CN109575322B - 环糊精接枝物复合胶珠及其在生物转化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及环糊精接枝物复合胶珠及其在生物转化中的应用。本发明提供了一种环糊精固载量高、循环利用次数多的的复合胶珠，所述复合胶珠是将壳聚糖‑环糊精接枝物，与海藻酸钠‑环糊精接枝物按比例混合后滴入氯化钙溶液中成球而制成的，有效提高了环糊精的固载量，复合胶珠的环糊精接枝率较海藻酸钠环糊精接枝物提高60‑70％，较壳聚糖环糊精接枝物提高20％‑40％；缩短了反应时间，在循环10次后甾体底物转化率仍在90％以上，达到提高甾体催化反应效率的同时增加了环糊精的利用率，降低生产成本的目的，具有很好的应用价值和推广前景。

Description

环糊精接枝物复合胶珠及其在生物转化中的应用

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及环糊精接枝物复合胶珠、制备及其在生物转化中的应用。

背景技术：

甾体化合物作为仅次于抗生素的第二大类药物，其在生命体内具有调控各种物质代谢及生理作用的功能。与传统化学合成方法相比，微生物转化的方法可以形成多种甾体药物活性中间体且产物纯度高。环糊精作为增溶剂能增加疏水性甾体的溶解度，其特殊空腔结构可以包结甾体底物，从而提高甾体化合物的生物利用度和产率。然而环糊精的价格较高，制约了其在生物催化领域中的大范围应用。通过接枝技术将环糊精固载到高分子载体上，可以把环糊精从溶于水的粉体材料制备成不溶于水的高分子材料，克服环糊精难回收的缺陷，使其能够循环利用，降低工业使用的成本，但接枝率低且部分材料对细胞有害。所以找到无害的接枝载体且采用合适的方法提高环糊精负载量是亟待解决的重要问题。

中国专利CN10647770公布了一种用于去除工业废水中重金属离子的预糊化淀粉-壳聚糖接枝共聚物絮凝剂的制备方法，本发明制备的絮凝剂有效地提高了废水中重金属的去除率。本发明是以预糊化淀粉和壳聚糖为原料，以硝酸饰铰为引发剂，在pH为9的条件下，合成改性淀粉/壳聚糖共聚物絮凝剂。在上述步骤中，改性淀粉与壳聚糖质量比为(2-5):1，反应温度为30-60℃，反应时间为8h，引发剂用量占体系总质量的0.1-1％。采用上述方法制备的预糊化淀粉一壳聚糖接枝共聚物絮凝剂具有高效、价廉、能去除重金属离子、环境友好的特点，针对不同的污水，与常规絮凝剂相比，在较少的使用量下，能使废水重金属脱除率达到90％。

壳聚糖具有良好吸附、成膜、絮凝、螯合等性能，且安全无毒，成本低，生物可降解性以及生物相容性良好，具备药用辅料所需的性质。壳聚糖的大分子链上分布着许多羟基、氨基及一些N-乙酰氨基，是一种良好的生物聚合物，且易于改性及与其它高分子物质进行接枝。针对这种性质，可用作许多高分子接枝材料。

海藻酸钠是一种天然聚阴离子多糖高分子化合物，由G、M两个单元构成，遇水后表面具有粘性，会使得溶液也具有粘性。其安全无毒，成本低，生物可降解性以及生物相容性良好，具备药用辅料所需的性质，遇到Ca²⁺、Zn²⁺等阳离子时，会发生化学反应形成凝胶球，针对这种性质，可用作药物的缓释和控释材料，以及用于固定性质不稳定物质，提高稳定性，同时还可用于固定微生物、细胞、酶等，实现循环利用。

