CN109596818B - 一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，结合与奥沙利铂神经毒性(OXIN)相关的瞬时感受器电位(TRP)离子通道的亚型，全细胞膜片钳技术记录OXIN模型大鼠背根神经节(DRG)细胞的基本膜电生理特性。本发明基于电生理学，提供的一种生物膜片钳分析TRP通道活性的方法，提示抑制TRP通道活性可能是当归四逆汤发挥治疗OXIN效应的重要机制之一。在深入了解当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的作用机制和组方配伍的科学原理上有重要意义，也预示了当归四逆汤在奥沙利铂神经毒性预防上有着广阔应用前景。

Description

一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机 制的研究方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法。

背景技术

奥沙利铂(Oxaliplatin OXA)是继顺铂和卡铂后的第3代铂族金属抗肿瘤药物。其抗癌谱更广，且与顺铂和卡铂无交叉耐药，是目前胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药之一。奥沙利铂最常见的不良反应为外周神经毒性(Oxaliplatin-induced neurotoxicity OXIN)，接受奥沙利铂治疗5-7个月的患者中约50％发生中-重度周围神经病变，且呈剂量依赖和累积性，限制了该药的剂量和临床疗效的进一步发挥。

奥沙利铂神经毒性发生机制目前尚不完全明确。已报道的机制包括：①与离子通道尤其是电压门控的Na+通道有关；②与DNA损伤，包括对特定的在细胞凋亡和细胞周期间起平衡调节的分子作用有关；③与血清神经生长因子(nerve growth factor NGF)水平的下降有关；④近期的研究与瞬时感受器电位(transient receptor potential TRP)通道有关。

TRP超家族离子通道在多种感觉传导，特别是听觉、触觉、机械性痛等感觉过程中起着重要的作用。TRP超家族蛋白作为非选择性阳离子通道对Ca2+具有高通透性，是感受体系中的门控分子，也是外部环境与神经系统之间的中介，可以将热刺激、化学刺激以及机械刺激转换为内向电流，是产生温度和疼痛感觉的第一步。TRP家族主要由七个亚族组成：TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN等。继1997年Caterina等在背根神经节成功克隆了TRPV1受体后，TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8和TRPA1也相继被发现存在于DRG中。这些离子通道被认为参与了化学物质、温度以及机械刺激所诱导的痛觉的形成。

目前研究显示TRPV1、TRPA1、TRPM8可能参与到奥沙利铂神经毒性中。体内试验显示TRPV1在化疗诱导的奥沙利铂神经毒性中起到重要作用，和外周神经损伤后诱导的神经痛相似。Lauren等也报道应用奥沙利铂后TRPV1、TRPA1、TRPM8mRNA表达增加，并指出TRPV1可能起到主要的作用。Histopathology实验中TRPA1缺陷小鼠未反应出机械痛和冷过敏，而使用奥沙利铂后细胞内cAMP增加，诱导TRP通道开放，导致神经元损伤。有几项研究显示DRGTRPM8 mRNA在奥沙利铂诱导的亚急性外周神经毒性中表达一过性的上调。TakehiroKawashiri等也通过实验证实奥沙利铂可以诱导大鼠DRG TRPM8 mRNA、TRPM8蛋白表达上调和钙离子内流，并发现钙离子通道阻滞剂能够改变这种变化。

虽然临床用于防治奥沙利铂神经毒性的药物较多，但都没有获得明确的推荐，理想的药物是在改善奥沙利铂外周神经毒性的同时，既不削减奥沙利铂的抗肿瘤活性，又不促进肿瘤生长，并且本身不具有内在毒性。总体而言，西医在防治奥沙利铂神经毒性方面没有更为理想的方法，所以中医药的运用显示越来越重要的作用。目前已有报道，当归四逆汤在防治奥沙利铂神经毒性上取得了较好的临床效果，由奥沙利铂神经毒性引起的手足麻木疼痛等表现得到了不同程度的缓解，同时发现当归四逆汤可明显延缓奥沙利铂神经毒性动物模型的疼痛阈值下降的时间和幅度，并且其主要作用靶点在背根神经节(DRG)，通过下调大鼠L4-6脊髓中NR2B的表达，以及上调L5DRG中pNF-H蛋白水平来介导。

