及任选地，在纯化期间)对它们进行检测和跟踪。GFP及其变体是最常用的荧光标签。此外，实际研究表明，可以对粗制膜或粗制膜囊泡中的特定膜蛋白进行标记，然后将其用于步骤a)中以制备根据本发明的文库。例如，通过遗传工程或通过将载有标记的转基因的载体插入获得粗制膜囊泡的细胞或细胞器中，可以使该标记优先在遗传水平上发生。

使用上述技术，本发明提供了制备Salipro颗粒的方法，所述Salipro颗粒包含含有抗原或亲和标签的特定目的膜蛋白。

下面对于含有膜蛋白GLUT5的GFP融合物的粗制细胞膜示例性地描述该方法，但是本发明不限于此。简言之，在液体环境中，将包含含有GFP-GLUT5的粗制膜囊泡的粗制膜部分(本发明方法的步骤a))与鞘脂激活蛋白A(含有或不含去垢剂)相接触(本发明方法的步骤b)以及部分地已经为c))，然后在无去垢剂的缓冲液中使用凝胶过滤层析/尺寸排阻色谱法去除去垢剂-胶束(本发明方法的步骤c))，从而迫使初始混合物的疏水部分自组装成Salipro纳米颗粒。鉴于用作起始材料的粗制膜的复杂性，该过程会产生包含过多不同膜蛋白的Salipro颗粒的异质文库。如下图4b所示，文库中的一些Salipro颗粒将含有荧光标记的GFP-GLUT5膜蛋白，其他Salipro颗粒将含有其他膜蛋白，而一些Salipro颗粒将缺乏膜蛋白，并且仅含有源自粗制膜的膜脂质。

在一个实施方案中，根据本发明的方法提供了Salipro颗粒文库，其中每个Salipro颗粒实质上包含至少一种脂质结合多肽和粗制细胞膜或细胞器膜的成分，特别地，其中每个Salipro颗粒实质上包含至少一种脂质结合多肽和膜脂质，并且任选地包含来自粗制细胞膜或细胞器膜的膜蛋白。

本文所用的术语“实质上”是指Salipro颗粒中也可以存在本发明方法中使用的痕量的其他成分，如粗制膜的其他成分或该方法中使用的试剂，如去垢剂。然而，Salipro颗粒实质上包含至少一种脂质结合多肽以及得自细胞膜或细胞器膜的膜成分应特别意味着未添加其他脂质和/或蛋白质。特别地，在根据本发明的方法中未添加其他合成的、纯化的和/或外源的脂质和/或蛋白质。

在本发明的一个优选实施方案中，除了粗制膜囊泡的脂质成分之外，在根据本发明的方法中未添加其他的脂质。在本发明的另一个优选实施方案中，除了粗制膜囊泡的蛋白质成分之外，在根据本发明的方法中未添加其他的膜蛋白。

本发明提供了鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒和/或根据任意上述方法得到的Salipro颗粒的文库。

可通过本发明的方法获得并包含在本发明的Salipro颗粒文库中的Salipro颗粒在多种特征方面与现有技术的颗粒有所不同。例如，Salipro颗粒包含粗制细胞膜和细胞器膜的成分。特别地，Salipro颗粒包含来自细胞膜和细胞器膜的膜蛋白，特别是仍保留在其天然细胞膜或细胞器膜脂质环境中的膜蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的Salipro颗粒仅包含作为膜蛋白成分和脂质成分的膜脂质，以及任选的来自一种或一种特定类型的细胞膜或细胞器膜的膜蛋白。在一个特别优选的实施方案中，本发明的Salipro颗粒仅包含作为膜蛋白成分(如果有的话)和作为脂质成分的膜蛋白和来自相同细胞膜或细胞器膜的脂质。

此外，本发明的Salipro颗粒的特征在于其固有的尺寸灵活性和适应待纳入脂蛋白颗粒中的膜成分各自的尺寸的能力。这使得能够将多种膜蛋白、其复合物、膜结构域或膜成分纳入文库的Salipro颗粒中。因此，本发明的文库不仅在各单独的Salipro颗粒的含量方面是异质的，而且在各单独的Salipro颗粒的尺寸方面也是异质的。“空的”(即，仅含脂质的)Salipro颗粒将小于载有给定膜蛋白的颗粒，还小于载有多聚膜蛋白复合物的颗粒。通过这种尺寸灵活性，使得Salipro颗粒文库能够捕获无偏性的一系列(unbiased array)处于其天然环境中的给定细胞膜或细胞器膜蛋白质组和脂质组。

通常，Salipro颗粒文库中的颗粒在其蛋白质组成方面有所不同。这些颗粒在其脂质组成方面也可能不同，从而反映了用作起始材料的细胞膜或细胞器膜中膜结构域的不同的脂质组成。有利地，根据本发明获得的文库可提供包含膜的一部分或成分的颗粒。另一个优点是，本发明的Salipro颗粒中保持了膜脂质和任选的膜蛋白的天然环境。

可根据本发明的方法获得的Salipro颗粒文库或Salipro颗粒还具有医药用途，特别是用于预防、治疗疾病或减轻疾病的严重程度或用于诊断方法、美容处理或用作疫苗接种制剂。

例如，本发明的Salipro颗粒可以包含在药物组合物中，用于将一种或多种膜蛋白和/或脂质递送至有此需要的个体，其中所述组合物包含如上所述的本发明的颗粒。

除了本发明所述颗粒，所述药物组合物可以任选包含(其他)药学可接受的赋形剂、载体或佐剂。

当本发明的颗粒用于药物组合物时，颗粒和药物组合物的各个成分应当是药学上可接受的。本文使用的术语“药学上可接受的”是指在健全的医疗判断范围内，成分、化合物或试剂适合用于接触人体和低等动物的组织，而不会引起异常毒性、刺激、过敏反应等，并且相应地具有合理的受益/风险比率。

在另一方面，本发明提供了使用治疗有效量的上述药物组合物对需要治疗的个体进行治疗的方法。本文所述药物组合物的“治疗有效量”为：治疗或减轻待治疗的疾病或病症的严重程度的有效量。本文所使用的术语“个体”是指动物，如哺乳动物，更具体是人。

本发明的药物组合物可根据待治疗的疾病或病症的严重程度，通过以下方式作为气溶胶、口或鼻喷雾等施用给人和其他动物：经口、经直肠、不经肠、脑池内(intracisternally)、阴道内、腹膜内、经局部(例如以粉末、软膏或滴剂)，经面颊(bucally)。特别地，所述药物组合物可被配制为经肠内、不经肠和/或经局部给药。其可以以胶囊、输注或注射、可涂刷或可饮用的组合物来施用，或者以气溶胶来施用。在本发明的药物组合物的一些实施方案中，本发明的颗粒以固体形式、作为分散液或溶液的形式存在。

本发明的颗粒对诊断和/或美容应用也是有用的。例如，含有可检测的例如上文所述的抗原或标签的Salipro颗粒可用作诊断试剂并用于诊断目的。抗原或标签可以本身包含在Salipro颗粒中存在的膜蛋白中，或由Salipro颗粒中存在的膜蛋白形成，然而它们也可以附连至颗粒的脂质结合多肽或脂质成分上。本发明所述的诊断工具和生命科学研究工具的例子包括：纳入有标记的膜蛋白的颗粒、具有标记的脂质结合多肽的颗粒、具有标记的脂质的颗粒、纳入有荧光基团或造影剂(例如用于MR成像)的颗粒。标签可以是(例如)荧光标签。

在另一方面，本发明的颗粒作为疫苗接种制剂、疫苗接种制剂的载体或药物递送载体是有用的。许多在接种疫苗中特别有效的致病抗原暴露在真核生物或原核生物的病原体或患者的疾病细胞(例如癌细胞)的细胞外膜表面和/或包含于其中。这些抗原可以(例如)来源于致病性脂质、其他疏水性生物分子或膜蛋白。本文所用的术语病原体不包括病毒。通过使用本发明的颗粒，此类抗原能够有效地被纳入到颗粒中，然后可以将其用作疫苗接种制剂中的抗原呈递递送载体。按照这样的方法，本发明的颗粒也可以用于作为抗原呈递递送载体以在合适的宿主动物中、优选在哺乳动物(诸如兔子、山羊、羊驼、小鼠和灵长类动物)中生产抗脂质或膜蛋白的抗体。

在另一方面，本发明还提供了本发明的Salipro颗粒文库或本发明的Salipro颗粒作为药物研发、药物筛选、药物探索的工具的用途。

例如，特定的膜蛋白药物靶标(如细胞表面受体或离子通道)可以被纳入到本发明的颗粒中并溶解，从而使其处于天然状态。然后，可如上所述从文库中纯化出所述颗粒。然后，该颗粒可以用于检验以研究药物靶标膜蛋白在其天然的脂双层环境中的活性，或用于药物筛选来鉴定新药。

相反地，可将得自可能是疾病靶标的特定细胞或细胞器的整个Salipro颗粒文库用于药物筛选目的，以鉴定新的分子药物靶标，如靶标细胞或细胞器的膜中存在的膜蛋白或脂质。

本文描述的文库和方法还可以用作以下方面的工具：膜蛋白纯化、膜蛋白表达、膜和/或膜蛋白研究，特别是脂质组学和蛋白质组学，优选膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或蛋白质组文库或数据库。

