CN109600992A

CN109600992A - 治疗或预防阿尔茨海默病和相关病况的方法

Info

Publication number: CN109600992A
Application number: CN201780047500.2A
Authority: CN
Inventors: 马亚·科龙尤; 阿尔坦齐梅格·伦特森道尔吉; 优素福·科龙尤; 基思·L·布莱克
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2019-04-09
Also published as: KR20190009374A; US20210290670A1; KR102425326B1; WO2017201539A1; JP2019519515A; US20190290687A1; EP3458036B1; EP3458036A1; US20230414658A1; US11779600B2; EP3458036A4; US11058720B2

Abstract

本发明描述了通过增加OPN表达来治疗、预防阿尔茨海默病的症状和相关病况、降低阿尔茨海默病的症状和相关病况的可能性或减轻阿尔茨海默病的症状和相关病况的方法。本发明进一步提供了改善有需要的受试者的认知功能的方法。

Description

治疗或预防阿尔茨海默病和相关病况的方法

技术领域

本发明涉及阿尔茨海默病及相关病况的治疗和预防。

背景技术

本文的所有出版物均通过引用而并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用而并入。以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何明确或隐含引用的出版物是现有技术。

阿尔茨海默病与淀粉样蛋白β蛋白的脑积累，特别是神经毒性可溶的淀粉样蛋白β_1–42肽和淀粉样蛋白β斑块的细胞外聚集紧密相关。淀粉样蛋白前体淀粉样蛋白β形式的大幅度增加与神经炎症和含有异常tau蛋白(由MAPT编码)的下游细胞内神经纤维缠结有关。这些被认为是导致认知衰退的突触和神经元丧失的关键因素。散发性阿尔茨海默病中大脑淀粉样蛋白β的年龄依赖性积累似乎是由于淀粉样蛋白β_1–42的清除不足而不是由于其过量产生而导致，如在患有家族性阿尔茨海默病的病例中观察到的。

因此，本领域需要治疗、预防或降低阿尔茨海默病的可能性和解决相关病症的方法。

附图说明

示例性实施方案在参考附图中说明。本文公开的实施方案和附图意在被认为是说明性的而不是限制性的。

图1A-图1D描绘了根据本发明的各个实施方案，Aβ_1-42组装体引起原代皮层神经元中的突触丧失。

图2A-图2E显示根据本发明的各个实施方案，GA处理的MΦ保护免受Aβ_1-42引起的原代皮层神经元(CN)中的突触和神经炎丧失。

图3A-图3E描绘了根据本发明的各个实施方案，在AD+脑中GA免疫的和过继性转移的Mo中的突触保留。

图4A-图4D显示根据本发明的各个实施方案，明确定义的f/pf/oAβ_1-42组装体被MΦ(CD36，清道夫受体)与EEA1⁺内体中的细胞内6E10⁺-Aβ显著吞噬。

图5A-图5D显示根据本发明的各个实施方案，GA诱导MФ中的OPN表达以及fAβ_1-42的增强的细胞摄取。

图6A-图6B描绘了根据本发明的各个实施方案，通过在GA免疫的AD+小鼠脑中浸润MΦ引起的OPN水平增加。图6A)PBS或GA处理的AD小鼠脑的代表性荧光显微照片。图6B)定量多因素相关图分析(Pearson检验；每只动物)证明了在GA免疫和GA+Mo^BM处理的ADtg小鼠中OPN与增加的单核细胞浸润之间的显著线性关联，以及与Aβ斑块负荷的负相关关系。

图7A-图7C描绘了根据本发明的各个实施方案，OPN抑制对MФfAβ_1-42吞噬作用的影响。

图8A-图8D描绘了根据本发明的各个实施方案，稳定的Aβ组装体的产生和纯化。

图9A-图9B描绘了根据本发明的各个实施方案，A)体外实验(以天计的时间线)以及B)体内实验(以月计的时间线)的示意图。

图10A-图10F描绘了根据本发明的各个实施方案，ADtg(AD)和野生型(WT)小鼠的脑中的OPN表达模式。图10A)冠状脑切片的定量方案。在前囟-2.65mm处的小鼠脑的代表性Nissl染色图像。比例尺：1mm。扣带皮层(CC)(Comi等人，Journal of Alzheimer'sdisease:2010JAD 19:1143-1148)、海马体(HC)以及内嗅皮层(EC)(Comi等人，Journal ofAlzheimer's disease:2010JAD 19:1143-1148)包括在随后的定量分析中。图10B)来自ADtg和年龄匹配的WT小鼠的脑的代表性荧光显微照片，针对抗OPN、抗人Aβ(6E10)和细胞核(DAPI)进行免疫标记。在所有AD相关的脑区域(HC、CC和EC-箭头)中ADtg小鼠的Aβ斑块内和周围检测到OPN免疫染色。在WT动物中，未检测到Aβ或OPN免疫标记。图10C)ADtg小鼠中OPN的过氧化物酶标记。ADtg小鼠的HC和EC中的OPN免疫反应性(DAB)，在EC的II/III层中很多并且经常形成斑块样结构。图10D)CC和EC中的OPN、NeuN、Tuj1和GFAP表达。图10E)CC和HC中的OPN、Iba1和DAPI表达。图10F)13个月龄和24个月龄的小鼠的脑样品中的OPN ELISA。比例尺：100μm，除非另有描述；插图：10μm。

图11A-图11L描绘了根据本发明的各个实施方案，ADtg小鼠中的GA免疫增加了脑OPN表达，同时降低了Aβ斑块负荷。图11A)来自HC(20x，顶行)和CC(63x，中间行)区域的冠状脑切片的荧光显微照片显示了以下所有实验组的OPN和Aβ(6E10)表达模式：GA、GA+Mo^BM和PBS对照ADtg小鼠。DAPI用于给细胞核染色。下行包括单通道OPN(左下图)和Aβ(右下图)。与PBS对照相比，具有和不具有移植的Mo^BM的GA免疫组显示出增强的脑OPN表达和减少的斑块负荷。比例尺：100μm。图11B-图11D)定量IHC分析：图11B)总OPN免疫反应(IR)面积，图11C)6E10⁺斑块面积，以及图11D)每个切片的OPN-IR面积与6E10⁺斑块面积的比率。图11E)每个切片的OPN与4G8的比率。图11F)每个切片的OPN与Aβ₄₂水平的比率。图11G)脑中的OPN ELISA。图11H、图11I)在总脑区域(图11H)以及皮层区(图11I)中的OPN25IR面积和Aβ斑块负荷之间的相关性分析。图11J)OPN ELISA与Aβ斑块面积之间的相关性分析。图11K)OPN ELISA与不可溶的Aβ₄₂ELISA之间的相关性分析。用Pearson检验进行相关性分析。图11L)WT和AD小鼠脑中的OPN ELISA。指示了与PBS对照相比的平均值的倍数增加或百分比减少。每组n＝5-8只小鼠。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。

图12A-图12F描绘了根据本发明的各个实施方案，ADtg小鼠的GA免疫减少了血管脑淀粉样血管病(CAA)负担。血管Aβ和Aβ_1-40的减少与OPN呈负相关。图12A)PBS和GA免疫的ADtg小鼠中的Thio-S染色。图12B)在PBS、GA处理的和GA-Mo^BM处理的小鼠中的CAA评分。最后三张图表明了OPN ELISA与可溶的Aβ₄₀、OPN ELISA与不可溶的Aβ₄₀以及CAA评分与OPNELISA的相关性。图12C-图12F)：CAA评分与不可溶的Aβ₄₀(图12C)、CAA评分与可溶的Aβ₄₀(图12D)、CAA评分与ELISA不可溶的Aβ₄₂(图12E)以及CAA评分与可溶的Aβ₄₂(图12F)的相关性分析。

图13A-图13G描绘了根据本发明的各个实施方案，通过与Aβ斑块清除相关的浸润的单核细胞衍生的巨噬细胞进行的脑OPN表达。图13A-图13C)来自GA免疫的ADtg小鼠的CC和EC区域的冠状脑切片的荧光显微照片。主要负责OPN表达的Mo衍生的巨噬细胞(MФ)与Aβ斑块紧密相关。图13A)在GA免疫的ADtg小鼠脑中用组合的Iba1和CD45生物标志物免疫标记鉴定的浸润的Mo/MФ。还示出了脑OPN、Aβ(6E10)和细胞核(DAPI)。箭头指示浸润的表达OPN的Iba1⁺CD45^高MФ吞噬Aβ。图13B)通过以下第二种方法在GA+Mo^BM处理的ADtg小鼠脑中也鉴定了表达OPN的EC浸润的单核细胞：将GFP标记的CD115⁺单核细胞亚群过继性转移注射至有症状的ADtg小鼠的尾静脉中。表达GFP⁺CD45^高的单核细胞显示出高OPN表达，并且可与常驻小神经胶质细胞(GFP^–CD45^中低)区分开。图13C)表达OPN的Iba-1⁺髓单核细胞与斑块相关，尤其是在EC的边界上的斑块。图13D-图13E)穿过细胞体和沿Iba1⁺过程的囊泡隔室中的亚细胞OPN的Puncta染色模式。在核周亚区域中信号特别强烈。比例尺：10μm。图13F)HC、CC、EC和组合的脑区域(脑)中的OPN⁺CD45⁺细胞计数。GA免疫组的浸润OPN⁺髓单核细胞的数目显著增加。指示了与PBS对照相比平均值的倍数增加。图13G)相关性分析(Pearson检验)发现OPN表达与浸润Iba1+CD45高巨噬细胞之间存在强烈的、显著的线性关联。每组n＝5-8只小鼠。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。

图14A-图14J描绘了根据本发明的各个实施方案，GA上调BM衍生的巨噬细胞的原代培养物中的OPN表达。图14A)体外研究的实验程序：从WT小鼠(8至12周龄)分离骨髓，并将该骨髓在富含MCSF的培养基中培养6-7天以分化成巨噬细胞(MФ^BM)。在第6天，用GA、siRNA、米诺环素或GA和siRNA处理细胞过夜。在第7天，在一部分实验中加入纤维状Aβ(fAβ_1-42)并进行吞噬作用测定。在吞噬作用前3小时进行布雷菲德菌素A(BFA)处理。图14B-图14C)在暴露于Aβ之前，未进行BFA处理(图14B)或用BFA预处理(图14C)的体外MФ^BM和GA-MФ^BM细胞的荧光显微照片。用抗OPN抗体对OPN进行免疫染色。MФ^BM表达OPN并且GA处理增加OPN表达。(图14B：插图)亚细胞OPN位于MФ^BM中的运输囊泡内。图14C)BFA抑制OPN分泌后的圆形MФ^BM。图14D)OPN免疫反应区域的定量ICC显示了在GA处理之后，暴露于Aβ之前，在有和没有BFA抑制的情况下的MФ^BM中OPN的上调。图14E)来自GA处理和未处理的MФ^BM的细胞裂解物中OPN水平的定量ELISA。图14F)使用山羊单克隆抗OPN抗体进行的来自上述实验组的细胞裂解物的代表性Western印迹图像。图14G)Western印迹的定量。结果反映了ICC和ELISA数据，表明不论Aβ暴露如何，GA均显著诱导MФ^BM中的OPN表达。指示了与PBS对照相比平均值的倍数增加。BFA处理和未处理的细胞之间的比较显示了在短时间内(1小时内)OPN的大量积累。图14H)高尔基体、OPN和DAPI染色的荧光显微照片。图14I)OPN、EEA1和DAPI染色的荧光显微照片。图14J)用GA处理不同时间点的WT小鼠的OPN ELISA。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。比例尺：20μm，插图比例5μm。

图15A-图15P描绘了根据本发明的各个实施方案，GA处理的巨噬细胞对Aβ原纤维摄取的OPN依赖性增加。用fAβ_1-42刺激30min的原代培养物中MФ^BM的Aβ摄取和OPN表达的代表性荧光显微照片和定量分析。图15A)更高放大倍数的Z-stack图像，其显示6E10⁺-Aβ的细胞内摄取以及亚细胞OPN表达模式。图15B-图15C)GA处理的与未处理的MФ^BM中OPN表达和细胞内Aβ的定量ICC。GA处理持续24小时。在GA处理后发现增加的OPN表达和增强的fAβ_1-42细胞摄取。图15D-图15E)GA处理的与未处理的MФ^BM中OPN水平和细胞内Aβ_1-42的定量ELISA。图15F)WT、KO和GA处理的WT和KO小鼠的OPN、CD36、6E10和DAPI染色的荧光显微照片。图15G-图15H')(图15)未处理的或(图15H-15H')GA处理的并用针对OPN、CD68和6E10的抗体共标记的MФ^BM的显微照片。图15H-15H')用GA预处理的MФ^BM显示增强的fAβ_1-42摄取。图15I-图15J)来自MФ^BM和GA-MФ^BM的细胞裂解物的ELISA分析。图15K)GA处理的与未处理的MФ^BM中Aβ₄₀摄取的定量ICC。图15L)未处理的与用siRNA^OPN转染的MФ^BM细胞的代表性显微照片，显示了fAβ_1-42吞噬作用。图15M-图15N)定量ICC显示了在MФ^BM和GA-MФ^BM中siRNA介导的敲低OPN后的降低的OPN表达和受损的fAβ_1-42吞噬作用。阴性对照杂乱的(scrambled)siRNA(Franzen和Heinegard)对OPN表达或Aβ吞噬作用没有影响。在OPN敲低后，GA的添加对OPN表达或Aβ摄取几乎没有或没有影响。图15O)未处理的和siRNA转染的OPN ELISA。图15P)对照、敲除和GA处理的敲除中的Aβ摄取。指示了与PBS对照相比平均值的倍数增加或百分比减少。比例尺：10μm。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。

图16A-16J描绘了根据本发明的各个实施方案，OPN介导巨噬细胞中GA获得的促愈合表型。图16A)未处理的或用GA或siRNA^OPN预处理过夜并针对OPN进行免疫染色的原代培养物中的MФ^BM的荧光显微照片。下行通过Zeiss Axiovision软件显示了MФ^BM细胞长度。图16B)细胞长度测量的定量分析。MФ^BM向抗炎、促愈合表型的极化与延长的细胞形状相关，这是由GA处理和扩增的OPN表达引起的。siRNA引起的OPN敲低产生更短的细胞。图16C)用GA或米诺环素(M)处理24小时然后暴露于fAβ_1-42持续30min的MФ^BM的荧光图像。对iNOS和6E10进行免疫染色的细胞。图16D-图16E)定量ICC显示米诺环素处理增加iNOS表达，其反过来降低fAβ_1-42吞噬作用。图16F)对MMP-9、6E10和SCARA-1进行免疫染色的MФ^BM的荧光图像。图16G)定量ICC显示GA处理增加体外MMP-9表达。图16H)WT、OPN KO和GA处理的OPN KO中的MMP9面积(μm²/细胞)。图16I-图16J)用兔抗OPN抗体进行的Western印迹及其相应的定量条带密度分析显示，用GA处理使来自金属蛋白酶(MMP)蛋白水解的OPN片段增加，这与升高的MMP-9产生一致。OPN分泌及其通过MMP介导的巨噬细胞向抗炎表型极化的蛋白水解，导致扩增的fAβ_1-42吞噬作用。指示了与PBS对照相比平均值的倍数增加或百分比减少。比例尺：50μm。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。