通过电生理学方法分析当归四逆汤对于TRP通道活性的作用还未见报道。在深入了解当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的作用机制和组方配伍的科学原理上有重要意义，也预示了当归四逆汤在奥沙利铂神经毒性预防上有着广阔应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对现有药理学方法不能完整全面的阐释当归四逆汤发挥预防奥沙利铂神经毒性的作用机制的难点，提供一种基于电生理学的分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，为奥沙利铂神经毒性的预防治疗提供依据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

构建奥沙利铂神经毒性大鼠模型，急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞，利用全细胞膜片钳技术，记录分离的各组DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性，分析奥沙利铂神经毒性与TRP通道活性的关系。对当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的机制及研究方法有了进一步认识。

为了达到上述目的，本发明的具体步骤如下：

1、所述构建奥沙利铂神经毒性大鼠模型按如下步骤进行：

1)将大鼠随机分为5组，每组6只，分别为空白组、模型组、当归四逆汤低、中、高剂量组；

2)除空白组予以腹腔注射5％葡萄糖注射液4mg/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂(按奥沙利铂注射液计1.6ml/kg)，一周两次，共四周(时间点分别为d1，d2，d8，d9，d15，d16，d22，d23)；

3)当归四逆汤药方为当归12g、桂枝9g、细辛3g、白芍9g、通草6g、甘草6g、大枣9g。当归四逆汤成人处方生药量为54g(生药低剂量含量0.62g/ml，中剂量1.24g/ml，高剂量2.48g/ml)，当归四逆汤各组灌胃给药10ml/kg，每日1次，空白组、模型组予0.9％NaCl溶液灌胃10ml/kg，每日1次，奥沙利铂用药当天，中药于奥沙利铂应用前一小时给药；

4)平时观察大鼠一般情况，每7天测一次体重，并通过Von Frey纤维细丝测量大鼠的诱发痛觉，检测机械疼痛阈值。

2、所述急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞按如下步骤进行：麻醉处死大鼠，快速分离并切取L4-L5位的神经节，无菌条件下仔细剥离脊膜及血管；胰蛋白酶消化组织块，37℃，10min，制成细胞悬液；离心细胞悬液(1000rpm，10min，4℃)，弃去上清液，加入DMEM-F12培养基重悬，200目细胞筛过滤；将滤液进行台盼蓝拒染试验，血细胞计数板镜下计数；将细胞接种到培养板，置37℃、5％CO2培养箱培养过夜；体外培养，更换为Ara-C工作液，作用24h后吸出；此后更换为神经元维持培养基培养细胞用于实验。

3、所诉利用全细胞膜片钳技术，记录分离的各组DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性按如下步骤进行：

1)标本制备：将生长状态良好的DRG细胞，分为20组，如下

组1.空白组DRG

组2.模型组DRG

组3.当归四逆汤低剂量组DRG

组4.当归四逆汤中剂量组DRG

组5.当归四逆汤高剂量组DRG

组6.空白组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组7.模型组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组8.当归四逆汤低剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组9.当归四逆汤中剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组10.当归四逆汤高剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组11.空白组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组12.模型组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组13.当归四逆汤低剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组14.当归四逆汤中剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组15.当归四逆汤高剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组16.空白组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组17.模型组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组18.当归四逆汤低剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组19.当归四逆汤中剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组20.当归四逆汤高剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油

