CN109593728A - 一种噬菌体絮凝剂及其在发酵后处理工艺中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噬菌体絮凝剂及其在发酵后处理工艺中的应用，属于微生物后处理工艺领域。其技术方案要点是：一种噬菌体絮凝剂，噬菌体絮凝剂为阳离子型絮凝剂，一般工作浓度为0.1%‑5%。絮凝剂在副溶血性弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体或铜绿假单胞菌噬菌体发酵后处理工艺中的应用。本发明能够起到让细菌快速沉降的作用；能够起到操作方便快捷、减少离心设备投入、减少人力物力损耗的效果；能够起到满足噬菌体工业化批量生产要求的效果；对动植物安全无毒害。

Description

一种噬菌体絮凝剂及其在发酵后处理工艺中的应用

技术领域

本发明涉及微生物后处理工艺技术领域，更具体地说，它涉及一种噬菌体絮凝剂及其在发酵后处理工艺中的应用。

背景技术

噬菌体是一类能够感染细菌的病毒，体积微小，结构简单，主要由蛋白质衣壳和内部包裹的核酸组成。噬菌体具有严格的寄生性，广泛分布于自然界，能够专一性的裂解细菌，安全性好，对机体及环境无毒副作用。

噬菌体是分子生物学领域的重要实验工具和最理想的材料，可用于防治疾病、鉴定细菌分型、筛选和检测致癌物质等，通过发酵来提高噬菌体的效价培养噬菌体是一种常用工艺。

现有公开号为CN102187937A的国内专利公开了一种猪血球蛋白酶解物的生产方法，包括如下步骤：1.取新鲜猪血加入柠檬酸钠溶液抗凝；2.分离得到血球液；3.向血球液中加入0.8-2.5倍水；4.添加血球液重量的2.0‰-6.0‰的动物蛋白水解酶酶解，调pH值终止酶解反应；5.分别使用三足离心机、管式固液分离机对酶解液进行离心，得到上清液；6.将上述上清液在70-90℃的温度下，活性炭搅拌脱色30-60min后，静置20-40min；7.再次分别使用三足离心机、管式固液分离机对脱色液进行离心，得到上清液；8、将清液进行喷雾干燥即得到最终的成品。

但是当需要大规模量产的时候，上述发酵后处理工艺中的离心机、离心辅助用具、以及耗电成本非常高，而工业生产中对成本的把控是非常重要的，故亟需提供一种便于噬菌体菌液分离的絮凝剂及可适用于工业生产的发酵后处理工艺。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种噬菌体絮凝剂及其在发酵后处理工艺中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种噬菌体絮凝剂，噬菌体絮凝剂为阳离子型絮凝剂，所述阳离子型絮凝剂应用于噬菌体时的工作浓度为0.1％-5％。

通过上述技术方案，本发明提供了一种无抗生素的絮凝剂，在防止噬菌体变质增长细菌的同时还不会造成毒害，而且成本较低。并且为水剂，制备工艺简单，于对动植物上施用时也非常方便，因絮凝剂成本非常低，也降低了发酵后处理工艺的成本。

进一步的，所述阳离子絮凝剂包括聚丙烯酰胺絮凝剂、聚硅酸絮凝剂、聚磷铝絮凝剂、聚合硫酸氯化铁铝絮凝剂、聚合聚铁硅絮凝剂的一种或几种。

一种噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，所述絮凝剂在弧菌属噬菌体、埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体发酵后处理工艺中的应用。

进一步的，所述絮凝剂在副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体或产气荚膜梭菌噬菌体发酵后处理工艺中的应用。

进一步的，所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrioparahaemolyticus phage VP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticusphage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)。其中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏编号为CCTCCNO.M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏编号为CCTCC NO.M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phageVP7)保藏编号为CCTCC NO.M2016289。

进一步的，所述沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)，其保藏编号为CCTCC NO.M2015145。

进一步的，所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)，其保藏编号为CCTCC NO.M201857。

进一步的，所述茄科雷尔氏菌噬菌体为茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstoniasolanacearum phage GP3)，其保藏编号为CCTCC NO.M2016635。

进一步的，所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)，保藏编号CCTCC NO.M2016535。

