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CN109633179A - 一种人体口腔液免疫球蛋白总含量的简捷检测方法 - Google Patents

一种人体口腔液免疫球蛋白总含量的简捷检测方法 Download PDF

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CN109633179A CN201910106405.6A CN201910106405A CN109633179A CN 109633179 A CN109633179 A CN 109633179A CN 201910106405 A CN201910106405 A CN 201910106405A CN 109633179 A CN109633179 A CN 109633179A
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tube
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姜二晨
朱明亮
金志刚
赵铁军
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Jinhua Ankou Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种基于免疫层析胶体金技术的人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量简便快捷检测方法。本发明使用口腔液的定向采集管，根据检测抗体的不同包埋量递增设置数条检测线的胶体金检测试纸，联合应用基于口腔液免疫球蛋白特性的标准比色卡，实现对口腔液免疫球蛋白总含量的半定量检测。本发明针对人体口腔液的特点和个体差异，改进了样品采集和处理，使得免疫层析胶体金技术适合用于口腔液免疫球蛋白检测，提高了人体口腔液免疫球蛋白检测的准确度和灵敏性。与现有技术相比，本发明取样便捷合理，检测准确且能进行半定量，携带方便，操作简便快捷，不需要借助其它仪器设备，适合不具备专业医护知识的人群使用。

Description

一种人体口腔液免疫球蛋白总含量的简捷检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种人体口腔液中免疫球蛋白总含量的检测方法，包括人体口腔液的采集、处理和试纸检测等步骤。
背景技术
人体口腔液(Oral fluids)，是唾液(Saliva)和口腔粘膜渗出液(Oral mucosaltransudate,or gingival crevicular fluid)的混合液体，是机体抵御病原微生物感染的第一道防线。唾液主要由口腔内三对大唾液腺分泌，其中70％唾液由下颌下腺(Submandibular gland)分泌，25％唾液由腮腺(Parotids)分泌，5％唾液由舌下腺(Sublingual gland)分泌。人体唾液富含多种蛋白质，主要包括α-淀粉酶、白蛋白、分泌型免疫球蛋白A (SIgA，二聚体)、溶菌酶、乳铁蛋白和过氧化物酶等，其中大多数蛋白都参与机体防御，负责抵抗或中和侵入口腔的细菌、病毒等微生物。口腔粘膜渗出液或龈沟液是指牙龈结缔组织中富含的毛细血管渗入到龈沟内的液体，其成分主要来源于血清，因此其蛋白成分与血清类似，主要包括白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA，非分泌型单体)和免疫球蛋白M(IgM)等。唾液来源和口腔粘膜渗出液来源的免疫球蛋白共同参与口腔防御，实现特异性抗致病菌的功能。因此，人体口腔液中免疫球蛋白的总含量，可以反映人体口腔内的免疫力以及炎症水平。
口腔也是人体消化系统的起始通道，且与呼吸系统相通，一些消化系统和呼吸系统疾病也往往引起或体现在口腔液某些蛋白组分的变化。近年来，越来越多的研究表明，人体口腔液或口腔粘膜渗出液中某些血清来源的的特定蛋白，可以作为全身系统性疾病的早期诊断分子。
如果口腔液各类免疫球蛋白工作正常，口腔具有很强的局部抗感染能力，病原体就难以侵入口腔、消化系统和呼吸系统并引起感染。相反，如果口腔液免疫球蛋白总量不足(特别是周围黏膜的浆细胞合成和分泌的SIgA不足)就会导致口腔局部抗感染水平低下，病原体易侵入口腔、消化系统和呼吸系统并引起感染。研究表明，慢性感染(如口腔溃疡和慢性肠炎)的早期，往往伴随着口腔液免疫球蛋白的不足；而在感染的恢复期，由于消化道和呼吸道黏膜下浆细胞受抗原刺激后，合成和分泌的免疫球蛋白(抗体)经共同黏膜系统从口腔液中分泌出来，口腔液免疫球蛋白也会增加且具有特异性。因此，口腔液免疫球蛋白的过低或过高，可能都与慢性感染疾病或者感染的发展阶段密切相关。人体的健康需要或体现在口腔液免疫球蛋白总量稳定维持在相对狭窄的某个区间。因此，医学检测技术领域，亟需一种能够针对人体口腔液的特点，能够快速简便的检测人体口腔液免疫球蛋白总含量的检测方法，并且该方法的操作不需要操作者具备专业医护知识和专业仪器设备，从而能够推广至并适用于更广的人群。