2)电极制备：将玻璃毛细管用电极拉制仪拉制而成膜片微电极，电极在实验前要灌注电极液，灌注后的全细胞记录控制在2～3MΩ；

3)进行实验，记录，具体步骤如下

(1)将500ml烧杯内的孵育液通过蠕动泵与神经细胞片记录槽相通，蠕动泵速度为2ml/min，开启单通道恒温加热控制系统使记录槽内温度控制在32℃；

(2)取已完全孵育的神经细胞片将其置于记录槽内，用绑有尼龙丝的U形铂金丝固定，观察大体形态。选定大小适中，表面光滑，遮光性好，未见细胞核的梭形神经元为目标神经元，升起物镜；

(3)用微电极水平拉制仪将有芯玻璃毛细管拉制为玻璃微电极，将适量电极内液(必须浸没记录电极)注入玻璃微电极内，将玻璃微电极固定在膜片钳系统的夹持器上，给予0.1ml的正压空气后通过微操纵仪将玻璃微电极放入记录槽液面内，在Clampex10.2软件封接测试窗口观察微电极接液电阻，控制微电极接液电阻为5-8MΩ，否则重新拉制玻璃微电极，用MultiClamp 700B软件补偿电极接液电阻；

(4)在5x物镜下找到玻璃微电极后转换到40x浸水物镜，在40x浸水物镜和控制玻璃微电极移动的微操纵仪的配合下，将玻璃微电极下降到目标神经元的正上方；

(5)缓慢接近神经元，直至神经元被压出小凹，并出现细胞内液在神经元表面缓慢扩散时，撤去正压，用嘴给予轻轻的负压吸引，并将细胞钳制电位由0mV逐步降至-80mV，直至封接测试窗口所示封接电阻稳定在GΩ水平，形成高阻封接，待封接稳定一会后，用MultiClamp700B软件补偿快、慢电极电容，待漏流维持在个位数时，用嘴轻轻吸破细胞膜形成全细胞膜片钳记录；

(6)选择串联电阻小于30MΩ，静息膜电位＜-70mV的细胞进行下一步实验，否则放弃；

(7)待细胞稳定10min以上，细胞内液与电极内液交换完毕，将钳制电位维持在-80mV水平，在灌流用孵育液中加入OXA，打开预先设置在Clampex10.2软件中的protocol，记录信号；

(8)在记录开始5min时，在灌流液中分别加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油，之后持续记录30min；

(9)信号稳定后，重新开始记录；在记录开始5min时，在灌流液中加入当归四逆汤，在记录开始第15min时，在灌流液中加入各激动剂，之后持续记录15min；

4、所述步骤分析奥沙利铂神经毒性与TRP通道活性的关系，分析结果如下：

1)当归四逆汤处理模型组，可改善由于奥沙利铂建模所引起的DRG细胞全细胞电流上升，且随着药物浓度的升高，效果有所增加；

2)辣椒素为TRPV1激动剂，可增加空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此的逆转作用不明显，且随着药物浓度的升高，效果无变化；

3)薄荷醇为TRPM8激动剂，可增加空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此有逆转作用，且随着药物浓度的升高，效果有所增加；

4)芥子油为TRPA1激动剂，可增加空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此有逆转作用，且随着药物浓度的升高，效果有所增加。

本发明的有益效果是通过电生理学方法分析当归四逆汤对于TRP通道活性的作用还未见报道。本发明通过电生理学方法分析当归四逆汤对于TRP通道活性，在深入了解当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的作用机制和组方配伍的科学原理上有重要意义，也预示了当归四逆汤在奥沙利铂神经毒性预防上有着广阔应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1是各组大鼠体重

图2是各组大鼠机械疼痛阈值

图3是组1-组10钳制电位

图4是组11-组20钳制电位

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明方法的具体实现过程如下：

【实施例1】构建奥沙利铂神经毒性大鼠模型

1.主要试剂配制：

(1)PBS磷酸盐缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，超纯水800ml，调pH值为7.2，加超纯水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，室温保存。

