CN109562059A - 用于施用rna的制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含聚合复合物制剂的组合物，其用于在肠胃外施用之后(特别是在肌内施用之后)将RNA递送至靶器官或靶细胞。更确切地说，本发明涉及用于特别是通过肌内注射来施用RNA(例如自复制RNA)的制剂。更详细地，所述制剂包含来自单链RNA和聚亚烷基亚胺的聚合复合物颗粒。所述RNA可编码目的蛋白质，例如药学活性蛋白质。此外，本发明涉及用于向人或向动物肠胃外施用的包含所述RNA聚合复合物制剂的药物产品。本发明还涉及此类药物产品的制备，其任选地包括无菌过滤、冷冻和脱水的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及包含聚合复合物(polyplex)制剂的组合物，其用于在肠胃外施用之后(特别是在肌内施用之后)将RNA递送至靶器官或靶细胞。更确切地说，本发明涉及用于特别是通过肌内注射来施用RNA(例如自复制RNA)的制剂。更详细地，聚合复合物颗粒包含单链RNA(优选自复制或自扩增RNA)和聚亚烷基亚胺(polyalkyleneimine)。RNA可编码目的蛋白质，例如药学活性蛋白质。RNA被细胞吸收，并且RNA优选翻译成可表现出其生理活性的肽或蛋白质。本发明的组合物适用于诱导或增强免疫应答。其还可用于涉及抗原(例如蛋白质)的疾病的预防性和/或治疗性治疗。此外，本发明涉及用于产生包含RNA-聚合复合物制剂的稳定组合物的方法，所述RNA-聚合复合物制剂包含单链RNA和聚亚烷基亚胺。本文中所述的RNA-聚合复合物颗粒制剂可进行冷冻和解冻，或脱水和再水合而没有产品品质的损失，特别是没有RNA活性的显著损失。特别地，本文中所述的RNA-聚合复合物颗粒制剂可通过冷冻干燥、喷雾干燥或相关的方法进行冷冻或脱水，从而使得能够获得相对于液体储存延长的产品保质期(shelf life)。此外，本文中所述的RNA-聚合复合物颗粒制剂可符合药物产品的要求，更具体地涉及GMP制备的要求和用于肠胃外施用之药物产品的品质要求。本文中所述的RNA-聚合复合物制剂特别地可用于人或动物的例如针对感染性疾病的疫苗接种。
背景技术
为了预防和治疗目的而引入编码一种或更多种多肽的外源核酸多年来一直是生物医学研究的目标。现有技术方法共有核酸分子向靶细胞或生物体的递送，但核酸分子和/或递送系统的类型不同：受与脱氧核糖核酸(DNA)分子的使用相关的安全性担忧的影响，近年来核糖核酸(RNA)分子受到越来越多的关注。已经提出了多种方法，包括以裸RNA的形式或以复合或包装的形式(例如在非病毒或病毒递送载剂中)施用单链或双链RNA。在病毒和在病毒递送载剂中，核酸通常被蛋白质和/或脂质(病毒颗粒)包封。例如，已经提出将来源于RNA病毒的经改造的RNA病毒颗粒作为递送载剂用于处理植物(WO 2000/053780 A2)或用于哺乳动物的疫苗接种(Tubulekas等，1997，Gene，第190卷，第191-195页)。考虑到安全性担忧，医学和兽医界不愿意将RNA病毒颗粒施用于人或动物。已经广泛研究了可适用于RNA的非病毒递送载剂，用于开发基于基因递送的治疗剂。然而，由于多种原因，将非病毒基因递送方法转化为临床实践并不是非常成功。原因可与不满意的基因表达水平、与这样的复合物产品之药物开发相关的技术和监管问题、以及安全性原因相关。
因此，需要一种药物产品，用于在患者和动物中安全且高效地递送编码具有治疗价值之蛋白质(例如疫苗)的RNA。如本文中所述，本发明的一些方面和实施方案解决了这种需要。
发明概述
免疫治疗策略代表了用于预防和治疗例如感染性疾病和癌症疾病的有希望的选择。越来越多的病原体相关和肿瘤相关的抗原的鉴定导致了免疫治疗的合适靶标的广泛收集。本发明包含适用于高效表达抗原、适用于预防和治疗疾病之免疫治疗性治疗的改进的试剂和方法。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
所述组合物用作药物。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺中氮原子(N)数目与所述单链RNA中磷原子(P)数目的摩尔比(N∶P比)为1.0至30，优选2.0至15.0，更优选6.0至12.0。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
其中所述聚亚烷基亚胺中氮原子(N)数目与所述单链RNA中磷原子(P)数目的摩尔比(N∶P比)为1.0至30.0，优选2.0至15.0，更优选6.0至12.0。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述组合物的离子强度为50mM或更低，优选地其中带正电荷的单价离子的浓度为25mM或更低，并且游离的带正电荷的二价阳离子的浓度为20μM或更低。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
其中离子强度为50mM或更低。
在一个实施方案中，带正电荷的单价离子的浓度为25mM或更低，并且带正电荷的二价阳离子的浓度为20μM或更低。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述组合物用于肌内施用，例如通过肌内注射。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述单链RNA和所述聚亚烷基亚胺存在于聚合复合物颗粒中。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺包含以下通式(I)：
其中
R是H、酰基或包含以下通式(II)的基团：
其中R1是H或包含以下通式(III)的基团：
n、m和l独立地选自2至10的整数；并且
p、q和r是整数，其中p、q和r的总和使得所述聚合物的平均分子量为1.5·102至107Da，优选5000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
在一个实施方案中，n、m和l独立地选自2、3、4和5，优选选自2和3。在一个实施方案中，R1是H。在一个实施方案中，R是H或酰基。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺包含聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述聚亚烷基亚胺中至少92％的N原子是可质子化的。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种添加剂。在一个实施方案中，所述一种或更多种添加剂选自缓冲物质、糖类、稳定剂、冷冻保护剂、冻干保护剂和螯合剂。在本发明的所有方面的一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或更多种聚合物。在一个实施方案中，缓冲物质包含选自以下的至少一种：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、乙酸缓冲系统及类似物、磷酸缓冲系统或柠檬酸缓冲系统。在本发明的所有方面的一个实施方案中，本发明的组合物包含用于在4至8(优选5至7.5)的pH范围内缓冲的缓冲液。这样的缓冲系统的一些实例是乙酸盐缓冲液或HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液或乙酸缓冲液。在一个实施方案中，糖类包含选自以下的至少一种：单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖，优选选自葡萄糖、海藻糖、蔗糖和葡聚糖。在一个实施方案中，添加剂是平均摩尔质量为1kDa至100kDa的葡聚糖。在一个实施方案中，冷冻保护剂包含选自以下的至少一种：二醇，例如乙二醇、丙二醇，以及甘油。在一个实施方案中，螯合剂包含EDTA。在一个实施方案中，脂质包含选自以下的至少一种：阳离子脂质、中性脂质和阴离子脂质。在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或更多种包含环氧乙烷和环氧丙烷构建单元(building block)的嵌段共聚物。在一个实施方案中，本发明的组合物包含含有乙二胺基团的共聚物。在一个实施方案中，本发明的组合物包含两亲嵌段共聚物，其优选包含环氧乙烷和环氧丙烷构建单元，任选地还包含乙二胺基团。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述组合物包含HEPES缓冲的葡萄糖(HEPES buffered glucose，HBG或HBG×1)、MES缓冲的葡萄糖(MES-buffered glucose，MBG或MBG×1)或HEPES缓冲的海藻糖(HEPES buffered trehalose，HBT或HBT×1)。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述组合物包含在乙酸缓冲液中的浓度为0.1mM至10mM的葡萄糖或海藻糖或蔗糖。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述组合物包含在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1mM至10mM的葡萄糖或海藻糖或蔗糖。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述颗粒的z-平均尺寸小于200nm，优选小于150nm，并且更优选小于100nm。