一种应用噬菌体絮凝剂的发酵后处理工艺，其步骤如下：

(1)向获得的噬菌体和菌混合发酵液中加入0.1％-3％所需工作浓度的絮凝剂溶液，搅拌均匀；

(2)室温静置1-3h；

(3)当出现上下分层的时候取上清液；

(4)将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.通过在噬菌体发酵后处理工艺中应用絮凝剂，能够起到让噬菌体快速沉降作用；

2.通过在噬菌体发酵后处理工艺中应用絮凝剂，能够起到操作方便快捷、减少离心设备投入、减少人力物力损耗的效果；

3.通过在噬菌体发酵后处理工艺中应用絮凝剂，能够起到满足噬菌体工业化批量生产要求的效果；

4.通过本发明絮凝剂沉降而获得的噬菌体，对动植物安全无毒害。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。

副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO.M2016290；

副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO.M2016291；

副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO.M2016289。

地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phage YHC5)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2018年8月30日；保藏编号为CCTCC NO.M2018579。

肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO.M2015145。

金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号CCTCC NO.M2016535。

茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年11月10日；保藏编号为CCTCC NO.M2016635。

本发明絮凝剂为阳离子型絮凝剂，阳离子型絮凝剂应用于噬菌体时的工作浓度一般为0.1％-5％。阳离子絮凝剂可以是聚丙烯酰胺絮凝剂、聚硅酸絮凝剂、聚磷铝絮凝剂、聚合硫酸氯化铁铝絮凝剂、聚合聚铁硅絮凝剂中的一种或几种。

本发明实施例采用噬菌体絮凝剂采用0.1％工作浓度的聚丙烯酰胺絮凝剂、0.1％工作浓度的聚硅酸絮凝剂、5％工作浓度的聚磷铝絮凝剂、3％工作浓度的聚合硫酸氯化铁铝絮凝剂或1％工作浓度的聚合聚铁硅絮凝剂。不同絮凝剂工作浓度可根据需求适当优化。

以下为关于本发明絮凝剂对噬菌体发酵液中菌体分离的应用实验

絮凝剂对副溶血性弧菌噬菌体发酵液中菌体分离的应用实验

实施例1：

絮凝剂沉降获得副溶血性弧菌噬菌体过程：向获得的副溶血性弧菌噬菌体和副溶血性弧菌混合发酵液中加入3％工作浓度的聚合硫酸氯化铁铝絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得副溶血性弧菌噬菌体过程：将获得的副溶血性弧菌噬菌体和副溶血性弧菌混合发酵液6000转离心10min，将副溶血性弧菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

按照上述两种方式分别制取获得副溶血性弧菌噬菌体VP46、副溶血性弧菌噬菌体VP48、副溶血性弧菌噬菌体VP7。将两种方式获得的副溶血性弧菌噬菌体VP46、副溶血性弧菌噬菌体VP48、副溶血性弧菌噬菌体VP7按体积比1：1：1分别配置两个副溶血性弧菌噬菌体制剂。

取两种方式获得的副溶血性弧菌噬菌体制剂500ml各三组静置。将含有絮凝剂和不含有絮凝剂的对照例合并为一组，这样的三组副溶血性弧菌噬菌体制剂分别放置在4℃、25℃、37℃环境下，每2周取样经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，直至52周。

效价测定方法：

用SM液做稀释液，将副溶血性弧菌噬菌体制剂按10倍梯度逐级稀释至10⁷倍。分别取10⁵、10⁶及10⁷稀释度的噬菌体培养液1000μl其宿主菌副溶血性弧菌HN9菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。

结果如表1所示，4℃条件下含有絮凝剂副溶血性弧菌噬菌体制剂18周后仍有6.9x10⁹PFU/ml，与采用离心机分离获得副溶血性弧菌噬菌体效价基本持平，且效价持久稳定；25℃下含有絮凝剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂效价14周仍为1.1x10⁹PFU/ml，14周以后开始降低数量级，但其效价相比采用离心机分离获得副溶血性弧菌噬菌体效价的稳定性更好；37℃下含有絮凝剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂效价8周以后开始下降数量级，而不含有絮凝剂的副溶血性弧菌噬菌体制剂6周开始下降数量级。因此，絮凝剂对副溶血性弧菌噬菌体活性无影响，且通过絮凝剂获得副溶血性弧菌噬菌体制剂相比采用离心机分离获得副溶血性弧菌噬菌体效价的稳定性更高。

