CN109609333B - 一种生物芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种生物芯片及其制备方法。本申请的生物芯片为DNA芯片或蛋白质芯片，该生物芯片基底表面具有小分子修饰试剂结合在基底表面形成的抗非特异性吸附层，小分子修饰试剂为式一所示通式的化合物中的至少一种；式一中R1、R2和R3分别选自亲水基团或氢原子。本申请的生物芯片，采用式一化合物作为小分子修饰试剂形成抗非特异性吸附层，该吸附层可有效防止测序所用核苷酸的非特性吸附，提高特性检测信号比率，降低非特信号干扰，且本申请中的生物芯片的抗非特异性吸附层连接强度高、不易脱落；而且，本申请的小分子修饰试剂反应可控、可重复性好，使得本申请的生物芯片质量高、重复性好，具有高可用性，并且特别适用于单分子检测。
Description
技术领域
本申请涉及生物芯片领域，特别是涉及一种生物芯片及其制备方法。
背景技术
单分子检测技术能做到以下两点：1)识别单个分子的信号，而不是分子群体的平均信号，2)跟踪单分子的动力学过程，提供分子运动或反应的细节。得益于上述的优异性能，基于单分子的检测以及识别技术受到了学术界和产业界的高度关注。其中，单分子DNA测序技术尤为受到广泛的关注与研究。当前，主流的DNA单分子测序技术包括：瀚海基因的TIRF技术、Paciffic的ZMW技术以及牛津公司的Nanopore技术。这些测序技术的实现都有赖于高可用的测序芯片，即DNA芯片；因此，对DNA芯片的性能要求至少包括：1)良好和可重复的单分子修饰效率，例如TIRF中的DNA；2)可控的、极低的非特异性吸附。其中，可控的非特异性吸附是实验成败的重要因素。在DNA测序过程中，特异的单分子信号与非特异的吸附信号都会被仪器识别收集，非特异的吸附信号会严重地干扰特异信号的识别，给仪器的后期信号处理构成极大的障碍。
因此，制备具有抗非特异性吸附的芯片对分子检测领域具有重要价值。
发明内容
本申请的目的是提供一种改进的生物芯片及其制备方法。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种生物芯片，本申请的生物芯片为DNA芯片或蛋白质芯片，该生物芯片的基底表面具有抗非特异性吸附层，抗非特异性吸附层由小分子修饰试剂结合在基底表面形成，该小分子修饰试剂为式一所示通式的化合物中的至少一种；
式一
其中，R1、R2和R3分别选自亲水基团或氢原子。
需要说明的是，本申请的生物芯片，其关键在于采用式一所示通式的化合物作为小分子修饰试剂，形成芯片的抗非特异性吸附层。本申请所采用的小分子修饰试剂，与现有的小分子修饰试剂相比，具有可控性好、可重复性好等优点，能够精确控制非特异性吸附，从而获得高可用的单分子检测的DNA芯片或蛋白质芯片。本申请的小分子修饰试剂，是指相对分子质量在1000以下的小分子化合物。
任选的，式一所示通式的化合物中，亲水基团为负电基团。
任选的，亲水基团含有磷酸基团、磷酸酯基团、磺酸基团、羧酸基团、羟基或酰胺基团。
任选的，式一所示通式的化合物为牛磺酸、氨丙基磺酸、丝氨酸、谷氨酸和磷酸丝氨酸中的至少一种。
任选的，生物芯片的基底表面具有环氧硅烷修饰。
可以理解，小分子修饰试剂与基底表面结合，可以通过共价键结合，也可以通过非共价键结合。本申请的一种实现方式中，小分子修饰试剂通过共价键结合在基底表面，从而形成稳定、可控的抗非特异性吸附层。
本申请的另一方面公开了一种生物芯片的制备方法，该生物芯片为DNA芯片或蛋白质芯片，本申请的制备方法包括采用式一所示通式的化合物中的至少一种作为小分子修饰试剂，与基底表面结合，固定在基底表面，形成抗非特异性吸附层；
式一
其中，R1、R2和R3分别选自亲水基团或氢原子。
需要说明的是，本申请的制备方法，其关键在于采用式一所示通式的化合物中的至少一种作为小分子修饰试剂，至于具体的小分子修饰试剂如何结合到基底表面，可以参考现有的抗非特异性吸附层制备工艺，在此不做具体限定。但是，为了达到更好的抗非特异性吸附层，本申请的优选方案中，对生物芯片的制备方法进行了改进和优化，详见后续方案。
任选的，本申请的制备方法中，亲水基团为负电基团。
任选的，本申请的制备方法中，亲水基团含有磷酸基团、磷酸酯基团、磺酸基团、羧酸基团、羟基或酰胺基团。
任选的，本申请的制备方法中，式一所示通式的化合物为牛磺酸、氨丙基磺酸、丝氨酸、谷氨酸和磷酸丝氨酸中的至少一种。