图17A-图17C描绘了根据本发明的各个实施方案，OPN在与AD病理学无关的脑区域中的表达模式。图17A)来自ADtg和年龄匹配的WT小鼠脑的冠状切片的荧光显微照片，其中针对抗OPN、Iba1⁺小神经胶质细胞和巨噬细胞以及细胞核(DAPI)进行免疫标记。在WT和ADtg小鼠的纹状体中检测到OPN免疫染色的模式。OPN未与Iba1⁺小神经胶质细胞/巨噬细胞进行共标记，但对神经元进行免疫标记。图17B)WT与ADtg小鼠中OPN的过氧化物酶成像。WT和ADtg小鼠的纹状体中的OPN免疫反应性(DAB)对神经元具有选择性，但在小神经胶质细胞或巨噬细胞中未检测到。图17C)来自ADtg和年龄匹配的WT小鼠脑的冠状切片的荧光显微照片，其中针对抗OPN、Tuj1神经元和细胞核(DAPI)进行免疫标记。比例尺：100μm。

图18A-18D描绘了根据本发明的各个实施方案，在ADtg小鼠中进行基于免疫的干预后通过浸润的单核细胞的增强的脑OPN表达。图18A-图18B)针对图18A)OPN阳性面积以及图18B)每个切片的OPN阳性面积与6E10⁺斑块面积的比率，评估了脑切片(CC、EC和HC)的定量IHC分析。与PBS对照相比，GA和GA+Mo^BM组显示了在所有脑区域中增加的OPN表达。图18B)结果显示GA和GA+Mo^BM处理后每个斑块的OPN表达明显增多。图18C)CAA评分、OPN ELISA与可溶的Aβ₄₂ELISA的相关性分析，HC中的CAA评分与OPN ELISA的相关性分析以及CC中的CAA评分与OPN ELISA的相关性。图18D)HC和CC中的CAA评分与可溶的Aβ₄₀的相关性分析以及HC和CC中的CAA评分与不可溶的Aβ₄₀的相关性。指示了与PBS对照相比平均值的倍数增加。每组N＝5-8只小鼠。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。

图19A-图19K描绘了根据本发明的各个实施方案，脑OPN与斑块负荷负相关，并且与浸润的单核细胞和MMP-9直接相关。图19A)先进的定量多因素相关图分析证明了在GA免疫的和GA+Mo^BM处理的ADtg小鼠中OPN与增加的单核细胞浸润之间的显著线性关联。发现了OPN和Aβ斑块负荷之间的负相关关系(每个切片均进行相关性分析)。图19B)其他的相关性分析验证了OPN:6E10与CD45hi:6E10(浸润的单核细胞)之间的显著的正线性相关性。图19C-19D)相关性分析证明了ADtg小鼠中OPN与MMP-9之间(图19)以及表达OPN的CD45^hi单核细胞与MMP-9表达之间的显著线性关联。结果显示了总脑MMP-9与OPN水平之间的直接相关性，以及浸润的表达OPN的单核细胞与脑MMP-9水平之间的更强的相关性。使用Pearson检验进行相关性分析。图19E-图19F)OPN ELISA与MMP-9(图19E)和MCP-1(图19F)的相关性分析。图19G)PBS、GA处理的和GA处理的Mo^BM中CAA评分的相关性分析。图19H-图19K)脑OPN表达与突触后密度(图19H-图19I)和降低的认知功能(图19J-图19K)相关。每组N＝5-8只小鼠。*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001，****p<0.00001。

图20描绘了根据本发明的各个实施方案，用ADtg小鼠的单核细胞进行GA免疫和血液富集减少了认知沉积并增加了突触后保留。

发明内容

本发明的各个实施方案提供了在有需要的受试者中治疗、预防阿尔茨海默病或降低阿尔茨海默病的可能性，减轻阿尔茨海默病的症状，救治突触结构和/或认知功能，增强病理性淀粉样蛋白β形式的清除或抑制神经元结构和功能的衰退的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于所述受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向所述受试者施用足以增加所述OPN水平的量的所述组合物。

在各个实施方案中，所述组合物包含表达OPN的先天免疫细胞、重组OPN、OPN片段、OPN衍生物、OPN模拟物、OPN类似物或其组合。

在各个实施方案中，所述组合物刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。在各个其他实施方案中，所述先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。

在一些实施方案中，所述单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。在一些其他实施方案中，所述单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。在其他实施方案中，所述先天免疫细胞是吞噬细胞。

在各个实施方案中，施用醋酸格拉替雷(GA)以刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。在一些实施方案中，离体或体内刺激所述先天免疫细胞。

在各个实施方案中，通过过继性细胞转移或骨髓移植将表达OPN的先天免疫细胞施用于所述受试者。在各个实施方案中，所述先天免疫细胞过表达OPN。

在各个实施方案中，所述组合物通过选自直接递送至受试者、病毒载体递送、脂质体递送系统或纳米药物递送系统的方法进行施用。

在各个实施方案中，阿尔茨海默病的症状选自记忆丧失、认知的非记忆方面的衰退、推理或判断受损、行为改变、执行多步骤任务、幻觉、妄想、偏执及其组合。

在各个实施方案中，所述组合物的施用导致MMP-9增加。

在各个实施方案中，升高的OPN表达导致所述受试者的错误折叠的蛋白质的水平降低。在各个其他实施方案中，所述错误折叠的蛋白质是淀粉样蛋白β(Aβ)。在其他实施方案中，所述Aβ是Aβ₄₀和/或Aβ₄₂。

本发明的各个实施方案还提供了改善有需要的受试者的认知功能的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于所述受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向所述受试者施用足以增加所述OPN水平的量的所述组合物。

在一些实施方案中，所述组合物刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。在各个其他实施方案中，所述先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。在其他实施方案中，所述单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115+单核细胞)或其组合。在其他实施方案中，所述单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。在某些实施方案中，所述先天免疫细胞是吞噬细胞。

在各个实施方案中，所述组合物包含醋酸格拉替雷(GA)。在各个其他实施方案中，离体或体内刺激所述先天免疫细胞。

在各个实施方案中，所述组合物的施用导致MMP-9增加。在各个其他实施方案中，OPN的水平增加导致所述受试者的错误折叠的蛋白质的水平降低，所述受试者的炎症减少，所述受试者的突触再生增加，巨噬细胞被募集至所述受试者的淀粉样蛋白β(Aβ)斑块部位或其组合。

在其他实施方案中，其中所述错误折叠的蛋白质是Aβ。在其他实施方案中，所述Aβ是Aβ₄₀和/或Aβ₄₂。

在各个实施方案中，可以将具有增加的OPN表达的先天免疫细胞施用于有需要的受试者的血液和/或脑。

具体实施方式

本文引用的所有参考文献均通过引用而整体并入，如同全文阐述。除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版,Revised,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；以及Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。关于如何制备抗体的参考文献，参见D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor NY,2013)；Kohler和Milstein,(1976)Eur.J.Immunol.6:511；Queen等人，美国专利号5,585,089；以及Riechmann等人，Nature 332:323(1988)；美国专利号4,946,778；Bird,Science 242:423-42(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Ward等人，Nature334:544-54(1989)；Tomlinson I.和Holliger P.(2000)MethodsEnzymol,326,461-479；Holliger P.(2005)Nat.Biotechnol.九月；23(9):1126-36。

本领域技术人员将认识到许多类似于或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料可用于本发明的实践中。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。

如本文所用，“OPN”是指骨桥蛋白，其参考包括全长、功能片段、生物活性片段。在一些实施方案中，还可以参考OPN类似物、衍生物和/或模拟物。

如本文所用，“过继性细胞转移”是指细胞向受试者的转移。该细胞可能来自受试者或来自另一个个体(供体)。

如本文所用，“先天免疫细胞”是指先天免疫系统的细胞，其包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或天然杀伤细胞。

如本文所用，术语“治疗”或“改善”在涉及疾病、病症或医学病况中使用时，是指治疗性处理和防范性或预防性措施两者，其中目的在于预防、逆转、减轻、改善、抑制、缓解、减缓或停止症状或病况的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病况的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病、病症或医学病况的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的症状进展或恶化。而且，“治疗”可能意味着追求或获得有益结果，或者即使治疗最终不成功也会降低个体发展病况的可能性。需要治疗的受试者包括那些已经患有该病况的受试者以及那些容易患有该病况的受试者或待预防该病况的受试者。

术语“治疗有效量”是指细胞群、刺激的或遗传修饰的细胞、抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的其他药物的量。在阿尔茨海默病的情况下，治疗有效量的OPN可以降低阿尔茨海默病症状的严重程度。这些包括但不限于记忆丧失、认知的非记忆方面的衰退、推理或判断受损、行为改变、执行多步骤任务、幻觉、妄想和偏执。

如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴(Rhesus)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物例如家猫和犬科动物，例如狗、狐狸、狼。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。在实施方案中，受试者是哺乳动物。如本文所用，“哺乳动物”是指哺乳动物类的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类动物，如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不指示特定年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者以及胎儿(无论是男性还是女性)，均应包括在该术语的范围内。

如本文所述，本发明人发现骨桥蛋白的上调以及GA免疫的ADtg小鼠的内嗅皮层、扣带皮层和海马体中的淀粉样蛋白β蛋白(Aβ)斑块减少。结合GA和CD115⁺单核细胞的外周血富集的治疗进一步增加了残留的Aβ斑块周围的骨桥蛋白水平。骨桥蛋白主要通过参与Aβ-斑块摄取的浸润的单核细胞衍生的巨噬细胞表达。证实体内发现的体外研究表明GA直接上调骨髓来源的巨噬细胞中的骨桥蛋白表达，并进一步促进Aβ高度吞噬的抗炎表型。不受任何特定理论的束缚，该研究显示了骨桥蛋白作为GA激活的巨噬细胞在AD模型中的治疗作用的介导物的新作用。

本发明的各个实施方案至少部分地基于这些发现并满足了本领域升高OPN的方法，在有需要的受试者中治疗、预防阿尔茨海默病或降低阿尔茨海默病的可能性的方法，以及改善认知功能的方法的需要。

阿尔茨海默病的治疗

本发明的各个实施方案提供了在有需要的受试者中治疗、预防阿尔茨海默病或降低阿尔茨海默病的可能性，减轻阿尔茨海默病的症状，救治突触结构和/或认知功能，增强病理性淀粉样蛋白β形式的清除或抑制神经元结构和功能的衰退的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案还提供了治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案还提供了预防阿尔茨海默病的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案还提供了降低阿尔茨海默病的可能性的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案还提供了减轻阿尔茨海默病的症状的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案还提供了救治阿尔茨海默病中的突触结构的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案还提供了救治阿尔茨海默病中的认知功能的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案提供了增强病理性淀粉样蛋白β形式的清除的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

本发明的各个实施方案提供了抑制神经元结构和功能的衰退的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

在一些实施方案中，单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。在一些其他实施方案中，单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。在一些实施方案中，单核细胞过表达OPN。在其他实施方案中，巨噬细胞过表达OPN。在其他实施方案中，先天免疫细胞是吞噬细胞。

在各个实施方案中，所述组合物包含醋酸格拉替雷(GA)。在一些实施方案中，离体或体内刺激先天免疫细胞。

在各个实施方案中，通过过继性细胞转移或骨髓移植将表达OPN的先天免疫细胞施用于受试者。在各个实施方案中，先天免疫细胞过表达OPN。

在各个实施方案中，所述组合物的施用导致MMP-9增加。

在各个实施方案中，升高的OPN表达导致受试者的错误折叠的蛋白质的水平降低。在其他实施方案中，错误折叠的蛋白质是淀粉样蛋白β(Aβ)。在其他实施方案中，Aβ是Aβ₄₀和/或Aβ₄₂。在各个实施方案中，错误折叠的Aβ蛋白包含斑块和/或血管Aβ沉积物。

本发明的各个实施方案还提供了治疗、预防阿尔茨海默病或降低阿尔茨海默病的可能性，减轻阿尔茨海默病的症状，救治突触结构和/或认知功能，增强病理性淀粉样蛋白β形式的清除或抑制神经元结构和功能的衰退的方法，该方法包括：富集具有单核细胞的血液；以及刺激单核细胞，从而增加脑中的骨桥蛋白(OPN)表达。

在各个实施方案中，进行过继性细胞转移或骨髓移植以施用单核细胞并富集具有单核细胞的血液。在各个实施方案中，单核细胞过表达OPN。在一些实施方案中，使用过继性细胞转移施用的单核细胞是骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。在其他实施方案中，用醋酸格拉替雷(GA)刺激单核细胞。在各个实施方案中，离体或体内刺激单核细胞。

在各个实施方案中，富集具有单核细胞的血液包括施用从骨髓和/或血液收集的干细胞。在各个其他实施方案中，富集具有单核细胞的血液包括施用CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)。在其他实施方案中，单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。在一些实施方案中，单核细胞过表达OPN。在其他实施方案中，巨噬细胞过表达OPN。

在各个实施方案中，阿尔茨海默病的症状选自记忆丧失、认知的非记忆方面的衰退、推理或判断受损、行为改变、无法执行多步骤任务、幻觉、妄想、偏执及其组合。

在各个实施方案中，刺激单核细胞引起MMP-9增加。

本发明的各个实施方案还提供了治疗阿尔茨海默病的方法。本发明的各个实施方案提供了减轻阿尔茨海默病的症状的方法。阿尔茨海默病的症状包括但不限于记忆丧失、认知的非记忆方面的衰退(例如，找词、视觉/空间问题)、推理或判断受损、行为改变、执行多步骤任务、幻觉、妄想和偏执。本发明的各个实施方案提供了救治突触结构和/或认知功能的方法。本发明的各个实施方案提供了增强病理性淀粉样蛋白β形式的清除和抑制神经元结构和功能的衰退的方法。

在各个实施方案中，所述方法包括对受试者进行骨髓移植。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括施用醋酸格拉替雷(GA)。在骨髓移植后不一定需要进行GA施用。实际上，GA可以在骨髓移植之前、基本上同时和/或之后施用。

在一些实施方案中，骨髓移植是同种异体骨髓移植。在一些实施方案中，骨髓移植是自体骨髓移植。在一些实施方案中，进行骨髓移植包括施用从骨髓收集的干细胞。在其他实施方案中，进行骨髓移植包括施用从血液收集的干细胞(例如，经由白细胞去除术)。

在各个实施方案中，所述方法包括对受试者进行过继性细胞转移。

在一些实施方案中，进行过继性细胞转移包括向受试者施用巨噬细胞。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括施用醋酸格拉替雷(GA)。在过继性细胞转移后不一定需要进行GA施用。实际上，GA可以在过继性细胞转移之前、基本上同时和/或之后施用。