此外，纯化的或作为整个文库的一部分的本发明的颗粒也能够被固定在固体支持物上，从而使其可用于诸如表面等离子共振(SPR)等应用或生物传感器应用。

本发明的颗粒通常可用于在其天然的膜双层微环境中使不可溶的膜蛋白和膜结构域或成分可溶于水性溶液。因此，本发明提供了膜蛋白研究中的多种新应用。例如，本发明的颗粒使得可以通过以下方法研究被纳入本发明的颗粒中的膜蛋白：例如，核磁共振(NMR)、X射线晶体学、电镜(EM)、质谱、等温滴定量热法(ITC)、差示光散射、小角X射线散射(SAXS)等。

本发明的文库特别适用于系统生物学领域的研究，尤其是脂质组学和膜蛋白质组学。本发明的文库可适用于对细胞或细胞器的脂质组或蛋白质组进行捕获和溶液化。脂质组学和蛋白质组学中的典型分析技术为质谱(MS)、核磁共振(NMR)波谱、荧光光谱和计算方法等技术。将这些方法或技术应用于本发明的Salipro颗粒将使得能够进一步阐明天然脂质和膜蛋白在许多代谢疾病(例如，癌症、自身免疫疾病、肥胖症、动脉粥样硬化、中风、高血压和糖尿病)中的作用。

将粗制膜纳入本发明文库的颗粒中的优点在于，而后粗制膜可表现出获得粗制膜的实际膜的微区和成分的瞬像。与此相反，现有技术中已知的典型的含有鞘脂激活蛋白脂质的颗粒由合成脂质或纯化的脂质的异质混合物以及任选的蛋白质组成，其中脂质通常来源于与颗粒中存在的膜蛋白完全不同的来源。

附图说明

下文将参照附图对本发明进行描述，附图描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明为如权利要求以及本文中的一般性描述所定义的。不应限于在以下附图中出于说明目的而示出的实施方案。

图1a)和1b)示出了现有技术的脂蛋白颗粒。图1a为现有技术(如上述的EP 1 596828 B1)的包含载脂蛋白A-1的纳米盘颗粒的形状和分子构造的示意图。图1b为用于产生上述现有技术(例如WO 2014/095576 A1)的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法的示意图。

图2a)至2f)为根据本发明的Salipro颗粒的示意图。在图2a)和2b)中，示出了含有细胞膜或细胞器膜脂质的Salipro颗粒1c；a)为侧视图而b)为俯视图。在图2c)和2d)中，示出了含有细胞膜或细胞器膜脂质以及膜蛋白4a的Salipro颗粒1a；c)为侧视图而d)为俯视图。在图2e)和2f)中，示出了含有细胞膜或细胞器膜脂质以及寡聚膜蛋白4b的Salipro颗粒1b；e)为侧视图而f)为俯视图。

图3a)和3b)为制备本发明的鞘脂激活蛋白颗粒文库的方法的示意图。图3a)示出了用于制备文库的起始材料，即鞘脂激活蛋白A2和粗制膜囊泡5、5'。膜囊泡5、5'包含多种膜脂质3，并且在5的情况中，包含多种膜蛋白，这里以4a、4b的简化形式例示。图3b)示意性地示出了所得的文库7，其以简化形式示例为不同的Salipro颗粒1a、1b和1c(它们在脂质含量、蛋白质货物含量和尺寸中的至少一个方面有所不同)的混合物。颗粒1a和1b包含膜蛋白4a、4b。颗粒1c为“空的”、仅含脂质的颗粒。

图4a)和4b)为制备本发明的鞘脂激活蛋白颗粒文库的方法的示意图，其中利用亲和标签8标记粗制膜囊泡5中存在的膜蛋白4c。图4a)示出了用于制备文库的起始材料，即鞘脂激活蛋白A 2和粗制膜囊泡5。膜囊泡5包含膜脂质3和多种膜蛋白，这里以4c、4b的简化形式例示。图4b)示意性地示出了所得的文库7'，其以简化形式例示为不同的Salipro颗粒1d、1b和1c(它们在脂质含量、蛋白质货物含量和尺寸中的至少一个方面有所不同)的混合物。颗粒1d包含其上附有亲和标签8的膜蛋白4c。颗粒1b包含寡聚膜蛋白4b。颗粒1c为“空的”、仅含脂质的颗粒。

图5为如上所述通过进行步骤f)制备本发明颗粒的方法的一个实施方案的示意图。使用亲和柱9对图4b)的文库7'进行纯化步骤。还示出了从柱9排出的1.)流经液级分；2.)冲洗液级分；3.)洗脱液级分的内容物的示意图。

图6示出了实施例1a的结果。该图示出了将荧光GFP-GLUT5纳入来自粗制膜的Salipro纳米颗粒的荧光尺寸排阻色谱(FSEC)分析。

图7示出了实施例1b的结果。该图再次示出了将荧光GFP-GLUT5纳入来自粗制膜的Salipro纳米颗粒的FSEC分析。

图8示出了实施例2的结果。该图示出了将荧光GFP-GLUT5纳入来自粗制膜的Salipro纳米颗粒的FSEC分析。“产量对照样品”在缓冲液中连续存在去垢剂的情况下运行，而所有其他样品均在无去垢剂的缓冲液体系中运行。

图9示出了实施例3的结果。该图示出了添加的鞘脂激活蛋白A的量增加的SEC分析。当存在鞘脂激活蛋白A时，来自粗制膜的膜蛋白被纳入Salipro颗粒文库中并在无去垢剂的缓冲液体系中保持可溶。

图10示出实施例4的结果。该图示出了添加的鞘脂激活蛋白A的量增加的SEC分析。当存在鞘脂激活蛋白A时，来自粗制膜的膜脂质被纳入Salipro颗粒文库中并在无去垢剂的缓冲液体系中保持可溶。

图11示出了实施例4的进一步结果。该图示出了鞘脂激活蛋白A、现有技术Salipro颗粒和根据本发明制备的Salipro颗粒的SEC分析。

图12a)和12b)分别是文献“Bruhn(2005),Biochem J 389(15)：249-257”的图4A和4B的相同复制品，这些序列构成本发明公开内容的一部分。

图1a)示出了现有技术的包含载脂蛋白A-1的纳米盘颗粒A(参见(例如)上述的EP1 596 828 B1)，其含有脂质B和作为脂质结合多肽C的载脂蛋白A-1。与现有技术的载脂蛋白衍生纳米盘相反，本发明的脂质结合多肽不以双带样形式包封脂质(参见图1a中的C)，而是通过包含膜脂质的核心将本发明的颗粒保持在一起，所述膜脂质被两个或更多个近似V形或飞旋镖形的以头-尾方向排列的脂质结合多肽围绕，并且在本发明的给定颗粒中，各个脂质结合多肽之间实质上没有直接的蛋白质-蛋白质接触(参见图2a至2f)。

图1b为用于产生上述现有技术(例如WO 2014/095576A1)的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒G的方法的示意图。这里，将SAPLIP D与纯化的脂质E以及去垢剂F溶解的、纯化的膜蛋白4a一起孵育，以形成颗粒G。由与膜蛋白4a不同的来源纯化并衍生出脂质E。膜蛋白4a不存在于膜或囊泡中，而是处于人工的、溶解于去垢剂中的状态(参见图1b中间，脂质E和去垢剂分子F结合至膜蛋白4a的疏水表面)。因此，在颗粒G中，膜蛋白4a不是嵌入其天然膜环境中，而是嵌入人造或外源的脂质E(并且可能还有去垢剂F)的混合物中。

图2a)至2f)为根据本发明某些实施方案获得的Salipro颗粒的示意图。颗粒1a、1b和1c包含多种不同的膜脂质3，并且任选地包含膜蛋白4a、4b。膜脂质3以及膜蛋白4a和4b均来自用于制备颗粒的相同细胞膜或细胞器膜。脂质3不是相同或同质的，而是彼此不同，这是生物膜中的典型情况。此外，根据获得粗制膜囊泡5的来源(参见图3a和3b)，Salipro颗粒中膜的组成会变化，因而脂质3和任选地存在的膜蛋白的混合物也会变化。在另一个实施方案(未示出)中，Salipro颗粒还可以包含通常存在于细胞膜或细胞器膜中的其他成分。

颗粒1a至1c未按比例绘制。取决于纳入颗粒1a或1b中的膜蛋白4a、4b的尺寸，仅含脂质的颗粒1c的尺寸可以与其他颗粒1a、1b显著不同。颗粒1a和1b也可以在尺寸、脂质和最佳膜蛋白组成方面不同。例如，如果脂筏的一部分完全被纳入Salipro颗粒中，则颗粒1c也可以在尺寸方面不同。应注意，本发明的Salipro颗粒尺寸灵活。例如，与含有单体膜蛋白的颗粒1a相比，含有寡聚膜蛋白的颗粒1b更大，并且含有更多的鞘脂激活蛋白亚基2。

图2a)和2b)以简化的示意图形式示出了Salipro颗粒1c，其包含作为脂质结合多肽2的SAPLIP以及细胞膜或细胞器膜脂质3；a)为侧视图而b)为俯视图。

图2c)和2d)示出了Salipro颗粒1a，其与1c的不同之处在于1a还包含膜蛋白4a；c)为侧视图而d)为俯视图。膜蛋白4a可以是单体形式的整合跨膜蛋白。然而，其也可以为图2e)或2f)所示的寡聚状态，或者为外周膜蛋白、脂质结合状态的双向性蛋白、脂质锚定蛋白或具有融合疏水/或跨膜结构域的嵌合蛋白，它们均可以为单体或寡聚状态。