任选的，本申请的一种实现方式中，抗非特异性吸附层是采用含有小分子修饰试剂的钝化反应液在钝化处理过程中形成。
需要说明的是，钝化处理的钝化反应液可以采用钝化处理常规使用的钝化液，在此不做具体限定；钝化处理的反应条件参考现有的钝化处理工艺。
任选的，钝化反应液中，小分子修饰试剂的浓度为0.01-0.2mol/L。
需要说明的是，钝化处理的反应液中的小分子修饰试剂，其目的在于结合到基底表面形成抗非特异性吸附层；可以理解，只要添加有本申请的小分子修饰试剂就能够形成抗非特异性吸附层，为了使形成的抗非特异性吸附层具有更好的效果，本申请任选的钝化反应液中的小分子修饰试剂的浓度为0.01-0.2mol/L。可以理解，在该范围以外，例如浓度太低，可能无法形成有效的抗非特异性吸附层，浓度太高会造成试剂浪费，对抗非特异性吸附层效果提升作用不大。
任选的，钝化处理的反应液中还添加有反应促进剂，以促进小分子修饰试剂与基底表面的结合反应。
任选的，反应促进剂为苄基三乙基氯化铵、苯基三甲基氯化铵和四丁基氯化铵中的至少一种。
任选的，反应促进剂在钝化反应液中的浓度为10-50mmol/L。
需要说明的是，反应促进剂的作用就是促进本申请的小分子修饰试剂与基底表面的结合反应，在反应促进剂的作用下，进一步提升了小分子修饰试剂与基底表面的结合效率和质量，使反应更可控、重复性更好，因此，在任选的方案中钝化处理的反应液中还添加有反应促进剂。可以理解，根据不同的生产或者产品设计需求，例如对反应可控性要求相对较低的情况下，也可以不使用反应促进剂。
还需要说明的是，苄基三乙基氯化铵只是本申请的一种实现方式中证实可适用的反应促进剂，不排除还可以采用其它的反应促进剂，只要能够促进小分子抗非特异性吸附试剂与基底表面的结合反应即可。
任选的，本申请的制备方法还包括在钝化处理之前进行弱钝化处理；弱钝化处理包括在弱钝化反应液中加入小分子修饰试剂，利用小分子修饰试剂与基底表面的结合反应，预先将小分子修饰试剂固定在基底表面。
需要说明的是，弱钝化处理的作用之一是通过添加小分子修饰试剂，预先将小分子修饰试剂固定在基底表面，然后再通过钝化处理进一步巩固，形成稳定的抗非特异性吸附层。
任选的，弱钝化反应液中，小分子修饰试剂的浓度为15-45mmol/L，优选为30mmol/L。
任选的，弱钝化处理的反应条件为35℃-40℃反应2h-5h。
任选的，弱钝化处理和钝化处理所用的小分子修饰试剂相同。
任选的，弱钝化反应液中还添加有表面活性剂，用于促进DNA或蛋白质与基底表面的共价键生成，使DNA或蛋白质充分固定在基底表面。
任选的，表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、双十八烷基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵和四辛基溴化铵中的至少一种。
任选的，表面活性剂在弱钝化反应液中的浓度为1-25mmol/L，优选为10mmol/L。
需要说明的是，弱钝化处理步骤是本申请的一个任选的改进方案，本申请的优选方案中，在弱钝化处理的弱钝化反应液中添加了表面活性剂和小分子修饰试剂；弱钝化处理的作用，除了预先将小分子修饰试剂固定在基底表面以外，还有一个重要的作用，就是通过弱钝化处理，提高DNA或蛋白质与基底表面的共价键反应效率，使DNA或蛋白质更充分的结合在基底表面，从而使生物芯片上固定的DNA或蛋白质的量与固定液中初始加入的DNA或蛋白质浓度具有很好的相关性，从而实现了生物芯片上固定的DNA或蛋白质的量可控，且重复性好。
还需要说明的是，弱钝化处理的弱钝化反应液就是为表面活性剂和小分子修饰试剂提供一个反应环境，本申请的一种实现方式中，为了操作方便，直接采用固定液作为弱钝化反应液，不排除还可以采用其它反应缓冲液。其中固定液是生物芯片制备常用的固定处理的反应缓冲液，在此不做具体限定。
任选的，本申请的一种实现方式中，本申请的制备方法具体包括以下步骤，