(2)7％水合氯醛：水合氯醛7g，溶于约60ml超纯水中，超纯水定容至100ml，室温避光保存。

(3)奥沙利铂注射液：注射用奥沙利铂50mg(50mg/瓶)加入20ml的5％葡萄糖溶液使充分溶解，终浓度为2.5mg/ml，现配现用。

(4)当归四逆汤；药方为当归12g、桂枝9g、细辛3g、白芍9g、通草6g、甘草6g、大枣9g，共计54g(中药材颗粒约50ml)加入约24ml温开水，充分搅拌溶解后3000转离心2min，取上层药液记为高剂量药液，中剂量药液取高剂量药液加入等体积温开水，低剂量药液取高剂量药液加入3倍体积温开水。

2.实验分组：

A：空白对照组

B：模型组

C：当归四逆汤低剂量组

D：当归四逆汤中剂量组

E：当归四逆汤高剂量组

共5组，每组6只，共30只。

实验鼠自购回后动物房12h-12h昼夜交替，保持大鼠自由饮水、进食，温度23-25℃，适应性喂养一周后进入实验。

经适应性喂养后的Wistar大鼠称重，随机分为空白对照6只、模型组6只、当归四逆汤低、中高剂量组各6只。

造模方法：除空白组予以腹腔注射5％葡萄糖注射液4mg/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂(按奥沙利铂注射液计1.6ml/kg)。一周两次，共四周(时间点分别为d1，2，8，9，15，16，22，23)。

平时观察大鼠一般情况，每7天测一次体重，并通过Von Frey纤维细丝测量大鼠的诱发痛觉，检测机械疼痛阈值。

当归四逆汤成人处方生药量为54g(生药低剂量含量0.62g/ml，中剂量1.24g/ml，高剂量2.48g/ml)，当归四逆汤各组灌胃给药10ml/kg，每日1次，空白组、模型组予0.9％NaCl溶液灌胃10ml/kg，每日1次。奥沙利铂用药当天，中药于奥沙利铂应用前一小时给药。

取材时间点：造模第29天。大鼠称重，腹腔注射7％水合氯醛麻醉(麻醉剂量5ml/kg)，仰卧固定，按要求取出大鼠双侧坐骨神经及双侧L5背根神经节，急性分离大鼠DRG细胞用于细胞实验。

如图1所示各组大鼠体重。与空白组相比，模型组、当归四逆汤低、中、高剂量组大鼠生长速度均受到抑制。与模型组相比，当归四逆汤各剂量组均不能改变奥沙利铂对大鼠生长的抑制趋势(p＞0.05)。

如图2所示各组大鼠机械疼痛阈值的改变。模型组、当归四逆汤各剂量组大鼠的机械疼痛阈值均下降，第14天下降的最明显。而第28天时，与空白组相比，当归四逆汤高剂量组未出现明显的机械阈值下降(p＞0.05)。

【实施例2】急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞

用0.01％的L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育4h或常温过夜。吸弃L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。麻醉处死大鼠，75％(体积分数)酒精消毒，快速分离并切取L4-L5位的神经节，置于预冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank’s液的平皿中。无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。用虹膜剪将组织剪切成1mm³左右的组织块，0.125％胰蛋白酶消化，37℃，10min，期间振摇2～3次。巴斯德吸管轻轻吹打20次，静置5min，将细胞上清移入新的无菌离心管，加入完全培养基终止消化。剩余组织按照上述步骤继续消化，重复2-3次，制成细胞悬液。将新的离心管中细胞悬液，离心(1000rpm，10min，4℃)，弃去上清液。加入DMEM-F12培养基重悬，200目细胞筛过滤。

将滤液进行台盼蓝拒染试验，血细胞计数板镜下计数。以8.0×10⁴至1.0×10⁵/mL的密度将细胞以400μL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板。置37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。体外培养，更换为Ara-C工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用24h后吸出。此后更换为神经元维持培养基培养细胞用于实验。