口腔溃疡，又称为“上火”，是表现在口腔粘膜上且以浅表性溃疡为特征的涉及消化系统的亚健康状态。据调查研究，以口腔溃疡为特征的“易上火”体质人群，是消化系统疾病发生前兆的较典型的亚健康表现；以口腔溃疡为特征的“易上火”，通常为亚健康体质的人 (如老年人)唾液缺乏抵御病菌侵袭的免疫球蛋白及乳铁蛋白等。口腔溃疡是口腔黏膜疾病中发病率最高的一种疾病，该病具有周期性和复发性等特点，虽然经过7-10天左右患者溃疡可逐渐自愈，但经长短不一的间歇期后又可复发，患者甚为痛苦，久治不愈的复发性口腔溃疡甚至有进一步恶化成口腔癌的可能。因此，医学检测技术领域亟需一种能直接或间接反映口腔溃疡发生前期或早期的生理指标及其检测方法，该生理指标的缺陷可作为口腔溃疡频发或发生前期的直接或间接的依据和预警，从而可以进行人为的预防和早期治疗，减少口腔溃疡甚至口腔癌发生的风险。
目前人体口腔液(包括唾液)中的分泌型免疫球蛋白的常用检测方法有酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫比浊法和侧向层析法。其中ELISA检测灵敏度高，特异性好，但检测费用高，操作繁琐耗时长，需要相应的仪器设备和专业知识；免疫比浊法简单快速，可自动化，但同样需要相应的仪器设备；以乳胶微粒或胶体金为固相载体的传统侧向层析法简便快速、检测费用低，但只能定性不能定量，且未能有效针对口腔液黏度大、免疫球蛋白含量高的特点进行改进。
此外，人体口腔液较之血液和尿液更加粘稠，且不同受试者黏度不均一，并且缺少定向采集口腔液的装置，使得口腔液中免疫球蛋白总含量的检测难以实现。
发明内容
本发明的技术针对现有技术存在的缺陷，提供了一种既能够对口腔液免疫球蛋白总含量进行半定量，同时又不需要借助其它仪器设备以及操作者专业医护知识的快速检测方法。
本发明具体技术方案如下：
一种测定人体口腔液免疫球蛋白总含量的方法，以人体口腔液为检测样本，对免疫球蛋白总含量进行检测，所述免疫球蛋白选自IgA、IgG和IgM中的一种或几种。
优选的，所述免疫球蛋白选自IgA、IgG和IgM。
本发明所述人体口腔液选自人体口腔粘膜渗出液以及总唾液两者的混合物、人体口腔粘膜渗出液、人体唾液腺分泌的总唾液、人体下颌下腺分泌的唾液、人体腮腺分泌的唾液或人体舌下腺分泌的唾液。
本发明另一目的在于提供一种测定人体口腔液免疫球蛋白总含量的装置，包括人体口腔液采集管、口腔液处理瓶、胶体金检测试纸，
所述人体口腔液采集管包括富集管和引流管，引流管管径小于富集管管径，富集管和引流管通过漏斗状连接管连接，富集管管口直径较大，适合将采集管伸入口腔内采集口腔液至管中，引流管管口直径较小，适合已采集好的口腔液缓慢流出，使口腔液流入口腔液处理瓶的量更为可控。
优选的，所述富集管直径为10-25mm，管长为30-75mm；引流管直径为1-3mm，管长为20-50mm。更优选，所述富集管直径为12mm，管长为40mm；引流管直径为2.5 mm，管长为25mm。
所述口腔液处理瓶包括瓶体和瓶盖，瓶盖顶端处有小孔。优选的，控制小孔的孔径，使其每次挤出的液滴为50μL。进一步的，所述口腔液处理瓶瓶盖端部罩还有可拆卸的保护罩，密闭小孔，防止瓶中的水或生理盐水蒸发损失。
优选的，所述采集管体和/或口腔液处理瓶上设有刻度，可以定量控制口腔液的采集量以及稀释倍数。
所述胶体金检测试纸的结合垫上喷涂有胶体金偶联的标记抗体，所述的标记抗体为抗人免疫球蛋白IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种的单克隆抗体；根据检测抗体的不同包埋量递增设置2-5个线状、环状、点状或其他任意形状的检测点，检测抗体为抗人免疫球蛋白IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的，所述胶体金检测试纸结合垫上标记抗体的结合量为10-25μg/mL，所述检测线包埋检测抗体的量为0.01-1μg。
优选的，所述胶体金检测试纸根据检测抗体的不同包埋量递增设置3条检测线T1、T2和T3，T1的包埋量为0.01-0.6μg，T2的包埋量比T1的包埋量多0.01-0.3μg，T3的包埋量比T2的包埋量多0.01-0.3μg。
检测线T1不显色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量低于60 μg/mL；
检测线T1显粉色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量低于60-90μg/mL；
检测线T1显红色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为90-120μg/mL；