弱钝化处理，包括使含有小分子修饰试剂或同时含有小分子修饰试剂和表面活性剂的弱钝化反应液与基底接触，在恒温条件下进行弱钝化；本申请的弱钝化处理，其目的在于预先使小分子修饰试剂固定在基底表面，在具有表面活性剂的情况下，还具有使DNA或蛋白质与环氧基团充分结合的作用；可以理解，小分子修饰试剂的浓度和处理时间都会影响其固定在基底表面的量，浓度越高、处理时间越长相应的小分子修饰试剂固定在基底表面的量越大；同样的，表面活性剂的浓度越高、处理时间越长，相应的使DNA或蛋白质与环氧基团充分结合的效果越好；具体的可以根据生产或产品需求而定，在此不做具体限定；本申请的一种实现方式中，弱钝化处理的弱钝化反应液为含有10nM的表面活性剂和30mM的小分子修饰试剂的0.25mol/L的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，利用流体设备在芯片通道中通入反应液进行弱钝化处理，其流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为3h，反应温度为37℃；以上条件可供参考，在此不做具体限定；
钝化处理，包括采用钝化反应液对弱钝化处理的基底进行清洗，然后使含有小分子修饰试剂或同时含有小分子修饰试剂和反应促进剂的钝化反应液与清洗后的基底接触，在恒温条件下进行钝化；一般的，钝化反应液即钝化液为1mol/L的K2HPO4/KH2PO4，pH 9.0；其中，“K2HPO4/KH2PO4”表示由K2HPO4和KH2PO4组成的钝化液，两者的配比参考常规的DNA芯片钝化液，在此不做具体限定；本申请的一种实现方式中，具体的，含有小分子修饰试剂或同时含有小分子修饰试剂和反应促进剂的反应液采用0.25mol/L的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，小分子修饰试剂的浓度为0.01-0.2M，利用流体设备在芯片通道中通入反应液进行反应，其钝化处理的条件为，流入钝化液的次数为3-4次，每次流入的体积为500μL，流体的速度为1mL/min，每次流入的间隔时间为1800s，整个钝化过程中，温度保持37℃，以上条件可供参考，在此不做具体限定。
需要说明的是，本申请的关键在于钝化处理时采用了特殊的小分子修饰试剂；进一步的改进中，还增加了弱钝化处理；至于其它步骤，可以参考现有的DNA芯片或蛋白质芯片制备工艺。
任选的，本申请的制备方法还包括洗涤步骤，即对钝化处理后的芯片进行洗涤，该洗涤步骤包括采用三种洗涤液依序对钝化处理的基底进行洗涤，每种洗涤液至少洗涤一次，三种洗涤液按照使用顺序依序为RI-05、RI-06、RI-07，其中，RI-05为磷酸缓冲液，RI-06为HEPES缓冲液与NaCl溶液组成的混合溶液，RI-07为双蒸水。钝化处理后对DNA芯片进行洗涤是本领域熟知的，RI-05、RI-06、RI-07也是常规的洗涤液，一般的，每种洗涤液需要重复洗涤3次。其中，HEPES即4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
任选的，本申请的制备方法还包括在弱钝化处理之前进行固定处理，具体包括使含有DNA或蛋白质的固定液与基底表面接触，在恒温条件下进行DNA或蛋白质固定。一般的，固定液为0.25mol/L的Na2CO3/NaHCO3，pH 9.78，其中DNA的浓度一般为0.01-0.4nmol/L，固定处理的温度为37℃左右，处理时间在30min左右，以上条件可供参考，在此不做具体限定；其中，“Na2CO3/NaHCO3”表示由Na2CO3和NaHCO3组成的固定液，两者的配比参考常规的DNA芯片固定液，在此不做具体限定。
本申请的再一面公开了一种小分子化合物在制备DNA芯片或蛋白质芯片中的应用，该应用包括将小分子化合物作为小分子修饰试剂，结合在基底表面，形成抗非特异性吸附层，小分子化合物为式一所示通式的化合物中的至少一种；
式一
其中，R1、R2和R3分别为亲水基团或氢原子。
任选的，小分子化合物中，亲水基团为负电基团。
任选的，小分子化合物中，亲水基团含有磷酸基团、磷酸酯基团、磺酸基团、羧酸基团、羟基或酰胺基团。
任选的，小分子化合物为牛磺酸、氨丙基磺酸、丝氨酸、谷氨酸和磷酸丝氨酸中的至少一种。
需要说明的是，本申请的关键在于发现了一些新的小分子化合物特别适用于作为DNA芯片或蛋白质芯片的小分子修饰试剂，本申请的小分子化合物作为小分子修饰试剂使用时，不仅具有现有小分子修饰试剂的优点，而且，反应可控、重复性好，对制备高可用的单分子检测的DNA芯片和蛋白质芯片具有重要价值；因此，本申请提出了这些小分子化合物作为制备DNA芯片或蛋白质芯片的小分子修饰试剂，在基底表面形成抗非特异性吸附层的新的用途。
本申请的再一面公开了利用本申请生物芯片在核酸或蛋白检测分析中的应用。其中，核酸或蛋白检测分析包括测序分析、杂交分析、免疫分析、SNP检测分析等。