表1 絮凝剂对副溶血性弧菌噬菌体发酵液中菌体分离的影响

絮凝剂对地毯草黄单胞菌噬菌体发酵液中菌体分离的应用实验

实施例2：

絮凝剂沉降获得地毯草黄单胞菌噬菌体过程：向获得的地毯草黄单胞菌噬菌体和地毯草黄单胞菌混合发酵液中加入0.1％工作浓度的聚硅酸絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得地毯草黄单胞菌噬菌体过程：将获得的地毯草黄单胞菌噬菌体和地毯草黄单胞菌混合发酵液6000转离心10min，将地毯草黄单胞菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

取两种方式获得的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂500ml各三组静置。将含有絮凝剂和不含有絮凝剂的对照例合并为一组，这样的三组地毯草黄单胞菌噬菌体制剂分别放置在4℃、25℃、37℃环境下，每2周取样经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，直至52周。

效价测定方法：

用SM液做稀释液，将地毯草黄单胞菌噬菌体制剂按10倍梯度逐级稀释至10⁷倍。分别取10⁵、10⁶及10⁷稀释度的噬菌体培养液1000μl与其宿主菌地毯草黄单胞菌D1菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。

结果如表2所示，

结果如表1所示，4℃条件下含有絮凝剂地毯草黄单胞菌噬菌体制剂18周仍有7.0x10⁹PFU/ml，与采用离心机分离获得地毯草黄单胞菌噬菌体效价基本持平，且地毯草黄单胞菌噬菌体效价的持久稳定；25℃下含有絮凝剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂效价14周仍具有1.8x10⁹PFU/ml，14周以后开始下降，相比采用离心机分离获得地毯草黄单胞菌噬菌体效价的稳定性更好；37℃下含有絮凝剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂效价第8周开始降低数量级，而不含有絮凝剂的地毯草黄单胞菌噬菌体制剂第6周开始降低数量级。总体来说，絮凝剂对地毯草黄单胞菌噬菌体活性无影响，且通过絮凝剂获得地毯草黄单胞菌噬菌体制剂相比采用离心机分离获得地毯草黄单胞菌噬菌体效价的持久稳定性更高。

表2 絮凝剂对地毯草黄单胞菌噬菌体发酵液中菌体分离的影响

絮凝剂对沙门氏菌噬菌体制剂发酵液中菌体分离的应用实验

实施例3：

絮凝剂沉降获得沙门氏菌噬菌体过程：向获得的沙门氏菌噬菌体和沙门氏菌混合发酵液中加入5％工作浓度的聚磷铝絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得沙门氏菌噬菌体过程：将获得的沙门氏菌噬菌体和沙门氏菌混合发酵液6000转离心10min，将沙门氏菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

取两种方式获得的沙门氏菌噬菌体制剂500ml各三组静置。将含有絮凝剂和不含有絮凝剂的对照例合并为一组，这样的三组沙门氏菌噬菌体制剂分别放置在4℃、25℃、37℃环境下，每隔2周取样经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价，直至52周。

效价测定方法：

用SM液做稀释液，将沙门氏菌噬菌体制剂按10倍梯度逐级稀释至10⁷倍。分别取10⁵、10⁶及10⁷稀释度的噬菌体培养液1000μl与其宿主菌沙门氏菌S5菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。

结果如表3所示，4℃条件下含有絮凝剂沙门氏菌噬菌体制剂18周时仍有6.0x10⁹PFU/ml的效价，与采用离心机分离获得沙门氏菌噬菌体效价基本持平，且沙门氏菌噬菌体效价的持久稳定；25℃下含有絮凝剂的沙门氏菌噬菌体制剂效价4周仍为5.0x10⁹PFU/ml，4周以后开始降至10⁸PFU/ml，相比采用离心机分离获得沙门氏菌噬菌体效价的稳定性更好；37℃下含有絮凝剂的沙门氏菌噬菌体制剂效价于第4周降至10⁸PFU/ml，不含有絮凝剂的沙门氏菌噬菌体制剂于第2周就降至10⁸PFU/ml。总体来说，絮凝剂对沙门氏菌噬菌体活性无影响，且通过絮凝剂获得沙门氏菌噬菌体制剂相比采用离心机分离获得沙门氏菌噬菌体效价的持久稳定性更高。