图2e)和2f)示出了Salipro颗粒1b，其与1c的不同之处在于1b还包含寡聚膜蛋白4b，e)为侧视图而f)为俯视图。颗粒1b在尺寸方面表现出灵活性并且适应于纳入其中的寡聚膜蛋白4b的尺寸。在图2e)或2f)所示的实施方案中，颗粒1b的每个颗粒包含三个以头-尾形式排列的SAPLIP分子2。取决于纳入其中的疏水试剂，包含三个SAPLIP分子的颗粒的流体动力学半径在5nm至20nm的范围内。

图3a)和3b)再次以简化的示意图形式示出了根据本发明的用于从粗制膜囊泡5制备Salipro颗粒文库7的方法。在图3b)中，将文库7示意性地描绘为不同的典型Salipro颗粒1a至1c(它们在膜脂质3和任选的蛋白质货物4a、4b和/或尺寸方面有所不同)的混合物。当然，实际上，文库7将包含数千种不同的Salipro颗粒。类似地，起始混合物6将包含大量不同的粗制膜囊泡。

如图3a)所示，通过将纯化的SAPLIP 2与粗制膜囊泡5、5'混合并进行颗粒1的自组装X，从而制备本发明的颗粒1a至1c。包含粗制膜囊泡5和5'的组合物6可以为细胞或细胞器裂解后直接得到的粗制膜部分。囊泡5和5'通常会在裂解或膜破裂时自发形成。仅将起始组合物6示意性地描述为含有典型的囊泡5和5'，其中一者(5')较小并且可以仅含有膜脂质，另一者(5)较大并且除膜脂质3之外还含有膜蛋白4a和4b。在本发明的方法中用作起始材料6的粗制膜囊泡的尺寸和含量可以是非常异质的。不一定(但是可以)需要均质化或特定的囊泡产生步骤。当然，包含更均匀的粗制膜囊泡的组合物也可用作起始材料6。

图3a)示出了图3b所示的文库7的制备。通过将纯化的SAPLIP2与包含膜脂质3和任选的一种或多种膜蛋白4a和/或4b的粗制膜囊泡5、5'(它们均来源于粗制膜)混合，从而制备本发明的颗粒1a至1c。然后例如在约5.0至约10.0的pH下进行颗粒1的自组装X。粗制膜囊泡5、5'可任选地包含去垢剂分子(本文未描绘)或与去垢剂分子相关。对于鞘脂激活蛋白分子2也是如此。与膜蛋白4a和/或4b相关的膜脂质3优选为在提供粗制膜囊泡5、5'之前，来自细胞膜或细胞器膜中的膜蛋白的天然脂质环境中的唯一遗留物。在颗粒1a和1b中，相应的膜蛋白4a和4b嵌入获得它的膜的疏水部分的成分中。优选地，膜蛋白与其天然膜结合状态具有相同或相似的构象。

图3b)示出了包含典型颗粒1a、1b和1c的Salipro颗粒文库。颗粒1a和1b包含膜蛋白4a、4b。作为本发明的特定实施方案示出的颗粒1a至1c(也在图2a至2f中更详细地示出)为近似盘形，其具有平的、盘状的、大致圆形至方形的脂双层，该脂双层由两个或三个SAPLIP分子的两亲性α螺旋围绕。在颗粒1a至1c的内部，粗制膜囊泡5、5'的脂质3组装成不连续尺寸的盘状双分子层样结构。SAPLIP 2限定了颗粒1a至1c中的盘状双分子层的边界，颗粒1a至1c的内部是疏水的，即由脂质脂肪酰链组成并且缺少亲水或水性核心。颗粒1a至1c主要通过颗粒1a至1c的双分子层核心内的粗制膜囊泡5的脂质3的疏水相互作用、以及粗制膜囊泡5的脂质3与面向颗粒内部的SAPLIP 2的两亲性螺旋的疏水部分之间的疏水相互作用而保持在一起。据认为，颗粒1c在其最小形式中含有两个SAPLIP分子2和至少约2至5个粗制膜囊泡5、5'的脂质分子3。然而，本发明的颗粒1a至1c在尺寸方面灵活。取决于待纳入的货物(例如脂质结构域、膜蛋白等)的尺寸及其制备中使用的成分的摩尔比，本发明的颗粒可以容纳多个(即多于两个)SAPLIP 2、更多的粗制膜囊泡5的脂质3，并任选地容纳一种或多种膜蛋白4a和/或4b。例如，本发明的颗粒可包含2至20个、特别是2至10个SAPLIP 2，并任选地包含一种或多种膜蛋白。取决于纳入颗粒1a、1b中的膜蛋白4a、4b的尺寸，所述颗粒可显著大于仅含脂质的颗粒1c。通常，颗粒尺寸的增加也会反映每个颗粒中的SAPLIP 2的数量，SAPLIP 2的数量可以多于两个。本发明的颗粒可以例如包含2至20个、特别是2至10个SAPLIP分子2。

图4a)和4b)基本上与图3a)和3b)相同，不同之处在于，起始材料6的粗制膜囊泡5中包含具有亲和标签8的膜蛋白4c。由于在粗制膜囊泡5、5'与纯化的SAPLIP 2接触后的自组装Y，所得的文库7'包含含有膜蛋白4c和亲和标记8的颗粒1d。上述图3a)和b)的描述同样适用于图4a)和b)。

图5是根据本发明的方法的一个实施方案的示意图，该方法用于通过进行如上文更一般性地描述的步骤f)，由本发明的文库纯化出特定的颗粒。使用可以如上图4a)和b)所示获得的文库7'作为起始材料。例如，使用亲和柱9对文库7'进行亲和纯化。该柱9包含能结合至亲和标签8的识别实体。例如，如果亲和标签8为His标签，则亲和柱9中的识别实体为Ni-Nta。虽然图5中示出了柱形式的纯化，但批量纯化方法也是可能的。

使文库7'通过亲和柱9可使得颗粒1d通过其亲和标签8与柱9中的识别实体特异性结合。颗粒1b和1c以及文库的其他成分或碎片不与柱9结合或仅与柱9非特异性结合。因此，所得的流经液1.)实质上无颗粒1d。通过进行至少一个冲洗步骤2.)来除去文库的一些残留成分(如颗粒1b和1c)，所述残留成分可能非特异性地结合至亲和柱9。最后，在洗脱步骤3.)中通过破坏亲和柱9中的识别实体与亲和标签8之间的结合，可将纯化的颗粒1d洗脱。这种破坏可以通过以下方式进行：高盐洗涤、酶促切割、或者在His标签/Ni-NTA标签/识别实体对的情况中使用咪唑。在3.)之后获得的洗脱液级分包含纯化形式的本发明的颗粒1d。

实施例

以下例子旨在具体参照一些实施方案和附图以更详细的方式进一步说明本发明，而并不旨在限制本发明。

将使用以下缩写：

GF-缓冲液pH 7.5：20mM HEPES、pH 7.4和150mM NaCl

GFP：绿色荧光蛋白

Glut5：转运蛋白、膜蛋白

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

His：组氨酸

HN缓冲液：20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4

HN-D缓冲液：含有0.2％DDM的HN缓冲液

M：摩尔

RT：室温

SEC：尺寸排阻色谱法

TCEP：三(2-羧乙基)膦

TEV：烟草蚀刻病毒

Tris：三(羟甲基)氨基甲烷

以下实验中所用的纯化的鞘脂激活蛋白A由以下方法制备。通过以下方法进行鞘脂激活蛋白A蛋白的表达：使用将人鞘脂激活蛋白A(SEQ ID NO.1)的编码区插入pNIC-Bsa4质粒的载体，并将其转染入大肠杆菌E.coli Rosetta gami-2(DE3)(Novagen公司)菌株中进行表达。在补充有四环素、氯霉素和卡那霉素的TB培养基中，在37℃下培养细胞，并利用0.7mM IPTG诱导。诱导后3小时，通过12,000×g离心15分钟收集细胞。弃上清，细胞团利用裂解缓冲液(20mM Hepes pH 7.5,150mM NaCl,20mM Imidazol)重悬，并且通过超声使其破裂。裂解物经过26,000×g离心30分钟，上清于85℃加热10分钟，而后26000×g再次离心30分钟。利用Ni Sepharose^TM 6Fast Flow介质，颠倒旋转60分钟，从而对上清进行分批吸附，由此进行初步IMAC纯化。在鞘脂激活蛋白A结合到IMAC树脂后，将层析介质装入10mm(内径(i.d.))的开口重力流柱中，利用15柱床体积的裂解缓冲液进行清洗以去除未结合的蛋白。用15柱床体积的清洗缓冲液WB2(20mM Hepes pH 7.5,150mM NaCl,40mM Imidazol)清洗树脂。添加5柱床体积的洗脱缓冲液EB(20mM Hepes pH 7.5,150mM NaCl,400mM Imidazol)来洗脱鞘脂激活蛋白A。洗脱液利用pH 7.5的补充有重组TEV蛋白酶的凝胶过滤缓冲液GF(20mM Hepes pH 7.5,150mM NaCl)透析过夜。通过使洗脱液经过2ml的IMAC树脂来从其中除去含有不可剪切的His标签的TEV蛋白酶。利用离心过滤单元将剪切后的靶标蛋白浓缩至5ml体积，并且利用10层析系统上柱至HiLoad Superdex^TM 200 16/60GL柱(均得自GE Healthcare公司)。合并(pool)峰组分并浓缩至1.2mg/ml蛋白。蛋白样品在液氮中快速冷冻，并于-80℃储藏。