壳聚糖作为天然高分子载体，分子中含有-OH和-NH₂两种基团，易于改性，可以戊二醛为交联剂与环糊精进行接枝，同时，海藻酸钠可以以环氧氯丙烷为交联剂将环糊精进行接枝，使接枝率得到有效提高，但目前关于将两种接枝物制成复合胶珠作为促溶剂运用于难溶化合物的生物转化，并对环糊精循环利用的技术尚未可见。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种环糊精固载量高、循环利用次数多的的复合胶珠，所述复合胶珠是将壳聚糖-环糊精接枝物，与海藻酸钠-环糊精接枝物按比例混合后滴入氯化钙溶液中成球而制成的；

所述壳聚糖-环糊精接枝物与海藻酸钠-环糊精接枝物的混合比例为质量体积比1-2:10；

所述壳聚糖-环糊精接枝物是将质量比1:2-1:10的壳聚糖和环糊精经戊二醛作为交联剂接枝而成；

所述海藻酸钠-环糊精接枝物是将摩尔比1:0.2-1:1.5的海藻酸钠和环糊精经环氧氯丙烷作为交联剂接枝而成；

优选地，所述复合胶珠的制备方法如下：

(1)壳聚糖接枝环糊精

按质量比1:2-1:10称取壳聚糖和环糊精，分别以45-55倍(体积质量比)的0.1mol/LHCl和5-25倍(体积质量比)的蒸馏水溶解，加入三角瓶中，25℃水浴中搅拌1小时；

按戊二醛与液体总体积比0.2-1:10加入戊二醛，在30分钟内逐渐加入，在30-90℃水浴摇床中反应2-8h后，1mol/LNaOH水溶液加入反应溶液中沉淀产物，沉淀用水和丙酮彻底冲洗干净，干燥至恒重备用。

(2)海藻酸钠接枝环糊精

按海藻酸钠和环糊精摩尔比1:0.2-1:1.5称取海藻酸钠和环糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸钠45-55倍(体积质量比)的蒸馏水，30-70℃水浴中搅拌使之完全溶解；

按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.05-1:50加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.05-1:10滴加0.5mol/L的NaOH溶液，滴加时间10min，之后反应1.5-6.5h；

(3)复合胶珠的制备

按质量体积比1-2:10加入壳聚糖-环糊精接枝物及海藻酸钠-环糊精接枝物，搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡1-6h，过滤，用反应溶液洗涤，即得复合胶珠；

所述复合胶珠直径为3-5mm；

所述环糊精可以是天然环糊精，也可以是衍生环糊精；

进一步地，所述的环糊精为β-环糊精，HP-β-环糊精，RM-β-环糊精或SBE-β-环糊精。

本发明还提供上述复合胶珠在甾体药物生物催化过程中的应用；

所述应用具体为，在甾体药物生物催化过程中，将所述胶珠作为促溶剂，按胶珠质量与反应体系体积比1：3-5添加到反应体系中，反应结束后，进行过滤，滤液用于收集反应产物，过滤物即复合胶珠，使用反应溶液洗涤1-10次后，重新用于甾体生物催化反应，从而实现环糊精介质的循环利用；

所述复合胶珠可循环利用10次以上；

所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水等，pH7.0-pH7.6；

所述复合胶珠可通过再次固定延长循环利用的次数，所述的固定方法具体如下：

将机械性能降低的复合胶珠投入到CaCl₂溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠1-8次，置于4℃冰箱中保存备用；

再次固定后的复合胶珠可再次循环利用3-5次。

有益效果：

(1)本发明在实现环糊精的循环利用的同时，有效提高了环糊精的固载量，复合胶珠的环糊精接枝率较海藻酸钠环糊精接枝物提高60-70％，较壳聚糖环糊精接枝物提高20％-40％；缩短了反应时间，在循环10次后甾体底物转化率仍在90％以上，达到提高甾体催化反应效率的同时增加了环糊精的利用率，降低生产成本的目的，具有很好的应用价值和推广前景。

(2)本发明可以提高甾体底物生物催化初始转化速率，提高最终转化率。

(3)本发明所述的环糊精循环利用工艺方法简单便捷，便于实现，成本节约。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