表3 絮凝剂对沙门氏菌噬菌体发酵液中菌体分离的影响

絮凝剂沉降获得的副溶血性弧菌噬菌体对南美白对虾生长影响的田间实验

实施例4：

絮凝剂沉降获得副溶血性弧菌噬菌体过程：向获得的副溶血性弧菌噬菌体和副溶血性弧菌混合发酵液中加入1％工作浓度的聚合聚铁硅絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得副溶血性弧菌噬菌体过程：将获得的副溶血性弧菌噬菌体和副溶血性弧菌混合发酵液6000转离心10min，将副溶血性弧菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

在南美白对虾的养殖池中加入终浓度为1x10⁵CFU/ml AHPND副溶血性弧菌菌液对南美白对虾进行攻毒试验。然后分组，分别加入终浓度为1x10⁶PFU/ml溶血性弧菌噬菌体制剂，分为通过絮凝剂沉降获得的噬菌体制剂和未通过絮凝剂沉降获得的噬菌体制剂。观察2周，每日观察南美白对虾的发病率和成活率，参见表4。并同时设置了阳性对照组(1x10⁵CFU/ml AHPND副溶血性弧菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、絮凝剂对照组(1％工作浓度的聚合聚铁硅絮凝剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x10⁶PFU/ml溶血性弧菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。死亡率＝(南美白对虾死亡虾数/南美白对虾总数)×100％。

如表4，使用絮凝剂沉降获得的副溶血性弧菌噬菌体制剂组与离心获得的副溶血性弧菌噬菌体组的南美白对虾死亡率相近，说明絮凝剂对副溶血性弧菌噬菌体治疗效果无影响，且对南美白对虾无毒害作用，安全性较高。

表4 絮凝剂对南美白对虾死亡率的影响

絮凝剂沉降获得的沙门氏菌噬菌体对小鸡鸡百痢的田间实验应用

实施例5：

絮凝剂沉降获得沙门氏菌噬菌体过程：向获得的沙门氏菌噬菌体和沙门氏菌混合发酵液中加入0.1％工作浓度的聚丙烯酰胺絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得沙门氏菌噬菌体过程：将获得的沙门氏菌噬菌体和沙门氏菌混合发酵液6000转离心10min，将沙门氏菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

在小鸡的养殖饮用水槽中加入终浓度为1x10⁵CFU/ml鸡白痢沙门氏菌对小鸡进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x10⁶PFU/ml沙门氏菌噬菌体制剂，分为含有絮凝剂的试剂和不含有絮凝剂的试剂。观察2周，每日观察小鸡的发病率和成活率，参见表5。并同时设置了阳性对照组(1x10⁵CFU/ml鸡白痢沙门氏菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、絮凝剂对照组(0.1％聚丙烯酰胺絮凝剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x10⁶PFU/ml沙门氏菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。死亡率＝(小鸡死亡数/小鸡总数)×100％。

如表5，使用絮凝剂沉降获得的鸡白痢沙门氏菌噬菌体制剂组与离心获得的沙门氏菌噬菌体组的小鸡死亡率相近，说明絮凝剂对沙门氏菌噬菌体治疗效果无影响，且对小鸡无毒害作用，安全性较高。

表5 絮凝剂对小鸡死亡率的影响

絮凝剂沉降获得的金黄色葡萄球菌噬菌体对仔猪油皮病的应用

实施例6：

絮凝剂沉降获得金黄色葡萄球菌噬菌体过程：向获得的金黄色葡萄球菌噬菌体和金黄色葡萄球菌混合发酵液中加入0.1％工作浓度的聚丙烯酰胺絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得金黄色葡萄球菌噬菌体过程：将获得的金黄色葡萄球菌噬菌体和金黄色葡萄球菌混合发酵液6000转离心10min，将金黄色葡萄球菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