【实施例3】全细胞膜片钳技术记录上述分离的各组DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性

1.标本制备：将生长状态良好的DRG细胞，按照实验设计条件进行处理，处理相应时间后分为20组，如下：

组1：空白组DRG

组2：模型组DRG

组3：当归四逆汤低剂量组DRG

组4：当归四逆汤中剂量组DRG

组5：当归四逆汤高剂量组DRG

组6：空白组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组7：模型组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组8：当归四逆汤低剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组9：当归四逆汤中剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组10：当归四逆汤高剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素

组11：空白组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组12：模型组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组13：当归四逆汤低剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组14：当归四逆汤中剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组15：当归四逆汤高剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇

组16：空白组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组17：模型组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组18：当归四逆汤低剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组19：当归四逆汤中剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油

组20：当归四逆汤高剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油

2.电极制备：合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃(苏打玻璃、电石玻璃)或硬质玻璃(硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃)。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。膜片微电极是将玻璃毛细管用电极拉制仪拉制而成的，制作分三步进行：

第一步是分两次拉制，第一次拉长7～10mm，直径小于200μm，在此基础上进行第二次拉制，最终使尖端的直径为1～2μm，两步拉制的目的主要是使电极前端的锥度变大，狭窄部长度缩短，因此可降低电极的串联电阻，也可减少全细胞记录时的电极液透析时间。由于膜片微电极最忌沾染灰尘和脏物，更忌触碰尖端附近部位，所以一般要求在使用前制作。

第二步是在电极前端涂以硅酮树脂(sylgard)，其目的是为了降低电极与灌流液之间的电容，并形成一个亲水界面。经此处理后，上述电容可由6～8pF减少到1pF以下。在进行全细胞记录时，不用硅酮树脂也可以得到满意的效果，通常微电极在涂抹硅酮树脂后再进行抛光，但最好是在涂抹后一小时内抛光，否则很难改变电极尖端的形状。

第三步是抛光，将电极固定于显微镜工作台上，在镜下将尖端靠近加热丝，当通电加热时，可见电极尖端微微回缩，此时电极变得光滑，且尖端的杂质烧去，得到较干净的表面。从而有利于和细胞膜紧密封接，并在封接后更易保持稳定。

电极在实验前要灌注电极液，由于电极尖端较细，因此在充灌前，电极内液要用0.2μm的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为2～5MΩ，而全细胞记录则最好在2～3MΩ。

3.膜片钳实验系统：根据不同的电生理实验要求，可以组建不同的实验系统，但有若干共同的基本部件，包括机械部分(防震工作台、屏蔽罩、仪器设备架)、光学部分(显微镜、视频监视器、单色光系统)、电子部件(膜片钳放大器、刺激器、数据采集的设备、计算机系统)和微操纵器。

在大多数膜片钳实验，要求所有实验仪器及设备均具有良好的机械稳定性，以使微电极与细胞膜之间的相对运动尽可能小。防震工作台放置倒置显微镜和与之固定连接的微操纵器，其他设备置于台外。屏蔽罩由铜丝网制成，接地以防止周围环境的杂散电场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。仪器设备架要靠近工作台，便于测量仪器与光学仪器配接。

倒置显微镜是膜片钳实验系统的主要光学部件，它不仅具有较好的视觉效果，便于将玻璃电极与细胞的顶部接触，而且是借助移动物镜来实现聚焦，具有较好的机械稳定性。视频监视器主要是用来监视实验过程中的操作，特别是能将封接参数(如封接阻抗)与细胞的形态对应，以实现良好的封接。

膜片钳放大器是整个实验系统中的核心，它可用来作单通道或全细胞记录，其工作模式可以是电压钳，也可以是电流钳。从原理来说，膜片钳放大器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种典型的结构，后者因用反馈电容取代了反馈电阻，降低了噪声，所以特别适合超低噪声的单通道记录。由于供膜片钳实验的专用计算机硬件及相应的软件程序的相继出现，使得膜片钳实验操作简便、效率提高。如与EPC-9型膜片钳放大器(内含ITC-16数据采集/接口卡)配套使用的软件PULSE/PULSEFIT，它既可产生刺激波形，控制数据采集，又可分析数据，同时具有用于膜电容监测的锁相放大器，多种软件功能集成于一体。