在一些实施方案中，所述巨噬细胞是自体巨噬细胞。在其他实施方案中，该巨噬细胞是同种异体巨噬细胞。在一些实施方案中，该巨噬细胞是单核细胞衍生的巨噬细胞。如本文所用的单核细胞衍生的巨噬细胞是指从单核细胞分化的巨噬细胞。在具体的实施方案中，进行过继性细胞转移包括向受试者施用单核细胞衍生的巨噬细胞，其中该单核细胞从骨髓获得。在一些实施方案中，该巨噬细胞已经用醋酸格拉替雷(GA)处理。在具体的实施方案中，该方法包括向受试者施用已经用GA处理的单核细胞衍生的巨噬细胞。

在一些实施方案中，进行过继性细胞转移包括向受试者施用骨髓来源的单核细胞。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括施用醋酸格拉替雷(GA)。在过继性细胞转移后不一定需要进行GA施用。实际上，GA可以在过继性细胞转移之前、基本上同时和/或之后施用。

在一些实施方案中，骨髓来源的单核细胞是自体骨髓来源的单核细胞。如本文所用的骨髓来源的单核细胞是指从骨髓获得的单核细胞。在其他实施方案中，骨髓来源的单核细胞是同种异体骨髓来源的单核细胞。在一些实施方案中，骨髓来源的单核细胞是CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)。在一些实施方案中，该骨髓来源的单核细胞已经用醋酸格拉替雷(GA)处理。在具体的实施方案中，该方法包括向受试者施用已经用GA处理的CD115⁺骨髓来源的单核细胞。

升高骨桥蛋白的方法

本发明的各个实施方案提供了一种升高骨桥蛋白(OPN)的方法，该方法包括刺激先天免疫细胞中的OPN表达的增加，从而升高OPN。

本发明的各个实施方案提供了一种升高骨桥蛋白(OPN)的方法，该方法包括施用表达OPN的先天免疫细胞，从而升高OPN。

在各个实施方案中，OPN是全长OPN或其功能片段。在各个实施方案中，通过用醋酸格拉替雷(GA)刺激先天免疫细胞来增加OPN表达。在一些实施方案中，离体或体内刺激先天免疫细胞。

在各个实施方案中，所述方法进一步包括向有需要的受试者施用具有增加的OPN表达的先天免疫细胞。在一些实施方案中，将具有增加的OPN表达的先天免疫细胞施用于有需要的受试者的血液和/或脑。

在各个实施方案中，所述先天免疫细胞是吞噬细胞。在其他实施方案中，该先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。在其他实施方案中，该单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。在一些其他实施方案中，该单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。

在各个实施方案中，所述方法进一步包括靶向递送全长OPN或其功能片段。在各个实施方案中，用于靶向递送全长OPN或其功能片段的方法选自：递送重组OPN、病毒载体递送、经由脂质体递送系统、递送含有OPN的外来体或纳米药物递送系统。

在各个实施方案中，升高OPN导致受试者中阿尔茨海默病的预防或阿尔茨海默病的可能性的降低和/或阿尔茨海默病症状的改善。

在各个实施方案中，OPN是全长OPN或其功能片段。

在各个实施方案中，通过靶向递送全长OPN或其功能片段来升高OPN。在各个实施方案中，用于靶向递送全长OPN或其功能片段的方法选自：递送重组OPN、病毒载体递送、经由脂质体递送系统、递送含有OPN的外来体或纳米药物递送系统。

在各个实施方案中，OPN的递送升高了脑中的OPN并导致治疗和/或预防受试者的阿尔茨海默病或降低受试者的阿尔茨海默病的可能性。更具体地，本发明包括通过向哺乳动物施用治疗有效量的基于OPN的疗法来治疗阿尔茨海默病和减少阿尔茨海默病的进展的方法。本发明还包括将OPN递送至患有阿尔茨海默病的哺乳动物的脑组织的方法。在各个实施方案中，哺乳动物是人。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但据信基于OPN的疗法的施用将调节脑中淀粉样蛋白斑块的水平和/或通过预防其额外的积累，并且可以通过有利地修饰循环单核细胞和/或单核细胞衍生的巨噬细胞的表型来有效治疗阿尔茨海默病。如本文所示，基于OPN的疗法的施用经由巨噬细胞来介导Aβ清除，所述巨噬细胞朝向更加促愈合、抗炎和高度吞噬的表型极化。本领域普通技术人员将容易理解，这些作用有益于阿尔茨海默病的治疗。

用于升高OPN的方法包括但不限于：1)用GA进行皮下免疫，导致内源性OPN增加，2)外周血或在病毒载体中表达的重组OPN的鼻腔递送(即AAV8或AAV9)，3)含有OPN的外来体的外周注射，4)过继性转移至用GA预处理以过表达OPN的单核细胞的外周血，以及5)将OPN包封在脂质体递送系统中以外周注射到血液中或口服给予。

在各个实施方案中，通过递送重组OPN、病毒载体递送、经由脂质体递送系统、递送含有OPN的外来体或纳米药物递送系统来实现升高脑中的OPN。

本发明的各个实施方案提供了通过施用治疗有效量的重组OPN将OPN递送至受试者的脑来升高骨桥蛋白(OPN)的方法。

如本文所用，术语“重组DNA分子”是指由通过本领域技术人员已知的分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成的DNA分子，包括但不限于遗传重组(即，分子克隆)。

如本文所用，术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指从重组DNA分子表达的蛋白质分子。

重组OPN可以通过使用包括重组方法和化学合成的公知方法进行合成。通过将包含编码肽的核酸的载体引入合适的宿主细胞来产生肽的重组方法是本领域熟知的，并且还可以使用本领域熟知的方法进行化学合成。参见例如，Bodanszky,M.,Principles ofPeptide Synthesis,Springer-Verlag,New York,NY(1984)；W.C.Chan和P.D.White(编著)Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,Oxford UniversityPress,Cary,NC(2000)；N.L.Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis,CRC Press,Boca Raton,FL(2005)；J.Jones,Amino Acid and Peptide Synthesis,第2版,OxfordUniversity Press,Cary,NC(2002)；以及P.Lloyd-Williams、F.Albericio和E.Giralt,Chemical Approaches to the synthesis of peptides and proteins,CRC Press,BocaRaton,FL(1997)，上述所有文献的内容均通过引用并入本文。

用于克隆和表达本发明的重组蛋白/多肽的系统包括在重组技术中众所周知的各种微生物和细胞。这些包括，例如，大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和酵母菌的各种菌株，以及哺乳动物、酵母和昆虫细胞。OPN可以作为多肽或融合蛋白产生。用于产生肽的合适载体是已知的，并且可从私人和公共实验室和贮藏所以及商业供应商处获得。然后转染能够表达基因产物的受体细胞。在允许表达重组基因产物的条件下培养转染的受体细胞，该重组基因产物从培养物中回收。可以使用宿主哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS-1细胞。许多这样的非致病性病毒通常用于人类基因治疗，并且作为其他疫苗剂的载体，并且是本领域技术人员已知的且可选择的。本领域技术人员通过参考已知技术可以选择其他合适的宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选和产物生产和纯化的方法。

重组OPN可包含全长OPN或其功能片段。产生的重组OPN可以在病毒载体中表达，包封在脂质体中，在外来体上表达或包含在纳米药物递送系统中。

本发明的各个实施方案还提供了通过使用病毒载体递送将OPN递送至受试者的脑来升高骨桥蛋白(OPN)的方法。在各个实施方案中，向受试者施用OPN病毒载体。

“载体”是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及病毒载体。

在各个实施方案中，病毒载体是AAV载体。“AAV载体”是指衍生自任何腺相关病毒血清型的任何载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7、AAV-8、AAV-9和AAV-10等。AAV载体可以具有全部或部分缺失(优选Rep和/或Cap基因)但保留功能性侧翼ITR序列的一种或多种AAV野生型基因。功能性ITR序列通常是AAV基因组的救治、复制、包装和潜在染色体整合所必需的。因此，本文将AAV载体定义为至少包括顺式复制和病毒的包装(例如，功能性ITR)所需的那些序列。ITR不必是野生型核苷酸序列，并且可以改变(例如，通过核苷酸的插入、缺失或置换)，只要该序列提供功能性救治、复制和包装。

“重组病毒”是指已经发生遗传改变(例如，通过向颗粒中添加或插入异源核酸构建体)的病毒。

“AAV病毒体”是指完整的病毒颗粒，如野生型(“wt”)AAV病毒颗粒(即，包括与AAV衣壳蛋白外壳相关的线性单链AAV核酸基因组)。在这方面，具有互补意义(即“有义”或“反义”链)的单链AAV核酸分子可以包装成任何一种AAV病毒体；两条链具有同样的传染性。此外，AAV衣壳蛋白外壳可以来自各种AAV血清型中的任何一种，这取决于AAV病毒体的靶标。

“重组AAV病毒体”或“rAAV病毒体”在本文中定义为由AAV蛋白壳组成的感染性复制缺陷型病毒，其包封两侧翼均为AAV ITR的感兴趣的异源DNA分子(例如，编码OPN的基因)。rAAV病毒体可以在合适的宿主细胞中产生，该宿主细胞中引入了AAV载体、AAV Rep和Cap功能以及辅助病毒功能。以这种方式，使宿主细胞能够产生AAV复制和衣壳蛋白，该蛋白是将AAV载体(即，含有感兴趣的重组核苷酸序列)复制和包装成重组病毒体颗粒以用于随后的基因递送所必需的。完整的转基因可以由启动子、编码序列(通常是cDNA)和多腺苷酸化信号组成。

转基因还可以包括调节序列和内含子区域。调节转基因表达的启动子可包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。术语“启动子区”在本文中以其普通含义使用，是指包括DNA调节序列的核苷酸区，其中调节序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’-方向)编码序列的转录的基因。

“基因”或“编码序列”或“编码”特定蛋白质的序列是当被置于合适的调节序列的控制下时，体外或体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。

术语“转染”在本文中用于指细胞对外来DNA的摄取。当外来DNA被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratories,New York，Davis等人(1986)Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier，以及Chu等人(1981)Gene 13:197。这样的技术可用于将一种或多种外源DNA部分，如质粒载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。该术语指遗传物质的稳定和瞬时摄取。

术语“转导”表示经由任何基因递送方法(包括病毒载体递送)体内或体外将DNA分子递送至受体细胞。

使用已知技术构建AAV载体以至少提供转录方向上的组分，(a)包括转录起始区的控制元件，(b)感兴趣的OPN DNA，和(c)转录终止区。此外，可以结合本发明的备选实施方案使用与OPN编码序列充分同源从而显示与OPN编码序列基本相似的功能性质的任何编码序列。选择控制元件以在靶细胞中起作用。含有所述组分的所得构建体可以与功能性AAV ITR序列结合(5'和3')。用于本发明载体的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列，并且可以改变(例如，通过核苷酸的插入、缺失或置换)。另外，AAV ITR可以来源于几种AAV血清型中的任何一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7、AAV-8、AAV-9、AAV-10等。

例如，包括对应于OPN编码序列的异源DNA的AAV载体可以通过本领域已知的任何常规技术产生。在各个实施方案中，AAV载体通过以下方法产生：(i)提供包含OPN或其片段的第一质粒，(ii)提供与第一质粒互补的第二质粒并且第二质粒包含用于救治和包装的组分，(iii)将第一和第二质粒共转染到宿主细胞，以及(iv)从所述共转染的宿主细胞产生一定量的所述AAV载体，其中选择所述第一和第二质粒对，使得所述rAAV载体靶向递送至特定组织类型。如本领域技术人员将容易认识到的，也可以使用任何数目的其他方法。

OPN基因的活性片段是指编码OPN片段的核苷酸序列或保留与OPN蛋白相同或基本相同的生物活性的氨基酸序列。在各个实施方案中，OPN蛋白在靶向脑的启动子的控制下负载到病毒载体上。

本发明的各个实施方案还提供了通过使用脂质体递送系统将OPN递送至受试者的脑来升高骨桥蛋白(OPN)的方法。

脂质体递送系统能够捕获亲脂性和亲水性化合物两者，这使得很多种药物能够被脂质体包封。如本文所用，术语“脂质体”是指由一个或多个包围离散水性空间的同心脂质双层组成的磷脂囊泡。大的水性中心和生物相容的脂质外部允许递送多种大分子，如DNA、蛋白质和成像剂。

作为药物递送系统，脂质体提供了若干优点，包括生物相容性、自组装能力、携带大量药物有效负载的能力以及可以修改以控制其生物学特征的广泛的物理化学和生物物理特性。脂质体内的包封保护化合物免于循环中的早期灭活、降解和稀释。

脂质体可通过很多种方法产生。制备脂质体递送系统的方法是已知的。参见例如，Gabizon等人，Cancer Research(1982)42:4734；Cafiso,Biochem Biophys Acta(1981)649:129；Szoka,Ann Rev Biophys Eng(1980)9:467；美国专利号4,882,165；以及Liposomes,Marcel Dekkev,Inc.,New York(1983)中的Deamer和User,"LiposomePreparation:Methods and Mechanisms"。

多层囊泡(MLV)通过干燥脂质粉末的水合形成。使用探针式声波仪进行超声波处理或通过弗氏压碎器(French press)进行处理可产生小的单层囊泡(SUV)。挤压技术是用于体外和体内研究的SUV脂质体生产的最广泛使用的方法，因为它们易于生产、易于选择粒径、批次间重现性并且不受溶剂和/或表面活性剂污染。用于脂质体生产的溶剂注射和洗涤剂透析技术产生不均匀的粒度分布，并且由于在这些粒子中保留膜杂质，因此不常用于生物物理或生物化学实验。待封装的材料可被动地包埋或“远程”负载。

将药物负载到脂质体中的方法是本领域已知的。参见例如Ostro和Cullis,Am.J.Hosp.Pharm.456:1567-1587(1989)，以及上述Liposomes中的Juliano,"Interactions of Proteins and Drugs with Liposomes"。大多数药物在脂质体形成时通过使药物与起始材料共溶解而负载。药物所在的脂质体(腔或膜)的位点取决于药物的性质。

脂质体递送系统可用于将多种外源分子递送至细胞的细胞质，包括诊断剂、能够调节或改变细胞功能的分子以及用于治疗疾病的分子。这些药剂/分子可以经由脂质体囊泡通过将水溶性化合物包封在它们的水腔中或者通过在膜本身内携带脂溶性化合物来捕获。外源分子可包括但不限于：肽、寡肽、蛋白质、脱辅基蛋白、糖蛋白、抗原及其抗体、受体和其他膜蛋白、蛋白质类似物、酶、辅酶、酶抑制剂、氨基酸及其衍生物、激素、脂质和磷脂。其他分子包括核苷酸；寡核苷酸；多核苷酸；及其领域认可的和生物功能性类似物和衍生物，包括，例如；甲基化多核苷酸和具有硫代磷酸酯键的核苷酸类似物；质粒、粘粒、人工染色体和其他核酸载体。