需要说明的是，本申请中的DNA芯片和蛋白质芯片，指的是芯片的基底表面固定了DNA或蛋白质，在本申请中如果没有特别指明DNA和蛋白质的种类，DNA指的是含有DNA序列或者氨基酸序列的一类物质，如DNA芯片固定的DNA可以含有核苷酸衍生物、核苷酸类似物、含有荧光标记、或同时含有核苷酸序列和氨基酸序列；蛋白质指的是含有氨基酸序列的一类物质。
需要说明的是，在本申请中的芯片基底表面具有化学修饰，该化学修饰含有能够与DNA或蛋白质反应的活性基团，通过活性基团与DNA或蛋白质间的反应将DNA或蛋白质固定在基底表面。
本申请的有益效果在于：
本申请的生物芯片，采用式一所示结构的化合物作为小分子修饰试剂，形成生物芯片的抗非特异性吸附层，该吸附层可以有效地防止测序所用的核苷酸的非特性吸附，提高特性检测信号的比率，降低非特信号的干扰，且本申请中的生物芯片的抗非特异性吸附层连接强度高、不易脱落；而且，本申请的小分子修饰试剂反应可控、可重复性好，使得本申请的生物芯片质量高、重复性好，具有高可用性，并且特别适用于单分子检测。
附图说明
图1是本申请实施例中封装芯片基底的结构示意图；
图2是本申请实施例中单一负电荷基团的小分子抗非特异性吸附试剂和多亲水基团的小分子抗非特异性吸附试剂弱钝化处理DNA芯片的非特异性吸附点数测试结果对比图；
图3是本申请实施例中多负电荷基团的小分子抗非特异性吸附试剂和单一负电荷基团的小分子抗非特异性吸附试剂弱钝化处理DNA芯片的非特异性吸附点数测试结果对比图；
图4是本申请实施例中添加或不添加反应促进剂钝化处理DNA芯片的非特异性吸附点数测试结果对比图；
图5是本申请实施例中玻璃基底的结构示意图。
具体实施方式
通过特异的小分子修饰形成抗非特异性吸附层是已经在使用的技术，并且，小分子抗非特异性吸附层由于连接强度高，不易脱落以及较为广谱的抗非特异性吸附等显著优势，得到了广泛的应用。但是，目前的小分子修饰普遍存在可控性差、可重复性弱等问题，以至于不同批次甚至同一批次的小分子修饰，其抗非特异性吸附效果都不尽相同，因此，难以稳定可靠的制备高可用的单分子检测的DNA芯片和蛋白质芯片。
本申请在对DNA芯片和蛋白质芯片的长期大量研究过程中发现，式一所示通式的小分子修饰试剂，例如，牛磺酸、氨丙基磺酸、丝氨酸、谷氨酸和磷酸丝氨酸等，与基底具有高效、且可控性强的结合能力，并且，本申请的小分子修饰试剂与基底结合的可重复性好，能够稳定可靠的制备抗非特异性吸附效果良好的高可用的DNA芯片或蛋白质芯片，特别适用于单分子检测。
在本申请进一步的改进方案中，本申请进一步创造性的提出，利用表面活性剂能够使DNA或蛋白质更充分的与基底表面的化学修饰基团反应的原理，在DNA芯片或蛋白质芯片制备的过程中，引入表面活性剂，使得DNA或蛋白质能够更有效的固定在基底上。由于表面活性剂的使用，DNA或蛋白质与基底表面的化学修饰基团反应更充分，不仅提高了DNA或蛋白质固定在基底表面的效率和质量，而且，使得生物芯片上固定的DNA或蛋白质的量与固定液中初始加入的DNA或蛋白质浓度具有很好的相关性，从而实现了生物芯片上固定的DNA或蛋白质量可控，且重复性好。这不仅为制备高品质的生物芯片奠定了基础，而且还能够满足定制化的生产需求。
需要说明的是，本申请的生物芯片中，基底表面具有化学修饰这些化学修饰含有能够与DNA或蛋白质反应的活性基团。在本申请中的一个实施例中，DNA或蛋白质的氨基基团与活性基团反应，活性基团为环氧基团、醛基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺和二氨基苯酰替苯胺中的一种。
在本申请中的一个实施例中，基底表面的化学修饰结构如图5所示，其中R1代表末端连接有活性反应基团的烷烃链分子，其中活性基团优选为环氧基团、醛基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺和二氨基苯酰替苯胺中的至少一种。
在本申请的一个实施例中，基底表面的化学修饰能够与本申请的小分子修饰试剂结合，将小分子修饰试剂固定在基底表面，形成抗非特异性吸附层。
本申请实施例中涉及的一些词汇进行如下说明：
AT-01：成分为0.25M Na2CO3/NaHCO3，0.6mM CTAB，pH 9.78；其中，CTAB为十六烷基三甲基溴化铵的缩写；
RI-04：成分为1M K2HPO4/KH2PO4，pH 9.0
RI-05：成分为PH7.4PBS溶液；