在一个实施方案中，所述颗粒的z-平均尺寸为50nm至200nm。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述颗粒的ζ-电位为20mV或更高，优选25至40mV。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述颗粒的电泳迁移率(μ)为1至1.6μm*cm/V*S。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述颗粒的z-平均尺寸和/或ζ-电位和/或电泳迁移率在包含聚合复合物颗粒和HEPES缓冲的葡萄糖(HBG)或HEPES缓冲的海藻糖(HBT)的混悬液中确定。在一个实施方案中，HBG包含5％葡萄糖(w/v)和10mM HEPES，pH 7.1或HBT包含10％海藻糖(w/v)和10mM HEPES，pH 7.1。在一个实施方案中，通过动态光散射和由累积量算法(cumulant algorithm)进行的数据分析确定所述颗粒的z-平均尺寸。在一个实施方案中，通过动态光散射测量迁移扩散系数(translation diffusion coefficient)。然后，使用Stock-Einstein方程以计算Z-平均值。在一个实施方案中，通过激光-多普勒电泳(laser-Doppler electrophoresis)测量电泳迁移率。然后，使用Henry方程或Smoluchowski方程以计算ζ-电位。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述颗粒优选在生理pH下或在4.5至7.5的pH下为中性或带正电荷。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述单链RNA是6000至15000个碱基、优选9000至12000个碱基的分子。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述单链RNA编码至少一种目的蛋白质。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述单链RNA是复制子，优选自复制或自扩增RNA。在一个实施方案中，所述复制子可通过来自甲病毒(alphavirus)的复制酶进行复制，并且其中所述复制子优选包含来自甲病毒的5’复制识别序列或其变体和来自甲病毒的3’复制识别序列或其变体。在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述单链RNA包含编码目的肽或蛋白质(例如药学活性肽或蛋白质)的开放阅读框。
在本发明的所有方面的一个实施方案中，本文中所述的组合物用于治疗。在本发明的所有方面的一个实施方案中，本文中所述的组合物是疫苗组合物。
在另一方面，本发明涉及本文中所述的组合物用于将RNA引入到细胞中(特别是用于在细胞中表达RNA)的用途。在一个实施方案中，所述细胞是肌细胞。
在另一方面，本发明涉及本文中所述的组合物用于肌内施用RNA的用途。
在另一方面，本发明涉及肌内施用RNA的方法，其包括肌内施用本文中所述组合物的步骤。
在另一方面，本发明涉及经冷冻、经冻干或经喷雾干燥组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
其中所述组合物包含冷冻保护剂和/或冻干保护剂，优选二糖(例如海藻糖)或多糖(例如葡聚糖)。
在一个实施方案中，所述组合物还包含螯合剂(例如EDTA)。
在一个实施方案中，所述组合物由包含5％至20％(w/v)的二糖和任选的20μM至10mM(例如80μM至5mM)的所述螯合剂的水性组合物(aqueous composition)制备。在一个实施方案中，所述水性组合物包含海藻糖、HEPES和EDTA，例如10％海藻糖(w/v)、2.8mMHEPES、80μM EDTA，pH 7.1。
在另一方面，本发明涉及水性组合物，其可通过使本文中所述的经冷冻组合物解冻或使本文中所述的经冻干或经喷雾干燥组合物重构来获得。
在另一方面，本发明涉及制备经冷冻、经冻干或经喷雾干燥组合物的方法，其包括：
(i)制备水性组合物，其包含单链RNA、聚亚烷基亚胺和冷冻保护剂和/或冻干保护剂(优选二糖(例如海藻糖)或多糖(例如葡聚糖))，以及
(ii)将所述组合物冷冻、冻干或喷雾干燥。
在一个实施方案中，所述水性组合物还包含螯合剂(例如EDTA)。在一个实施方案中，所述水性组合物包含5％至20％(w/v)的二糖和任选的20μM至10mM(例如80μM至5mM)的所述螯合剂。在一个实施方案中，所述水性组合物包含海藻糖、HEPES和EDTA，例如10％海藻糖(w/v)、2.8mM HEPES、80μM EDTA，pH 7.1。
在另一方面，本发明涉及冷冻保护剂和/或冻干保护剂(优选二糖(例如海藻糖)或多糖(例如葡聚糖))用于制备经冷冻、经冻干或经喷雾干燥组合物的用途，所述组合物包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺。
在一个实施方案中，所述二糖与螯合剂(例如EDTA)组合使用。
经冷冻或经冻干或经喷雾干燥组合物或用于制备经冷冻或经冻干或经喷雾干燥组合物的水性组合物，其可包含以下的一种或更多种：
(i)非水性溶剂，例如乙二醇、甘油、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺。
(ii)表面活性剂，例如Tween 80、Brij 35、Brij 30、Lubrol-px、Triton X-10；Pluronic F127(聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)(也称为泊洛沙姆(poloxamer))、泊洛沙胺(poloxamine)和十二烷基硫酸钠。
(iii)二糖，例如海藻糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖。
(iv)聚合物(可具有不同的MW)，例如聚乙二醇、葡聚糖、聚(乙烯醇)、羟丙基甲基纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素，Ficoll和白蛋白。
(v)氨基酸，例如甘氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、肌氨酸和γ-氨基丁酸。
在另一方面，本发明涉及用于通过使用连续流动泵(continuous flow pump)和混合装置对RNA聚合复合物制剂进行连续流制备的方法，其中两种水性流体通过mm或μm尺寸的通道进行混合。
附图简述
图1.A.游离的纯PEI对体外HEK-293细胞的毒性。IC50＝77μM氮(游离)。B.PEI/复制子-RNA聚合复合物对体外HEK-293细胞的毒性。IC50＝542μM氮(聚合复合物制剂)。
图2.用在不同储存条件下储存1周之后的N/P为11.6的PEI/复制子-RNA聚合复合物孵育之后，C2C12肌细胞的相对发光。
图3.在不同储存条件下储存2周之后，N/P为11.6的PEI/复制子-RNA聚合复合物的相对RNA完整性。
图4.在引发剂的存在下通过2-乙基-2-唑啉的开环异构化聚合获得聚(2-乙基-2-唑啉)。
图5.通过PEOZ的酸水解合成完全脱酰基的线型PEI22、PEI87和PEI217。条件：(i)24％(wt/vol)HCl，110℃，96小时；对于50-kDa PEOZ，n＝504，对于200-kDa PEOZ，n＝2，018，并且对于500-kDa PEOZ，n＝5，044。
图6.在递增的盐浓度下IVT(A)和复制子(B)聚合复合物的聚集动力学。
图7.过滤之前(初始)和之后(最终)聚合复合物的物理化学参数。A和B.通过DLS测量聚合复合物的直径和多分散性。C.通过肝素从聚合复合物释放RNA，并且通过在260nm处的UV吸收来测量。D.通过CuSO4测定法测量PEI浓度。
图8.高纯度PEI和常规纯度PEI的化学结构的比较。对于25kDa的PEI，n＝58。在PEI25kD中，-CH2CH2NH-单体的平均数量为581，这也是潜在可质子化氮的连续段(contiguousstretch)的长度。假设在常规的PEI25中N-丙酰基部分均匀分布，其可质子化氮的连续段仅为64。
图9.通过使用不同纯度水平的PEI制备的不同N/P比的复制子-RNA聚合复合物在体外转染C2C12肌细胞。
图10.用高纯度PEI(jetPEI)和常规纯度PEI(25kDa)制备N/P比为1(-)和11.6(+)的复制子-RNA聚合复合物。游离RNA用作对照。将制剂i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
图11.用以下高纯度PEI制备N/P比为7.7和11.6的复制子-RNA聚合复合物：jetPEI(来自Polyplus)、PEI-Max 40000(来自Polyscience)和Exgen 500(来自Eurodamex)。除了冻干制剂在HBT×1缓冲液中制备之外，所有制剂在HBG×1缓冲液中制备。将制剂i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
图12.用不同缓冲液制备的N/P为11.6的JetPEI/复制子-RNA聚合复合物的冻干饼(lyophilized cake)。