将仔猪表皮用砂纸打磨至至轻微创伤，在其创口处涂抹终浓度1x10⁵CFU/ml金黄色葡萄球菌对仔猪进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x10⁶PFU/ml金黄色葡萄球菌噬菌体制剂，分为含有絮凝剂的试剂和不含有絮凝剂的试剂。观察2周，每日观察仔猪表皮的发病率，参见表6。并同时设置了阳性对照组(1x10⁵CFU/ml金黄色葡萄球菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、絮凝剂对照组(0.1％聚丙烯酰胺絮凝剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x10⁶PFU/ml金黄色葡萄球菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。发病率＝(仔猪病猪数量/仔猪总数)×100％。

如表6，使用絮凝剂沉降获得的金黄色葡萄球菌噬菌体制剂组与离心获得的金黄色葡萄球菌噬菌体组的仔猪发病率相近，说明絮凝剂对金黄色葡萄球菌噬菌体治疗效果无影响，且对仔猪无毒害作用，安全性较高。

表6 絮凝剂对仔猪油皮病发病率的影响

絮凝剂沉降获得的茄科雷尔氏菌噬菌体对姜瘟病的应用

实施例7：

絮凝剂沉降获得茄科雷尔氏菌噬菌体过程：向获得的茄科雷尔氏菌噬菌体和茄科雷尔氏菌混合发酵液中加入0.1％工作浓度的聚丙烯酰胺絮凝剂，人工或使用搅拌机(量产时)搅拌均匀，室温静置3h，出现上下分层的时取上清液，将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

离心机分离获得茄科雷尔氏菌噬菌体过程：将获得的茄科雷尔氏菌噬菌体和茄科雷尔氏菌混合发酵液6000转离心10min，将茄科雷尔氏菌和上清液通过离心机分离，取上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。

在生姜根部灌注终浓度为1x10⁵CFU/ml茄科雷尔氏菌对生姜进行攻毒试验。然后加入终浓度为1x10⁶PFU/ml茄科雷尔氏菌噬菌体制剂，分为含有絮凝剂的试剂和不含有絮凝剂的试剂。观察2周，每日观察生姜成活率，参见表7。并同时设置了阳性对照组(1x10⁵CFU/ml茄科雷尔氏菌菌液)、阴性对照组(无攻毒处理)、絮凝剂对照组(0.1％聚丙烯酰胺絮凝剂，无攻毒处理)和噬菌体对照组(1x10⁶PFU/ml茄科雷尔氏菌噬菌体制剂，无攻毒处理)。死亡率＝(生姜死亡数/生姜总数)×100％。

如表7，使用絮凝剂沉降获得的茄科雷尔氏菌噬菌体制剂组与离心获得的茄科雷尔氏菌噬菌体组的生姜死亡率相近，说明絮凝剂对茄科雷尔氏菌噬菌体治疗效果无影响，且对生姜无毒害作用，安全性较高。

表7 絮凝剂对生姜死亡率的影响

综合实施例1-7，通过本发明絮凝剂沉降获得的噬菌体效价与通过离心机分离获得的噬菌体效价基本一致，对动植物病害的防治效果相同，且通过絮凝剂沉降获得的噬菌体效价稳定性更高。

下面从经济层面进行加入絮凝剂获得噬菌体的发酵后处理工艺与其他发酵后处理工艺的实验成本对比。

实施例8：

以处理200L噬菌体与细菌的混合发酵液为例，时间及设备成本参见表8。

应用噬菌体絮凝剂的发酵后处理工艺：每50ml噬菌体与细菌的混合发酵液需加500μl 0.1％工作浓度的絮凝剂。200L噬菌体与细菌的混合发酵液需要加入2L0.1％工作浓度的絮凝剂，即2mL絮凝剂原液。市面上1吨絮凝剂原液约4万元，即40元/L。处理200L噬菌体和细菌的混合发酵液则需花费的絮凝剂成本仅为0.8元。

应用台式离心机的发酵后处理工艺：台式离心机采购需约5万元，处理200L噬菌体和细菌的混合发酵液需4000个50ml离心管，无菌离心管一般约为1元/个，共需4000元。一般最快8分钟离心一次，一次放6只离心管，一次共离心300ml发酵后的噬菌体和细菌混合发酵液，而200L噬菌体和细菌的混合发酵液需要离心666次，耗时5333min，约88小时。成本和时间均非常高。