实施例1a

从表达GFP-GLUT5的酵母菌细胞获得粗制酵母菌细胞膜部分。将膜部分(其含有自发形成的粗制膜囊泡)与去垢剂和鞘脂激活蛋白A一起孵育，然后在无去垢剂的缓冲液中使用凝胶过滤层析/尺寸排阻色谱(SEC)去除去垢剂-胶束。这使得初始混合物中存在的膜成分自组装成纳米级Salipro颗粒文库。特别地，可以在该文库中鉴定出包含膜脂质和GFP-GLUT5的单分散的Salipro颗粒。

1.膜制备

从表达大鼠GLUT5的酵母菌细胞获得粗制酵母菌膜，所述酵母菌细胞来自现有技术中已知的GAL1诱导型TEV可剪切的GFP-His82μ载体pDDGFP2。将该载体转染入酿酒酵母菌(S.cerevisiae)菌株FGY217(MATa，ura3-52，lys2Δ201和pep4Δ)中，然后在其细胞膜中过表达GFP-GLUT5。

为了产生粗制膜，从12组酿酒酵母菌培养物中收获细胞，重悬于含有50mM Tris-HCl pH 7.6、1mM EDTA、0.6M山梨糖醇的缓冲液中，并通过机械破碎裂解。以195,000g超速离心3小时分离出膜，在20mM Tris-HCl pH 7.5、0.3M蔗糖、0.1mM CaCl₂中匀浆，在液氮中冷冻并于-80℃储藏。

2.Salipro颗粒文库的制备

将20μl含有自发形成的粗制膜囊泡(其特别含有GFP-GLUT5)的粗制酵母菌膜与60μl HN缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)以及20μl补充有5％DDM的HN缓冲液混合，然后在4℃下孵育1小时。然后通过使用TLA-55转子以47krpm(100,000g)超速离心30分钟，使膜裂解物从碎片和蛋白质聚集体中澄清。然后将5μl澄清的膜部分与量增加(5-10-20-30-40μl)的鞘脂激活蛋白A(1.2mg/ml，HN缓冲液)混合，并在37℃下孵育5分钟从而进行Salipro颗粒的自组装。该设置中存在的唯一脂质是源自粗制膜和粗制膜囊泡的脂质。

此后，用HN缓冲液将样品体积调节至50μl，并以13krpm离心10分钟。进行SEC分析(使用Shimadzu HPLC系统)：将35μl样品注入5/150Superose6increase柱(GE Healthcare公司)，流速为0.3ml/分钟，并在线监测荧光GFP标签的存在。SEC缓冲液由不含任何去垢剂的HN缓冲液构成。

作为阴性对照，从实验设置中完全省略鞘脂激活蛋白A(0μl SapA)，使用NH缓冲液将体积调节至50μl，然后如前所述处理样品。

3.结果

如图6所示的结果表明，可以将GFP-GLUT5等来自粗制细胞膜的膜脂质膜蛋白纳入并稳定在可溶的Salipro颗粒中，从而显示出单分散峰。量增加的鞘脂激活蛋白提高了纳入效率和峰的单分散性。因此，鞘脂激活蛋白A、来自粗制膜的脂质和GFP-GLUT5以这样的方式缔合，从而形成具有纳入的膜蛋白的水溶性颗粒。尽管在SEC分析中仅通过GFP-GLUT5的荧光而对其进行监测，但所得的Salipro颗粒文库还含有大量其他的Salipro颗粒，这些Salipro颗粒含有获得粗制膜部分的酵母菌细胞的其余的膜蛋白质组和脂质组。这可以例如通过质谱法、SDS-PAGE和/或通过与所得的salipro颗粒文库中存在的其他天然酵母菌膜蛋白和脂质结合的抗体进行探测来确认。

作为阴性对照，在设置中不存在鞘脂激活蛋白的情况中，GFP-GLUT5(相应地，还有其余的膜蛋白)不可溶并且聚集(参见高的无效峰)。

实施例1b

1.设置

如实施例1a中所述制备含有粗制膜囊泡和大鼠GLUT5的粗制酵母菌膜。

2.Salipro颗粒文库形成方法的变化。

对从粗制膜提取物制备Salipro-GFP-GLUT5颗粒的两种不同方法进行评价。

对于第一种方法，将25μl鞘脂激活蛋白A(0.75mg/ml)添加到1μl含有粗制膜囊泡和GFP-GLUT5的粗制膜提取物中，并在37℃下孵育5分钟。然后，将24μl HN-D缓冲液添加到混合物中并在37℃下再孵育5分钟。然后，将样品以13krpm离心10分钟，并如实施例1a中那样进行SEC分析。

对于第二种方法，首先通过添加24μl HN-D缓冲液对1μl含有粗制膜囊泡和GFP-GLUT5的粗制膜提取物进行补充，然后在37℃下孵育5分钟。然后将样品以13krpm离心10分钟。收集裂解物悬浮液并添加25μl鞘脂激活蛋白A(0.75mg/ml)并在37℃下再孵育5分钟。然后如实施例1a中所述通过SEC分析样品。

3.结果

图7所示的数据表明，两种方法均可用于获得具有可溶性Salipro-GFP-GLUT5颗粒的Salipro颗粒文库，不依赖于在37℃下使用HN-D缓冲液孵育粗制膜5分钟之前还是之后添加鞘脂激活蛋白A。在两种情况下，都扔存在粗制膜的天然脂质。有趣的是，当将鞘脂激活蛋白A直接添加到粗制膜中时，在空隙体积中仅看到非常少的蛋白质聚集。重要的是，这两种方法都起作用，这使得该方法在从复杂的粗制膜提取物中重构Salipro颗粒文库时具有一定的灵活性。

实施例2

1.设置

如实施例1a中所述制备含有大鼠GFP-GLUT5和粗制膜囊泡的粗制酵母菌膜。

2.Salipro形成、滴定

在4℃下，使用60μl HN缓冲液和20μl补充有5％DDM的HN缓冲液对20μl酵母菌粗制膜进行混合和溶液化1小时。然后通过使用TLA-55转子以47krpm(100,000g)超速离心30分钟，使膜裂解物从碎片和蛋白质聚集体中澄清。然后将5μl澄清的膜裂解物(其含有粗制膜囊泡)与不同体积(12μl、20μl、30μl和40μl)的鞘脂激活蛋白A(4mg/ml，HN缓冲液)混合，并在37℃下孵育5分钟。然后用HN缓冲液将样品体积调节至50μl，并以13krpm离心10分钟。进行SEC分析(使用Shimadzu HPLC系统)，将35μl样品注入5/150Superdex 200increase柱(GEhealthcare公司)，流速为0.3ml/分钟，并在线监测荧光GFP标签的存在。此外，使用不存在去垢剂的HN缓冲液进行SEC，以促进膜蛋白重构成Salipro颗粒。

作为对照，将5μl澄清的膜裂解物与45μl补充有0.03％DDM的NH缓冲液混合，并以13krpm离心10分钟。在含有0.03％DDM的HN缓冲液中进行SEC分析(使用Shimadzu HPLC系统)，将35μl样品注入5/150Superdex 200increase柱(GE healthcare公司)，流速为0.3ml/分钟，并在线监测荧光GFP标签的存在。该对照样品(产量对照样品)的目的是作为参照点，以确定持久存在去垢剂的情况中可溶解的GFP-GLUT5的量，从而与在无去垢剂的缓冲液系统中Salipro颗粒中重构的GFP-GLUT5的产量形成对照。

3.结果

图8所示的结果表明，增加鞘脂激活蛋白A的量提高了重构成文库的Salipro颗粒的GFP-GLUT5的量。

为了量化重构产量，将来自“产量对照样品”的GFP-GLUT5峰值的百分比与重构样品的峰值进行比较。结果表明，对于12μl SapA样品有36％的GFP-GLUT5进行重构，对于20μlSapA样品有57％进行重构，对于30μl SapA样品有65％进行重构，对于40μl SapA样品有74％进行重构。总而言之，这表明随着鞘脂激活蛋白量的增加，可以提高Salipro颗粒对于来自粗制膜的膜蛋白的纳入率。

实施例3：

分析了文库中Salipro膜蛋白成分的溶解度

1.背景

粗制膜包含多种不同的膜蛋白。在根据本发明的方法中，不仅将荧光标记的GFP-GLUT5，而且将来自粗制膜的各种其他酵母菌膜蛋白纳入Salipro颗粒中。在不存在去垢剂的情况中，膜蛋白部分不溶并且在无去垢剂的缓冲液系统中聚集，导致在SEC分析中形成大的无效峰。然而，当嵌入Salipro颗粒中时，可显示出Salipro颗粒文库中存在的膜蛋白仍然可溶于无去垢剂的缓冲液系统。

2.设置

在与实施例1a相同的实验设置中，这里基于280nm处的UV吸收而不是GFP荧光来分析SEC信号，无效峰的焦点(激增)表示聚集的膜蛋白。

3.结果

如SEC分析中在大约4分钟时出现的大的无效峰所示(参见图9，0μl SapA)，在不存在鞘脂激活蛋白的情况中，来自粗制膜的膜蛋白在无去垢剂的缓冲液系统中聚集。

相反地，通过增加添加到裂解物中的鞘脂激活蛋白的量，聚集的膜蛋白的量相应地减少。这表明由于膜蛋白被纳入所得的膜蛋白质组文库的Salipro颗粒中，从而使其保持可溶。应注意，在含有最高量的鞘脂激活蛋白的样品中，几乎没有检测到蛋白质聚集(图9，40μl SapA)。