RI-06：成分为150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液；
RI-07：成分为双蒸水；
Dot/FOV：观测区域为110×110μm范围的亮点数。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例在表面具有环氧硅烷的玻璃基底上，通过DNA的氨基基团将DNA固定在基底表面，形成本例的DNA芯片。并在制备过程中，固定处理之后，在钝化处理之前，增加弱钝化处理。本例对比了采用不同小分子修饰试剂，对DNA芯片的影响。具体的，本例比对了单一负电荷基团的小分子修饰试剂和多亲水基团的小分子修饰试剂的抗非特异性吸附效果。
本例采用“通道内”固定的方式，将DNA固定到芯片基底上，即先封装芯片基底，再采用流体设备将各种反应试剂、洗涤试剂分别通入到封装后的芯片通道内，实现固定处理、钝化处理等的化学反应。如图1所示，芯片基底封装后形成相互独立的各个芯片通道，各芯片通道可以独立的进行各反应，图1所示为8条通道的封装芯片基底，通道的规格为长×宽×高90mm×1.8mm×0.1mm，根据不同的封装工艺或者流体设备，还可以将芯片基底封装成16通道，在一张DNA芯片上独立地制作16种不同修饰的DNA。
本例的DNA芯片的制备方法具体如下：
(1)固定处理，在芯片基底的通道内通入固定反应液，进行固定反应，本例的固定反应液为含有0.05nM DNA和0.6mM CTAB的固定液AT-01；其中，所含DNA的3’末端同时带有氨基修饰NH2和Cy3荧光团修饰；AT-01的成分为0.25M的Na2CO3/NaHCO3，0.6mM CTAB，pH9.78，流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为30min，反应温度为37℃；
(2)弱钝化处理，通入弱钝化反应液，进行“弱钝化”步骤，弱钝化反应液为含有10mM CTAB和30mM小分子修饰试剂的0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，本例具体为pH 9.78；作为对比，本例部分通道采用的弱钝化反应液中添加的小分子修饰试剂为单一负电荷基团的小分子修饰试剂，具体的为牛磺酸(Taurine)，另一部分通道不添加小分子修饰试剂只采用弱钝化反应液进行弱钝化处理；所有通道设置流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为3h，反应温度为37℃；
(3)洗去弱钝化反应液，具体的，用钝化液RI-04，洗涤次数为3次，每次通入的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，洗涤时温度保持37℃；本例的RI-04成分为1M的K2HPO4/KH2PO4，pH 9.0；
(4)钝化处理，具体的，通入钝化反应液进行钝化处理，本例的钝化反应液为含有30mM小分子修饰试剂的0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，本例具体为pH 9.78；流入钝化反应液的次数为3-4次，每次流入的体积为500μL，流体的速度为1mL/min，每次流入的间隔时间为1800s，整个钝化过程中，温度保持37℃；其中，钝化反应液中的小分子修饰试剂，采用弱钝化处理时相应的Taurine，也就是说，在弱钝化处理时采用Taurine的通道，相应的钝化反应液中也添加Taurine；
(5)洗涤钝化处理后的芯片，包括采用三种溶液洗涤，每种溶液洗涤3次，每次通入的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，洗涤时温度保持37℃；三种洗涤液按照使用顺序依序为RI-05、RI-06、RI-07，其中RI-05为pH7.4的磷酸缓冲液，RI-06为150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液，RI-07为双蒸水。
经三种溶液洗涤后，正常晾干或烘干后即获得本例的DNA芯片。采用单分子荧光成像技术评价本例制备的DNA芯片的非特异性吸附。非特异性吸附的检测方法为，在制备的DNA芯片表面通入Cy5荧光标记的核苷酸，检测DNA芯片表面吸附的Cy5荧光，以单位面积中的Cy5荧光点数表征DNA芯片的非特异性吸附点数。本例具体统计了110×110μm区域的荧光点数表征非特异性吸附点数。