图13.通过编码萤光素酶的IVT-RNA在体外转染C2C12肌细胞。RNA在HBPx1缓冲液中以不同N/P比与JetPEI复合。在转染之后24小时测量发光信号。
图14.在HBG×1缓冲液中用纯PEI制备N/P比为5.8和11.6的IVT-RNA聚合复合物。HBG×1缓冲液中的游离IVT-RNA用作对照。将制剂以每次注射2至8μg的RNA剂量i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。在注射之后6小时记录来自小鼠肌肉的发光信号。
图15.在HBG×1缓冲液中以不同的RNA浓度以N/P比为11.6制备复制子-RNA和jetPEI的聚合复合物。为了通过DLS进行尺寸测量，将聚合复合物稀释至10mg/l的RNA浓度。
图16.通过来自图16的聚合复合物在体外转染C2C12肌细胞。在转染之后24小时测量发光信号。
图17.在HBG×1缓冲液中以如图16中所示的不同RNA浓度用纯PEI制备N/P比为11.6的Rep-RNA聚合复合物。将制剂以每次注射2至8μg的RNA剂量i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
图18.PEI/复制子-RNA聚合复合物作用于人树突细胞(DC)和小鼠肌细胞(C2C12)的体外研究。A.毒性(表示为用聚合复合物处理之后活细胞的％)。B.转染(表示为用聚合复合物处理之后的发光发射)。仅示出了对于C2C12细胞的转染结果。
图19.在HBG×1或Hepes 10mM缓冲液中用来自Polyplus或Polytheragene的PEI制备N/P比为11.6或15.8的Rep-RNA聚合复合物。在向小鼠注射之前，将聚合复合物在HBG×1或Opti-MEM缓冲液中稀释。将制剂以每次注射2μg的RNA剂量i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
图20.A)向Balb/c小鼠的两个胫骨后肌(musculus tibialis posterior)肌内(i.m.)施用2μg非配制(缓冲溶液)或配制的编码萤光素酶的复制子-RNA之后4天、7天和11天，对动物进行非侵入性体内生物发光成像。收集来源于萤光素酶蛋白的光子一分钟，并且显示为与所成像小鼠的照片的重叠。B)在注射部位处测量的光子/秒(p/s)的图形显示(graphical display)。
图21.A)向Balb/c小鼠的背部皮肤上的两个注射部位皮内(i.d.)施用2μg非配制(缓冲溶液)或配制的编码萤光素酶的复制子-RNA之后7天，对动物进行非侵入性体内生物发光成像。收集来源于萤光素酶蛋白的光子一分钟，并且显示为与所成像小鼠的照片的重叠。黑色的箭头指示注射部位。B)在注射部位处测量的光子/秒(p/s)的图形显示。
图22.复制子-RNA制剂作为疫苗的有益效果。
图23.复制子-RNA制剂作为疫苗的有益效果。
图24.来自在10％(w∶v)海藻糖中与PEI配制的复制子-RNA的喷雾干燥的结果。
图25.在用无菌过滤之前(制备的)和之后(灭菌的)的不同N/P比的PEI/复制子-RNA聚合复合物孵育之后，来自C2C12肌细胞的归一化发光。
图26：根据实施例16，短PEI和长PEI的组合对体外转染效率的影响。图26A)：短线型PEI和长PEI聚合复合物在250ng RNA/孔下的转染效力。图26B)：短支化PEI和长PEI聚合复合物在250ng RNA/孔下的转染效力。与基准in vivo Jet PEI相比并且对于相同的总NP比，使用短PEI(图26A：线型；图26B：支化)和长PEI(例如in vivo JetPEI)的组合实现了在不同时间框架(time frame)内更高的表达水平。
图27：根据实施例17，长Jet PEI+短PEI聚合复合物相对于基准(即in vivoJetPEI NP12)的复制子-RNA转染效力：对于总NP为12，在不同组合下的短PEI(支化1.8kDA)和长PEI(NP4+NP8或NP1.15+NP11)。
图28：根据实施例18，盐变化(例如NaCl)对复制子(saRNA)-RNA体内转染效率的影响。在第3天(图28A)、第6天(图28B)、第9天(图28C)和第13天(图28D)检测生物发光信号。在图28E中比较了信号强度。在接受PEI-复制子-RNA聚合复合物(例如长PEI N/P 12)并添加低浓度(5至10mM)盐的小鼠中i.m.注射之后第6天可检测到小鼠肌肉区域中最强烈的信号。
图29：根据实施例18，pH调节对复制子(saRNA)-PEI制剂的转染效率的影响。使用pH值为6.5至7.1的saRNA-PEI聚合复合物制剂获得了良好的结果。用调节至pH 6.5的saRNA-长PEI NP12制剂可检测到最强烈的信号。作为基准，使用未调节pH的saRNA-Jet PEI聚合复合物NP12(BM)或HBG(20mM Hepes，pH 7.4，5wt.％葡萄糖)。
图30：根据实施例19，调节至不同pH值的in vivo JetPEI/复制子-RNA聚合复合物(N/P 4)的电泳迁移率。
图31：根据实施例19，在用不同剂量的N/P比为4且具有不同pH值(pH 6.5至pH8.5)的in vivo JetPEI/复制子-RNA聚合复合物孵育之后，来自C2C12肌细胞的归一化发光。
图32：根据实施例20，在用不同量的PEI/在PEI制剂中过量的正电荷转染之后的萤光素酶表达。
图33：根据实施例21，通过使用2步复合(complexation)来优化聚合复合物转染。
图34：根据实施例22的免疫接种实验显示了与用HEPES缓冲的葡萄糖(HBG)相比，用MES缓冲的葡萄糖(MBG)配制的saRNA-聚合复合物的优异效果。
发明详述
尽管下面详细描述了本发明，但应理解本发明不限于本文中所描述的具体的方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
优选地，本文中所使用的术语如在以下中所描述的进行定义：“A multilingualglossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，和H.编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland，(1995)。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中解释(参见，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
下面将描述本发明的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各个描述的实施例和优选实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应认为被本说明书公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在本文中所列的数值或范围的情况下，优选意指所列举或要求保护的数值或范围的+/-10％。
除非本文中另有说明或与上下文明显相反，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个独立值的简写方法。除非本文中另有说明，否则每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。除非本文中另有说明或与上下文明显相反，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，并且不提供对另外要求保护的本发明的范围的限制。本说明书中的任何语言都不应解释为表示对于本发明的实践必要的任何未要求保护的要素。
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以表示除了由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，考虑了作为本发明的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由...组成”的含义。
在本说明书文本通篇中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文中引用的每一篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)在此均通过引用整体并入。本文中的任何内容均不解释为承认本发明无权先于这样的公开内容。
下面将提供适用于本发明的所有方面的定义。
如本文中所用的，例如“降低”或“抑制”的术语意指引起水平总体降低优选5％或更多、10％或更多、20％或更多、更优选50％或更多、并且最优选75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。
例如“提高”或“增强”的术语优选涉及约至少10％、优选至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少80％、并且最优选至少100％的提高或增强。
关于核酸序列，“片段”涉及核酸序列的一部分，即代表在5’-和/或3’-端缩短的核酸序列的序列。优选地，核酸序列的片段包含来自所述核酸序列的至少80％、优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸残基。在本发明中，保留RNA稳定性和/或翻译效率的RNA分子的那些片段是优选的。