总之，该数据表明，在进行本发明的方法后，由于成功重构成相应的Salipro纳米颗粒文库，从而使得来自粗制膜囊泡的所有膜蛋白在无去垢剂的环境中去除去垢剂后仍保持可溶。因此，可以产生来源于粗制膜的颗粒Salipro-膜蛋白/蛋白质组和/或膜脂质/脂质组文库。

实施例4：

分析了文库中Salipro膜脂质成分的溶解度

1.设置

在与实施例1a相同的实验设置中，进行了不同的SEC分析(注意图9和10中的轴标度和轴截距的差异)，峰的焦点(激增)来源于单体鞘脂激活蛋白和仅含脂质的Salipro颗粒的峰。

2.结果

图10所示的结果表明，将鞘脂激活蛋白A添加到粗制膜中不仅引起含有膜蛋白的Salipro颗粒的形成，而且引起仅含脂质(即“空的”)Salipro颗粒的形成。鞘脂激活蛋白(5μl、10μl、20μl、30μl和40μl)的量增加也会使仅含脂质的Salipro颗粒的形成增加。SEC分析显示来源于仅含脂质的Salipro颗粒的峰在7.6分钟(图示)，而单体鞘脂激活蛋白相应的峰(“游离的鞘脂激活蛋白”)出现在8.2分钟(图示)。该数据表明来自粗制膜囊泡的脂质能够在中性pH下形成仅含脂质的Salipro颗粒。

作为阴性对照，在不存在鞘脂激活蛋白的情况中(0μl SapA)分析一个样品。

使用量增加的鞘脂激活蛋白的该实验在Superose 6 5/150柱(GE Healthcare公司)上进行。由于两个鞘脂激活蛋白相关峰的SEC分离没有很好地分离，因此使用Superdex200 5/150柱(GE Healthcare公司)重复实验(图11)。

完全如实施例2所述制备一个样品用于“12μl SapA”样品(在图11中称为“Sap+粗制膜”)。这次，使用280nm处的UV吸光度进行SEC分析。作为第一对照，一个样品仅含有鞘脂激活蛋白A，以指示无脂质的单体鞘脂激活蛋白在SEC曲线中的位置。第二对照样品含有通过WO 2014/095576 A1中描述的方法(即通过将鞘脂激活蛋白A与纯化的脂质一起孵育)获得的鞘脂激活蛋白A颗粒。

本文提供的数据清楚地表明，细胞膜脂质组以及蛋白质组都可以纳入Salipro颗粒中以形成相应的文库。

实施例5：

在该实施例中，如上述实施例中所述制备Salipro颗粒文库，但是，仅使用不含去垢剂的HN缓冲液。该实验还实现了将来自粗制膜的GFP-GLUT5成功地纳入可溶的Salipro颗粒中。

实施例6：从文库中纯化出特定的鞘脂激活蛋白颗粒

在该实施例中，制备了根据实施例3获得的膜蛋白文库。文库Salipro颗粒实质上覆盖了整个酵母菌膜蛋白质组，并且还包括含有GFP-GLUT5的Salipro颗粒。后一种颗粒通过GFP-Glut5构建体中存在的TEV可剪切的GFP-His8标签进行纯化。

根据制造商的说明书对文库进行Ni-NTA亲和纯化(例如，Qiagen)。在规定的洗涤步骤后，通过TEV蛋白酶剪切或咪唑对含有GFP-GLUT5的Salipro颗粒进行洗脱。

SEQUENCE LISTING

<110> Frauenfeld, Jens

<120> Salipro颗粒

<130> 161605WO

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp

1 5 10 15

Met Leu Lys Asp Asn Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu

20 25 30

Lys Thr Cys Asp Trp Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys

35 40 45

Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly

50 55 60

Glu Met Ser Arg Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu

65 70 75 80

Ser

<210> 2

<211> 79

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile Gln Thr

1 5 10 15

Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu His Val

20 25 30

Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile Cys Lys

35 40 45

Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met Met His

50 55 60

Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp Glu

65 70 75

<210> 3

<211> 80

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys

1 5 10 15

Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp

20 25 30

Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu

35 40 45

Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu

50 55 60

Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met Leu His Leu Cys Ser Gly Thr

65 70 75 80

<210> 4

<211> 78

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Gly Tyr Leu Asp Arg Asn

1 5 10 15

Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu Lys

20 25 30

Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln Lys Gln Cys Asp Gln Phe

35 40 45

Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu Ile Leu Val Glu Val Met

50 55 60

Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly Ala Cys Pro Ser

65 70 75

<210> 5

<211> 145

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Ala Thr Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Gly Asn

1 5 10 15

Pro Gly Leu Val Phe Ser Arg Leu Ser Pro Glu Tyr Tyr Asp Leu Ala

20 25 30

Arg Ala His Leu Arg Asp Glu Glu Lys Ser Cys Pro Cys Leu Ala Gln

35 40 45

Glu Gly Pro Gln Gly Asp Leu Leu Thr Lys Thr Gln Glu Leu Gly Arg

50 55 60

Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys Met Val

65 70 75 80

Asp Lys Pro Thr Gln Arg Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg Val Cys

85 90 95

Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe Met Arg

100 105 110

Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu Thr Ala

115 120 125

Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg Leu Cys Ile Pro Ser Thr Gly Pro