检测线T2显粉色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为120-150μg/mL；
检测线T2显红色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为150-180μg/mL；
检测线T3显粉色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为180-210μg/mL；
检测线T3显红色且质控线显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量大于210μg/mL。
一个优选的方案，所述胶体金检测试纸包括底板、位于底板上且相对设置的样品垫、结合垫、吸水垫、设置在结合垫与吸水垫之间的硝酸纤维素膜、沿结合垫至吸水垫的方向依次布设在硝酸纤维素膜上的检测线T1、T2、T3以及质控线C；所述的结合垫上喷涂有胶体金偶联的标记抗体，所述的标记抗体为小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的单克隆抗体A；所述的检测线T1、T2、T3是由检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上而形成，其包埋量由T1至T3依次递增，所述的检测抗体为羊抗人免疫球蛋白(IgA、IgG 和IgM三者均能识别)的多克隆抗体B；所述的质控线包埋有羊抗小鼠IgG抗体。
优选的，所述的小鼠抗人免疫球蛋白单克隆抗体A偶联胶体金的pH值为7.5-8.5。
优选的，所述的抗体偶联胶体金中，以小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)单克隆抗体A的质量与胶体金溶液的体积之比作为单克隆抗体A的结合量，所述的单克隆抗体A的结合量为10-25μg/mL，抗体偶联胶体金经浓缩后以10μL/cm2喷涂于检测试纸的结合垫。
优选的，所述检测线(T1，T2，T3)包埋有羊抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的多克隆抗体B，其包埋量为0.01-1μg，三条检测线上的包埋量沿T1至T3 方向依次递增，从而可以实现对人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量。
优选的，所述的质控线包埋羊抗小鼠IgG抗体的量为1-2μg。
优选的，利用来源于G族链球菌细胞的蛋白G(Protein G)作为结合垫处胶体金标记蛋白或检测线处包埋蛋白，用来检测人体口腔液的IgG含量。
利用来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A(Protein A)作为结合垫处胶体金标记蛋白或检测线处包埋蛋白，用来检测人体口腔液的IgG含量。
利用来源于Magnus消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的蛋白L(ProteinL) 作为结合垫处胶体金标记蛋白或检测线处包埋蛋白，用来检测人体口腔液的免疫球蛋白(κ轻链型的IgA、IgG和IgM)总含量。
利用来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的多肽肽段或其修饰物、衍生物，作为结合垫处胶体金标记蛋白或检测线处包埋蛋白，用来检测人体口腔液的IgA含量或IgG 含量或IgA和IgG总量；或者利用来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多肽肽段或其修饰物、衍生物作为结合垫处胶体金标记蛋白或检测线处包埋蛋白，用来检测人体口腔液的分泌型IgA(SIgA)含量。
本发明使用的胶体金检测试纸，可以采用如下方法制备：
步骤(1)：将1mL 1％氯金酸溶液加入到100mL去离子水中，在搅拌状态下加热，沸腾10-15分钟后，加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液至0.01％氯金酸溶液中并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1：40-1：50。
步骤(2)：将步骤(1)所得溶液加热至沸腾，当氯金酸溶液变成深红色后，再保持沸腾5分钟，然后停止加热，超声振荡3-5分钟，冷却至室温，置于4℃冰箱保存。
步骤(3)：调节胶体金溶液的pH值为7.5-8.5，便搅拌边加入小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的单克隆抗体A，加入完毕后，继续搅拌反应20-30分钟，随后加入含10％牛血清白蛋白(BSA)的1×磷酸盐缓冲液(PBS)，继续搅拌45-60分钟，低速离心(4000转/分钟，10分钟)后保留上清液，然后将上清液高速离心(14000 转/分钟，30分钟)并保留沉淀。