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含启动翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含例如来自所述氨基酸序列的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。
术语“离子强度”是指特定溶液中的不同种类的离子物质的数量与它们各自的电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上用下式表示
其中c是特定离子物质的摩尔浓度，并且z是其电荷的绝对值。总和∑取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
本文中所述的组合物的离子强度优选为50mM或更低、优选25mM或更低、优选20mM或更低、19mM或更低、18mM或更低、17mM或更低、16mM或更低、15mM或更低、10mM或更低或5mM或更低。优选地，本文中所述的组合物的离子强度足够低以防止聚合复合物颗粒的聚集。
根据本发明，术语“离子强度”优选涉及单价离子的存在。关于二价离子(特别是二价阳离子)的存在，它们的浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在优选地足够低以防止RNA的降解。在一个特别优选的实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解RNA核苷酸之间磷酸二酯键的催化水平。在一个特别优选的实施方案中，游离二价离子的浓度为20μM或更低，优选不存在或基本上不存在游离二价离子。
本文中所述的组合物的pH优选为4至8；更优选5.5至8，例如6至7.5，例如6.5至7.1、6.5至7或6.5至6.9。
术语“二糖”是指由通过糖苷键连接的两个单糖残基构成的碳水化合物。二糖的一些代表性实例包括：海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、乳果糖、纤维二糖、异麦芽糖、龙胆二糖、昆布多糖二糖(昆布二糖)、壳二糖、木二糖(木二糖)、菊粉二糖和甘露二糖。本文中所述组合物中二糖的优选含量为5％至20％(w/v)，例如5％至15％(w/v)、7％至15％(w/v)或8％至12％(w/v)。根据本发明优选的是具有高的玻璃化转变温度的二糖。
术语“螯合剂”意指与金属离子(优选二价或多价金属离子)形成螯合物的化合物。螯合剂具有多个能够与金属离子形成环结构的基团，例如OH、-COOH。螯合剂的一些实例是：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylene triamine pentaacetic acid，DTPA)、反式-1，2-二氨基-环己烷四乙酸单水合物、N-羟乙基乙二胺三乙酸(N-hydroxyethylethylene diamine triacetic acid，HEDTA)、柠檬酸和磷酸螯合剂(例如，Dequest 2000)。根据本发明，优选乙二胺四乙酸(EDTA)。优选地，螯合剂以至少20μM、至少40μM、至少60μM或至少80μM的浓度存在于本文中所述的组合物中。优选地，螯合剂以至多10mM、至多5mM、至多2mM、至多1mM、至多0.5mM、至多0.2mM或至多0.1mM的浓度存在于本文中所述的组合物中。
术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。
术语“冻干”是指通过冷冻物质然后降低周围压力以使物质中的冷冻介质直接从固相升华为气相而进行的物质的冷冻干燥。
术语“喷雾干燥”是指通过将(加热的)气体与在容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体混合来使物质喷雾干燥，其中来自所形成的液滴的溶剂蒸发，产生干燥粉末。
术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。
术语“冻干保护剂”涉及添加至制剂以在干燥阶段期间保护活性成分的物质。
术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原来的液体状态。
术语“自体”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体细胞”是指来源于同一对象的细胞。将自体细胞引入到对象中是有利的，因为这些细胞克服了免疫障碍，不然导致排斥。
术语“同种异体”用于描述来源于相同物种的不同个体的任何事物。当一个或更多个基因座处的基因不相同时，认为两个或更多个个体彼此是同种异体的。
术语“同基因”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织(即同卵双胎或同一近交品系的动物或者其组织或细胞)的任何事物。
术语“异源”用于描述由多种不同的要素组成的事物。例如，将一个个体的细胞引入到不同的个体中构成异源移植物。异源基因是来源于对象以外之来源的基因。
根据本发明，由于未经保护的RNA的不稳定性，因此提供复合形式的RNA分子是有利的。特别地，在一些实施方案中，本发明的组合物包含含有RNA和聚亚烷基亚胺的颗粒。
当根据本发明的系统配制成颗粒制剂时，每种RNA种类(例如复制子、复制酶构建体和任选的另外的RNA种类(例如编码适合于抑制IFN的蛋白质的RNA))可独立地配制成单独的颗粒制剂。在该情况下，每种单独的颗粒制剂将包含一种RNA种类。单独的颗粒制剂可作为独立的实体存在，例如在独立的容器中。这样的制剂可通过与颗粒形成剂一起独立提供每种RNA种类(通常各自以包含RNA之溶液的形式)从而允许颗粒的形成来获得。各颗粒将仅包含在颗粒形成时提供的特定RNA种类(单独的颗粒制剂)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含多于一种的单独的颗粒制剂。各组合物称为混合的颗粒制剂。根据本发明的混合的颗粒制剂可通过如上所述独立地形成单独的颗粒制剂、然后混合单独的颗粒制剂来获得。通过混合步骤，获得包含含RNA之颗粒的混合群体的制剂(举例说明：例如，第一颗粒群体可包含复制子，并且第二颗粒制剂可包含复制酶构建体)。单独的颗粒群体可以一起在一个容器中，该容器包含单独的颗粒制剂的混合群体。
或者，组合物的所有RNA种类(例如复制子、复制酶构建体和任选的另外的种类(例如编码适合于抑制IFN的蛋白质的RNA))可以一起配制成组合的颗粒制剂。这样的制剂可通过与颗粒形成剂一起提供所有RNA种类的组合制剂(通常是组合的溶液)从而允许颗粒形成来获得。与混合的颗粒制剂相反，组合的颗粒制剂通常将包含含有多于一种RNA种类的颗粒。在组合的颗粒组合物中，不同的RNA种类通常一起存在于单个颗粒中。
在一个实施方案中，本发明的颗粒制剂是纳米颗粒制剂。在该实施方案中，根据本发明的组合物包含纳米颗粒形式的RNA。
在一般定义中，术语“纳米颗粒”是指直径为1nm至1000纳米(nm)的任何颗粒。
在本发明的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的密实结构。
术语“In vivo-jetPEITM”、“in vivo JetPEITM”、“in vivo JetPEI”、“jetPEI”、“jet PEI”和“JetPEI”全部是指来自Polyplus-Transfection SA(Illkirch，France)的市售In vivo-jetPEITM试剂，Cat.#201-50G。
本文中使用的术语“聚合复合物”是指聚合物和核酸(例如RNA)通过静电相互作用形成的复合物。在聚合复合物包含RNA的情况下，其也可称为“RNA复合物”或“RNA聚合复合物”。
本发明涉及由至少一种单链RNA和至少一种聚亚烷基亚胺形成的聚合复合物颗粒。
在一个实施方案中，本文中所述的颗粒的平均直径小于约200nm，优选小于约150nm，并且更优选小于约100nm。在一个实施方案中，本文中所述的颗粒的平均直径为至少约30nm、至少约40nm、至少约50nm、至少约60nm、至少约70nm、至少约80nm、至少约90nm或至少约100nm。
术语“平均直径”是指通过动态光散射测量和使用所谓的累积量算法进行数据分析的颗粒的平均流体动力学直径，其提供具有长度尺寸和无量纲的多分散性指数(polydispersity index，PI)的所谓的Z平均值作为结果(Koppel，D.，J.Chem.Phys.57，1972，第4814-4820页，ISO 13321)。这里颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该Z平均值的值同义使用。
术语“净电荷”涉及电荷(例如正电荷和负电荷)的总和。例如，如果颗粒包含比正电荷更高数量的负电荷，则颗粒的净电荷是负的。如果颗粒包含比负电荷更高数量的正电荷，则颗粒的净电荷是正的。如果颗粒包含相等数量的正电荷和负电荷，则颗粒的净电荷是中性的，特别是电中性的。因此，根据本发明的颗粒的净电荷可以是负的、正的或中性的。在一个实施方案中，颗粒的净电荷是正的。在一个实施方案中，颗粒的净电荷是负的。
术语“带电荷”、“净电荷”、“带负电荷”或“带正电荷”是指给定化合物或颗粒溶解或混悬于相关pH(例如，7.1)的水性缓冲液中时的电净电荷。
根据本发明，术语“N/P比”、“NP比”、“N∶P比”、“N/P”和“NP”是指聚乙烯亚胺中氮原子(N)与RNA中磷原子(P)的摩尔比。
根据本发明，聚亚烷基亚胺中氮原子(N)数目与RNA中磷原子(P)数目的摩尔比(N/P比)优选为2.0至15.0，优选8.0至12.0、6.0至14.0或6.0至12.0。