130 135 140

Leu

145

<210> 6

<211> 129

<212> PRT

<213> 野猪（Sus scrofa）

<400> 6

Pro Gly Leu Ala Phe Ser Gly Leu Thr Pro Glu His Ser Ala Leu Ala

1 5 10 15

Arg Ala His Pro Cys Asp Gly Glu Gln Phe Cys Gln Asn Leu Ala Pro

20 25 30

Glu Asp Pro Gln Gly Asp Gln Leu Leu Gln Arg Glu Glu Leu Gly Leu

35 40 45

Ile Cys Glu Ser Cys Arg Lys Ile Ile Gln Lys Leu Glu Asp Met Val

50 55 60

Gly Pro Gln Pro Asn Glu Asp Thr Val Thr Gln Ala Ala Ser Arg Val

65 70 75 80

Cys Asp Lys Met Lys Ile Leu Arg Gly Val Cys Lys Lys Ile Met Arg

85 90 95

Thr Phe Leu Arg Arg Ile Ser Lys Asp Ile Leu Thr Gly Lys Lys Pro

100 105 110

Gln Ala Ile Cys Val Asp Ile Lys Ile Cys Lys Glu Lys Thr Gly Leu

115 120 125

Ile

<210> 7

<211> 77

<212> PRT

<213> 溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）

<400> 7

Ile Pro Val Leu Cys Pro Val Cys Thr Ser Leu Val Gly Lys Leu Ile

1 5 10 15

Asp Leu Val Leu Gly Gly Ala Val Asp Lys Val Thr Asp Tyr Leu Glu

20 25 30

Thr Leu Cys Ala Lys Ala Asp Gly Leu Val Glu Thr Leu Cys Thr Lys

35 40 45

Ile Val Ser Tyr Gly Ile Asp Lys Leu Ile Glu Lys Ile Leu Glu Gly

50 55 60

Gly Ser Ala Lys Leu Ile Cys Gly Leu Ile His Ala Cys

65 70 75

<210> 8

<211> 75

<212> PRT

<213> 迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar）

<400> 8

Val Val Cys Pro Val Cys Thr Ser Leu Val Gly Lys Leu Ile Asp Phe

1 5 10 15

Val Ile Gly Gly Ala Val Asp Lys Ala Thr Asp Tyr Leu Glu Thr Leu

20 25 30

Cys Ala Lys Ala Asp Gly Val Ile Glu Thr Val Cys Ser Lys Ile Val

35 40 45

Ser Tyr Gly Ile Asp Lys Leu Ile Glu Lys Ile Ile Glu Gly Gly Ser

50 55 60

Ala Lys Leu Ile Cys Gly Leu Ile His Ala Cys

65 70 75

<210> 9

<211> 77

<212> PRT

<213> 溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）

<400> 9

Gly Ala Ile Leu Cys Asn Leu Cys Lys Asp Thr Val Lys Leu Val Glu

1 5 10 15

Asn Leu Leu Thr Val Asp Gly Ala Gln Ala Val Arg Gln Tyr Ile Asp

20 25 30

Asn Leu Cys Gly Lys Ala Ser Gly Phe Leu Gly Thr Leu Cys Glu Lys

35 40 45

Ile Leu Ser Phe Gly Val Asp Glu Leu Val Lys Leu Ile Glu Asn His

50 55 60

Val Asp Pro Val Val Val Cys Glu Lys Ile His Ala Cys

65 70 75

<210> 10

<211> 75

<212> PRT

<213> 迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar）

<400> 10

Gly Leu Cys Asn Leu Cys Lys Asp Thr Val Asn Leu Ile Glu Asn Leu

1 5 10 15

Leu Thr Val Asp Gly Ala Gln Ala Val Arg Gln Tyr Ile Asp Asn Leu

20 25 30

Cys Ala Lys Ala Asp Gly Phe Leu Gly Thr Leu Cys Asn Lys Ile Leu

35 40 45

Ser Phe Gly Val Asp Glu Leu Val Lys Leu Ile Glu Asn His Val Asp

50 55 60

Pro Val Val Ile Cys Glu Lys Ile His Ala Cys

65 70 75

<210> 11

<211> 77

<212> PRT

<213> 溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）

<400> 11

Gly Glu Ile Leu Cys Asn Leu Cys Thr Gly Leu Ile Asn Thr Leu Glu

1 5 10 15

Asn Leu Leu Thr Thr Lys Gly Ala Asp Lys Val Lys Asp Tyr Ile Ser

20 25 30

Ser Leu Cys Asn Lys Ala Ser Gly Phe Ile Ala Thr Leu Cys Thr Lys

35 40 45

Val Leu Asp Phe Gly Ile Asp Lys Leu Ile Gln Leu Ile Glu Asp Lys

50 55 60

Val Asp Ala Asn Ala Ile Cys Ala Lys Ile His Ala Cys

65 70 75

<210> 12

<211> 75

<212> PRT

<213> 迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar）

<400> 12

Ile Val Cys Asn Leu Cys Thr Gly Leu Ile Asn Thr Leu Glu Asn Leu

1 5 10 15

Leu Thr Thr Lys Gly Ala Asp Lys Val Lys Asp Tyr Ile Asp Ser Leu

20 25 30

Cys Asn Lys Ala Ser Gly Phe Ile Ala Thr Leu Cys Thr Lys Val Leu

35 40 45

Asp Phe Gly Val Asp Lys Leu Ile Gln Leu Ile Glu Asp Lys Val Asp

50 55 60

Ala Asn Ala Ile Cys Ala Lys Ile His Ala Cys

65 70 75

<210> 13

<211> 83

<212> PRT

<213> 野猪（Sus scrofa）

<400> 13

Gly Leu Ile Cys Glu Ser Cys Arg Lys Ile Ile Gln Lys Leu Glu Asp

1 5 10 15

Met Val Gly Pro Gln Pro Asn Glu Asp Thr Val Thr Gln Ala Ala Ser

20 25 30

Arg Val Cys Asp Lys Met Lys Ile Leu Arg Gly Val Cys Lys Lys Ile

35 40 45

Met Arg Thr Phe Leu Arg Arg Ile Ser Lys Asp Ile Leu Thr Gly Lys

50 55 60

Lys Pro Gln Ala Ile Cys Val Asp Ile Lys Ile Cys Lys Glu Lys Thr

65 70 75 80

Gly Leu Ile

<210> 14

<211> 78

<212> PRT

<213> 野猪（Sus scrofa）

<400> 14

Gly Tyr Phe Cys Glu Ser Cys Arg Lys Ile Ile Gln Lys Leu Glu Asp

1 5 10 15

Met Val Gly Pro Gln Pro Asn Glu Asp Thr Val Thr Gln Ala Ala Ser

20 25 30

Gln Val Cys Asp Lys Leu Lys Ile Leu Arg Gly Leu Cys Lys Lys Ile

35 40 45

Met Arg Ser Phe Leu Arg Arg Ile Ser Trp Asp Ile Leu Thr Gly Lys

50 55 60

Lys Pro Gln Ala Ile Cys Val Asp Ile Lys Ile Cys Lys Glu

65 70 75

<210> 15

<211> 83

<212> PRT

<213> 马（Equus caballus）

<400> 15

Gly Ile Ala Cys Trp Ser Cys Arg Lys Ile Leu Gln Lys Leu Glu Asp

1 5 10 15

Leu Val Gly Glu Gln Pro Asn Glu Ala Thr Ile Asn Glu Ala Ala Ser

20 25 30

Arg Val Cys Arg Asn Leu Gly Leu Leu Arg Gly Ala Cys Lys Lys Ile

35 40 45

Met Arg Thr Cys Leu Arg Leu Ile Ser Arg Asp Ile Leu Ala Gly Lys

50 55 60

Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Asp Ile Lys Leu Cys Lys His Lys Ala

65 70 75 80

Gly Leu Ile

<210> 16

<211> 84

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 16

Gly Leu Leu Cys Gly Ser Cys Gln Arg Ile Ile Gln His Leu Met Asp

1 5 10 15

Lys Leu Gly Asp Gln Pro Asp Glu Asn Thr Val Ile Glu Ala Ala Ser

20 25 30

Lys Val Cys Gly Lys Met Gly Pro Leu Lys Gly Leu Cys Lys Ser Ile

35 40 45

Thr Lys Arg Phe Leu Arg Arg Ile Ala Ala Asp Ile Thr Ala Gly Lys

50 55 60

Thr Ser Arg Val Val Cys Glu Asp Ile Lys Met Cys Lys Ser Lys Pro

65 70 75 80

Val Gly Phe Ile

<210> 17

<211> 81

<212> PRT

<213> 肝片吸虫（Fasciola hepatica）

<400> 17

Glu Glu Pro His Leu Asp Ile Ser Leu Cys Glu Ser Cys Thr Asn Thr

1 5 10 15

Val Asn Leu Val Lys Arg Leu Leu Gln Asn Ser Val Val Glu Thr His

20 25 30

Ile Arg Tyr Leu Val Lys Tyr Leu Cys Lys Gly Ala Gly Ser Ser Gln

35 40 45

Asp Ala Cys Ile Lys Phe Ile Gln Tyr Glu Val Asp Gly Ala Val Gly

50 55 60

Tyr Leu Ile Gln His Asn Ala Thr Asp Ile Cys His Val Ile Arg Leu

65 70 75 80

Cys

<210> 18

<211> 83

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 18

Gly Arg Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys

1 5 10 15

Met Val Asp Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg

20 25 30

Val Cys Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe

35 40 45

Met Arg Arg Tyr Gln Ser Arg Val Ile Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu

50 55 60

Thr Ala Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg Leu Cys Ile Pro Ser Thr

65 70 75 80

Gly Pro Leu

<210> 19

<211> 83

<212> PRT

<213> 福氏耐格里阿米巴（Naegleria fowleri）

<400> 19

Ser Gly Ile Cys Asn Met Cys Gln Leu Leu Val Thr Gln Val Glu Asn

1 5 10 15

Trp Val Glu Ser Asn Asp Thr Ile Met Thr Leu Glu Lys Lys Leu Glu

20 25 30

Gln Val Cys Ser Val Ile Pro Gly Gln Tyr Ser Ala Leu Cys Thr Tyr

35 40 45

Ala Val Glu Gln Tyr Leu Pro Ile Phe Ile His Gln Val Glu Lys Gln

50 55 60

Phe Pro Ala Leu Thr Ile Cys Gln Asp Val His Leu Cys Ser Ser Ala

65 70 75 80

Gln Ala Ala

<210> 20

<211> 73

<212> PRT

<213> 华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）

<400> 20

Cys Lys His Cys Lys Thr Leu Val Gly Arg Ile Gln Asp Cys Trp Gln

1 5 10 15

Lys Gly Arg Ala Lys Ser Phe Val Glu Lys Thr Leu Ile Phe Leu Cys

20 25 30

Lys Leu Thr Gly His Ser Glu Glu Gln Cys Thr Glu His Ala Glu Glu

35 40 45

Phe Met Lys His Leu Asp Asp Trp Ile Thr Gly Lys Thr Pro Glu Glu

50 55 60

Leu Cys Arg Ser Leu His Met Cys Lys

65 70

<210> 21

<211> 83

<212> PRT

<213> 福氏耐格里阿米巴（Naegleria fowleri）

<400> 21

Pro Ser Glu Phe Cys Asp Val Cys Lys Tyr Ala Val Gln Gln Val Asp

1 5 10 15

Gln Leu Ala Leu Gln Asn Glu Ala Ala Ile Gln Asn Ala Leu Leu Ala

20 25 30

Ala Cys Gln Gln Leu Gly Asp Asn Gln Phe Gly Lys Ile Cys Asn Thr

35 40 45

Val Val Leu Val Tyr Gly Asn Glu Leu Val Asn Ala Leu Val Thr Tyr

50 55 60

Glu Asn Pro Thr Arg Val Cys Ser Glu Gln Leu Pro Leu Cys Pro Lys

65 70 75 80

Asn Asn Thr

<210> 22

<211> 88

<212> PRT

<213> 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）

<400> 22

Asn Pro Ala Asn Pro Leu Asn Leu Lys Lys His His Gly Val Phe Cys

1 5 10 15

Asp Val Cys Lys Ala Leu Val Glu Gly Gly Glu Lys Val Gly Asp Asp

20 25 30

Asp Leu Asp Ala Trp Leu Asp Val Asn Ile Gly Thr Leu Cys Trp Thr

35 40 45

Met Leu Leu Pro Leu His His Glu Cys Glu Glu Glu Leu Lys Lys Val

50 55 60

Lys Lys Glu Leu Lys Lys Asp Ile Glu Asn Lys Asp Ser Pro Asp Lys

65 70 75 80

Ala Cys Lys Asp Val Asp Leu Cys

85

<210> 23

<211> 83

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 23

Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp

1 5 10 15

Met Leu Lys Asp Asn Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu

20 25 30

Lys Thr Cys Asp Trp Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys

35 40 45

Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly

50 55 60

Glu Met Ser Arg Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu

65 70 75 80

Ser Leu Gln

<210> 24

<211> 83

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 24

Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Asp Val Ile Thr Ala Ala Gly Asn

1 5 10 15

Leu Leu Lys Asp Asn Ala Thr Glu Gln Glu Ile Leu Met Tyr Leu Glu

20 25 30

Arg Thr Cys Asp Trp Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys

35 40 45

Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Met Ile Lys Gly

50 55 60

Gln Met Ser His Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu

65 70 75 80

Ser Leu Gln

<210> 25

<211> 83

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 25

Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Thr Val Val Thr Glu Ala Gly Asn