步骤(4)：将步骤(3)获得的沉淀物与胶体金溶液混合，进行复溶，复溶后最终浓缩了10倍，此时即制得小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)单克隆抗体A 偶联胶体金，该抗体偶联胶体金置于4℃冰箱保存。
步骤(5)：将步骤(4)制得的单克隆抗体A偶联胶体金以10μL/cm2喷涂于玻璃纤维素膜的结合垫；将羊抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)多克隆抗体B喷涂于硝酸纤维素膜上形成包埋量递增的检测线T1、T2和T3，包埋量为0.01-1μg；将羊抗小鼠 IgG抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线。随后对底板、样品垫、结合垫、吸水垫及硝酸纤维素膜进行组装，即制得所述的口腔液免疫球蛋白总含量的半定量检测试纸。
上述测定人体口腔液免疫球蛋白总含量的装置，进一步包括比色卡，利用免疫球蛋白标准品以及经测定已知免疫球蛋白总含量的人体口腔液样品，建立对应于1-4条检测线的标准比色卡，从而可以实现对人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量。
一个优选的方案，利用人初乳分泌型IgA(SIgA)标准品以及经免疫酶联吸附测定(ELISA)或免疫比浊法测得的已知免疫球蛋白总含量的人体口腔液样品，建立对应于三条检测线T1、T2和T3的标准比色卡，从而可以实现对人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量。较之以往技术采用血清型IgA作为标准品，本发明提供的标准比色卡的建立依据于 SIgA，以及口腔液以SIgA为主、IgG和IgM为次、富含多种类型免疫球蛋白的特点，从而还原了受试者检测样品的真实性，提高了检测结果的可靠性和准确性。
本发明所述的检测方法，采用上述装置进行检测，具体包括如下步骤：
(1)人体口腔液的采集：将采集管的富集管部分伸入受试者舌头上方，舌尖略微上卷翘起，在下颌处富集非刺激性口腔液，通过紧闭双唇和轻缩面颊两侧，使舌头上方的口腔液自然流入采集管，同时将采集管的引流管连接至预装有定量的水或生理盐水的口腔液处理瓶中，定量采集口腔液，混匀；
(2)倒置口腔液处理瓶，挤压瓶身，将稀释的口腔液从口腔液处理瓶瓶盖顶端挤出至胶体金检测试纸的加样部位，待试纸显色，判读检测结果。
上述方法，优选使口腔液进行10倍稀释，所述胶体金检测试纸结合垫上标记抗体的结合量为10-25μg/mL，所述检测线包埋检测抗体的量为0.01-1μg。更优选的口腔液处理瓶中预装有4.5ml水或生理盐水，采集管定量引流0.5ml口腔液至瓶中。
上述方法中，受试者要求：采集前1小时内不能进食，采集前1小时内不能剧烈运动。采集前10分钟使用纯净水漱口三次。
具体受试者口腔液采集：由受试者自行操作，除去口腔液采集管外包装，将采集管富集管部分伸入受试者舌头上方，舌尖略微上卷翘起，在下颌处富集非刺激性口腔液，通过紧闭双唇和轻缩面颊两侧，使舌头上方的口腔液自然流入采集管。同时，将引流管连接至口腔液处理瓶中(预装有4.5ml水或生理盐水)，采集口腔液约0.5ml，即至口腔液处理瓶5.0mL的刻度线处。移去采集管，口腔液处理瓶瓶盖，并拧紧，摇荡数次混匀。
采集并处理好口腔液后，移去瓶盖上方的保护罩，倒置口腔液处理瓶，轻轻挤压口腔液处理瓶透明瓶身，滴加2滴样品(约100μL)至检测试纸的加样槽中，等待5-10分钟，判读检测结果。
本发明所述装置及方法并不限于仅用于评估人体亚健康状态，也适用于检测和人体亚健康相关的其他健康状态和疾病等，包括口腔溃疡、慢性肠炎、慢性胃炎、慢性疲劳、呼吸道感染、记忆力衰退、焦虑症、抑郁症、社交恐惧症、失眠等。
本发明优点：
1.本发明克服了以往传统的侧向层析法大多应用于血液和尿液的检测，而不能应用于口腔液(包括唾液)半定量检测的缺陷，针对人体口腔液较之血液和尿液更加粘稠,且不同受试者黏度不均一的特点,将口腔液进行10倍稀释等处理，使得稀释后的样品更加适合于免疫层析胶体金技术；同时，本发明提供的检测方法，在口腔液的采集、处理和上样过程中，在不需要借助精密仪器(如移液枪)的情况下，可以做到每位受试者的上样量都一致，相当于 10μL口腔液原液。
2.本发明利用口腔液采集管上端较宽的富集管方便将舌头上方的口腔液流入采集管中，利用口腔液采集管下端较窄的引流管使采集管中的口腔液缓慢流出。避免因流量太大导致无法准确采集口腔液。
3.本发明在不需要精密仪器(如移液枪)的情况下，利用口腔液处理瓶5.0mL处的刻度线，可以比较准确的采集到约0.5mL的口腔液，保证每位受试者使用同等量的口腔液进行检测，从而提高了检测结果的可靠性和准确性。