根据本发明，优选以多于1个步骤(例如以2、3、4或更多个步骤)将本文中所述的组合物调节至最终N/P比。例如，可将组合物在第一步中调节至低于最终N/P比的第一N/P比，例如使用长聚亚烷基亚胺。通过添加另外的聚亚烷基亚胺(例如，短聚亚烷基亚胺或长聚亚烷基亚胺，例如在第一步中使用的长聚亚烷基亚胺)，可将N/P比调节至最终N/P比。在一个实施方案中，最终N/P比为8至16，例如9至14，例如10至12。在一个实施方案中，在第一步中产生的N/P比为1至6，例如2至5(例如3或4)。
聚亚烷基亚胺
本文中使用的聚亚烷基亚胺优选包含以下通式(I)：
其中
R是H、酰基或包含以下通式(II)的基团：
其中R1是H或包含以下通式(III)的基团：
n、m和1独立地选自2至10的整数；并且
p、q和r是整数，其中p、q和r的总和使得聚合物的平均分子量为1.5·102至107Da，优选5000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
在一个实施方案中，n、m和l独立地选自2、3、4和5，优选选自2和3，并且更优选为2。在一个实施方案中，R1是H。在一个实施方案中，R是H或酰基。
在一个实施方案中，聚亚烷基亚胺包括聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)。PEI的平均分子量优选为1.5·102至107Da，优选5000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
根据本发明优选的是线型聚亚烷基亚胺，例如线型聚乙烯亚胺(PEI)。在一个实施方案中，线型PEI如下获得：2-乙基-2-唑啉开环异构化聚合以获得聚(2-乙基-2-唑啉)(PEOX；N-丙酰基-PEI)，其随后酸水解来切割掉N-丙酰基以产生PEI。
优选地，根据本发明，通过PEOX的完全或基本上完全的脱酰化来获得线型PEI。例如，分子量为50kDa的PEOX提供分子量为22kDa的线型PEI。优选地，聚亚烷基亚胺(例如聚乙烯亚胺)中氮原子的至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％的取代基是氢(即上式中的R是H)。因此优选地，聚亚烷基亚胺例(如聚乙烯亚胺)中至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％的氮原子是可质子化的。
根据本发明优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(PEI)，特别是线型聚乙烯亚胺。这样的线型聚乙烯亚胺优选具有15kDa至30kDa的摩尔质量，并且优选与自复制或自扩增RNA组合使用，其中N/P比优选为6至15，并且线型聚乙烯亚胺和自复制或自扩增RNA优选存在于尺寸小于200nm、优选小于150nm、并且甚至更优选小于100nm的聚合复合物颗粒中。
在本发明的一个实施方案中，聚亚烷基亚胺是短聚亚烷基亚胺(例如0.6至11kDa、优选1至6kDa或1至4kDa(例如1至3kDa)的短聚乙烯亚胺(线型和/或支化)与长聚亚烷基亚胺(例如20至40kDa的长聚乙烯亚胺(线型和/或支化))的组合，其中总N/P比优选为8至16，例如9至14，例如10至12。在一个实施方案中，长聚亚烷基亚胺和RNA的N/P比为1至6，例如2至5，例如3或4。
聚乙烯亚胺(PEI)是具有高阳离子电荷密度的有机大分子。PEI可将核酸压缩成带正电的颗粒，该颗粒能够与细胞表面的阴离子蛋白多糖相互作用并且促进颗粒通过胞吞作用的进入。
对于PEI，存在数种制造方法。根据本发明，线型聚乙烯亚胺优选通过包括以下步骤的方法合成和制备：从确定量的纯度高于99％的单体2-乙基-2-唑啉开始，彻底干燥所述量的单体，并通过以下使所述量的单体聚合以获得聚(2-乙基-2-唑啉)(PEOX)：
-在彻底干燥预定量的乙腈之后，在所述量的经干燥的单体中使用所述乙腈作为溶剂，同时添加预定量的经彻底干燥的聚合反应引发剂，并将它们一起混合，
-通过蒸发以除去所述溶剂，同时用甲醇和乙醚以及相应的过滤进行至少三次连续的洗涤/沉淀步骤，来纯化所述得到的PEOX，
安排所述干燥、聚合和纯化操作以获得，(i)通过进行1H NMR测试，正确鉴定所述PEOX聚合物，确认单体不存在至水平＜1.0％并且确认溶剂不存在至水平＜5.0％；以及(ii)，通过进行凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)，所述PEOX的分子量(molecular weight，Mw)的平均值＞23,000Da并且多分散性(Mw/Mn)＜1.5，
-用盐酸水解所述PEOX以充分高效地获得所述PEI，通过进行1H-NMR测试，残留侧链或丙酸的量＜5％，并且鉴定PEI为单峰。
应理解，通过彻底干燥特定量的单体、乙腈或引发剂，在临使用之前，获得水的湿度低于10ppm的降低，这可通过在氢化钙上干燥48小时并随后通过在高于129℃的温度下蒸馏和收集单体来获得。
根据本发明，以下特征的一个或更多个是优选的：
(i)PEOX的分子量(Mw)的平均值为例如40,000Da＜Mw＜60,000Da；
(ii)单体/引发剂比为约500(约应理解为±5％)；
(iii)单体/引发剂比为480；
(iv)单体纯度高于99.95％；
(v)在添加至单体之前，将引发剂与乙腈混合；
(vi)聚合在高于85℃的温度下进行多于20个小时；
(vii)聚合的温度高于或等于105℃；
(viii)在第一次过滤之后，将残余物用溶剂(例如MeOH)自由洗涤，并且在添加乙醚之后，聚(2-乙基-2-唑啉)从溶液中自然地分离为油状物，倾去所有溶剂并将所述洗涤和分离重复至少四次，然后在真空中进行干燥；
(ix)水解步骤包括从反应混合物中除去排出的丙酸，该丙酸通过规律的且在至少一天期间的共沸蒸馏获得，同时通过1H-NMR谱监测反应的过程；
(x)将在反应过程结束时获得的残余物在水中稀释并蒸发至少三次以除去痕量的丙酸，然后将残余物再次溶解在水中并在冻干之前进行过滤；
(xi)通过具有0.20μm至0.25μm的网格尺寸的无菌膜，(特别是无菌的细胞乙酸酯膜)提供过滤。
有利地，根据本发明使用的线型PEI的特征在于中间物PEOX的分子量Mw为例如40,000＜Mw＜60,000Da。
聚合度由单体/引发剂比和合成的产率控制。分子量测定可通过凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，GPC)进行。
根据本发明的术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和锁核酸(locked nucleic acid，LNA)。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、病毒RNA、重组制备的和化学合成的分子。根据本发明，核酸可以是单链或双链和线性或共价闭合的环状分子的形式。根据本发明的术语“核酸”还包括核酸在核苷酸碱基上、在糖上或在磷酸酯上的化学衍生化，以及包含非天然核苷酸和核苷酸类似物的核酸。所述核酸可以是分离的和/或重组的核酸。
本文中使用的术语“分离的”旨在指基本上没有其他分子(例如其他细胞材料)的分子。根据本发明术语“分离的核酸”意指核酸已经(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，(ii)通过克隆重组产生，(iii)纯化，例如通过切割和凝胶电泳分级，或(iv)合成，例如通过化学合成。分离的核酸是可用于通过重组技术操作的核酸。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中“重组物质”不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指客体(object)可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从自然界中的来源分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“存在于自然界中”并且包括已知的客体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的客体。
根据本发明“核酸序列”是指在核酸例(如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))中的核苷酸的序列。该术语可以指整个核酸分子(例如整个核酸分子的单链)或其部分(例如片段)。
根据本发明“核酸的3’端”是指具有游离羟基的末端。在双链核酸(特别是DNA)的图示中，3’端总是在右侧。根据本发明“核酸的5’端”是指具有游离磷酸酯基团的末端。在双链核酸(特别是DNA)的图示中，5’端总是在左手边。
5′末端 5′--P-NNNNNNN-OH-3′ 3′末端
3′-HO-NNNNNNN-P--5′
“上游”描述了核酸分子的第一元件相对于该核酸分子的第二元件的相对定位，其中这两个元件均包含在相同的核酸分子中，并且其中第一元件比该核酸分子的第二元件更靠近该核酸分子的5’端。然后第二元件称为位于该核酸分子的第一元件的“下游”。位于第二元件“上游”的元件可同义地称为位于该第二元件的“5”’。对于双链核酸分子，根据(+)链给出指示，例如“上游”和“下游”。
根据本发明，术语“基因”是指负责产生一种或更多种细胞产物和/或用于实现一种或更多种细胞间或细胞内功能的特定核酸序列。更具体地，所述术语涉及包含编码特定蛋白质或者功能性或结构性RNA分子的核酸的核酸部分(DNA或RNA)。