在各个实施方案中，药剂/分子是OPN、其功能/生物活性片段。在各个实施方案中，药剂/分子是阿尔茨海默病治疗剂。阿尔茨海默病的治疗剂包括但不限于胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐(Aricept)、加兰他敏(Razadyne)和利凡斯的明(Exelon)；美金刚(Namenda)；抗抑郁药和抗焦虑药，如氯硝西泮(Klonopin)和劳拉西泮(Ativan)。在其他实施方案中，药剂/分子是阿尔茨海默病治疗剂和OPN的组合。

在各个实施方案中，OPN被包封在脂质体内以增强其向受试者的脑的递送。在各个其他实施方案中，脂质体OPN向脑的递送导致治疗和/或预防受试者的阿尔茨海默病或降低受试者的阿尔茨海默病的可能性。

本发明的各个实施方案提供了通过使用纳米药物递送系统将OPN递送至受试者的脑来升高骨桥蛋白(OPN)的方法。

纳米药物递送系统可用于向脑递送治疗活性分子穿过血脑屏障，以治疗有需要的受试者。

在各个实施方案中，纳米药物递送系统包括重组OPN或其功能/生物活性片段。在各个实施方案中，纳米药物递送系统的目标是穿过血脑屏障以到达脑。在各个其他实施方案中，纳米药物递送系统在脑中的脑淀粉样蛋白斑块位点处释放。

纳米药物递送方法包括但不限于使用外来体来递送治疗、前药、肽掩蔽、受体介导的透化剂(permabilitizer)或纳米颗粒。

可以对外来体进行修饰以含有重组OPN或其功能/生物活性片段。在各个实施方案中，通过施用含有OPN的外来体，使受试者的脑中的OPN升高。在一些实施方案中，全身(即静脉内)注射含有OPN的外来体。

前药是用亲脂性分子伪装的治疗性分子，这允许其穿过血脑屏障。一旦进入脑，则亲脂性分子通过酶降解或一些其他机制被去除以将药物释放成其活性形式。在各个实施方案中，OPN前药用于升高有需要的受试者的脑中的OPN表达。在一些实施方案中，OPN是重组OPN或其功能/生物活性片段。

肽掩蔽是一种用更可能穿过血脑屏障的分子掩蔽治疗性分子的方法。更可能穿过血脑屏障的分子的实例包括但不限于胆甾醇基。

受体介导的透化剂是增加血脑屏障的渗透性从而使分子更容易通过的药物化合物。在各个实施方案中，通过向有需要的受试者施用受体介导的透化剂来升高脑中的OPN，从而增加血脑屏障的渗透性并允许脑中的OPN。

纳米颗粒是能够穿过血脑屏障的与治疗性分子结合的颗粒。可以使用各种类型的纳米颗粒，其包括但不限于基于脂质的阳离子脂质体、固体脂质、纳米乳剂、基于聚合物的纳米颗粒或聚合物分支纳米颗粒。常见的聚合物材料包括但不限于聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)、聚(氰基丙烯酸异己酯)(PIHCA)、聚乳酸(PLA)或聚丙交酯-co-乙交酯(PLGA)。

在各个实施方案中，纳米颗粒是可生物降解的。在各个其他实施方案中，可以用表面活性剂涂覆纳米颗粒以有助于穿过血脑屏障。表面活性剂的实例包括但不限于聚山梨醇酯80、20、40、60和泊洛沙姆188。在一些实施方案中，纳米颗粒靶向脑。

改善认知功能

本发明的各个实施方案还提供了改善有需要的受试者的认知功能的方法，该方法包括：提供一种组合物，当该组合物施用于受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及向受试者施用足以增加所述OPN水平的量的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。在各个其他实施方案中，所述先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。在其他实施方案中，所述单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115+单核细胞)或其组合。在其他实施方案中，单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。在某些实施方案中，所述先天免疫细胞是吞噬细胞。

在各个实施方案中，所述组合物包含醋酸格拉替雷(GA)。在各个其他实施方案中，离体或体内刺激先天免疫细胞。

在各个实施方案中，通过过继性细胞转移或骨髓移植将表达OPN的先天免疫细胞施用于受试者。

在各个实施方案中，所述组合物的施用导致MMP-9增加。在各个其他实施方案中，OPN的水平增加导致受试者的错误折叠的蛋白质的水平降低，受试者的炎症减少，受试者的突触再生增加，巨噬细胞被募集至受试者的淀粉样蛋白β(Aβ)斑块部位或其组合。

在其他实施方案中，其中错误折叠的蛋白质是Aβ。在其他实施方案中，Aβ是Aβ₄₀和/或Aβ₄₂。

在各个实施方案中，所述组合物包含表达OPN的先天免疫细胞。

在一些实施方案中，所述组合物刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。在各个其他实施方案中，该先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。在其他实施方案中，该单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115+单核细胞)或其组合。在其他实施方案中，该单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。在某些实施方案中，该先天免疫细胞是吞噬细胞。

在各个实施方案中，所述组合物包含重组OPN、OPN片段、OPN衍生物、OPN模拟物、OPN类似物或其组合。

单核细胞富集

本发明的各个实施方案提供了单核细胞富集的方法，该方法包括：从受试者获得血液样品，从样品中分离血细胞，以及通过刺激血细胞来增加OPN表达。在各个实施方案中，分离的血细胞包含单核细胞。在其他实施方案中，用醋酸格拉替雷(GA)刺激单核细胞。在一些其他实施方案中，离体刺激单核细胞。

在一些实施方案中，单核细胞是骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞和/或CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)。在其他实施方案中，单核细胞成为脑中表达OPN的巨噬细胞。

在各个实施方案中，所述方法进一步包括向有需要的受试者施用富集的单核细胞。在各个实施方案中，经由过继性细胞转移或骨髓移植施用单核细胞。GA可以在过继性细胞转移或骨髓转移之前、基本上同时和/或之后施用。

MMP

如本文所讨论的，OPN是MMP(包括MMP-9)的已知底物。MMP-9是瘢痕组织和Aβ降解酶。已知OPN使免疫细胞更具吞噬能力，而MMP-9是切割OPN并增强Aβ降解的蛋白酶。GA的施用导致OPN(全长OPN及其MMP切割的片段)和MMP-9的增加并导致Aβ降解。

本发明的各个实施方案提供了一种方法，该方法包括在有需要的受试者中刺激先天免疫细胞。

在各个实施方案中，用醋酸格拉替雷(GA)刺激先天免疫细胞。在一些实施方案中，离体或体内刺激先天免疫细胞。

在各个实施方案中，在用GA刺激后，OPN增加。在各个实施方案中，在用GA刺激后，MMP-9增加。在各个实施方案中，在用GA刺激后，OPN和MMP-9增加。

在各个实施方案中，先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。在一些实施方案中，单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。在其他实施方案中，单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。

在各个实施方案中，受试者患有阿尔茨海默病。

在各个实施方案中，所述方法进一步包括治疗有需要的受试者。在各个实施方案中，OPN和/或MMP-9的增加导致受试者的淀粉样蛋白斑块的降解。

剂量和施用

如本文所述的本发明组合物可用于多种应用，包括但不限于升高脑中OPN的方法和治疗方法，如治疗阿尔茨海默病。使用方法可以是体外、离体或体内方法。

在各个实施方案中，根据本发明的药物组合物可以被配制用于经由任何施用途径的递送。“施用途径”可以指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于气溶胶、经鼻、口服、经粘膜、经皮或肠胃外。

“经皮”施用可以使用局部乳膏或软膏或通过经皮贴剂完成。

“肠胃外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、包膜下、皮下、经粘膜或经气管。经由肠胃外途径，组合物可以是用于输注或注射的溶液或悬浮液的形式，或者作为冻干粉末。

经由肠途径，药物组合物可以是允许控制释放的片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒、乳液、微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡的形式。

经由局部途径，基于根据本发明的化合物的药物组合物可以被配制用于治疗皮肤和粘膜，并且为软膏、乳膏、乳、油膏、粉末、浸渍垫、溶液、凝胶、喷雾剂、洗液或悬浮液的形式。它们还可以是允许控制释放的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡或聚合物贴剂和水凝胶的形式。根据临床适应症，这些局部途径组合物可以是无水形式或含水形式。

经由眼途径，药物组合物可以是滴眼剂的形式。

在各个实施方案中，可以通过注射或通过随时间逐渐输注来静脉内施用药剂。考虑到针对给定途径的合适的制剂，例如，用于本文所述方法和组合物的药剂可静脉内、鼻内、通过吸入、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内进行施用，并且可通过蠕动手段(如果需要)或者通过本领域技术人员已知的其他方式进行递送。在具体的实施方案中，本文使用的化合物通过口服、静脉内或肌肉内施用于患有阿尔茨海默病的患者。

根据本发明的药物组合物还可含有任何药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，其涉及将感兴趣的化合物从一个组织、器官或身体的一部分携带或运送到另一个组织、器官或身体的另一部分。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或其组合。载体的每种组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适合用于与可能与之接触的任何组织或器官接触，这意味着它不应具有毒性、刺激性、变态反应、免疫原性或任何其他过度超过其治疗益处的并发症的风险。

在各个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂以及治疗有效量的OPN。“药学上可接受的赋形剂”是指用于制备通常安全、无毒的期望的药物组合物的赋形剂，并且包括兽医用途以及人类药物用途的可接受的赋形剂。活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且可与活性成分相容并且为适合用于本文所述治疗方法的量。这样的赋形剂可以是固体、液体、半固体或者在气溶胶组合物的情况下，可以是气态的。合适的赋形剂是，例如，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、水、盐水、右旋糖、丙二醇、甘油、乙醇、甘露醇、聚山梨醇酯等及其组合。此外，如果需要，该组合物可含有少量辅助物质，如增强或保持活性成分的有效性的润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。如本文所述的治疗组合物可包括药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸，诸如盐酸或磷酸，有机酸，例如乙酸、酒石酸或扁桃酸形成的酸加成盐，由无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁形成的盐，以及由有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等形成的盐。

液体组合物除水之外以及排除水还可含有液相，例如甘油、植物油，如棉籽油和水-油乳液。生理上可耐受的载体是本领域熟知的。本发明中使用的在治疗特定病症或病况方面有效的活性剂的量将取决于病症或病况的性质，并且可由本领域技术人员用标准临床技术确定。

根据本发明的药物组合物还可以包封、压片或制备成乳液或糖浆以用于口服施用。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可包括单独或与蜡一起的持续释放物质，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

药物制剂按照常规的制药技术制备，包括针对片剂形式的研磨、混合、造粒和压制(必要时)；或针对硬明胶胶囊形式的研磨、混合和填充。当使用液体载体时，制剂将为糖浆、酏剂、乳液或水性或非水性悬浮液的形式。这样的液体制剂可以直接口服(p.o.)施用或填充至软明胶胶囊中。

根据本发明的药物组合物可以以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是在对给定受试者的治疗功效方面将产生最有效结果的组合物的量。该量将根据多种因素而变化，包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中药学上可接受的一种或多种载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如，通过监测受试者对化合物施用的反应并相应地调整剂量。有关其他指导，参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro编著.第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。

典型的剂量可以如技术人员通过体外反应或动物模型中的反应所示。这样的剂量通常可以在浓度或量上减少至多约一个数量级而不丧失相关的生物活性。因此，实际剂量将取决于医师的判断、患者的状况以及基于例如相关原代培养细胞或组织培养组织样品(如获得的生物样品)的体外反应性的治疗方法的有效性或在适当的动物模型中观察到的反应。

对于疾病的治疗，合适的剂量取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、抗体是否被施用用于治疗或预防目的、先前的治疗和患者的临床病史。如果出现任何并发症并且由治疗医师酌情决定时，也可以由个体医师调整剂量。施用医师可以确定最佳剂量，给药方法和重复率。药物组合物可以施用一次或持续数天至数月的一系列治疗，或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻(例如治疗或改善阿尔茨海默病)。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展和对治疗的反应。在某些实施方案中，剂量为每千克体重0.01μg至100mg，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。

在各个实施方案中，如本领域技术人员将容易理解的，通过任何适当的技术将治疗有效量的重组OPN施用于受试者。在一些实施方案中，重组OPN通过鼻、肠胃外或眼途径施用。在一些实施方案中，肠胃外途径是静脉内注射。在各个实施方案中，眼途径是通过滴眼剂。

在各个实施方案中，如本领域技术人员将容易理解的，OPN病毒载体可以通过任何适当的技术进行施用。在各个实施方案中，施用组合物包括通过静脉内注射施用。在各个实施方案中，通过肌肉内注射施用组合物。在各个实施方案中，经鼻施用组合物。这些方法导致OPN基因或编码OPN活性片段的基因向脑组织递送。这些方法还导致OPN或其活性片段直接分泌到循环中。可以使用标准转染技术将AAV载体、AAV辅助构建体和辅助病毒或辅助功能载体同时或连续引入宿主细胞中。此外，病毒载体可以作为单次施用或作为治疗方案进行递送，例如每天、每周或以任何其他合适的时间间隔递送，如本领域技术人员容易认识到的。剂量取决于各种因素，例如年龄、体重、血管状况的严重程度以及医生可能确定的其他因素。

在各个实施方案中，脂质体被修饰成包含OPN或功能/生物活性OPN片段。在一些实施方案中，修饰的脂质体可以通过任何合适的技术进行施用，如本领域技术人员将容易理解的。在各个实施方案中，修饰的脂质体通过外周注射施用于血液。在各个其他实施方案中，修饰的脂质体口服施用。

在各个实施方案中，施用共聚物GA以增强血源性单核细胞的天然募集。在各个实施方案中，血源性单核细胞被募集并浸润患病的脑实质。在其他实施方案中，浸润的单核细胞成为巨噬细胞。

在一些实施方案中，每周施用共聚物GA。在各个实施方案中，共聚物施用至多10周。在各个实施方案中，施用的GA的剂量可以在约10–150μg的范围内。在一些实施方案中，GA的剂量在约10-20μg、20-30μg、30-40μg、40-50μg、50-60μg、60-70μg、70-80μg、80-90μg、90-100μg、100-110μg、110-120μg、120-130μg、130-140μg或140-150μg的范围内。在一些实施方案中，GA剂量为100μg。在其他实施方案中，剂量为30μg。

在各个实施方案中，施用GA持续6-48小时暴露。在一些实施方案中，GA暴露持续6-12小时、12-24小时、24-36小时或36-48小时。在其他实施方案中，GA暴露持续12-24小时。

在各个其他实施方案中，施用骨髓来源的CD115⁺单核细胞的子集。在一些实施方案中，每月施用骨髓来源的CD115⁺单核细胞。在一些实施方案中，外周血富含骨髓来源的CD115⁺单核细胞。在各个实施方案中，骨髓来源的CD115⁺单核细胞的施用增加了单核细胞衍生的巨噬细胞的脑募集。

在其他实施方案中，施用共聚物GA和骨髓来源的CD115⁺单核细胞的子集。在其他实施方案中，组合施用导致受试者中更大的单核细胞募集。

在各个实施方案中，共聚物GA和/或骨髓来源的CD115⁺单核细胞子集的施用导致认知功能的保留、突触保留、斑块去除、星形胶质细胞增生的限制和免疫分子环境的调节。本领域技术人员可以确定将向有需要的受试者施用的先天免疫细胞的合适的量。