4.由于口腔液比较粘稠且个体差异大，高浓度的原液不适合作为免疫层析胶体金检测试纸的直接样品。本发明使用10倍稀释后的口腔液作为上样样品，消除了黏度的个体差异，适合用于试纸检测，从而提高了检测结果的可靠性和准确性，避免将高浓度口腔液原液用于免疫层析胶体金检测试纸时出现钩状效应(Hook effect)导致的假阴性，从而提高了检测结果的可靠性和准确性。
5.本发明在将稀释后的口腔液上样时，通过倒置口腔液处理瓶并挤压瓶身，稀释后的口腔液经过瓶盖顶端的小孔流出，每一滴约50μL，在不需要精密仪器(如移液枪)的情况下，可以保证每位受试者的上样量一致(共2滴，100μL，相当于10μL口腔液原液)。同时瓶盖顶端的小孔兼具过滤功能，可以避免将口腔液中可能含有的食物残渣带入检测试纸的上样槽中，从而提高了检测结果的可靠性和准确性。
5.本发明制备的胶体金颗粒粒径为20-40nm，颗粒大小均匀，分散单一，使得抗免疫球蛋白抗体在胶体金溶液能分布均匀，并且提高了制备得到的结合垫和已处理口腔液中免疫球蛋白结合的特异性，避免了口腔液中其他物质与结合垫的非特异性结合而导致的假阳性，进而提高了检测结果的可靠性和准确性。
6.本发明提供的口腔液免疫球蛋白总含量半定量检测试纸，利用浓度梯度的检测线 (优选三条抗体包埋量递增的检测线)，以及利用人初乳SIgA标准蛋白建立的标准比色卡，可以实现对口腔液免疫球蛋白总含量的半定量检测：
如果检测线T1不显色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量低于60 μg/mL；
如果检测线T1显粉色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为60-90 μg/mL；
如果检测线T1显红色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为90-120μg/mL；如果检测线T2显粉色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为 120-150μg/mL；如果检测线T2显红色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为150-180μg/mL；如果检测线T3显粉色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为180-210μg/mL；如果检测线T3显红色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量大于210μg/mL；如果质控线C不显色，不管检测线T1、T2和T3显色结果如何，都说明半定量检测试纸已失效。
7.本发明提供的口腔液免疫球蛋白总含量半定量检测试纸，在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器，保存期可达2年，且检测重复性好，具有很好的市场应用前景。
附图说明
图1为口腔液采集管的结构示意图。
图2为口腔液处理瓶的结构示意图。
图3为免疫球蛋白总含量检测试纸结构示意图。
图4为免疫球蛋白总含量检测试纸外壳结构示意图。
具体实施方式
本发明技术方案包括但不限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方案间的任意组合。
本发明实施方式中所用到的主要仪器：分光光度计UV-2700购自岛津，酶标仪Infinite M200Pro购自Tecan，Nanodrop 2000C购自Thermo Fisher Scientific，点样仪AD6010购自BIO-DOT，高速冷冻台式离心机5430R购自Eppendorf，单人净化工作台SW- CJ-1FD型购自苏净安泰。
本发明实施方式中所用到的主要试剂：小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)单克隆抗体购自Thermo Fisher Scientific，羊抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)多克隆抗体购自Jackson ImmunoResearch，羊抗小鼠IgG抗体、氯化金、柠檬酸三钠等购自生工生物工程(上海)股份有限公司，牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich，人初乳SIgA购自Athens Research&Technology。
实施例1
一种测定人体口腔液免疫球蛋白总含量的装置，包括人体口腔液采集管、口腔液处理瓶、胶体金检测试纸。
所述人体口腔液采集管如图1所示，包括富集管1和引流管2，引流管管径小于富集管管径，富集管和引流管通过漏斗状连接管3连接；