非特异性吸附点数结果如图2所示，图2中横坐标分别为Taurine处理的DNA芯片(即Taurine)、和没添加小分子修饰试剂处理的DNA芯片(即Null)，纵坐标为单位面积110×110μm区域内的非特异性吸附的荧光点数。图2的结果显示，单一负电荷基团的小分子修饰试剂Taurine处理后，其非特异性吸附点数约为1000Dot/FOV，非特异吸附点数远低于没添加小分子修饰试剂处理的DNA芯片。可见，单一负电荷基团的小分子修饰试剂具有很好的抗非特异性吸附效果。
实施例二
本例DNA芯片制备材料和流程与实施例一相同，所不同的是，本例分别添加多负电荷基团的小分子修饰试剂和单一负电荷基团的小分子修饰试剂，比较不同小分子修饰试剂对DNA芯片的影响。具体的，本例比对了单一负电荷基团的小分子修饰试剂Taurine，多负电荷基团的小分子修饰试剂谷氨酸和磷酸丝氨酸的抗非特异性吸附效果。
本例DNA芯片的具体制备方法如下：
(1)固定处理，在芯片基底的通道内通入固定反应液，进行固定反应，本例的固定反应液为含有0.05nM DNA和0.6mM CTAB的固定液AT-01；其中，所含DNA的3’末端同时带有氨基修饰NH2和Cy3荧光团修饰；AT-01的成分为0.25M的Na2CO3/NaHCO3，0.6mM的CTAB，pH9.78，流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为30min，反应温度为37℃；
(2)弱钝化处理，通入弱钝化反应液，进行“弱钝化”步骤，弱钝化反应液为含有10mM CTAB和30mM小分子修饰试剂的0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，本例具体为pH 9.78；作为对比，本例部分通道采用的弱钝化反应液中添加的小分子修饰试剂为单一负电荷基团的小分子修饰试剂，具体的为牛磺酸(Taurine)，另一部分通道采用的弱钝化反应液中添加的小分子修饰试剂为多负电荷基团的小分子修饰试剂谷氨酸(Glutamicacid)，再一部分通道采用的弱钝化反应液中添加的小分子修饰试剂为多负电荷基团的小分子修饰试剂磷酸丝氨酸(Phospho-serine)；所有通道设置流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为3h，反应温度为37℃；
需要说明档是，弱钝化处理与后续的钝化处理中，添加的小分子修饰试剂可以是一样的，也可以不一样；一般而言，两个步骤中添加的小分子修饰试剂是一致的；
(3)洗去弱钝化反应液，具体的，用钝化液RI-04，洗涤次数为3次，每次通入的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，洗涤时温度保持37℃；本例的RI-04成分为1M的K2HPO4/KH2PO4，pH 9.0；
(4)钝化处理，具体的，通入钝化反应液进行钝化处理，本例的钝化反应液为含有30mM小分子修饰试剂的0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，本例具体为pH 9.78；流入钝化反应液的次数为3-4次，每次流入的体积为500μL，流体的速度为1mL/min，每次流入的间隔时间为1800s，整个钝化过程中，温度保持37℃；其中，钝化反应液中的小分子修饰试剂，采用弱钝化处理时相应的Taurine、谷氨酸或磷酸丝氨酸，也就是说，在弱钝化处理时采用Taurine的通道，相应的钝化反应液中也添加Taurine，弱钝化处理时采用谷氨酸的通道，相应的钝化反应液中也添加谷氨酸，弱钝化处理时采用磷酸丝氨酸的通道，相应的钝化反应液中也添加磷酸丝氨酸；
(5)洗涤钝化处理后的芯片，包括采用三种溶液洗涤，每种溶液洗涤3次，每次通入的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，洗涤时温度保持37℃；三种洗涤液按照使用顺序依序为RI-05、RI-06、RI-07，其中RI-05为pH7.4的磷酸缓冲液，RI-06为150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液，RI-07为双蒸水。
经三种溶液洗涤后，正常晾干或烘干后即获得本例的DNA芯片。