4.进行实验，记录和分析数据。准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析：

(1)将500ml烧杯内的孵育液通过蠕动泵与神经细胞片记录槽相通，蠕动泵速度为2ml/min。开启单通道恒温加热控制系统使记录槽内温度控制在32℃。

(2)取已完全孵育的神经细胞片将其置于记录槽内，用绑有尼龙丝的U形铂金丝固定。观察大体形态。选定大小适中，表面光滑，遮光性好，未见细胞核的梭形神经元为目标神经元。升起物镜。

(3)用微电极水平拉制仪将有芯玻璃毛细管拉制为玻璃微电极，将适量电极内液(必须浸没记录电极)注入玻璃微电极内。将玻璃微电极固定在膜片钳系统的夹持器上，给予0.1ml的正压空气后通过微操纵仪将玻璃微电极放入记录槽液面内。在Clampex10.2软件封接测试窗口观察微电极接液电阻，控制微电极接液电阻为5-8MΩ，否则重新拉制玻璃微电极。用MultiClamp 700B软件补偿电极接液电阻。

(4)在5x物镜下找到玻璃微电极后转换到40x浸水物镜，在40x浸水物镜和控制玻璃微电极移动的微操纵仪的配合下，将玻璃微电极下降到目标神经元的正上方。

(5)缓慢接近神经元，直至神经元被压出小凹，并出现细胞内液在神经元表面缓慢扩散时，撤去正压，用嘴给予轻轻的负压吸引，并将细胞钳制电位由0mV逐步降至-80mV，直至封接测试窗口所示封接电阻稳定在GΩ水平，形成高阻封接。待封接稳定一会后，用MultiClamp700B软件补偿快、慢电极电容。待漏流维持在个位数时，用嘴轻轻吸破细胞膜形成全细胞膜片钳记录。

(6)选择串联电阻小于30MΩ，静息膜电位＜-70mV的细胞进行下一步实验，否则放弃。

(7)待细胞稳定10min以上，细胞内液与电极内液交换完毕，将钳制电位维持在-80mV水平，在灌流用孵育液中加入OXA，打开预先设置在Clampex10.2软件中的protocol，记录信号。

(8)在记录开始5min时，在灌流液中分别加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油，之后持续记录30min。

(9)信号稳定后，重新开始记录一个完整的protocol。在记录开始5min时，在灌流液中加入当归四逆汤，在记录开始第15min时，在灌流液中分别加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油，之后持续记录15min。

5.结果分析：如表1、表2、图1、图2所示当归四逆汤处理模型组，可改善由于奥沙利铂建模所引起的DRG细胞全细胞电流上升，且随着药物浓度的升高，效果有所增加；辣椒素为TRPV1激动剂，可增加空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此的逆转作用不明显，且随着药物浓度的升高，效果无变化；薄荷醇为TRPM8激动剂，可增加空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此有逆转作用，且随着药物浓度的升高，效果有所增加；芥子油为TRPA1激动剂，可增加空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此有逆转作用，且随着药物浓度的升高，效果有所增加。

表1 组1-组10钳制电位

表2 组11-组20钳制电位

Claims (2)

1.一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，其特征在于，所述研究方法是结合与奥沙利铂神经毒性OXIN相关的瞬时感受器电位TRP离子通道的亚型，全细胞膜片钳技术记录慢性OXIN模型大鼠背根神经节DRG细胞的基本膜电生理特性，研究当归四逆汤防治奥沙利铂神经毒性的作用机理，具体包括步骤a)构建奥沙利铂神经毒性大鼠OXIN模型及背根神经节DRG细胞急性分离；步骤b)全细胞膜片钳技术记录DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性；步骤c)分析奥沙利铂神经毒性与TRP通道活性的关系；