富集管直径为10-25mm，管长为30-75mm；引流管直径为1-3mm，管长为20-50mm。
优选富集管直径为12mm，管长为40mm；引流管直径为2.5mm，管长为15mm，连接管长度为10mm。
所述口腔液处理瓶如图2所示，包括瓶体1和瓶盖2，瓶盖顶端处有小孔，瓶盖顶端还罩有保护罩3。
瓶体直径为12mm，瓶盖长33mm，瓶体长60mm。
胶体金检测试纸如图3和图4所示，包括底板7、位于底板上且相对设置的样品垫1、结合垫2及吸水垫6、设置在结合垫与吸水垫之间的硝酸纤维素膜3、沿结合垫至吸水垫的方向依次布设在硝酸纤维素膜上的检测线4(T1、T2、T3)以及质控线5(C)。
胶体金检测试纸具有外壳，外壳上在对应样品垫1的位置开有加样槽8，可以更准确的定量上样。外壳上对应检测线和质控线的位置开有阅读窗9，可以更方便地判读显色结果。
所述的结合垫上喷涂有胶体金偶联的标记抗体，所述的标记抗体为小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的单克隆抗体A，标记抗体的结合量为10-25 μg/mL。
所述的检测线T1、T2、T3是由检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上而形成，其包埋量由T1至T3依次递增，优选的，T1的包埋量为0.01-0.6μg，T2的包埋量比T1的包埋量多 0.01-0.3μg，T3的包埋量比T2的包埋量多0.01-0.3μg。所述的检测抗体为羊抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的多克隆抗体B；所述的质控线包埋有羊抗小鼠IgG 抗体。
上述结合垫和检测线处的抗体和抗原(或蛋白、多肽)可以有多种任意组合，并通过双抗体夹心法或间接法或竞争法来实现对不同免疫球蛋白的检测；其中使用的抗体包括小鼠抗人免疫球蛋白单克隆抗体A1(识别IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种)，小鼠抗人免疫球蛋白单克隆抗体A2(识别IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种)，兔或羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体B1(识别IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种)，兔或羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体B2(识别IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种)；其中使用的抗原(或蛋白、多肽)包括蛋白G、蛋白A、蛋白L、来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的多肽肽段或其修饰物及衍生物、来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多肽肽段或其修饰物及衍生物。
实施例2
抗体偶联胶体金的制备方案包括以下步骤：
步骤(1)：将1mL 1％氯金酸溶液加入到100mL去离子水中，在搅拌状态下加热，沸腾10-15分钟后，加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液至0.01％氯金酸溶液中并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1：40-1：50。
步骤(2)：将步骤(1)所得溶液加热至沸腾，当氯金酸溶液变成深红色后，再保持沸腾5分钟，然后停止加热，超声振荡3-5分钟，冷却至室温，置于4℃冰箱保存。
步骤(3)：调节胶体金溶液的pH值为7.5-8.5，便搅拌边加入小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的单克隆抗体A，加入完毕后，继续搅拌反应20-30分钟，随后加入含10％牛血清白蛋白(BSA)的1×磷酸盐缓冲液(PBS)，继续搅拌45-60分钟，低速离心(4000转/分钟，10分钟)后保留上清液，然后将上清液高速离心(14000 转/分钟，30分钟)并保留沉淀。
步骤(4)：将步骤(3)获得的沉淀物与胶体金溶液混合，进行复溶，复溶后最终浓缩了10倍，此时即制得小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)单克隆抗体A 偶联胶体金，该抗体偶联胶体金置于4℃冰箱保存。
实施例3