实施例

提供以下实施例是为了更好地说明要求保护的发明，而不应解释为限制本发明的范围。就提及具体材料而言，其仅用于说明的目的而非意图限制本发明。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围且不需要发明创造能力的情况下开发等同的手段或反应物。

实施例1

小鼠

从Jackson Laboratories(货号005864)购买来自B6.Cg-Tg(APPswe，PSEN1E9)85Dbo/J株的阿尔茨海默病双转基因APPK595N、M596L+PS1_△E9、APP/PS1(ADtg)小鼠及其年龄匹配的非转基因(野生型)同窝仔，然后将它们在Cedars-Sinai Medical Center饲养和维护。这些ADtg小鼠携带人转基因，从而允许使用抗人抗体检测淀粉样蛋白β形式。本研究中的所有小鼠都具有C57BL/6同类系背景。两组小鼠(均为雄性)用于行为、组织学和生物化学分析。使用另外的ADtg小鼠群组(相等数量的雄性和雌性)通过流式细胞术评估针对脑的先天免疫浸润。对于体外研究、原代细胞培养物和在磁性激活细胞分选(MACS)柱选择前后分离的CD115+单核细胞的表征，骨髓供体小鼠是年轻的非转基因野生型同窝仔(8-10周龄)。对于骨髓来源的单核细胞的过继性转移，供体小鼠是在人泛素C启动子的指导下表达增强的绿色荧光蛋白(GFP)的年轻的(8-10周龄)C57BL/6-转基因(UBC-GFP)30Scha/J小鼠(Stock#004353)。对于评估向ADtg脑的单核细胞浸润的流式细胞术研究，供体是年轻的非转基因野生型小鼠(8-10周龄)。所有实验均根据Cedars-Sinai Medical Center机构动物护理和使用委员会(IACUC)的规定在批准的方案下进行。此外，所有实验都是由对小鼠基因型不知情的研究人员进行和记录的。

基因分型

通过使用DNA提取试剂盒(Qiagen)并遵循制造商的方案从小鼠尾部的尖端提取基因组DNA。通过PCR进行基因分型确定转基因的存在来鉴定双转基因APP_SWE/PS1_ΔE9小鼠和非转基因野生型同窝小鼠，如前所述(Jankowsky等人，Biomol Eng 2001；17:157–65；Jankowsky等人，Hum Mol Genet 2004；13:159–70；Butovsky等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 2006103:11784-11789)。

醋酸格拉替雷免疫

ADtg小鼠(10个月龄)接受皮下注射GA[也称为Cop-1和100μg，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中]或单独PBS(对照组)，每周两次，持续1周，随后每周一次，持续8周。为了通过流式细胞术评估向大脑的先天免疫浸润，10个月龄的ADtg小鼠每周两次接受皮下注射GA(PBS中100mg)或单独PBS，持续1周，然后每周一次，持续3周。在研究结束时，将所有小鼠麻醉，然后用含有0.5mM EDTA的冰冷PBS灌注，之后收集它们的器官并进行分析或固定在2.5％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)中，并用30％蔗糖冷冻保护用于进一步的组织学分析。

骨髓来源的CD115+单核细胞的分离和过继性转移

如先前报道的，分离来自小鼠供体的CD115⁺单核细胞(Koronyo等人，Brain:ajournal of neurology 2015,138:2399-2422)。简而言之，从股骨、胫骨和肱骨收获骨髓细胞，并在PLUS(17-1440-03,GE Healthcare)密度梯度上富集单核细胞。根据制造商的方案，使用生物素化的抗CD115mAb克隆AFS98(#13-1152；eBioscience)和链霉亲和素偶联的磁珠(Miltenyi Biotec)，通过MACS富集柱分离CD115⁺单核细胞群。在此过程之后，将单核细胞(5–6x 10⁶个细胞/小鼠)每月一次注射至10个月龄的ADtg小鼠的尾静脉中，持续2个月。为了评估通过流式细胞术对大脑的先天免疫浸润，10个月龄的ADtg小鼠接受一次骨髓来源的CD115+单核细胞注射(与上述相同的剂量)。

骨髓来源的CD115⁺单核细胞的流式细胞术和免疫组织化学表征

如上详述的，从年轻的供体野生型小鼠(每个实验n＝3-4只小鼠)收获骨髓细胞。通过梯度富集单核细胞后，收集一部分细胞(在CD115⁺柱之前)，并使用如上详述的MACS富集柱对第二部分细胞进行CD115⁺单核细胞群(CD115⁺柱之后)的进一步分离。将在CD115+柱之前和之后的两个部分的细胞立即染色并通过流式细胞术进行分析或铺板以产生巨噬细胞培养物用于进一步的免疫组织化学分析。对于流式细胞术分析，将CD115⁺柱之前的细胞用以下抗体染色：生物素化的抗CD115mAb克隆AFS98(#13-1152；eBioscience)、APC缀合的抗生物素克隆Bio3-18E7(#130-090-856；Miltenyi Biotec)、PE缀合的抗-CD36克隆REA262(#130-102-763；Miltenyi Biotec)、Viobright FITC缀合的抗CD36克隆REA262(#130-104-889；Miltenyi Biotec)、PE缀合的抗CD204克隆REA148(#130-102-328；Miltenyi Biotec)以及Alexa 488缀合的抗MMP9多克隆抗体(#bs-0397R-A488；Bioss)。对于CD115⁺柱之后的细胞，我们使用了一组与上述特定抗体相同的染色抗体，但排除了原代抗CD115mAb，因为这种分离方法已经将生物素化的抗CD115抗体与细胞连接。所有抗体稀释液均为1:100。在配备有BD FACS Diva软件的BD LSRFortessaTM细胞分析仪上分析标记的样品；用FlowJo软件(vX.0.7r2；Tree Star,Inc.)进一步分析数据。

在CD115+柱选择之前和之后的两部分细胞也分化成原代巨噬细胞培养物并通过免疫组织化学进行分析。简言之，通过在含有10％血清和20ng/ml MCSF(#315-02；PeproTech)的完全RPMI-1640培养基(#21870；Life Technologies)中培养7天，使细胞分化成巨噬细胞。然后将巨噬细胞的原代培养物以每孔1.2x 10⁵个细胞(每种条件下3-4个孔)铺板在玻璃盖玻片上的24孔组织培养板中过夜。使用-20℃下的甲醇(99.8％)保持20min用于细胞的固定，然后用PBS重复洗涤。然后使用大鼠抗CD36mAb克隆MF3(1:200；ab80080；Abcam)、大鼠抗CD204清道夫受体I/II型(SCARA1)mAb(1:100；MCA1322；AbD Serotec)和山羊抗MMP9pAb(1:100；AF909；R&D systems)对细胞进行染色。二级多克隆抗体包括与Cy2、Cy3或Cy5缀合的驴抗大鼠和抗山羊(1:200；Jackson ImmunoResearch Laboratories)。使用Gold与DAPI(Molecular Probes,Life Technologies)固定细胞。使用配备有Carl Zeiss Axio Imager Z1Apotome的显微镜从每个孔获得几个场(每组最少n＝4个(随机选择))(每个场平均120个细胞)。在每种情况下使用相同的暴露时间获得图像。荧光信号及其总面积通过将各个图像转换为灰度并使用NIH ImageJ软件用基于直方图的阈值相对于基线进行标准化来确定和定量。“面积/细胞”衡量总荧光信号(面积)除以相同场(图像)的细胞总数(DAPI计数)。对于所有实验，研究者对处理条件均不知情。

在小鼠中的Barnes迷宫行为测试

Barnes迷宫是一项空间学习任务，其允许受试者使用空间线索来找到逃避轻度厌恶环境(带有光投射的开放空间)的手段；小鼠需要使用空间线索来找到逃生位置。评估小鼠在Barnes迷宫装置中在9天的过程中了解逃生箱位置的能力。该时间基于野生型和PBS组之间的显著差异而建立，并且被发现适合于测试我们的治疗的效果。Barnes迷宫装置是一个圆形桌子，其中20个孔围绕周边等距离定位。在试验过程中，逃生箱被放置在这些孔中的一个孔的下方，而假箱子(太小而无法进入)被放置在其他19个孔的下方。首先将动物放入迷宫中心的不透明圆柱体中30s，以促进初始空间迷失。在此之后，移除圆柱体并且动物探索迷宫直到它发现并进入逃生箱，导致其返回到饲养笼。逃生潜伏期是移除圆柱体与动物进入逃生箱之间的持续时间。错误(不正确条目)表示小鼠进入假箱子的事件数。两盏明灯照亮了Barnes平台的中心。如果小鼠在5min(300s)内未能进入逃生箱，则实验者将其引导至逃生箱。在将动物移走并带到饲养笼之前，使动物在逃生箱中再停留30s。所有箱子和迷宫表面都喷洒70％异丙醇，并以非系统方式擦拭，以消除后续试验的气味提示。在训练/采集阶段的每次试验期间，逃生箱的位置保持相同，并且在小鼠之间移动以减少非预期的迷宫内线索的可能性。训练每天重复三次，每次试验间隔15min。保留每个试验的数据并将数据进行平均。训练/采集阶段为4天。在此之后为2天休息，没有针对迷宫的任何暴露。在第7天，通过使用来自训练/采集阶段的相同逃生箱位置和方法，在三次试验期间重新测试每只动物。在第8天，在记忆保持阶段之后，反向阶段开始。逃生箱放置在与原始逃生箱位置不同的象限中。使用上文详述的相同程序，反向试验在连续两天(第8天和第9天)内进行，每天重复三次。第二组小鼠经历了相同的Barnes迷宫测试，除了每次试验时间缩短到最多4min(240s)，因为这个时间长度显示与更长时间(5min)一样有效。所有研究者都对小鼠组不知情。手动、数字和通过位于迷宫上方的摄像机记录数据。

免疫组织化学

在应用无血清蛋白质封闭(Dako Cytomation或含有20％正常马血清(Invitrogen)和0.05％TritonTM X-100(Sigma-Aldrich)的透化封闭溶液)之前，在抗原修复溶液(DAKO)中将脑冠状冷冻切片(30μm厚)处理30min。然后将切片杂交并用在PBS中的2％封闭溶液中的一级抗体的组合在4℃下染色过夜，该一级抗体包括：山羊多克隆OPN(R&Dsystems)、小鼠抗人淀粉样蛋白-β[残基17–24，mAb克隆4G8(1:100；SIG-39220；Covance)以及残基1–16，mAb克隆6E10(1:100；SIG-39320；Covance)]、兔抗GFAP pAb(1:100；G926；Sigma-Aldrich)、兔抗Iba1pAb(1:250；#019-19741；Wako Chemicals)、兔抗GFP pAb(1:500；#598；MBL)、大鼠抗CD68(1:100；Abcam)、兔抗iNOS(1:100；Cell signaling)、大鼠抗CD45mAb克隆30-F11(1:25；#550539；BD Pharmingen)、山羊抗IL10pAb(1:100；AF519；R&Dsystems)以及山羊抗-MMP9pAb(1:100；AF909；R&D systems)。与一级抗体杂交后，与同Cy2、Cy3、Cy5或DyLightTM 649缀合的适当的辣根过氧化物酶(HRP)或荧光团偶联的二级抗体(驴抗小鼠、抗大鼠、抗山羊和抗兔；1:200；Jackson ImmunoResearch Laboratories)温育，在37℃下温育1小时。将切片在PBS中洗涤并使用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(H-1200)或不含DAPI(H-1000)的Vectashield(Vector Laboratories)或Gold与DAPI(Molecular Probes,Life Technologies)进行固定。使用相同的方案处理阴性对照，其中省略一级抗体以评估非特异性标记。对于显微分析，我们使用配备有ApoTome(Carl Zeiss MicroImaging,Inc.)的Carl Zeiss Axio Imager Z1荧光显微镜。为了处理和分析图像，我们使用了AxioVision(版本4.6.3)软件(Carl Zeiss)。

海马体中突触区域的突触前标记和定量

为了确定ADtg和非转基因(野生型)小鼠海马体中的突触区域，将每只动物的前囟-2.50、-2.65和-2.80mm处的三个独立的冠状脑切片(Liang等人，2011)(每组n＝6只小鼠)用突触前标志物VGluT1(由Slc17a7编码)(Chemicon，豚鼠，1:6000)进行染色。对于每个海马区域，使用x 100油浸物镜和Zeiss ApoTom模式获得高分辨率扫描。光学切片包括15个Z-stack图像，每个图像0.25mm宽并覆盖组织深度为3.75mm内的焦平面。在相同水平获得的所有五个组的切片都具有相同的免疫染色。在所有实验期间，并行运行非一级和非二级抗体对照。这些对照没有特异性染色。为了覆盖海马区域，在齿状回的横向的和中间的叶片分子层以及在海马1(CA1)的腔隙分子层、辐射层和起层(stratum oriens)精确选择15个矩形场(每个90μm x 70μm)。在整个处理条件下，扫描参数保持不变。使用NIH ImageJ宏和批处理分析单个光学切片图像以对突触区域进行定量(15个光学切片/场、15个场/脑切片以及总共675个图像/脑)。计算每种条件下的平均突触面积或每个图像的面积百分比。

硫磺素-S淀粉样蛋白β斑块染色

二级抗体染色后，将脑切片用硫黄素-S(Thio-S，在70％乙醇中1％w/v)(Sigma-Aldrich)在室温下染色10分钟，在70％乙醇中洗涤三次，然后在蒸馏水中洗涤一次，每次持续1min。

定量和体现学计数程序

OPN+细胞、Iba1⁺CD45^hi细胞、GFAP⁺细胞、Thio-S⁺淀粉样蛋白β斑块和4G8⁺淀粉样蛋白β斑块的数目和面积(μm²)通过检查每个小鼠在覆盖海马和皮层(包括内嗅和扣带皮层)区的区域上方以150-μm间隔的4至6个冠状切片来确定。对于Iba1⁺/CD45^hi定量，我们仅选择用CD45抗体强烈标记的Iba1⁺细胞，同时排除Iba1^–细胞。将CD45⁺细胞(Iba1⁺细胞以外)转换成灰度图像，并在ImageJ软件中确定一次强/高信号阈值，并应用于CD45^高的所有图像。对于每个图像使用相同的曝光时间捕获特定信号的荧光。将图像转换为灰度，数字化为PC，并使用NIH ImageJ软件(版本1.38x和1.46r)用基于直方图的阈值相对于基线进行标准化。此外，使用“分析”网格借助ImageJ软件对OPN⁺/CD45^hi细胞、Iba1⁺/CD45^hi细胞、GFAP⁺细胞和淀粉样蛋白β斑块进行手动计数。分析人员对进行所有计数的小鼠组都不知情。