应用落地式离心机的发酵后处理工艺：落地式离心机采购需约10万元，落地式离心机一般20分钟离心一次，最高转速5000rpm，一次离心6L噬菌体和细菌的混合发酵液。处理200L噬菌体和细菌的混合发酵液需要33次，耗时约666min，约11.11小时。成本和时间非常多。

应用工业生产用陶瓷过滤膜的发酵后处理工艺，同样存在成本和使用问题。第一，工业生产用陶瓷过滤膜采购需约4.2万元；第二，陶瓷过滤膜使用后需要用碱清洗膜管；第三，发酵液中细胞碎片较多，极易堵塞陶瓷膜孔隙，导致噬菌体截流，发酵液中噬菌体回收率无法超过95％，损耗较大。

上述四种方法对200L噬菌体和细菌的混合发酵液分离处理获得的噬菌体效价参见表9。

表8 四种方法处理200L噬菌体和细菌的混合发酵液时间及经济成本

表9 四种方法处理200L噬菌体和细菌的混合发酵液前后效价(PFU/mL)

本发明絮凝剂在噬菌体及其细菌混合发酵液后处理工艺中的应用并不局限于上述实施例1-17中所列菌种，还可以包括溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体、产气荚膜梭菌噬菌体等菌种。

当然，上述菌种所在菌属，例如弧菌属噬菌体、埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体等菌属。本发明絮凝剂均可在其发酵后处理工艺中得到良好应用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种噬菌体絮凝剂，其特征在于：噬菌体絮凝剂为阳离子型絮凝剂，所述阳离子型絮凝剂应用于噬菌体时的工作浓度为0.1％-5％。

2.根据权利要求1所述的一种噬菌体絮凝剂，其特征在于：所述阳离子絮凝剂包括聚丙烯酰胺絮凝剂、聚硅酸絮凝剂、聚磷铝絮凝剂、聚合硫酸氯化铁铝絮凝剂、聚合聚铁硅絮凝剂的一种或几种。

3.一种根据权利要求1所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述絮凝剂在弧菌属噬菌体、埃希氏菌属噬菌体、沙门氏菌属噬菌体、黄单胞菌属噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、葡萄球菌属噬菌体、气单胞菌属噬菌体、链球菌属噬菌体、假单胞菌属噬菌体、克雷伯氏菌属噬菌体、不动杆菌属噬菌体、丙酸杆菌属噬菌体、农杆菌噬菌体、棒形杆菌属噬菌体、李斯特菌属噬菌体、弯曲杆菌属噬菌体或梭菌属噬菌体发酵后处理工艺中的应用。

4.一种根据权利要求3所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述絮凝剂在副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体或产气荚膜梭菌噬菌体发酵后处理工艺中的应用。

5.根据权利要求4所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述副溶血性弧菌噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phageVP46)、副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)或副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)，其中所述副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏编号为CCTCC NO.M2016290，副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phage VP48)的保藏编号为CCTCCNO.M2016291，副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phage VP7)保藏编号为CCTCC NO.M2016289。

6.根据权利要求4所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)，其保藏编号为CCTCCNO.M2015145。

7.根据权利要求4所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述地毯草黄单胞菌噬菌体为地毯草黄单胞菌噬菌体YHC5(Xanthomonas axonopodis phageYHC5)，其保藏编号为CCTCC NO.M2018579。

8.根据权利要求4所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述茄科雷尔氏菌噬菌体为茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)，其保藏编号为CCTCC NO.M2016635。

9.根据权利要求4所述的噬菌体絮凝剂在发酵后处理工艺中的应用，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phage BP-13A)，保藏编号CCTCC NO.M2016535。

10.一种应用噬菌体絮凝剂的发酵后处理工艺，其特征在于，其步骤如下：

(1)向获得的噬菌体和菌混合发酵液中加入0.1％-3％所需工作浓度的絮凝剂溶液，搅拌均匀；

(2)室温静置1-3h；

(3)当出现上下分层的时候取上清液；

(4)将上清液通过0.2微米的细菌滤膜获得滤液成品。