人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量检测试纸的制备步骤如下：将小鼠抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)单克隆抗体A偶联胶体金以10μL/cm2喷涂于玻璃纤维素膜的结合垫，标；将羊抗人免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM三者均能识别)多克隆抗体B 喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线T1、T2和T3，包埋量为0.01-1μg且沿T1至T3检测线递增，其中T1的包埋量为0.01-0.6μg，T2的包埋量比T1的包埋量多0.01-0.3μg，T3的包埋量比T2的包埋量多0.01-0.3μg。将羊抗小鼠IgG抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线，其包埋量为1-2μg。随后对底板、样品垫、吸水垫及硝酸纤维素膜进行组装，即制得所述的人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量检测试纸。
检测线T1、T2和T3处依次递增的包埋量可以设置成更大或更小，检测线T1、T2 和T3间的间距以及距离结合垫的间距可以设置成更大或更小，现有的三条检测线(T1、T2 和T3)可以设置成更多或更少，从而可以得到不同的检测线显色条带及相应检测线不同的显色程度，进而得到更精密或更粗略的标准比色卡，使标准比色卡对应于不同的免疫球蛋白总量，使半定量检测结果更精密或更粗略、检测范围更广或更窄。
实施例4
受试者口腔液的采集步骤如下：
步骤(1)：受试者要求：采集前1小时内不能进食，采集前1小时内不能剧烈运动。采集前10分钟使用纯净水漱口三次。
步骤(2)：受试者口腔液采集：由受试者自行操作，除去口腔液采集管外包装，将采集管的富集管部分伸入受试者舌头上方，舌尖略微上卷翘起，在下颌处富集非刺激性口腔液，通过紧闭双唇和轻缩面颊两侧，使舌头上方的口腔液自然流入采集管。
步骤(3)：在操作步骤(2)的同时，受试者将采集管引流管部分连接至口腔液处理瓶中(预装有4.5mL生理盐水)，采集口腔液约0.5mL，即至口腔液处理瓶5.0mL的刻度线处。
受试者口腔液采集后的处理步骤如下：
当受试者口腔液流入到移去口腔液处理瓶5.0mL的刻度线处时，移去采集管，将瓶盖盖于口腔液处理瓶上方并拧紧，摇荡数次混匀。倒置口腔液处理瓶，轻轻挤压口腔液处理瓶瓶身，滴加2滴样品(约100μL)至胶体金检测试纸的加样槽中，等待5-10分钟，判读检测结果。
口腔液免疫球蛋白总含量的半定量检测试纸的结果判读：
如果检测线T1不显色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量低于60 μg/mL；如果检测线T1显粉色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为60- 90μg/mL；如果检测线T1显红色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为 90-120μg/mL；如果检测线T2显粉色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为120-150μg/mL；如果检测线T2显红色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为150-180μg/mL；如果检测线T3显粉色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量为180-210μg/mL；如果检测线T3显红色且质控线C显色，提示人体口腔液中免疫球蛋白总含量大于210μg/mL；如果质控线C不显色，不管检测线T1、T2和T3 显色结果如何，都说明半定量检测试纸已失效。
实施例5
为了能够计算出口腔液中免疫球蛋白总含量，需要利用标准样品检测，分别在7个干净试管中加入不同量的人初乳SIgA标准品(0.5μg，1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，32μg)，用生理盐水稀释至100μL，得到浓度分别为5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80 μg/mL，160μg/mL，320μg/mL的标准免疫球蛋白溶液，以生理盐水作空白对照，加入含有羊抗人免疫球蛋白抗体(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的抗体应用液1mL，混匀，置于 37℃水浴10分钟，通过分光光度计分别测定样品在700nm处的吸光度值。以样品浓度 (μg/mL)为横坐标，吸光度值(OD700)为纵坐标，绘制免疫球蛋白的标准曲线，并作相关性分析，从而得到标准曲线y＝0.00165x+0.0227，R2＝0.956，其中x代表样品浓度(μg/mL)，y代表吸光度值(OD700)。。