所述步骤b)具体包括如下步骤：1)标本制备：将生长状态良好的DRG细胞，分为20组，如下：

组1空白组DRG，

组2模型组DRG，

组3当归四逆汤低剂量组DRG，

组4当归四逆汤中剂量组DRG，

组5当归四逆汤高剂量组DRG，

组6空白组DRG+TRPV1激动剂辣椒素，

组7模型组DRG+TRPV1激动剂辣椒素，

组8当归四逆汤低剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素，

组9当归四逆汤中剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素，

组10当归四逆汤高剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素，

组11空白组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇，

组12模型组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇，

组13当归四逆汤低剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇，

组14当归四逆汤中剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇，

组15当归四逆汤高剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇，

组16空白组DRG+TRPA1激动剂芥子油，

组17模型组DRG+TRPA1激动剂芥子油，

组18当归四逆汤低剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油，

组19当归四逆汤中剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油，

组20当归四逆汤高剂量组DRG+TRPA1激动剂芥子油；

2)进行全细胞膜片钳实验：首先是电极制备及膜片钳系统组建；然后进行实验，记录和分析数据，包括将孵育液通过蠕动泵与神经细胞片记录槽相通，控制蠕动泵速度为2ml/min，使记录槽内温度控制在32℃；取已完全孵育的神经细胞片将其置于记录槽内，选定目标神经元；拉制玻璃微电极并控制微电极接液电阻为5-8MΩ；稳定封接电阻在GΩ水平后补偿快、慢电极电容，待漏流维持在个位数时，用嘴轻轻吸破细胞膜，形成全细胞膜片钳记录；选择串联电阻小于30MΩ，静息膜电位＜-70mV的细胞继续进行实验，待细胞稳定10min以上，细胞内液与电极内液交换完毕，将钳制电位维持在-80mV水平，在灌流用孵育液中加入OXA，开始记录信号，在记录开始5min时，在灌流液中分别加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油，之后持续记录30min；信号稳定后，重新开始记录，在记录开始5min时，在灌流液中加入当归四逆汤，在记录开始第15min时，在灌流液中分别加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油，之后持续记录15min；

所述步骤c)具体如下：当归四逆汤处理模型组，改善了由于奥沙利铂建模所引起的DRG细胞全细胞电流上升，且随着药物浓度的升高，效果增加；辣椒素为TRPV1激动剂，增加了空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此的逆转作用不明显，且随着药物浓度的升高，效果无变化；薄荷醇为TRPM8激动剂，增加了空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此有逆转作用，且随着药物浓度的升高，效果增加；芥子油为TRPA1激动剂，增加了空白组以及奥沙利铂模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤对此有逆转作用，且随着药物浓度的升高，效果增加。

2.根据权利要求1所述的基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，其特征在于，所述步骤a)具体如下：

1)奥沙利铂神经毒性大鼠造模：Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、当归四逆汤低剂量组、当归四逆汤中剂量组、当归四逆汤高剂量组；除空白组予以腹腔注射5％葡萄糖注射液4mg/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂；一周两次，共四周；

2)给药：当归四逆汤药方为当归12g、桂枝9g、细辛3g、白芍9g、通草6g、甘草6g、大枣9g，共计54g；当归四逆汤成人处方生药量为54g，生药低剂量含量0.62g/ml，中剂量1.24g/ml，高剂量2.48g/ml；当归四逆汤各组灌胃给药10ml/kg，每日1次，空白组、模型组予0.9％NaCl溶液灌胃10ml/kg，每日1次；奥沙利铂用药当天，中药于奥沙利铂应用前一小时给药；

3)体重测量与痛阈测试结果：观察大鼠情况，每7天测一次体重，并通过Von Frey纤维细丝测量大鼠的诱发痛觉，检测机械疼痛阈值；

4)急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞：麻醉处死大鼠，快速分离并切取L4-L5位的神经节，分离及培养大鼠脊髓神经元细胞。