1 5 10 15

Leu Leu Lys Asp Asn Ala Thr Gln Glu Glu Ile Leu His Tyr Leu Glu

20 25 30

Lys Thr Cys Glu Trp Ile His Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ser Cys Lys

35 40 45

Glu Val Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Met Ile Lys Gly

50 55 60

Glu Met Ser Asn Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Gln

65 70 75 80

Ser Leu Gln

<210> 26

<211> 83

<212> PRT

<213> 原鸡（Gallus gallus）

<400> 26

Ser Ile Pro Cys Asp Leu Cys Lys Glu Leu Val Thr Val Val Gly Lys

1 5 10 15

Val Leu Lys Asp Asn Gly Thr Glu Asp Glu Ile Arg Ser Tyr Leu Glu

20 25 30

Lys Thr Cys Glu Phe Leu Pro Asp Gln Gly Leu Ala Ser Glu Cys Lys

35 40 45

Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Met Asp Met Ile Lys Glu

50 55 60

Glu Phe Asp Lys Pro Glu Val Val Cys Ser Ala Leu Ser Leu Cys Gln

65 70 75 80

Ser Leu Gln

<210> 27

<211> 83

<212> PRT

<213> 斑马鱼（Danio rerio）

<400> 27

Thr Val Pro Cys Asp Leu Cys Lys Glu Val Leu Val Val Val Glu Gln

1 5 10 15

Leu Leu Lys Asp Asn Val Thr Glu Ser Glu Leu Leu Gly Tyr Leu Glu

20 25 30

Lys Ala Cys Gln Leu Ile Pro Asp Glu Gly Leu Ala Asn Gln Cys Lys

35 40 45

Glu Ile Val Asp Asn Tyr Phe Pro Val Leu Met Gly Ile Ile Gln Gly

50 55 60

Glu Leu Asp Asp Pro Gly Val Val Cys Gly Ala Leu Gly Leu Cys Val

65 70 75 80

Ser Gln Gln

<210> 28

<211> 83

<212> PRT

<213> 非洲爪蟾（Xenopus laevis）

<400> 28

Ser Met Pro Cys Asp Phe Cys Lys Glu Val Val Thr Val Leu Gly Asn

1 5 10 15

Tyr Leu Lys Asp Asn Ile Thr Gln Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Leu Asn

20 25 30

Lys Val Cys Asp Phe Ile Pro Asp Pro Gly Leu Ala Ser Thr Cys Lys

35 40 45

Gln Glu Val Ser Asp Tyr Phe Thr Ile Val Leu Asn Leu Leu Glu Gln

50 55 60

Glu Leu Ser Asn Pro Gly Val Leu Cys Ser Ser Leu Gly Leu Cys Thr

65 70 75 80

Ser Leu Gln

<210> 29

<211> 80

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 29

Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr Lys

1 5 10 15

Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp

20 25 30

Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu

35 40 45

Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu

50 55 60

Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met Leu His Leu Cys Ser Gly Thr

65 70 75 80

<210> 30

<211> 79

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 30

Asp Ile Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Val Val Lys Glu Val Ala Lys

1 5 10 15

Leu Ile Asp Asn Asn Arg Thr Glu Glu Glu Ile Leu His Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Val Cys Ser Lys Leu Pro Thr Ser Leu Ala Glu Gln Cys Gln Glu

35 40 45

Val Val Asp Thr Tyr Gly Arg Ser Ile Leu Ser Ile Leu Leu Asp Glu

50 55 60

Ala Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met Leu His Leu Cys Ser Ser

65 70 75

<210> 31

<211> 79

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 31

Val Ile Leu Cys Gln Thr Cys Gln Phe Val Met Asn Lys Phe Ser Glu

1 5 10 15

Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Gly Leu Ser

20 25 30

Asn Ala Cys Gly Val Leu Pro Asp Pro Ala Arg Thr Lys Cys Gln Glu

35 40 45

Val Val Gly Thr Phe Gly Pro Ser Leu Leu Asp Ile Phe Ile His Glu

50 55 60

Val Asn Pro Ser Ser Leu Cys Gly Val Ile Gly Leu Cys Ala Ala

65 70 75

<210> 32

<211> 80

<212> PRT

<213> 原鸡（Gallus gallus）

<400> 32

Phe Ser Val Cys Glu Ile Cys Glu Thr Met Val Lys Glu Val Thr Gly

1 5 10 15

Leu Leu Glu Ser Asn Lys Thr Glu Glu Glu Ile Val His Glu Met Glu

20 25 30

Val Val Cys Tyr Leu Leu Pro Ala Ser Val Lys Asp Gln Cys Lys Asp

35 40 45

Phe Ile Glu Val Tyr Gly Gln Ala Leu Ile Asp Met Leu Leu Glu Ala

50 55 60

Thr Asn Pro Glu Ala Val Cys Val Met Leu Lys Cys Cys Ala Ala Asn

65 70 75 80

<210> 33

<211> 79

<212> PRT

<213> 非洲爪蟾（Xenopus laevis）

<400> 33

Asn Val Leu Cys Glu Val Cys Glu Leu Met Val Ser Gln Leu Glu Lys

1 5 10 15

Leu Leu Asp Asn Asn Arg Thr Arg Glu Asn Ile Lys His Gly Leu Glu

20 25 30

Lys Val Cys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Tyr Thr Gln Lys Cys Glu Asp

35 40 45

Met Ile Glu Glu Tyr Ser Asp Ala Leu Ile Glu Leu Leu Glu Gln Glu

50 55 60

Ala Asn Pro Gln Ala Ile Cys Thr Ala Leu Gly Tyr Cys Ser Gly

65 70 75

<210> 34

<211> 79

<212> PRT

<213> 斑马鱼（Danio rerio）

<400> 34

Ser Pro Gln Cys Ala Ile Cys Glu Tyr Val Met Lys Glu Ile Glu Asn

1 5 10 15

Met Ile Gln Asp Gln Thr Ser Glu Ala Glu Ile Val Gln Ala Val Glu

20 25 30

Lys Val Cys Asn Ile Leu Pro Ser Thr Leu Thr Ala Gln Cys Lys Asp

35 40 45

Leu Ile Glu Thr Tyr Gly Gln Ala Ile Ile Asp Leu Leu Val Gln Glu

50 55 60

Ala Asp Pro Lys Thr Val Cys Ser Phe Leu Ala Leu Cys Ser Gly

65 70 75

<210> 35

<211> 81

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 35

Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Gly Tyr Leu Asp Arg

1 5 10 15

Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu

20 25 30

Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln Lys Gln Cys Asp Gln

35 40 45

Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu Ile Leu Val Glu Val

50 55 60

Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Ala

65 70 75 80

His

<210> 36

<211> 81

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 36

Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Gly Tyr Leu Asp Arg

1 5 10 15

Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Glu Gln Ile Leu Ala Ala Leu Glu

20 25 30

Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Gln Cys Asp Gln

35 40 45

Phe Val Thr Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu Ile Leu Val Glu Val

50 55 60

Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly Ala Cys Pro Ala Ala

65 70 75 80

His

<210> 37

<211> 81

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 37

Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Glu His

1 5 10 15

Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu

20 25 30

Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln Lys Gln Cys Asp Asp

35 40 45

Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Leu Leu Leu Glu Ile Leu Val Glu Val

50 55 60

Met Asp Pro Gly Phe Val Cys Ser Lys Ile Gly Val Cys Pro Ser Ala

65 70 75 80

Tyr

<210> 38

<211> 81

<212> PRT

<213> 原鸡（Gallus gallus）

<400> 38

Gly Gly Phe Cys Asp Ile Cys Lys Met Ile Val Ala Tyr Ala Asp Lys

1 5 10 15

Glu Leu Glu Lys Asn Ala Thr Thr Thr Glu Ile Glu Ala Leu Leu Glu

20 25 30

Lys Val Cys His Phe Leu Pro Glu Ser Val Ser Asp Gln Cys Val Gln

35 40 45

Phe Val Glu Gln Tyr Glu Pro Val Val Val Gln Leu Leu Ala Glu Met

50 55 60

Met Asp Pro Thr Phe Val Cys Thr Lys Leu Gly Val Cys Gly Ala Ala

65 70 75 80

Lys

<210> 39

<211> 81

<212> PRT

<213> 斑马鱼（Danio rerio）

<400> 39

Gly Gly Phe Cys Asp Val Cys Lys Met Ala Val Arg Tyr Val Asp Gly

1 5 10 15

Ile Leu Glu Gln Asn Ala Thr Gln Ser Glu Ile Glu Glu Ala Val Leu

20 25 30

Lys Val Cys Ser Phe Leu Pro Asp Ala Val Lys Asp Glu Cys Asn Gln

35 40 45

Leu Ile Glu Gln Tyr Glu Pro Leu Leu Val Gln Leu Leu Leu Gln Thr

50 55 60

Leu Asp Pro Asp Phe Val Cys Met Lys Leu Gly Ala Cys Pro Glu Ala

65 70 75 80

Val

<210> 40

<211> 81

<212> PRT

<213> 非洲爪蟾（Xenopus laevis）

<400> 40

Gly Asp Tyr Cys Ala Val Cys Lys Met Leu Met Arg Tyr Val Asp Glu

1 5 10 15

Leu Leu Glu Lys Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ile Lys Ala Phe Leu Gly