随机抽取经口腔溃疡与免疫球蛋白取样调查研究鉴定为健康和复发性口腔溃疡 (非感染期)的受试者各10名的口腔液，将口腔液4℃离心4000转/分钟，15分钟后取上清 100μL，加入含有羊抗人免疫球蛋白抗体(IgA、IgG和IgM三者均能识别)的抗体应用液 1mL， 混匀，置于37℃水浴10分钟，通过分光光度计分别测定样品在700nm处的吸光度值。将测得 的吸光度值代入标准曲线y＝0.00165x+0.0227，便可计算出不同受试者口腔液免疫球蛋白 的总含量，测定结果如下表：
受试者 免疫球蛋白总含量(μg/mL)
健康者 158.45±47.62
复发性口腔溃疡者(非感染期) 123.57±39.98
由以上数据得知，复发性口腔溃疡者(非感染期)与健康者相比，其口腔液免疫球蛋白总含量呈下降趋势。因此，可以根据口腔液免疫球蛋白总含量来评估口腔溃疡患病风险。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种人体口腔液免疫球蛋白总含量的检测方法，其特征在于以人体口腔液为检测样本，所述免疫球蛋白选自IgA、IgG和IgM中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述免疫球蛋白选自IgA、IgG和IgM。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述人体口腔液选自人体口腔粘膜渗出液以及总唾液两者的混合物、人体口腔粘膜渗出液、人体唾液腺分泌的总唾液、人体下颌下腺分泌的唾液、人体腮腺分泌的唾液或人体舌下腺分泌的唾液。
4.一种人体口腔液免疫球蛋白总含量的检测装置，其特征在于包括人体口腔液采集管、口腔液处理瓶和胶体金检测试纸；
所述人体口腔液采集管包括富集管和引流管，引流管管径小于富集管管径，富集管和引流管通过漏斗状连接管连接；
所述口腔液处理瓶包括瓶体和瓶盖，瓶盖顶端处有小孔；
所述胶体金检测试纸的结合垫上喷涂有胶体金偶联的标记抗体，所述的标记抗体为抗人免疫球蛋白IgA、IgG和IgM中的一种或几种的单克隆抗体；根据检测抗体的不同包埋量递增设置2-5个线状、环状、点状或其他任意形状的检测点，检测抗体为抗人免疫球蛋白IgA、IgG和IgM中的任何一种或几种的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于所述胶体金检测试纸结合垫上标记抗体的结合量为10-25μg/mL，所述检测线包埋检测抗体的量为0.01-1μg。
6.如权利要求5所述的装置，其特征在于所述胶体金检测试纸根据检测抗体的不同包埋量递增设置3条检测线T1、T2和T3，T1的检测抗体包埋量为0.01-0.6μg，T2的检测抗体包埋量比T1的包埋量多0.01-0.3μg，T3的检测抗体包埋量比T2的包埋量多0.01-0.3μg。
7.如权利要求4所述的装置，其特征在于所述富集管直径为10-25mm，管长为30-75mm；引流管直径为1-3mm，管长为20-50mm。
8.如权利要求4所述的装置，其特征在于所述采集管体和/或口腔液处理瓶上设有刻度。
9.如权利要求4所述的装置，其特征在于还包括比色卡，利用免疫球蛋白标准品以及经测定已知免疫球蛋白总含量的人体口腔液样品，建立对应于梯度检测线的标准比色卡，实现对人体口腔液免疫球蛋白总含量的半定量。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于采用如权利要求3-9任一项所述的装置进行检测。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)人体口腔液的采集：将采集管的富集管部分伸入受试者舌头上方，在下颌处富集非刺激性口腔液，使舌头上方的口腔液自然流入采集管，同时将采集管的引流管连接至预装有定量的水或生理盐水的口腔液处理瓶中，定量采集口腔液，混匀；
(2)倒置口腔液处理瓶，挤压瓶身，将稀释的口腔液从口腔液处理瓶瓶盖顶端挤出至胶体金检测试纸的加样部位，待试纸显色，判读检测结果。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述对口腔液进行2倍至20000倍稀释。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述对口腔液进行10倍稀释。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于口腔液处理瓶中预装有4.5mL水或生理盐水，采集管定量引流0.5ml口腔液至瓶中。
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