脑单核细胞浸润的流式细胞术分析

在收获前，用补充有0.5mM EDTA(pH8.0，Invitrogen)的冷盐水灌注实验性ADtg小鼠(每组n＝4-6只小鼠)。然后将全脑在70-mm细胞过滤器(Falcon；Corning Inc.)中用在PBS中的冰冷的2％胎牛血清(Atlanta Biological)机械切碎。在离心、均质化和洗涤后，将沉淀物悬浮在40％无菌Percoll(GE Healthcare)中，并以850g离心25min。将细胞沉淀物重悬于70％Percoll中，并以800g再离心20min。收集并洗涤Percoll梯度后位于顶层的细胞。接下来，用购自Biolegend的以下抗体将细胞染色：FITC缀合的抗CD11b克隆M1/70(1:100，#101206)；PE缀合的抗Ly-6C克隆HK1.4(1:100，#128007)；以及PE/Cy7缀合的抗CD45.2克隆104(1:100，#109830)。在配备有BD FACS Diva软件的BD LSRFortessa细胞分析仪上分析染色的样品；并且用FlowJo软件(vX.0.7r2；Tree Star,Inc.)进一步分析数据。

通过夹心ELISA进行的淀粉样蛋白β_1-40、淀粉样蛋白β_1–42、MCP1、IL10和MMP9的水平的生化测定

对于脑溶性和不可溶的ELISA分析，将脑组织在含有0.5％TritonTM X-100(T8787；Sigma)和蛋白酶抑制剂混合物组I(#539131；Calbiochem)的PBS缓冲液中彻底均质化(Argos均质器)。除去细胞碎片后，将匀浆在4℃下以10,000g离心25min。上清液被视为“可溶的”级分，并用于评估可溶的淀粉样蛋白β_1–40、淀粉样蛋白β_1–42、MCP1(由Ccl2编码)、IL10和MMP9水平。然后将沉淀物稀释并用上述均质化缓冲液进行均质化。这是“不可溶的”级分，并用于评估不可溶的淀粉样蛋白β_1–40和淀粉样蛋白β_1–42。

对于MФ^BM细胞，将每孔中的细胞用2mM EDTA-PBS提起，收集在管中，并进行离心。将细胞沉淀物裂解并重悬于补充有1％蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific)的RIPA缓冲液的混合物中，并在-80℃下储存直至使用。

在使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(#23227；Thermo Scientific)测定蛋白质浓度后，用抗人淀粉样蛋白β_1-42末端特异性夹心ELISA试剂盒(KHB3442，Invitrogen；不识别小鼠淀粉样蛋白β也不识别人淀粉样蛋白β40/淀粉样蛋白β43)、抗人淀粉样蛋白β_1-40末端特异性夹心ELISA试剂盒(KHB3482，Invitrogen；不识别小鼠淀粉样蛋白β也不识别人淀粉样蛋白β₄₂/淀粉样蛋白β₄₃)和抗小鼠OPN quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems)根据制造商的说明书分析可溶的和不可溶的转基因衍生的淀粉样蛋白β_1–42和淀粉样蛋白β_1–40水平和OPN。

淀粉样蛋白β试剂盒使用对淀粉样蛋白β_1-42或淀粉样蛋白β_1-40序列的N-和COOH-末端具有特异性的两种抗体的组合。通过使用辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体检测结合的兔抗COOH末端，并使用酶标仪(Spectra Max 384plus,Molecular Devices)在450nm处读取。分别使用小鼠/大鼠CCL2/JE/MCP1ELISA试剂盒(MJE00)、小鼠IL10ELISA试剂盒(M1000B)和小鼠总MMP-9ELISA试剂盒(MMPT90)，全部按照制造商的说明书(R&D systems)测量可溶的MCP1、IL10和MMP9的水平。使用相同的酶标仪(Spectra Max 384plus,Molecular Devices)在450nm(540nm校正)处读取每个孔的光密度。

淀粉样蛋白β_1–42原纤维的制备

将冻干的非氟淀粉样蛋白β_1–42肽(#20276；Anaspec)最初通过在冰冷的HFIP(六氟异丙醇)(#52512；Sigma)中溶解成1mM的最终浓度来进行单体化，然后在无菌硅化微量离心管中进行等分。首先使HFIP在无菌罩中蒸发，然后在真空条件下在SpeedVac中蒸发2小时以除去任何痕量的HFIP；将肽膜在-20℃下储存直至使用。为了诱导原纤维形成，将荧光(HiLyte647；#64161；Anaspec)和非荧光淀粉样蛋白β_1–42膜重悬于培养基(首先向该培养基中添加10％无菌NaOH 60mM，并将培养基涡旋30s)中。然后，添加无菌45％H₂O和无菌的45％的20mM NaH₂PO₄+Na₂HPO₄溶液(pH 7.4)，并将培养基再次涡旋并在37℃下在振动器上温育2周。然后将预形成的淀粉样蛋白β_1–42原纤维声处理60秒，并在吞噬作用测定之前使用相同的培养基稀释至100nM。骨髓来源的巨噬细胞的原代培养物和吞噬作用测定

为了测试通过巨噬细胞的淀粉样蛋白β吞噬作用，在重复实验中从野生型小鼠(n＝18只小鼠)的骨髓中分离出单核细胞，并通过在含有10％血清和20ng/ml MCSF(#315-02；PeproTech)的完全RPMI-1640培养基(#21870；Life Technologies)中培养7天来分化成巨噬细胞。从在含有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和20ng/mlMCSF(PeproTech)的完全RPMI 1640培养基(Life Technologies)中培养6-7天的股骨和胫骨中产生骨髓来源的巨噬细胞(MФBM)。然后将巨噬细胞的原代培养物以每孔1.2x 10⁵个细胞(每种条件下3-4个孔)铺板在玻璃盖玻片上的24孔组织培养板中过夜。接下来，将巨噬细胞用30μg/ml GA(TEVA Neuroscience)、布雷菲德菌素A(BFA；Sigma，1X)或10μM米诺环素(Sigma)处理1、3或24小时，或不进行处理(对照组)。在添加纤维状淀粉样蛋白β_1-42之前，将细胞在4℃冰浴中冷冻5分钟；在添加预先形成的纤维状淀粉样蛋白β_1–42(100nM)后立即将板在25℃下以515g离心，然后在37℃下温育30min或60min。然后用不含淀粉样蛋白β的培养基冲洗细胞以除去未掺入的淀粉样蛋白β，随后用PBS洗涤两次。使用-20℃下的甲醇(99.8％)持续20min或室温下的4％多聚甲醛持续12min用于细胞的固定，然后用PBS进行重复洗涤。对于免疫染色，首先使用小鼠抗人淀粉样蛋白βmAb克隆6E10(1:100；SIG-39320；Covance)、大鼠抗CD68mAb克隆FA-11(1:100；ab53444；Abcam)、大鼠抗CD36mAb克隆MF3(1:200；ab80080；Abcam)、大鼠抗CD204清道夫受体I/II型(SCARA1)mAb(1:100；MCA1322；AbD Serotec)、兔抗CD163pAb(1:100；orb13303；Biorbyt)和山羊抗MMP-9pAb(1:100；AF909；R&D systems)对细胞进行染色。二级多克隆抗体包括与Cy2、Cy3或Cy5缀合的驴抗小鼠、抗大鼠、抗兔和抗山羊(1:200；Jackson ImmunoResearch Laboratories)。使用Gold与DAPI(Molecular Probes,Life Technologies)固定细胞。使用配备有Carl Zeiss Axio Imager Z1ApoTome的显微镜从每个孔获得几个场(每组最少n＝5个(随机选择))(每个场平均120个细胞)。在每种情况下使用相同的暴露时间获得图像。荧光信号及其总面积通过将各个图像转换为灰度并使用NIH ImageJ软件用基于直方图的阈值相对于基线进行标准化来确定和定量。“每个细胞的平均面积”是每个场的单个细胞的免疫反应面积的数值平均的结果。“面积/细胞”衡量总荧光信号(面积)除以相同场(图像)的细胞总数(DAPI计数)。对于所有实验，研究者对处理条件均不知情。

Western印迹

通过2mM EDTA-PBS将MФ^BM从每个细胞中提起，收集在Eppendorf管中，并进行离心。将细胞沉淀物在RIPA缓冲液(Thermo Scientific)中裂解并补充蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。使用4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)电泳分离蛋白质样品的等分试样，然后将该等分试样转移至硝酸纤维素膜，在含5％(w/v)脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭，并且与适当的一级抗体，包括兔多克隆OPN(Abcam)、山羊多克隆OPN(R&D systems)和肌动蛋白(Abcam)杂交。然后在用化学发光底物显色之前将膜与适当的HRP缀合的二级抗体一起温育。使用ImageJ软件进行印迹的光密度分析，并将每个实验样品相对于肌动蛋白进行归一化。

siRNA体外敲除OPN

将由25bp双链体寡核糖核苷酸组成的一组三个Stealth OPN siRNA分别与对应于OPN(Invitrogen)的有义链和反义链的序列一起使用。将等量(每种100nM)的siRNA混合并在OptiMEM(Gibco)中稀释至最终浓度为100nmol/L，然后使用RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)按照制造商的方案瞬时转染到MФ^BM中。用Stealth RNAi^TM siRNA阴性对照转染对照巨噬细胞。转染后将MФ^BM温育48小时，并用于后续实验。

细胞长度测量

使用Axiovision Rel.4.8软件包中的长度工具，从显微图像(McWhorter等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 2013,110:17253-17258)手动测量(以μm计)细胞的长轴和短轴。在每个实验中检查至少100个细胞，其中通过显微镜分析单个细胞。

统计学分析

使用GraphPad Prism 6.01(GraphPad Software)分析数据。使用双向ANOVA进行数天内两个或更多个组的比较(Barnes迷宫测试)，然后进行配对组的Bonferroni多重比较后检验。使用单向ANOVA进行三组或更多组的比较，然后进行配对组的Tukey或Bonferroni多重比较检验。使用双尾非配对Student t检验分析两组比较。进行StatPlus配对t检验和单向ANOVA与Tukey事后比较以用于突触面积的定量。使用Prism Pearson检验进行相关性分析。结果表示为平均值±标准偏差(SD)或平均值±平均值的标准误差(SEM)，如所示的。P值<0.05被认为是显著的。组之间的显著性程度表示如下：*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001以及****p<0.00001。低于0.05的p值被认为是显著的。所有数据分析均由不知情的检查员负责；在分析结束时揭示代码。

实施例1

发明人研究了通过醋酸格拉替雷(GA)或BM-CD115⁺单核细胞(Mo)的移植实现的免疫调节是否以及如何在阿尔茨海默病(AD)鼠模型中保持突触和神经炎形成以及认知功能。AD神经病理学与增加的淀粉样蛋白β蛋白(Aβ)紧密相关，尤其是被认为引起认知衰退的高度突触毒性的Aβ_1-42同种型(alloforms)。在原代培养物中骨髓(BM)衍生的MΦ的GA处理通过上调清道夫受体和Aβ降解酶显著增强了吞噬作用和fAβ_1-42的降解。检测到非纤维状Aβ形式，主要是被认为是最具神经毒性物质的寡聚(o)Aβ_1-42。然而，它们对细胞的影响在很大程度上仍然未知，这是因为它们具有高亚稳态性质并且存在于动态变化的混合物中。为了克服这些困难，已经开创了用于制备特定大小的结构特征的低聚物的稳定群体(单体数目)以及纯原纤维和纤维种类的技术。这独特地允许我们确定非纤维状Aβ_1-42组装体对突触和神经炎完整性和神经元功能的影响，并探索Mo/MΦ从脑中消除这种组装体的能力。不受任何特定理论的束缚，AD⁺小鼠中的数据表明脑Aβ_1-42的累积伴随着突触丧失和认知衰退。GA或移植的Mo导致保持与保留的认知相关的突触。该研究还表明，在MΦ和神经元的原代共培养物中，响应于结构稳定的定义的f/oAβ_1-42，通过GA处理的MΦ保持突触密度和神经炎长度。发明人确定GA处理的MΦ中免疫调节物骨桥蛋白(OPN)的上调与增加的fAβ_1-42吞噬作用有关；OPN抑制似乎损害吞噬作用。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但我们认为通过消除致病性Aβ种类、调节有害的炎症以及分泌神经营养因子的脑浸润的Mo/MΦ(由GA或移植的Mo诱导)，可以增强突触和神经元活性的保持。

在本文中，本发明人研究了在MΦ和神经元的原代共培养物中响应于与AD相关的稳定的结构上定义的Aβ组装体，通过GA处理的MΦ保持突触结构和功能。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但本发明人认为GA处理的MΦ通过上调免疫调节物OPN而表现出神经保护表型，从而导致病理性Aβ形式的有效清除，以及增强的神经元结构和功能的保持。

测定了突触前、突触后和神经炎长度损失的量级，以及由o/pf/fAβ_1-42组装体诱导的神经元功能障碍。评估了GA处理的MΦ响应于Aβ_1-42组装体的突触和神经炎保护。本发明人确定了响应于神经毒性Aβ_1-42组装体，GA处理的MΦ防止突触丧失和神经元功能障碍的机制，并评估了MΦ在内化和降解Aβ_1-42组装体中的效率。发明人确定了与诸如免疫调节和神经营养支持等功能相关的MΦ神经保护表型，其中着重于与这些功能相关的免疫调节物OPN的作用。

本发明人还研究了通过在鼠模型中GA或移植BM-CD115⁺Mo(作为潜在的AD疗法)实现经由免疫调节保持突触和认知功能。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但我们认为GA免疫或移植的Mo将增加表达OPN的脑MΦ，恢复突触结构并在AD鼠模型中在由毒性Aβ_1-42诱导的丧失之后保持认知功能。

测量了作为认知损害的函数的AD⁺小鼠模型中疾病相关脑区域中的离体前和突触后标志物和神经炎长度损失。评估了用GA或移植的WT与OPN^KOCD115⁺-Mo进行免疫调节后的突触和认知保持。鉴定了在AD⁺小鼠中通过检查与保留的突触相关的脑MΦ获得性表型而保留突触的免疫调节机制。