术语“载体”在本文中以其最一般的含义使用，并且包括用于核酸的任何中间载剂，其例如使得所述核酸能够被引入到原核和/或真核宿主细胞中，并且当合适时被整合到基因组中。优选地，这样的载体在细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、病毒基因组、及其部分。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全地或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子，并且包括本文中所述的所有RNA类型。术语“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA(例如经修饰的RNA，其通过一个或更多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然存在的RNA)。这样的改变可包括例如向RNA的末端或例如在RNA的一个或更多个核苷酸处在内部添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可包括非标准的核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物，特别是天然存在的RNA的类似物。根据本发明使用的RNA可具有已知的组成，或者RNA的组成可以是部分或全部未知的。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达的持续时间”。可预期具有长的半衰期的RNA将在延长的时间段内表达。
术语“翻译效率”涉及由RNA分子在特定的时间段内提供的翻译产物的量。
根据本发明，“双链RNA”或“dsRNA”意指具有两条部分或完全互补的链的RNA。
根据本发明，RNA优选为单链RNA(ssRNA)。术语“单链RNA”通常是指没有互补核酸分子(通常没有互补RNA分子)与其缔合的RNA分子。单链RNA可包含自互补序列，其允许RNA的部分折回并形成包括但不限于碱基对、茎、茎环和凸起(bulge)的二级结构基序。单链RNA可作为负链[(-)链]或作为正链[(+)链]存在。(+)链是包含或编码遗传信息的链。遗传信息可以是例如编码蛋白质的多核苷酸序列。当(+)链RNA编码蛋白质时，(+)链可直接用作翻译(蛋白质合成)的模板。(-)链是(+)链的互补链。在双链RNA的情况下，(+)链和(-)链是两个独立的RNA分子，并且这两个RNA分子彼此缔合以形成双链RNA(“双链体RNA”)。
根据本发明特别优选的单链RNA是mRNA和复制子-RNA，例如自复制RNA。根据本发明，RNA可以是编码RNA，即编码肽或蛋白质的RNA。优选地，RNA是药学活性RNA。
“药学活性RNA”是编码药学活性肽或蛋白质(例如抗原或免疫活性化合物(其不编码抗原))或自身具有药学活性的RNA，例如，其具有一种或更多种药学活性，例如对于药学活性蛋白质所描述的那些。
根据本发明，术语“编码肽或蛋白质的RNA”意指如果存在于合适的环境中(优选在细胞内)，可在翻译过程中指导氨基酸的组装以产生肽或蛋白质的RNA。优选地，根据本发明的编码RNA能够与细胞翻译机器相互作用，允许编码RNA的翻译以产生肽或蛋白质。
根据本发明，术语“mRNA”意指“信使RNA”并且涉及通常通过使用DNA模板产生并编码肽或蛋白质的转录物。通常来说，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区、3’-UTR和聚(A)序列。mRNA可由DNA模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，市售有多种体外转录试剂盒。根据本发明，mRNA可通过稳定化修饰和加帽来进行修饰。
术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中被转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。
如果存在的话，3’-UTR位于基因的3’端、蛋白质编码区的终止密码子的下游，但术语“3’-UTR”优选不包含聚(A)尾。因此，3’-UTR位于聚(A)尾(如果存在的话)的上游，例如直接与聚(A)尾相邻。如果存在的话，5’-UTR位于基因的5’端、蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’-帽相邻。根据本发明，5’-和/或3’-非翻译区可与开放阅读框功能性连接，以便这些区域与开放阅读框以使包含所述开放阅读框的RNA的稳定性和/或翻译效率提高的方式缔合。
根据本发明，术语“聚(A)序列”或“聚(A)尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断的序列，其通常位于RNA分子的3’端。不间断的序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的聚(A)序列是典型的。虽然聚(A)序列通常不在真核DNA中编码，但是其在细胞核中真核转录期间通过不依赖模板的RNA聚合酶连接到转录之后RNA的游离3’端，本发明涵盖由DNA编码的聚(A)序列。
例如“5’-帽”、“帽”、“5’-帽结构”或“帽结构”的术语同义使用以指在一些真核初级转录物(例如前体信使RNA)的5’端发现的二核苷酸。5’-帽是这样的结构，其中(任选经修饰的)鸟苷通过5’至5’三磷酸酯键(或在某些帽类似物的情况下经修饰的三磷酸酯键)键合至mRNA分子的第一个核苷酸。所述术语可以指常规的帽或帽类似物。
根据本发明的RNA分子的特征可以是5’-帽、5’-UTR、3’-UTR、聚(A)序列和/或密码子使用的适应。
根据本发明使用的RNA分子的大小优选为多于2000个碱基，优选多于3000个碱基，多于4000个碱基，多于5000个碱基，多于6000个碱基，多于7000个碱基，多于8000个碱基，多于9000个碱基，或多于10000个碱基。根据本发明使用的RNA分子的大小优选为6000至20000个碱基，优选6000至15000个碱基，优选9000至12000个碱基。
根据本发明，术语“表达”以其最一般的含义使用，并且包括RNA和/或蛋白质的产生。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及在细胞的核糖体中的过程，通过该过程，编码RNA(例如信使RNA)的链指导氨基酸序列的组装以制备肽或蛋白质。
术语“转录”涉及在这样的过程，在该期间期间，通过RNA聚合酶读取具有特定核酸序列的核酸分子(“核酸模板”)使得RNA聚合酶产生单链RNA分子。在转录期间，核酸模板中的遗传信息被转录。核酸模板可以是DNA；但是，例如，在从甲病毒核酸模板转录的情况下，模板通常是RNA。随后，转录的RNA可被翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中RNA(特别是mRNA)在无细胞的系统中体外合成的过程。优选地，应用克隆载体以产生转录物。这些克隆载体通常被指定为转录载体，并且根据本发明被术语“载体”涵盖。克隆载体优选为质粒。根据本发明，RNA优选是体外转录的RNA(invitro transcribed RNA，IVT-RNA)，并且可通过合适的DNA模板的体外转录来获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸(特别是cDNA)并将其引入到用于体外转录的合适的载体中来获得。cDNA可通过RNA的逆转录来获得。
在转录期间产生的单链核酸分子通常具有作为模板的互补序列的核酸序列。
根据本发明，术语“模板”或“核酸模板”或“模板核酸”通常是指可被复制或转录的核酸序列。
根据本发明，术语“表达控制序列”包括启动子、核糖体结合序列和控制基因转录或得到的RNA的翻译的其他控制元件。在本发明的一些特定实施方案中，表达控制序列可被调节。表达控制序列的精确结构可取决于物种或细胞类型而变化，但通常包括分别参与启动转录和翻译的5’-非转录序列以及5’-和3’-非翻译序列。更具体地，5’-非转录表达控制序列包括启动子区，其涵盖用于功能性连接的基因的转录控制的启动子序列。表达控制序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。DNA分子的表达控制序列通常包括5’-非转录序列以及5’-和3’-非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。甲病毒RNA的表达控制序列可包括亚基因组启动子和/或一种或更多种保守序列元件。如本文中所述，根据本发明的具体表达控制序列是甲病毒的亚基因组启动子。
术语“启动子”或“启动子区”是指通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点来控制转录物(例如包含编码序列的转录物)之合成的核酸序列。启动子区还可包含参与调节所述基因之转录的其他因子的识别或结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。启动子可以是“诱导型的”并且响应于诱导物而启动转录，或者如果转录不受诱导物控制则可以是“组成型的”。如果不存在诱导物，则诱导型启动子仅在非常小的程度上表达或根本不表达。在诱导物的存在下，基因被“开启”或转录的水平提高。这通常通过特定转录因子的结合来介导。如本文中所述，根据本发明的特异性启动子是甲病毒的亚基因组启动子。其他特异性启动子是甲病毒的基因组正链或负链启动子。