壳聚糖与环糊精以戊二醛为交联剂进行接枝，同时，将海藻酸钠与环糊精以环氧氯丙烷为交联剂进行接枝，本发明将两种接枝物混合后滴入氯化钙溶液中制成复合胶珠。接枝后的环糊精仍保留独特的空腔结构及其它优良性质，同时还拥有了高分子载体良好的机械性能、稳定性等特征，且接枝率大大提高。所制得的复合胶珠仍具有包合特性，使用次数增加，且环糊精负载量有所提高，这大大拓宽了环糊精的应用空间，提升了它的应用价值。

以下将结合具体实施例对本发明所述的技术方案作进一步的说明。

实施例1：一种环糊精接枝复合胶珠及其在醋酸可的松C_1,2位脱氢反应中的应用

1、复合胶珠的制备：

制备壳聚糖-β-环糊精接枝物，1g壳聚糖溶解于50mL0.1mol/LHCl溶液中，加入50mLβ-CD水溶液中(6gβ-CD)，并在25℃搅拌1小时。然后，6mL25％戊二醛溶液在30分钟内逐渐加入，在70℃水浴摇床中反应6小时后，35mL 1mol/L NaOH水溶液加入反应溶液中沉淀产物。沉淀用水和丙酮彻底冲洗，干燥至恒重。

制备海藻酸钠-β-环糊精接枝物，将摩尔比1:0.7的海藻酸钠(1g)和β-环糊精，加入于100mL三角瓶中，加入约50mL蒸馏水，60℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.3mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，反应2.5h。

将1g的壳聚糖-β-环糊精接枝物与10mL海藻酸钠-β-环糊精混合均匀，在磁力搅拌下，用注射器滴加到0.25mol/L的CaCl₂溶液中，形成复合胶珠，固定2h后过滤，获得直径为3-5mm的复合胶珠，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存备用，并通过紫外分光光度法测定复合胶珠的接枝率。

同时，分别制备壳聚糖-β-环糊精接枝物胶珠和海藻酸钠-β-环糊精接枝物胶珠：将①1g上述制备的壳聚糖-β-环糊精接枝物与10mL海藻酸钠溶液(浓度为1g/50mL)混合，②海藻酸钠-β-环糊精接枝物；将①、②分别在磁力搅拌下，用注射器滴加到0.25mol/L的CaCl₂溶液中，分别形成胶珠，固定2h后过滤，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存备用。

2、生物转化

(1)生物转化准备

微生物菌种采用简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037，它能实现甾体化合物的C₁，₂位脱氢转化，将醋酸可的松(CA)转化为醋酸泼尼松；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，琼脂20，pH 7.2；

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆10，蛋白胨5，磷酸二氢钾2.5，pH 7.2；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆15，蛋白胨5，磷酸二氢钾2.5，pH 7.2；

简单节杆菌静息细胞的制备：

TCCC 11037在32℃，160r/min，30/250mL种子培养基装量条件下培养18h后，按5％接种量接种于装有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，32℃，160r/min条件下培养20h，将发酵培养获得的细胞5000r/min离心后用pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤三遍，重悬于pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中得简单节杆菌静息细胞菌悬液；

(2)生物转化体系：

称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入15mL的Tris-HCl(pH 7.2)及5mL左右的简单节杆菌静息细胞悬液(使得转化体系中静息细胞的OD为2)，实验组加入6g上述步骤制备的复合胶珠，设置不加入复合胶珠为对照组1，设置加入7g壳聚糖-β-环糊精接枝物制备的胶珠为对照组2；设置加入9g海藻酸钠-β-环糊精接枝物制备的胶珠为对照组3(对照组2、3与实验组添加的环糊精为等量)；34℃、180r/min转化12h，HPLC法测定底物转化率；

环糊精的循环利用工艺：

将复合胶珠用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集复合胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，缓冲液的用量为每次每克细胞胶珠50ml，洗涤后重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；

循环利用8次后，复合胶珠机械强度下降(壳聚糖-β-环糊精接枝物循环利用6次后，机械强度下降；海藻酸钠-β-环糊精接枝物循环利用5次后，机械强度下降)，进行再次固定，步骤如下：