最初，测试了由原代皮层神经元(CN)中稳定的、结构上定义的fAβ_1-42和oAβ_1-42形式诱导的突触毒性。在培养的第8天，将神经元与250nM的Aβ组装体或仅与培养基(媒介物)一起温育12小时。清楚地检测到由两种f/oAβ_1-42形式诱导的突触前和突触后(分别为VGluT1和PSD-95)面积和数目的大量损失(图1A-图1C)。突触密度定量表明fAβ_1-42后共定位的VGluT1/PSD95⁺斑点数目显著减少50％。此外，我们检测到与单独培养基中的CN相比，由oAβ_1-42引起的斑点数减少了70％(图1D；p<0.0001)。fAβ_1-42和oAβ_1-42之间共定位的突触斑点数的统计学差异表明了oAβ_1-42的增加的突触毒性(图1D)。接下来，评估Aβ诱导的神经炎收缩。用抗Tuj1对CN进行免疫标记并对每个神经元的总神经炎长度进行精确定量(图2A-图2D)。与对照CN组相比，f/oAβ_1-42的过夜温育导致大量神经炎收缩(图2B与图2A)。接下来测试未处理的和GA处理的BM衍生的MΦ(CD68⁺细胞)是否可以预防突触和神经炎损失。将原代CN和MΦ共培养48小时，并在共培养的最后12小时期间引入Aβ_1-42形式。数据表明GA处理的MΦ广泛保护CN中的Tuj1⁺神经突起免受f/oAβ_1–42诱导的损失(图2D)。共定位的VGluT1/PSD95⁺斑点突触数目的定量分析证实在过夜暴露于fAβ_1-42或oAβ_1-42后分别降低了32％和65％(图2E)。有趣的是，虽然GA处理的MΦ和单独的MΦ完全保护免受fAβ_1-42诱导的突触丧失，但GA处理的MΦ在预防oAβ_1-42诱导的突触丧失方面更显著有效(图2E；p<0.0001)。评估了Aβ积累对突触病(synaptopathy)的体内作用以及通过GA免疫或移植的BM-CD115⁺Mo的可能的突触救治。对接受这些免疫调节干预的13个月龄的AD⁺(ADtg)小鼠的冠状脑切片的突触前和突触后改变进行定量(图3A-图3D)。在相应的前囟区域中捕获从海马体和内嗅皮层中的19个预定区域获得的高放大倍数z-stack图像(图3A-图3D)。数据表明与匹配的WT同窝仔小鼠相比，AD⁺小鼠(PBS对照)的脑中的突触前和突触后密度显著丧失(图3E)。值得注意的是，免疫调节疗法显著救治了突触形成(图3E；p<0.001)。来自13个月龄的AD⁺小鼠的脑的体外数据表明了显著的Aβ_1-42诱导的突触前和突触后区域的丧失，以及在接受GA免疫或移植的Mo的小鼠中的明显的突触救治(图3E)。这些结果提出了Aβ_1-42组装体诱导的突触丧失是否导致神经元功能障碍，以及GA处理的MΦ的突触救治是否会影响神经元功能保持的问题。

为了阐明MΦ可能发挥其突触保护作用的可能机制，评估了MΦ经由结合、内化和将其转移到内体中来清除Aβ_1-42组装体的能力(图4)。在MΦ摄取15min后，在早期内体(EEA1⁺囊泡)内共定位的Aβ的定量表明fAβ_1-42与oAβ_1-42的内体存在显著更高(图4D)，这可能指示了fAβ_1-42的增强的MΦ清除机制。还鉴定了GA处理后MΦ中免疫调节物OPN的上调(图5A-图5D)。GA处理的MΦ中OPN增加2倍与fAβ_1-42摄取增加2.8倍相关(图5D)。对接受GA免疫或移植Mo的AD⁺小鼠的脑组织的检查也显示OPN的上调，尤其是在Aβ斑块处并且由MΦ表达的(图6A)。脑OPN表达与6E10⁺斑块面积呈负相关，并且与浸润的Mo/MΦ呈正相关；相关图显示了OPN水平与Aβ-斑块负荷(R²＝-0.58；p＝0.02)以及OPN与浸润的Mo/MΦ(R²＝0.54；p＝0.04)之间的关系(图6B)。经由siRNA的OPN敲低导致由GA处理的MΦ引起的fAβ_1-42吞噬作用减少，从而表明了OPN介导GA增强的Aβ吞噬作用的机理(图7A-图7C)。

虽然不希望受任何特定理论的束缚，但我们认为用GA处理的巨噬细胞(MΦ)增加了免疫调节物OPN的表达，从而导致病理性Aβ形式和免疫谱的清除增强，以支持保留的神经元结构和功能。有关体外实验设计的概述，参见表1。

表1.

如先前报道的那样制备P1神经元。简而言之，从1天大的新生小鼠获得皮层神经元(CN)，将其解离、重悬并以5×10⁴个/ml细胞接种于24孔培养板中。如本文所述获得BM-MΦ。简而言之，从C57BL/6小鼠中分离单核的富集的BM衍生的细胞，并使该细胞分化成MΦ，持续7天。通过将原代MΦ在原代CN培养物(比率为1:1)中悬浮48小时来制备神经元和MΦ的共培养物。将单独的CN或CN与MΦ的共培养物与预先形成的(纯化的、稳定的)f-、pf-或oAβ_1-42一起温育过夜(图8)。为了评估GA效应和OPN抑制，在共培养之前，用含有和不含OPN-或杂乱的siRNA(Invitrogen，Stealth Select)的GA(30mg/ml，TEVA Neuroscience)将MΦ处理24小时。实验将在接种CN 9天后进行。对培养物进行处理以定量突触密度和神经炎长度。将原代培养物用突触前VGluT1(Chemicon，1:6,000)、突触后PSD95(Abcam，1:600)(用于突触)或Tuj1(用于神经突起)相同地染色。类似地对阴性对照进行处理，省略一级抗体或二级抗体。使用配备有Carl Zeiss ApoTome的Axio Imager Z1荧光显微镜拍摄显微照片。用Puncta分析仪对突触斑点数和突触免疫反应面积进行定量。使用NeuriteTracer测量总神经突起长度。每种条件分析至少3个盖玻片、36个图像和150个神经元。将计算平均斑点数、每个图像或每个神经元的突触面积。在Clive Svendsen博士的实验室中进行使用微电极阵列(EMA)的CN的自发网络活动。MEA记录方案将按照公布的方式进行。简言之，在培养的第9天，记录CN的自发网络活动持续60min以获得基线。然后，使用Axion Maestro MEA装置记录那些用f/pf/oAβ_1-42温育并与GA处理的MΦw/或w/o OPN siRNA或单独的MΦ共培养的神经元。然后确定总动作电位点火率和平均神经元点火频率并将其绘图。如本文所述，通过细胞裂解物中的Aβ_1-40/Aβ_1-42水平的ELISA和ICC定量评估MΦ的细胞内Aβ_1-42摄取。关于体外实验的示意图，请参见图9A。

虽然不希望受任何特定理论的束缚，但我们认为用BM-CD115⁺Mo进行GA免疫或血液富集将经由在斑块病变处增加表达OPN的MΦ的脑募集并增强Aβ_1-42的去除来救治AD⁺小鼠的突触结构和认知功能。有关体内实验设计的概述，请参见表2。

表2

使用AD⁺、OPN敲除(OPN^KO)和GFP系小鼠(Jackson Labs)的所有实验均根据Cedars-Sinai Medical CenterIACUC的规定进行。将如本文所述对小鼠组织进行处理。将脑切片用VGluT1和PSD95(用于突触)或Tuj1(用于神经突起)相同地染色，并且如上所述捕获图像。为了覆盖海马区，在DG的ML以及CA1的SLM、SR和SO中分别精确选择了在100×物镜下的15个相同的矩形场(90μm×70μm)。此外，在内嗅皮层2和3中仔细选择了4个相同的场。执行0.25μm间隔的单光学切片图像和3.75μm Zeiss ApoTom高分辨率扫描(图3A-图3D)。使用Puncta分析仪和NeuriteTracer对突触斑点数/面积和总神经突起长度进行定量。针对每种条件计算平均斑点数，每个图像或每个神经元的突触面积。Barnes迷宫行为测试按照我们之前描述的方式进行。关于体内实验的示意图，参见图9B。为了研究作用机理，我们提出，如上所述，评估Aβ_1-42组装体清除的效率，并确定与如免疫调节、神经营养支持等功能相关的MΦ神经保护表型。我们专门研究了免疫调节物OPN在这些功能中的作用。针对体外和体内机理的实验设计概述，参见表3。清道夫受体(Scara-1、CD36、CD163)和降解酶(MMP-9、ACE、脑啡肽酶)的水平也将根据制造商的方案(R&D system)通过夹心ELISA来测定。将通过ELISA和/或IHC检查促炎细胞因子和抗炎细胞因子、OPN、IL-10、TGFβ1、iNOS和TNFα(R&D system)的表达。除TGFβ1和OPN外，还进行了通过IGF-1对神经营养支持的测量。使用包括GFP标记、Iba-1、CD11b、Ly6C和/或CD45的标志物，通过FACS和IHC确定Mo/MΦ群体的脑浸润。

表3

实施例3

OPN表达模式与AD相关脑区域中的淀粉样蛋白斑块相关

对ADtg以及年龄和性别匹配的非Tg、野生型(WT)小鼠的各种脑区域中的OPN表达模式进行分析(图10)。免疫组织化学(IHC)显示在Aβ斑块内或附近的所有AD相关脑区域(海马体、扣带皮层和内嗅皮层；图10A)中的不同OPN表达模式(图10B)。在对照WT小鼠中，OPN免疫标记在很大程度上是不可检测的。在具有过氧化物酶标记的ADtg小鼠的脑中观察到类似的OPN表达模式(图10C)。在通常不与AD相关的脑区域(即纹状体)中，OPN免疫染色主要限于ADtg和WT小鼠中的神经元(图17A-图17B)。不受任何特定理论的束缚，这些结果证明，在ADtg小鼠的AD相关脑区域中，OPN由与Aβ斑块相关的骨髓细胞选择性表达。

通过GA免疫的脑OPN表达上调与Aβ斑块负荷呈负相关

为了研究GA免疫对脑中OPN表达的影响，对有症状的ADtg小鼠的三个处理组：GA免疫(每周一次皮下注射(s.c.)，持续2个月)、GA+Mo^BM组合处理(每周一次皮下注射GA加每月一次静脉内(i.v.)注射Mo^BM亚组，持续2个月)以及PBS对照组(每月一次静脉内注射PBS，持续两个月)进行分析。覆盖海马(HC)区域和扣带皮层区域的冠状脑切片的代表性显微照片显示，与PBS对照相比，GA和GA+Mo^BM免疫的小鼠的OPN免疫反应性升高且6E10⁺-Aβ斑块负荷降低(图10A)。在内嗅皮层(EC；未显示)中观察到类似的结果。

定量免疫组织化学(IHC)验证了GA免疫的ADtg小鼠组中脑OPN表达的显著增加(图11B和图18A)。与PBS对照相比，用GA处理的小鼠中的OPN表达高1.5倍，并且在EC中始终最高并且在HC中最低。这种差异在GA+Mo^BM组中甚至更大，其中脑OPN是PBS对照的1.7倍(图11B)。与PBS对照相比，相同脑切片中6E10⁺-Aβ斑块负荷的评估显示在GA免疫组(GA和GA+Mo^BM)中大幅度减少(图11C)。

接下来，针对斑块负荷的面积测量OPN表达水平。对总脑区域中总OPN面积与斑块面积的比率进行定量(图11D和图19B)。两个GA免疫组均在每个Aβ-斑块区域的总OPN表达中显示显著的增加(分别为2.6倍和3.6倍)。单独的皮层和海马分析显示了相似的结果(图18B)。对于组合的GA+Mo^BM组，对Aβ斑块内升高的OPN表达的这些影响更大(图11D)。使用Pearson检验的相关性分析表明OPN表达与6E10斑块负荷之间存在显著的负相关关系(图11H)，并且在皮层区域中观察到更强的相关性(图11I)。不受任何特定理论的束缚，这些结果共同表明ADtg小鼠中的GA免疫导致脑OPN表达的上调，伴随着淀粉样蛋白斑块负荷的减少。

OPN主要由参与Aβ清除的浸润的单核细胞衍生的巨噬细胞表达

为了鉴定ADtg小鼠脑中表达OPN的细胞，使用了两种不同的方法。为了区分浸润的单核细胞/巨噬细胞(Mo/MФ)与小神经胶质细胞，首先使用组合的Iba-1和CD45标志物(图13A)。代表性荧光显微照片显示了，与常驻Iba1+CD45^中低小神经胶质细胞相比，通过脑浸润Iba1⁺CD45^高Mo/MФ对OPN的选择性表达(图13A)。这些浸润的表达OPN的Iba1⁺CD45^高Mo/MФ积累在斑块病变部位处和周围，并直接吞噬Aβ(图13A，箭头)。在第二种方法中，从年轻供体WT小鼠中分离GFP标记的CD11b+CD115+-Mo^BM，并将其注射到有症状的10个月龄的ADtg小鼠的尾静脉中(图13B)。这些表达GFP⁺CD45^高的Mo/MФ可与GFP-小神经胶质细胞区分开，并与OPN强烈共标记。表达高OPN的Mo/MФ通常集中在EC中，归巢到斑块病变部位周围的脑实质(图13B-图13C)。还检查了OPN在ADtg小鼠脑中的浸润的Mo/MФ内的亚细胞定位。在囊泡隔室和在整个细胞体和过程中发现了OPN(图13D-图13E)。OPN表达在核周区域特别强烈。

接下来，对上述提到的脑区域中每个切片的OPN+CD45^高细胞计数进行定量。与PBS对照相比，分别在GA和GA+Mo^BM组中检测到浸润的OPN+CD45^高细胞的数目大幅增加1.5倍和2.2倍(图13F)。相关性分析表明在ADtg小鼠中OPN表达与Iba1⁺CD45^高Mo/MФ的浸润之间存在显著的直接线性关系(图13G)。通过每6E10免疫反应面积的CD45^高与OPN表达的比率指示OPN细胞因子的表达与斑块周围的募集的骨髓细胞之间的更紧密的关联(图19B)。多因素相关图分析证实了OPN表达与Aβ斑块负荷之间的负相关关系，以及浸润的Mo/MФ与OPN表达之间的直接关联(图6B和图19A)。不受任何特定理论的束缚，这些结果表明GA在ADtg小鼠中诱导表达OPN的Mo/MФ的脑募集，这表明通过GA免疫在ADtg小鼠中，主要是在直接参与脑Aβ斑块清除的浸润的Mo/MФ中升高了OPN表达。

GA上调BM衍生的巨噬细胞的原代培养物中的OPN表达

为了研究GA对巨噬细胞中OPN表达的影响，进行了使用原代MФ^BM的一系列体外研究。从年轻的WT供体小鼠中分离BM，使该BM分化成成熟的巨噬细胞，用GA(30μg/ml；GA-MФ^BM)预处理过夜并暴露于预先形成的Aβ_1-42原纤维中。代表性的荧光图像显示，在没有Aβ的初始实验中，OPN在培养物中由MФ^BM组成型表达，并在暴露于GA时过表达(图14B)。由于MФ^BM组成型表达OPN并将OPN分泌到细胞外基质中，因此评估了通过布雷菲德菌素A(BFA)预处理抑制分泌进行的OPN产生(图14C)。实际上，新生成的OPN被BFA捕获，从而增加了其细胞内积累。随后，这些细胞表现出降低的细胞粘附和改变的圆形形态。GA进一步升高了BFA预处理的MФ^BM中的OPN产生(图14C)。定量免疫细胞化学(qICC)证实GA-MФ^BM与未处理的MФ^BM中，OPN产生/表达(分别在有和没有BFA的情况下)显著增加1.6倍和2.5倍(图14D)。细胞裂解物的定量酶联免疫吸附测定(ELISA)分析证实了这些结果，表明GA处理后OPN水平增加(在有和没有BFA的情况下分别为1.4倍和2.3倍)(图14E)。BFA条件表明了在短时间内(即在1-3小时内)OPN在MФ^BM中的大量积累。总之，OPN的ELISA、qICC和Western印迹评估(图14D-图14G)反映了我们的体内结果，表明GA在MФ^BM中显著地诱导OPN表达和产生。