采用实施例一相同的测试方法对本例的DNA芯片进行测试，结果如图3所示。图3中，横坐标为不同小分子修饰试剂，纵坐标为不同小分子修饰试剂对应的110×110μm单位面积的非特异性吸附荧光点数。图3的结果显示，单一负电荷基团小分子修饰试剂Taurine处理后，非特异性吸附点数约为1000Dot/FOV，多负电荷基团的小分子修饰试剂谷氨酸(Glutamic acid)处理后，其非特异性吸附点数约为800Dot/FOV，多负电荷基团的小分子修饰试剂磷酸丝氨酸(Phospho-serine)处理后，其非特异性吸附点数约为650Dot/FOV；可见，非特异性吸附点数由大到小依序为Taurine、Glutamic acid和Phospho-serine，说明多负电荷基团的小分子修饰试剂优于单一负电荷基团的小分子修饰试剂，具有更好的抗非特异性吸附效果。
实施例三
本例DNA芯片制备材料和流程与实施例一相同，所不同的是，对比了在钝化处理时，在添加小分子修饰试剂的基础上，添加或不添加反应促进剂对DNA芯片的影响。本例具体添加的反应促进剂为苄基三乙基氯化铵(Benzyltriethylammonium chloride)。
本例DNA芯片的具体制备方法如下：
(1)固定处理，在芯片基底的通道内通入固定反应液，进行固定反应，本例的固定反应液为含有0.05nM DNA和0.6mM CTAB的固定液AT-01；其中，所含DNA的3’末端同时带有氨基修饰NH2和Cy3荧光团修饰；AT-01的成分为0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH 9.78，流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为30min，反应温度为37℃；
(2)弱钝化处理，通入弱钝化反应液，进行“弱钝化”步骤，本例的弱钝化反应液为含有10mM CTAB和30mM小分子修饰试剂的0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，本例具体为pH 9.78；其中，小分子修饰试剂为Taurine，所有通道设置流通溶液的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，反应时间为3h，反应温度为37℃；
(3)洗去弱钝化反应液，具体的，用钝化液RI-04，洗涤次数为3次，每次通入的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，洗涤时温度保持37℃；本例的RI-04成分为1M的K2HPO4/KH2PO4，pH 9.0；
(4)钝化处理，具体的，通入钝化反应液进行钝化处理，本例的钝化反应液为含有30mM小分子修饰试剂Taurine的0.25M的Na2CO3/NaHCO3，pH为9.58-10.53之间，本例具体为pH 9.78；流入钝化反应液的次数为3-4次，每次流入的体积为500μL，流体的速度为1mL/min，每次流入的间隔时间为1800s，整个钝化过程中，温度保持37℃；作为对比，本例分别设置了添加或不添加反应促进剂Benzyltriethylammonium chloride的通道；Benzyltriethylammonium chloride的钝化反应液中的浓度为30mM；
(5)洗涤钝化处理后的芯片，包括采用三种溶液洗涤，每种溶液洗涤3次，每次通入的体积为1mL，流体的速度为1mL/min，洗涤时温度保持37℃；三种洗涤液按照使用顺序依序为RI-05、RI-06、RI-07，其中RI-05为pH7.4的磷酸缓冲液，RI-06为150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液，RI-07为双蒸水。
经三种溶液洗涤后，正常晾干或烘干后即获得本例的DNA芯片。
采用实施例一相同的测试方法对本例的DNA芯片进行测试，结果如图4所示。图4中，横坐标Null为不添加反应促进剂的DNA芯片，Add为添加反应促进剂的DNA芯片；纵坐标为对应的110×110μm单位面积的非特异性吸附荧光点数。图4的结果显示，添加反应促进剂后，相应的DNA芯片的非特异性吸附荧光点数约为600Dot/FOV，而不添加反应促进剂的DNA芯片的非特异性吸附荧光点数约为1000Dot/FOV，说明反应促进剂能够进一步促进小分子修饰试剂Taurine结合到基底上，从而进一步减小DNA芯片的非特异性吸附。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (17)