术语“核心启动子”是指由启动子包含的核酸序列。核心启动子通常是正确启动转录所需的启动子的最小部分。核心启动子通常包含转录起始位点和RNA聚合酶的结合位点。
本文中所述的核酸序列(特别是可转录和编码的核酸序列)可与任何表达控制序列组合，所述表达控制序列可与所述核酸序列同源或异源，其中术语“同源”是指核酸序列也与表达控制序列天然地功能性连接的事实，并且术语“异源”是指核酸序列不与表达控制序列天然地功能性连接的事实。
如果核酸序列(特别是编码肽或蛋白质的核酸序列)与表达控制序列以这样的方式彼此共价连接：可转录和/或编码的核酸序列的转录或表达受表达控制序列的控制或影响，则它们彼此“功能性”连接。
根据本发明，“功能性键联”或“功能性连接”涉及功能性关系内的连接。如果核酸在功能上与另一核酸序列相关，则其是“功能性连接的”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则其与所述编码序列功能性连接。功能性连接的核酸通常彼此相邻，当合适时被其他核酸序列分开。
在一些特定实施方案中，根据本发明，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列可与核酸同源或异源。
“聚合酶”通常是指能够催化从单体构建单元合成聚合物分子的分子实体。“RNA聚合酶”是能够催化从核糖核苷酸构建单元合成RNA分子的分子实体。“DNA聚合酶”是能够催化从脱氧核糖核苷酸构建单元合成DNA分子的分子实体。对于DNA聚合酶和RNA聚合酶的情况，所述分子实体通常是蛋白质或多种蛋白质的组装或复合物。通常来说，DNA聚合酶基于模板核酸合成DNA分子，所述模板核酸通常是DNA分子。通常来说，RNA聚合酶基于模板核酸合成RNA分子，所述模板核酸是DNA分子(在这种情况下RNA聚合酶是DNA-依赖性RNA聚合酶，DdRP)或是RNA分子(在这种情况下RNA聚合酶是RNA-依赖性RNA聚合酶，RdRP)。
“RNA-依赖性RNA聚合酶”或“RdRP”是催化从RNA模板转录RNA的酶。在甲病毒RNA-依赖性RNA聚合酶的情况下，基因组RNA的(-)链互补链和基因组RNA的(+)链的依次合成导致RNA复制。因此，甲病毒RNA-依赖性RNA聚合酶同义地称为“RNA复制酶”。在自然界中，RNA-依赖性RNA聚合酶通常由除逆转录病毒之外的所有RNA病毒编码。编码RNA-依赖性RNA聚合酶的病毒的典型代表是甲病毒。
根据本发明，“RNA复制”通常是指基于给定的RNA分子(模板RNA分子)的核苷酸序列合成的RNA分子。合成的RNA分子可例如与模板RNA分子相同或互补。通常来说，RNA复制可通过DNA中间物的合成发生，或可通过由RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRP)介导的RNA-依赖性RNA复制直接发生。在甲病毒的情况下，RNA复制不通过DNA中间物发生，而是由RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRP)介导：模板RNA链(第一RNA链)或其部分用作用于合成与第一RNA链或其部分互补的第二RNA链的模板。第二RNA链或其部分可进而任选地用作用于合成与第二RNA链或其部分互补的第三RNA链的模板。因此，第三RNA链与第一RNA链或其部分相同。因此，RNA-依赖性RNA聚合酶能够直接合成模板的互补RNA链，并且能够间接合成相同的RNA链(通过互补的中间链)。
根据本发明，术语“模板RNA”是指可通过RNA-依赖性RNA聚合酶转录或复制的RNA。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明使用的RNA是复制子RNA或简称“复制子”，特别是自复制RNA。在一个特别优选的实施方案中，复制子或自复制RNA来源于ssRNA病毒，特别是正链ssRNA病毒(例如甲病毒)，或包含从其来源的元件。
通常来说，RNA病毒是具有RNA基因组的感染性颗粒的多样的组。RNA病毒可再分为单链RNA(single stranded RNA，ssRNA)和双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)病毒，并且ssRNA病毒通常可进一步分为正链[(+)链]和/或负链[(-)链]病毒。正链RNA病毒作为生物医学中的递送系统初步看来(prima facie)是有吸引力的，因为它们的RNA可直接用作用于在宿主细胞中翻译的模板。
甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒的宿主包括很多种生物体，包括昆虫、鱼和哺乳动物，例如家养动物和人。甲病毒在被感染细胞的细胞质中复制(关于甲病毒生命周期的综述参见José等，Future Microbiol.，2009，第4卷，第837-856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组RNA通常具有5’-帽和3’聚(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。四种非结构蛋白(nsP1至nsP4)通常由在基因组5’端附近开始的第一个ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由见于第一个ORF下游并且延伸靠近基因组3’端的第二个ORF一起编码。通常来说，第一个ORF大于第二个ORF，比例为约2∶1。
在由甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息从亚基因组转录物翻译，该亚基因组转录物是类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould等，2010，Antiviral Res.，第87卷第111-124页)。感染之后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组RNA直接像信使RNA一样作用，用于翻译编码非结构多蛋白(nsPl234)的开放阅读框。在一些甲病毒中，在nsP3和nsP4的编码序列之间存在乳白终止密码子(opal stop codon)：当翻译在乳白终止密码子处终止时，产生包含nsP1、nsP2和nsP3的多蛋白P123，并且在通读该乳白密码子之后产生另外地包含nsP4的多蛋白P1234(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；Rupp等，2015，J.Gen.Virology，第96卷，第2483-2500页)。nsP1234被自蛋白水解切割成片段nsP123和nsP4。多肽nsP123和nsP4缔合以形成(-)链复制酶复合物，其使用(+)链基因组RNA作为模板转录(-)链RNA。通常在后期阶段，nsP123片段完全切割成单独的蛋白质nsP1、nsP2和nsP3(Shirako&Strauss，1994，J.Virol.，第68卷，第1874-1885页)。所有四种蛋白质形成(+)链复制酶复合物，其使用基因组RNA的(-)链互补链作为模板合成新的(+)链基因组(Kim等，2004，Virology，第323卷，第153-163页，Vasiljeva等，2003，J.Biol.Chem.第278卷，第41636-41645页)。
在感染的细胞中，亚基因组RNA以及新的基因组RNA由nsP1提供5’-帽(Pettersson等1980，Eur.J.Biochem.105，435-443；Rozanov等，1992，J.Gen.Virology，第73卷，第2129-2134页)，并且由nsP4提供聚腺苷酸[聚(A)]尾(Rubach等，Virology，2009，第384卷，第201-208页)。因此，亚基因组RNA和基因组RNA二者都类似于信使RNA(mRNA)。
甲病毒结构蛋白通常在亚基因组启动子的控制下由一个单开放阅读框编码(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。亚基因组启动子被顺式作用的甲病毒非结构蛋白识别。特别地，甲病毒复制酶使用基因组RNA的(-)链互补链作为模板合成(+)链亚基因组转录物。(+)链亚基因组转录物编码甲病毒结构蛋白(Kim等，2004，Virology，第323卷，第153-163页，Vasilieva等，2003，J.Biol.Chem.第278卷，第41636-41645页)。亚基因组RNA转录物充当用于翻译编码作为一个多蛋白之结构蛋白的开放阅读框的模板，并且切割多蛋白以产生结构蛋白。在宿主细胞中甲病毒感染的后期阶段，位于nsP2的编码序列内的包装信号确保将基因组RNA选择性包装到由结构蛋白包装的芽殖病毒体(budding virion)中(White等，1998，J.Virol.，第72卷，第4320-4326页)。
在感染的细胞中，(-)链RNA合成通常仅在感染之后的前3至4个小时中观察到，并且在后期检测不到，此时仅观测到(+)链RNA(基因组和亚基因组二者)的合成。根据Frolov等，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页，用于调节RNA合成的主要模型表明对于非结构多蛋白加工的依赖：非结构多蛋白nsP1234的初始切割产生nsPl23和nsP4；nsP4充当RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRp)，其对(-)链合成具有活性，但对于(+)链RNA的产生低效。多蛋白nsP123的进一步加工(包括在nsP2/nsP3连接处的切割)改变复制酶的模板特异性以提高(+)链RNA的合成并且降低或终止(-)链RNA的合成。