20 25 30

Arg Ile Cys Asn Phe Leu Pro Asp Ser Met Gln Asn Glu Cys Ser Ala

35 40 45

Leu Val Asn Glu Tyr Glu Pro Leu Phe Ile Gln Leu Leu Leu Glu Ala

50 55 60

Leu Asp Pro Ser Phe Ile Cys Ile Lys Val Asn Leu Cys Gln Asn Lys

65 70 75 80

Lys

<210> 41

<211> 79

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 41

Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile Gln Thr

1 5 10 15

Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu His Val

20 25 30

Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile Cys Lys

35 40 45

Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met Met His

50 55 60

Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp Glu

65 70 75

<210> 42

<211> 79

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 42

Gly Asn Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Leu Val Thr Asp Val Gln Glu

1 5 10 15

Ala Leu Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Glu Ala Leu Val Asp His Ala

20 25 30

Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ser Asp Met Cys Lys

35 40 45

Asn Tyr Ile Asn Gln Tyr Ser Glu Val Ala Ile Gln Met Val Met His

50 55 60

Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Val Leu Ala Gly Phe Cys Asp Glu

65 70 75

<210> 43

<211> 83

<212> PRT

<213> 原鸡（Gallus gallus）

<400> 43

Glu Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Arg Leu Val Thr Asp Val Gln Glu

1 5 10 15

Ala Val Arg Thr Asn Ala Thr Phe Val Lys Ser Leu Val Ala His Ala

20 25 30

Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ser Asp Met Cys Lys

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Glu Tyr Ser Asp Leu Ala Ile Gln Met Met Met His

50 55 60

Met Lys Asp Gln Gln Pro Lys Asp Ile Cys Ala Met Val Gly Phe Cys

65 70 75 80

Pro Ser Val

<210> 44

<211> 83

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 44

Glu Asp Val Cys Gln Asp Cys Met Lys Leu Val Ser Asp Val Gln Thr

1 5 10 15

Ala Val Lys Thr Asn Ser Ser Phe Ile Gln Gly Phe Val Asp His Val

20 25 30

Lys Glu Asp Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Val Ser Asp Ile Cys Lys

35 40 45

Asn Tyr Val Asp Gln Tyr Ser Glu Val Cys Val Gln Met Leu Met His

50 55 60

Met Gln Asp Gln Gln Pro Lys Glu Ile Cys Val Leu Ala Gly Phe Cys

65 70 75 80

Asn Glu Val

<210> 45

<211> 79

<212> PRT

<213> 斑马鱼（Danio rerio）

<400> 45

Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Val Thr Phe Ile Ser Asp Thr Gln Asp

1 5 10 15

Glu Ala Arg Val Asn Ser Ser Phe Ile Asn Thr Leu Ile Ala Gln Val

20 25 30

Glu Asn Gln Cys Glu Leu Leu Gly Pro Gly Met Ser Asp Met Cys Lys

35 40 45

Glu Tyr Ile Ser Gln Tyr Gly Pro Leu Val Phe Gln Gln Leu Met Ser

50 55 60

Met Gln Pro Lys Asp Ile Cys Ala Arg Ala Gly Phe Cys Pro Thr

65 70 75

<210> 46

<211> 79

<212> PRT

<213> 非洲爪蟾（Xenopus laevis）

<400> 46

Gly Asp Ile Cys Asn Asp Cys Thr Lys Leu Val Ser Asp Val Gln Asp

1 5 10 15

Ala Leu Arg Ser Asn Ser Ser Phe Ser Lys Lys Leu Val Asp His Phe

20 25 30

Leu Gln Glu Cys Asn Leu Leu Asp Pro Ala Ile Ala Glu Met Cys Lys

35 40 45

Ser Tyr Ile Asn Gln Tyr Ser Asp Ile Ala Ile Gln Val Leu Leu Gln

50 55 60

Met Gln Pro Lys Gln Leu Cys Gly Met Ala Gly Phe Cys Asp Gln

65 70 75

Claims (15)

1.一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡的混合物；

b)在液体环境中使步骤a)的所述混合物与所述脂质结合多肽相接触；

c)进行所述颗粒的自组装。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述粗制膜囊泡是通过以下步骤中的至少一个步骤或全部步骤制备的：

a.1)提供细胞和/或细胞器；

a.2)使所述细胞和/或所述细胞器裂解或破裂；

a.3)得到粗制膜部分；以及

a.4)由步骤a.3)中得到的所述粗制膜部分制备粗制膜囊泡。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法在步骤a)和步骤b)之间还包括以下步骤：

b.1)在液体环境中使所述粗制膜囊泡与去垢剂相接触；其中，然后在步骤b)中，使步骤b.1)中得到的混合物在步骤c)中与脂质结合多肽相接触和/或

其中步骤b)在去垢剂的存在下进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述去垢剂选自由下列组成的组：烷基苯磺酸盐或胆汁酸、阳离子去垢剂和非离子去垢剂或两性离子去垢剂如十二烷基-二甲胺-氧化物(LDAO)、Fos-胆碱、CHAPS/CHAPSO、烷基糖苷如短、中链或长链烷基麦芽糖苷、特别是正十二烷基β-D-麦芽糖苷、葡糖苷、麦芽糖-新戊二醇(MNG)两亲化合物、两亲性聚合物(amphipols)、基于苯酚和醛的羟烷基化产物的大环化合物或环状低聚物(杯芳烃)以及它们的混合物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中

i)所述颗粒为盘状，特别是其中所述颗粒为盘状并且不包含亲水或水性核心，

ii)所述颗粒的最大直径通常为2nm至200nm，特别是3nm至150nm，优选3nm至100nm；

ii)在如下pH下进行步骤c)中所述颗粒的自组装：2.0至10.0，特别是6.0至10.0，优选6.0至9.0，特别优选7.0至9.0，并且最优选7.0至8.0和/或

iii)其中所述方法在步骤c)中或作为后续步骤d)包括通过至少部分除去游离膜脂质、游离膜蛋白、游离脂质结合多肽、不溶性物质或聚集物质和/或去垢剂来进行所述颗粒的纯化，其中，任选地，通过下列方法进行所述纯化：色谱法，特别是尺寸排阻色谱；超速离心；透析；接触去垢剂结合型生物珠子；使用浓缩器；亲和纯化方法，包括但不限于色谱法、磁珠、免疫纯化和/或膜/过滤器，从而除去未结合的/未纳入的脂质和/或疏水性化合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述脂质结合蛋白是鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D或其衍生物或截短形式，并且其中，任选地，SAPLIP的衍生物形式选自

i)与SEQ ID NO.1、2、3、4、5或6的全长序列具有至少80％序列同一性的蛋白质；

ii)与SEQ ID NO.1、2、3、4、5或6的全长序列具有至少40％序列同一性的蛋白质，其中所述蛋白质是两亲性的，形成至少一个α螺旋，并且当用于所述方法时能够与溶解的脂质一起自组装成脂蛋白颗粒；以及

iii)包含SEQ ID NO.1、2、3、4、5或6的序列的蛋白质，所述序列中有1至40个氨基酸缺失、添加、插入和/或替换。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述颗粒实质上由下列物质组成：至少一种所述脂质结合多肽和所述细胞膜或细胞器膜的成分，特别是源自步骤a)中所述的细胞膜或细胞器膜的膜脂质和/或膜蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中

i)所述颗粒包含源自步骤a)中所述的细胞膜或细胞器膜的膜脂质，其中所述膜脂质任选地选自由磷脂、糖脂、胆固醇以及它们的混合物组成的组，和/或其中

ii)所述颗粒的至少一部分包含源自步骤a)中所述的细胞膜或细胞器膜的膜蛋白，并且其中所述膜蛋白任选地选自由整合跨膜蛋白、单向整合膜蛋白、外周膜蛋白、脂质结合状态的双向性蛋白、脂质锚定蛋白、具有融合的疏水性跨膜结构域的嵌合蛋白以及它们的混合物组成的组。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞膜是古细菌、真核生物或原核生物的细胞膜。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中除了所述粗制膜囊泡的成分之外，该方法中不添加另外的脂质。

11.一种制备纯化的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法，其包括根据权利要求1至10中任一项所述的方法制备文库的步骤以及以下附加步骤：

f)从所述文库中纯化出至少一种类型的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，其中，任选地，通过亲和纯化进行步骤f)中的至少一种类型的颗粒的所述纯化，所述亲和纯化包括但不限于亲和色谱法和/或免疫纯化，特别是通过在待纯化的所述颗粒中存在的膜蛋白上使用抗原或标签；和/或其中，任选地，通过下列方法进行所述纯化：色谱法，特别是尺寸排阻色谱；超速离心；透析；接触去垢剂结合型生物珠子；或使用浓缩器。

12.一种鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库，其能够根据权利要求1至10中任一项所述的方法得到，其中所述颗粒在它们的脂质和/或蛋白质组成方面不同，优选在其蛋白质组成方面不同，特别优选在其膜蛋白组成方面不同。

13.一种鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，其能够通过权利要求11所述的方法得到。

14.根据权利要求12所述的颗粒文库或根据权利要求13所述的颗粒在医药中的用途，特别是在预防、治疗疾病或减轻疾病的严重程度中的用途，或在诊断方法、美容处理中的用途或作为疫苗接种制剂的用途。

15.根据权利要求12所述的颗粒文库或根据权利要求13所述的颗粒作为以下方面的工具的用途：药物研发、药物筛选、药物探索、抗体研发、治疗性生物制剂研发；膜或膜蛋白纯化；膜蛋白表达；膜和/或膜蛋白研究，特别是脂质组学和蛋白质组学，优选膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或蛋白质组数据库。