OPN在GA激活的巨噬细胞中正向调节Aβ吞噬作用

然后检查由GA激活引起的增加的OPN表达是否与巨噬细胞吞噬致病性Aβ聚集体的能力相关。如前文所述，将MФ^BM用GA预处理，并用100nM纤维状Aβ_1-42刺激30min。代表性的高放大倍数Z-stack图像证明，MФ^BM中的细胞内OPN表达伴随着纤维状Aβ_1-42的吞噬作用(图15A)。如通过qICC分析检测到的，增强的Aβ摄取与GA处理的MФ^BM中增加的OPN表达相关(图15B-图15C)。代表性图像显示了在体细胞内和沿着CD68⁺吞噬细胞的过程中OPN免疫反应性的不同的模式，具有强的核周和均匀分布的囊泡信号，伴随着点状的Aβ标记。这种染色在GA处理后显著增加(图15G-图15H’)。细胞裂解物的定量ELISA分析验证了上述qICC结果，表明GA处理的与未处理的MФ^BM中增加的细胞内OPN和Aβ_1-42(图15I-图15J)。这些结果表明GA增加了MФ^BM中的OPN表达(2.3-2.7倍)和纤维状Aβ_1-42摄取(2.5-2.85倍)。

先前的研究表明，巨噬细胞中的细胞内OPN缺失会损害吞噬活性。在此，为了评估OPN在Aβ的特异性吞噬作用中的参与，使用siRNA敲低OPN表达(图15L-图15N)。用siRNA^OPN或对照siRNA^Neg转染MФ^BM细胞，并在48小时后添加纤维状Aβ_1-42，然后进行吞噬作用测定。代表性的荧光图像显示siRNA-OPN抑制后CD68⁺MФ^BM对纤维状Aβ_1-42摄取的大幅度降低(图15L)。定量ICC分析验证了观察结果，并表明82％-85％的OPN抑制与56％-63％的Aβ_1-42原纤维细胞内摄取减少相关(图15M-图15N)。这些结果表明，在没有OPN的情况下纤维状Aβ_1-42的吞噬作用受损(图15N)。阴性对照杂乱的siRNA不影响OPN表达或Aβ吞噬作用。此外，当OPN被抑制时，GA对MФ^BM摄取Aβ的能力几乎没有或没有影响。总的来说，不受任何特定理论的束缚，数据表明OPN介导巨噬细胞吞噬纤维状Aβ_1-42的能力，即通过GA介导的OPN诱导获得功能以及在OPN抑制时丧失功能的活性。

GA通过诱导OPN及其活性片段促进巨噬细胞极化

巨噬细胞可以根据其微环境获得不同的表型和生物学功能。过去的研究报道了OPN促进巨噬细胞转变为抗炎M2表型。研究了OPN在朝向抗炎表型的巨噬细胞极化中的可能作用，所述抗炎表型与细长的细胞形状相关。分析在各种处理条件下的细胞长度，发现在经历具有扩增的OPN表达的GA处理的细胞中，长度增加了1.3倍。相反，siRNA^OPN敲低逆转GA效应，并进一步使细胞长度减少约30％-40％(图16A-图16B)。在没有OPN的情况下，GA不影响巨噬细胞伸长(图16B)，类似于siRNA^OPN敲低后我们的Aβ吞噬作用的结果(图15N)。

接下来评估在不同治疗组中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(促炎性M1巨噬细胞表型的标志)的表达(图16C-16D)。三环抗生素米诺环素用于抑制OPN表达。米诺环素已被证明可调节炎症反应并降低基质金属蛋白酶(MMP)-9活性和蛋白水解OPN片段的产生。MФ^BM由GA激活OPN或由米诺环素抑制OPN，然后暴露于纤维状Aβ持续30min。荧光显微照片显示GA降低iNOS表达并增加纤维状Aβ^1-42吞噬作用，而米诺环素具有相反的作用。定量ICC测定证实通过米诺环素处理的巨噬细胞的iNOS表达显著增加约1.3倍，并且Aβ^1-42吞噬作用显著减少48％。最重要的是，GA处理使iNOS产生减少了28％，并使Aβ吞噬作用增加2.5倍(图16D-图16E)。这些研究表明GA诱导OPN表达，这导致细长的促愈合细胞形态、减少的iNOS产生和增加的Aβ^1-42吞噬作用。不受任何特定理论的束缚，这些变化可支持向抗炎、高度吞噬巨噬细胞表型(其与AD模型中的神经保护相关)的转变。

接下来，对MMP-9表达和OPN蛋白水解片段进行分析。与发明人先前的结果一致，GA处理使巨噬细胞中的MMP-9表达显著增加2.7倍(图16F-图16G)。OPN是MMP(包括MMP-9)的已知底物。使用识别全长OPN及其MMP切割片段(包括32kD形式)的多克隆抗体进行巨噬细胞中OPN表达的详细分析。Western印迹分析和随后的条带密度定量揭示所有的OPN形式，包括源自MMP蛋白水解的片段，通过GA处理(图16I-图16J)升高，其与MMP-9产生增加同时发生。值得注意的是，在GA处理后，MMP产生的含32kD C末端的肽升高了12倍。该片段的基础水平在未处理的巨噬细胞中非常低，但在GA活化后变得非常突出(图16I-图16J)。

最后，对ADtg小鼠脑中MMP-9和OPN的表达的分析表明脑OPN免疫反应面积与MMP-9蛋白水平之间呈正相关(图19C)。脑浸润CD45^hi巨噬细胞中的OPN表达显示出与MMP-9水平的更强相关性(图19D)。不受任何特定理论的束缚，组合的数据表明GA诱导OPN表达(包括其MMP切割的活化片段)，并介导巨噬细胞向促愈合、抗炎、高度吞噬表型的极化，表明了其在神经保护中的新作用。

在该研究中，鉴定了利用体内和体外模型的AD中OPN的新型免疫调节作用。此外，FDA批准的药物GA是上调其在巨噬细胞中的表达的有效手段。第一个主要观察结果是在AD相关区域(海马体和皮层)中检测到ADtg小鼠脑中的OPN模式。虽然OPN在Aβ损伤部位周围的炎性细胞中大量表达，但非患病的脑区主要在神经元中表现出这种细胞因子。在炎性细胞中，OPN主要由浸润的Iba1⁺CD45^高或GFP标记的单核细胞衍生的巨噬细胞表达。该细胞因子在AD中可能的免疫调节作用来自OPN与单核细胞浸润和Aβ斑块清除紧密相关的发现。富含直接参与Aβ摄取的浸润的Mo/MФ(即内嗅皮层)的脑区域中OPN表达的增加进一步支持了OPN有助于巨噬细胞介导的Aβ清除的观点。

尽管在创伤性脑损伤后的反应性小神经胶质细胞中报道了OPN表达增加，但在此观察到ADtg小鼠脑中的OPN表达选择性地发生在巨噬细胞中。该观察结果与证明外周巨噬细胞比常驻小神经胶质细胞更有效地吞噬Aβ斑块的研究一致。OPN的已知的与各种表面整合素和清道夫受体的相互作用进一步支持了其对这些炎症细胞的吞噬活性的直接影响。

还注意到，当与静脉内单核细胞富集组合时，GA免疫后脑OPN的显著上调甚至更大。这些结果与发明人先前报道的增加的单核细胞向脑中的募集模式相似，由相同的组合免疫调节方法协同引起。鉴于OPN是由巨噬细胞表达的整合素结合蛋白，这些发现可以解释其在调理作用和免疫细胞向炎症部位募集中的作用。因此，不受任何特定理论的束缚，可以得出结论，当GA诱导外周吞噬细胞向淀粉样蛋白斑块募集时，该免疫调节现象由OPN介导。

此外，该研究表明GA以类似于在ADtg小鼠脑中观察到的方式实质上诱导BM衍生的巨噬细胞中的OPN表达。本发明人证明了这些GA刺激的原代培养物中OPN增加与随后的预先形成的纤维状Aβ^1-42的细胞内摄取的一致性证据。通过利用负向调节OPN表达(siRNA或米诺环素)或正向诱导它(GA)的系统，证明了OPN在巨噬细胞介导的Aβ吞噬作用中的关键作用。这些结果以及描述OPN参与其他吞噬活动的文献揭示了纤维状Aβ^1-42吞噬作用可能直接依赖于OPN表达。

OPN的不同功能可以通过其复杂的蛋白水解处理(例如允许多种不同的细胞相互作用的MMP的切割)来实现。具体而言，MMP-9涉及产生功能性的更强神经保护形式的OPN。数据表明GA不仅诱导MMP-9表达，而且还显著增加全长OPN及其MMP切割片段的丰度。特别地，GA激活的巨噬细胞培养物表现出32kD OPN片段水平的显著12倍增加，该片段是涉及神经保护的OPN产物。对ADtg小鼠脑中浸润的Mo/MФ的检查也为MMP-9和OPN之间的联系提供了进一步的支持，这由它们的紧密相关性和GA免疫后的表达增加得以证实。这些发现与之前的报道一致，表明了MMP-9在生成功能形式的OPN中的作用。未来的研究应该确定每个OPN片段如何影响AD背景下的巨噬细胞表型，不受任何特定理论的束缚，可以假定通过升高这些MMP切割的神经保护片段来介导GA对治疗性巨噬细胞表型的诱导。

尽管通常被认为是促炎性细胞因子，但最近的研究表明OPN可能有助于大脑中的修复促进过程。该研究意外地证明GA使巨噬细胞向高度吞噬(增加的纤维状Aβ_1-42摄取)、抗炎(减少的iNOS和增加的MMP-9)、促愈合(细长的)表型极化，这依赖于OPN表达。在OPN抑制后，这种表型转变被逆转。不受任何特定理论的束缚，数据共同证明了OPN作为AD模型中巨噬细胞表型和Aβ清除的关键免疫调节物的新作用。GA对巨噬细胞的极化由OPN特异性介导，表明了OPN在抵抗AD相关病理学和促进组织修复方面的有前途的神经保护作用。

以上在详细描述中描述了本发明的各个实施方案。虽然这些描述直接描述了上述实施方案，但应该理解，本领域技术人员可以想到对本文示出和描述的特定实施方案的修改和/或变化。落入本说明书范围内的任何此类修改或变化也意在包括在本发明中。除非特别指出，否则本发明人的意图是给予说明书和权利要求书中的词语和短语对于适用领域的普通技术人员来说一般和习惯的含义。

已经呈现了申请人在提交本申请时已知的本发明的各个实施方案的前述描述，并且该描述意在用于说明和描述的目的。本说明书并非旨在穷举，也并非将本发明限制于所公开的精确形式，并且根据上述教导可以进行许多修改和变化。所描述的实施方案用于解释本发明的原理及其实际应用，并且使得本领域的其他技术人员能够在各个实施方案中利用本发明以及适合于预期的特定用途的各种修改。因此，意图是本发明不限于为实施本发明而公开的特定实施方案。

虽然已经示出和描述了本发明的特定实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，基于本文的教导，可以在不脱离本发明及其更宽泛的方面的情况下进行改变和修改，因此，所附权利要求在其范围内包含在本发明的真实精神和范围内的所有这些改变和修改。本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“含有”应被解释为“含有但不限于”等)。

如本文所用的术语“包含”或“包括”用于提及对实施方案有用的组合物、方法及其相应的组分，但对于未指定的元素(无论是否有用)的包含是开放性的。本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“含有”应被解释为“含有但不限于”等)。尽管本文使用作为诸如包括、含有或具有的术语的同义词的开放式术语“包含”来描述和要求保护本发明，但本发明或其实施方案可替代地使用诸如“由......组成”或“基本上由......组成”等替代术语来描述。

Claims

1.一种在有需要的受试者中治疗、预防阿尔茨海默病或降低阿尔茨海默病的可能性，减轻阿尔茨海默病的症状，救治突触结构和/或认知功能，增强病理性淀粉样蛋白β形式的清除或抑制神经元结构和功能的衰退的方法，该方法包括：

提供一种组合物，当该组合物施用于所述受试者时，导致骨桥蛋白(OPN)的水平相对于正常受试者增加；以及

向所述受试者施用足以增加所述OPN水平的量的所述组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含表达OPN的先天免疫细胞、重组OPN、OPN片段、OPN衍生物、OPN模拟物、OPN类似物或其组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述单核细胞是浸润的单核细胞并在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述先天免疫细胞是吞噬细胞。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述组合物包含醋酸格拉替雷(GA)。

9.根据权利要求3所述的方法，其中离体或体内刺激所述先天免疫细胞。

10.根据权利要求3所述的方法，其中通过过继性细胞转移或骨髓移植将表达OPN的先天免疫细胞施用于所述受试者。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述先天免疫细胞过表达OPN。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物通过选自直接递送至受试者、病毒载体递送、脂质体递送系统或纳米药物递送系统的方法进行施用。

13.根据权利要求1所述的方法，其中阿尔茨海默病的症状选自记忆丧失、认知的非记忆方面的衰退、推理或判断受损、行为改变、执行多步骤任务、幻觉、妄想、偏执及其组合。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物的施用导致MMP-9增加。

15.根据权利要求1所述的方法，其中升高的OPN表达导致所述受试者的错误折叠的蛋白质的水平降低。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述错误折叠的蛋白质是淀粉样蛋白β(Aβ)。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述Aβ是Aβ₄₀和/或Aβ₄₂。

18.一种改善有需要的受试者的认知功能的方法，该方法包括：

向所述受试者施用足以增加所述OPN水平的量的所述组合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物包含表达OPN的先天免疫细胞、重组OPN、OPN片段、OPN衍生物、OPN模拟物、OPN类似物或其组合。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物刺激先天免疫细胞中的OPN的表达。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述先天免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞或其组合。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述单核细胞包括骨髓来源的单核细胞、脾来源的单核细胞、CD115阳性单核细胞(CD115⁺单核细胞)或其组合。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述单核细胞是浸润的单核细胞并且在脑中成为表达OPN的巨噬细胞。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述先天免疫细胞是吞噬细胞。

25.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合物包含醋酸格拉替雷(GA)。

26.根据权利要求20所述的方法，其中离体或体内刺激所述先天免疫细胞。

27.根据权利要求20所述的方法，其中通过过继性细胞转移或骨髓移植将表达OPN的先天免疫细胞施用于所述受试者。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述先天免疫细胞过表达OPN。

29.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物通过选自直接递送至受试者、病毒载体递送、脂质体递送系统或纳米药物递送系统的方法进行施用。

30.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物的施用导致MMP-9增加。

31.根据权利要求18所述的方法，其中OPN的水平增加导致所述受试者的错误折叠的蛋白质的水平降低，所述受试者的炎症减少，所述受试者的突触再生增加，巨噬细胞被募集至所述受试者的淀粉样蛋白β(Aβ)斑块部位或其组合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述错误折叠的蛋白质是Aβ。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述Aβ是Aβ₄₀和/或Aβ₄₂。