将机械性能降低的复合胶珠钠投入到CaCl₂溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠3次，置于4℃冰箱中保存备用；

结果表明：

(1)复合胶珠的接枝率较本实施例制备的海藻酸钠-β-环糊精胶珠提高了60％，较本实施例制备的壳聚糖-β-环糊精胶珠提高20％。接枝率见表1。

(2)对照组的初次转化率为83％，接枝β-环糊精的复合胶珠的初次转化率是96％，初始转化速率是对照组1(0.9×10^-2g/L min^-1)的2.6倍，循环利用10次后，CA的最终转化率为92％，见表2。

(3)添加复合胶珠的实验组6h完成转化；对照组1需12h完成转化；对照组2需7.5h完成转化；对照组3需8h完成转化。

表1

	接枝率(μmol/g)
		海藻酸钠-β-环糊精胶珠	10.3
壳聚糖-β-环糊精胶珠	13.4
		复合胶珠	16.1

表2

循环次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											转化率	96％	93％	92％	92％	93％	91％	91％	93％	94％	92％

实施例2：一种环糊精接枝复合胶珠及其在醋酸可的松C_1,2位脱氢反应中的应用

除以下内容外，其他同实施例1。

复合胶珠的制备：

制备壳聚糖-HP-β-CD接枝物，1g壳聚糖溶解于50mL0.1mol/LHCl中，溶液加入50mLHP-β-CD水溶液中(6.5g HP-β-CD)，并在25℃搅拌1小时。然后，5mL 25％戊二醛溶液在30分钟内逐渐加入，反应在50℃水浴摇床中反应8小时后，35mL 1mol/LNaOH水溶液加入反应溶液中沉淀产物。沉淀用水和丙酮彻底冲洗，干燥至恒重。

制备海藻酸钠-HP-β-CD接枝物，将摩尔比1:1.5的海藻酸钠(1g)和HP-β-CD，加入于100mL三角瓶中，加入约50mL的蒸馏水，50℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入1mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，约6h后停止反应。

将1.5g的壳聚糖-HP-β-环糊精接枝物与10mL海藻酸钠-HP-β-环糊精混合均匀，在磁力搅拌下，用滴管将滴加到0.5mol/L的CaCl₂溶液中，形成复合胶珠，固定4h后过滤，获得直径为3-5mm的复合胶珠，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存备用，并通过紫外分光光度法测定复合胶珠的接枝率。

同时，分别制备壳聚糖-HP-β-环糊精接枝物胶珠和海藻酸钠-HP-β-环糊精接枝物胶珠：①将1.5g上述制备的壳聚糖-HP-β-环糊精接枝物与10mL海藻酸钠溶液(浓度为1g/50mL)混合，②海藻酸钠-HP-β-环糊精接枝物；分别将①、②在磁力搅拌下，用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl₂溶液中，分别形成胶珠，固定4h后过滤，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存备用。

生物转化：

称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入15mL的Tris-HCl(pH 7.2)及5mL左右的简单节杆菌静息细胞悬液(使得转化体系中静息细胞的OD为2)，实验组加入6g上述步骤制备的复合胶珠，设置不加入复合胶珠为对照组1，设置加入8g壳聚糖-HP-β-环糊精接枝物制备的胶珠为对照组2；设置加入9g海藻酸钠-HP-β-环糊精接枝物制备的胶珠为对照组3；34℃、180r/min转化12h，HPLC法测定底物转化率；

环糊精的循环利用工艺：

将复合胶珠用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集复合胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，缓冲液的用量为每次每克细胞胶珠50ml，洗涤后重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；

循环利用8次后，复合胶珠机械强度下降(壳聚糖-HP-β-环糊精接枝物循环利用6次后，机械强度下降；海藻酸钠-HP-β-环糊精接枝物循环利用5次后，机械强度下降)，进行再次固定，步骤如下：

将机械性能降低的复合胶珠钠投入到CaCl₂溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠3次，置于4℃冰箱中保存备用；