1.一种生物芯片，所述生物芯片为DNA芯片或蛋白质芯片，其特征在于：所述生物芯片的基底表面具有抗非特异性吸附层，所述抗非特异性吸附层能够防止核苷酸的非特性吸附，所述抗非特异性吸附层由小分子修饰试剂结合在基底表面形成，所述小分子修饰试剂为谷氨酸和磷酸丝氨酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述生物芯片的基底表面具有环氧硅烷修饰。
3.一种制备权利要求1或2所述的生物芯片的方法，其特征在于：包括使所述小分子修饰试剂与基底表面结合，固定在基底表面，形成所述抗非特异性吸附层。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括钝化处理，所述钝化处理包括使含有所述小分子修饰试剂的钝化反应液与基底表面接触，以使所述小分子修饰剂固定在基底表面；
所述钝化反应液中的小分子修饰试剂的浓度为0.01-0.2mol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述钝化反应液中还含有反应促进剂；
所述反应促进剂为苄基三乙基氯化铵、苯基三甲基氯化铵和四丁基氯化铵中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述钝化反应液中的反应促进剂的浓度为10-50mmol/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在钝化处理之前利用弱钝化反应液对所述基底表面进行弱钝化处理；所述弱钝化处理包括使弱钝化反应液与基底表面接触，以使所述小分子修饰剂固定在基底表面；所述弱钝化反应液包括所述小分子修饰试剂和缓冲溶液；
所述弱钝化反应液中的小分子修饰试剂的浓度为15-45mmol/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述弱钝化反应液中小分子修饰试剂的浓度为30mmol/L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述弱钝化处理包括使所述基底表面置于35℃-40℃的所述弱钝化反应液中2h-5h。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述弱钝化反应液和所述钝化反应液中的小分子修饰试剂相同。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述弱钝化反应液中还包含表面活性剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、双十八烷基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵和四辛基溴化铵中的至少一种。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂的浓度为1-25mmol/L。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂的浓度为10mmol/L。
15.根据权利要求7-14任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述弱钝化处理后对所述基底表面进行洗涤，所述洗涤包括采用三种洗涤液依序对所述基底表面进行洗涤，每种洗涤液至少洗涤一次，三种洗涤液按照使用顺序依序为RI-05、RI-06、RI-07，其中，RI-05为PBS缓冲液，RI-06为HEPES缓冲液与NaCl溶液组成的混合溶液，RI-07为双蒸水。
16.根据权利要求7-14任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述弱钝化处理之前进行固定处理，所述固定处理包括使含有DNA或蛋白质的固定液与所述基底表面接触，在恒温条件下进行DNA或蛋白质固定。
17.根据权利要求1或2所述的生物芯片在非诊断治疗目的的核酸或蛋白检测分析中的应用。
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