结果表明:

(1)复合胶珠的接枝率较本发明制备的海藻酸钠-HP-β-环糊精提高了70％，较本发明制备的壳聚糖-HP-β-环糊精提高40％，接枝率见表3。

(2)对照组的初次转化率为83％，接枝HP-β-环糊精的复合胶珠的初次转化率是94％，初始转化速率是对照组(0.9×10^-2g/L min^-1)的2.7倍，循环利用10次后，CA的最终转化率为91％，见表4。

(3)添加复合胶珠的实验组6h完成转化；对照组1需12h完成转化；对照组2需7h完成转化；对照组3需8h完成转化。

表3

	接枝率(μmol/g)
		海藻酸钠-HP-β-环糊精	4.8
壳聚糖-HP-β-环糊精	5.6
		复合胶珠	7.9

表4

循环次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											转化率	94％	94％	92％	93％	95％	96％	91％	92％	94％	91％

实施例3：一种环糊精接枝复合胶珠及其在醋酸可的松C_1,2位脱氢反应中的应用

除以下内容外，其他同实施例1。

复合胶珠的制备：

制备壳聚糖-RM-β-环糊精接枝物，1g壳聚糖溶解于50mL0.1mol/L HCl中，溶液加入50mL RM-β-CD水溶液中(6g RM-β-CD)，并在25℃搅拌1小时。然后，6mL25％戊二醛溶液在30分钟内逐渐加入，反应在90℃水浴摇床中反应2小时后，35mL1mol/LNaOH水溶液加入反应溶液中沉淀产物。沉淀用水和丙酮彻底冲洗，干燥至恒重。

制备海藻酸钠-RM-β-环糊精接枝物，将摩尔比1:1.5的海藻酸钠(1g)和RM-β-CD加入100mL三角瓶中，加入约50mL的蒸馏水，30℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.05mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，约1.5h后停止反应。

将1.2g的壳聚糖-RM-β-环糊精接枝物与10mL海藻酸钠-RM-β-环糊精混合均匀，在磁力搅拌下，用注射器滴加到0.25mol/L的CaCl₂溶液中，固定2h后过滤，获得直径为3-5mm的复合胶珠，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存备用，并通过紫外分光光度法测定复合胶珠的接枝率。

同时，分别制备壳聚糖-RM-β-环糊精接枝物胶珠和海藻酸钠-RM-环糊精接枝物胶珠：①将1.2g上述制备的壳聚糖-RM-β-环糊精接枝物与10mL海藻酸钠溶液(浓度为1g/50mL)混合，②海藻酸钠-RM-环糊精接枝物；分别将①、②在磁力搅拌下，用注射器滴加到0.25mol/L的CaCl₂溶液中，分别形成胶珠，固定2h后过滤，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存备用。

生物转化：

称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入15mL的Tris-HCl(pH 7.2)及5mL左右的简单节杆菌静息细胞悬液(使得转化体系中静息细胞的OD为2)，实验组加入6g上述步骤制备的复合胶珠，设置不加入复合胶珠为对照组1，设置加入7g壳聚糖-RM-β-环糊精接枝物制备的胶珠为对照组2；设置加入9g海藻酸钠-RM-β-环糊精接枝物制备的胶珠为对照组3；34℃、180r/min转化12h，HPLC法测定底物转化率；

环糊精的循环利用工艺：

将复合胶珠用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集复合胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，缓冲液的用量为每次每克细胞胶珠50ml，洗涤后重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；

循环利用7次后，复合胶珠机械强度下降(壳聚糖-RM-β-环糊精接枝物循环利用6次后，机械强度下降；海藻酸钠-RM-β-环糊精接枝物循环利用5次后，机械强度下降)，进行再次固定，步骤如下：将机械性能降低的复合胶珠钠投入到CaCl₂溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠3次，置于4℃冰箱中保存备用；

结果表明:

(1)复合胶珠的接枝率较本发明制备的海藻酸钠-RM-β-环糊精提高了60％，较本发明制备的壳聚糖-RM-β-环糊精提高了30％，接枝率见表5。

(2)对照组的初次转化率为83％，接枝RM-β-环糊精的复合胶珠的初次转化率是95％，初始转化速率是对照组(0.9×10^-2g/L min^-1)的2.9倍，循环利用10次后，CA的最终转化率为93％，见表6。

(3)添加复合胶珠的实验组6h完成转化；对照组1需12h完成转化；对照组2需7h完成转化；对照组3需7.5h完成转化。

表5

表6

循环次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											转化率	95％	97％	92％	93％	91％	93％	93％	91％	94％	93％

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (6)

1.一种环糊精接枝物复合胶珠，其特征在于，所述复合胶珠是将壳聚糖-环糊精接枝物，与海藻酸钠-环糊精接枝物按比例混合后滴入氯化钙溶液中成球而制成的；

所述壳聚糖-环糊精接枝物与海藻酸钠-环糊精接枝物的混合比例为质量体积比1-2:10；

所述壳聚糖-环糊精接枝物制备方法如下：

按质量比1:2-1:10称取壳聚糖和环糊精，分别以0.1 mol/L HCl和蒸馏水溶解后混合并水浴搅拌反应；

按戊二醛与液体总体积比0.2-1:10加入戊二醛，30-90℃反应2-8h后，加入1 mol/LNaOH水溶液沉淀产物，沉淀用水和丙酮彻底冲洗干净，干燥至恒重备用；

所述海藻酸钠-环糊精接枝物的制备方法如下：

按海藻酸钠和环糊精摩尔比1:0.2-1:1.5称取海藻酸钠和环糊精，加入蒸馏水后，30-70℃搅拌溶解；

按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.05-1:50加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.05-1:10滴加 0.5mol/L的NaOH溶液，反应1.5-6.5h。

2.权利要求1所述的环糊精接枝物复合胶珠，其特征在于，所述环糊精为天然环糊精或衍生环糊精。

3.权利要求1所述的环糊精接枝物复合胶珠制备方法，其特征在于，具体如下：

（1）壳聚糖接枝环糊精

按质量比1:2-1:10称取壳聚糖和环糊精，分别以45-55倍的0.1 mol/L HCl和5-25倍的蒸馏水溶解， 25℃水浴中搅拌1小时；

按戊二醛与液体总体积比0.2-1:10加入戊二醛，在30分钟内逐渐加入，在30-90℃中反应2-8h后，1 mol/L NaOH水溶液加入反应溶液中沉淀产物，沉淀用水和丙酮彻底冲洗干净，干燥至恒重备用；

（2）海藻酸钠接枝环糊精

按海藻酸钠和环糊精摩尔比1:0.2-1:1.5称取海藻酸钠和环糊精，并加入海藻酸钠45-55倍的蒸馏水，30-70℃中搅拌使之完全溶解；

按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.05-1:50加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.05-1:10滴加 0.5mol/L的NaOH溶液，之后反应1.5-6.5h；

（3）复合胶珠的制备

按质量体积比1-2:10加入上述壳聚糖-环糊精接枝物及海藻酸钠-环糊精接枝物，搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡1-6 h，过滤，用反应溶液洗涤，即得复合胶珠；

所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水。

4.权利要求1或2所述环糊精接枝物复合胶珠在甾体药物生物催化过程中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在甾体药物生物催化过程中的应用如下：在甾体药物生物催化过程中，将所述胶珠作为促溶剂，按胶珠质量与反应体系体积比1：3-5添加到反应体系中，反应结束后，进行过滤，滤液用于收集反应产物，过滤物即复合胶珠，使用反应溶液洗涤1-10次后，重新用于甾体生物催化反应，从而实现环糊精介质的循环利用；

所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述复合胶珠可通过再次固定延长循环利用的次数，所述的固定方法具体如下：

将机械性能降低的复合胶珠投入到CaCl₂溶液中再次固定2 h，反应溶液洗涤收集胶珠1-8次，置于4℃冰箱中保存备用。