甲病毒RNA的合成也受顺式作用RNA元件调节，包括四种保守序列元件(CSEs；Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；和Frolov，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。
通常来说，甲病毒基因组的5’复制识别序列的特征在于不同甲病毒之间的低的整体同源性，但其具有保守的预测的二级结构。甲病毒基因组的5’复制识别序列不仅参与翻译启动，还包含含有参与病毒RNA合成的两个保守序列元件CSE 1和CSE 2的5’复制识别序列。对于CSE 1和2的功能，认为二级结构比线性序列更重要(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。
相比之下，甲病毒基因组的3’端序列(即紧邻聚(A)序列的上游的序列)的特征在于保守的一级结构，特别是在于保守序列元件4(CSE 4)，也称为“19-nt保守序列”，其对于(-)链合成的起始是重要的。
CSE 3也称为“连接序列(junction sequence)”，是甲病毒基因组RNA的(+)链上的保守序列元件，并且(-)链上的CSE 3互补序列充当亚基因组RNA转录的启动子(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页；Frolov等，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。CSE 3通常与编码nsP4的C端片段的区域重叠。
除了甲病毒蛋白质之外，宿主细胞因子(可能是蛋白质)也可与保守序列元件结合(Strauss&Strauss，同上)。
已提出了甲病毒来源的载体用于将外源遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，将编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框替换为编码目的蛋白质的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个独立的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶(通常为多蛋白nsP1234)，并且另一个核酸分子能够由所述复制酶反式复制(因此定名为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够由复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许通过甲病毒复制酶的识别和RNA合成。
根据本发明，术语“甲病毒”应被广泛地理解并且包括具有甲病毒特征的任何病毒颗粒。甲病毒的特征包括存在(+)链RNA，其编码适合于在宿主细胞中复制的遗传信息，包括RNA聚合酶活性。许多甲病毒的另外的特征例如在Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页中描述。术语“甲病毒”包括在自然界中发现的甲病毒，以及其任何变体或衍生物。在一些实施方案中，变体或衍生物未在自然界中发现。
在一个实施方案中，甲病毒是在自然界中发现的甲病毒。通常来说，在自然界中发现的甲病毒对任一种或更多种真核生物体(例如动物，包括脊椎动物(例如人)和节肢动物(例如昆虫))是感染性的。
在自然界中发现的甲病毒优选选自以下：巴马森林病毒复合物(Barmah Forestvirus complex)(包括巴马森林病毒(Barmah Forest virus))；东方马脑炎复合物(Eastern equine encephalitis complex)(包括七种抗原类型的东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus))；米德尔堡病毒复合物(Middelburg viruscomplex)(包括米德尔堡病毒(Middelburg virus))；恩杜穆病毒(Ndumu virus complex)复合物(包括恩杜穆病毒(Ndumu virus))；塞姆利基森林病毒复合物(Semliki Forestvirus complex)(包括贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、屈曲病毒(Chikungunya virus)、马罗亚病毒(Mayaro virus)及其亚型乌纳病毒(Una virus)、奥尼永尼永病毒(O’Nyong Nyongvirus)及其亚型Igbo-Ora病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)及其亚型贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、盖他病毒(Getah virus)、鹭山病毒(Sagiyama virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)及其亚型Me Tri病毒)；委内瑞拉马脑炎复合物(Venezuelanequine encephalitis complex)(包括卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、沼泽地病毒(Everglade virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、帕拉马纳病毒(Paramana virus)、那皮舒纳病毒(Pixuna virus)、里奥内格罗病毒(Rio Negro virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)及其亚型比茹桥病毒(Bijou Bridge virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus))；西方马脑炎复合物(Western equine encephalitis complex)(包括奥拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、奥克尔布病毒(Ockelbo virus)、瓦塔罗阿病毒(Whataroavirus)、博吉河病毒(Buggy Creek virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、西方马脑炎病毒(Western equine virus))；以及一些未分类的病毒，包括鲑鱼胰腺疾病病毒；睡眠疾病病毒；南象海豹病毒；图那特病毒(Tonate virus)。更优选地，甲病毒选自以下：塞姆利基森林病毒复合物(包括如上所述的病毒类型，包括塞姆利基森林病毒)、西方马脑炎复合物(包括如上所述的病毒类型，包括辛德毕斯病毒)、东方马脑炎病毒(包括如上所述的病毒类型)、委内瑞拉马脑炎复合物(包括如上所述的病毒类型，包括委内瑞拉马脑炎病毒)。
在另一个优选的实施方案中，甲病毒是塞姆利基森林病毒。在另一个替代的优选实施方案中，甲病毒是辛德毕斯病毒。在另一个替代的优选实施方案中，甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。
在本发明的一些实施方案中，甲病毒不是在自然界中发现的甲病毒。通常来说，在自然界中未发现的甲病毒是在自然界中发现的甲病毒的变体或衍生物，其通过核苷酸序列(即基因组RNA)中的至少一个突变区别于在自然界中发现的甲病毒。与在自然界中发现的甲病毒相比，核苷酸序列中的突变可选自一个或更多个核苷酸的插入、替换或缺失。核苷酸序列中的突变可与由该核苷酸序列编码的多肽或蛋白质中的突变相关或不相关。例如，在自然界中未发现的甲病毒可以是减毒的甲病毒。在自然界中未发现的减毒的甲病毒是通常在其核苷酸序列中具有至少一个突变的甲病毒，通过该突变其区别于在自然界中发现的甲病毒，并且其根本不具有感染性，或具有感染性但具有较低的产生疾病的能力或根本没有产生疾病的能力。作为举例说明性实例，TC83是减毒的甲病毒，其区别于在自然界中发现的委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis viru，VEEV)(McKinney等，1963，Am.J.Trop.Med.Hyg.，1963，第12卷；第597-603页)。
甲病毒属的成员也可基于它们在人中的相对临床特征进行分类：主要与脑炎相关的甲病毒，以及主要与发热、皮疹和多关节炎相关的甲病毒。
术语“甲病毒的”意指在甲病毒中发现，或起源于甲病毒或来自于甲病毒，例如通过遗传工程。
根据本发明，“SFV”代表塞姆利基森林病毒。根据本发明，“SIN”或“SINV”代表辛德毕斯病毒。根据本发明，“VEE”或“VEEV”代表委内瑞拉马脑炎病毒。
根据本发明，术语“甲病毒的”或“来源于甲病毒”是指起源于甲病毒的实体。例如，甲病毒的蛋白质可以指在甲病毒中发现的蛋白质和/或由甲病毒编码的蛋白质；甲病毒的核酸序列可以指在甲病毒中发现的核酸序列和/或由甲病毒编码的核酸序列。优选地，“甲病毒的”核酸序列是指“甲病毒的基因组的”和/或“甲病毒的基因组RNA的”核酸序列。
根据本发明，术语“甲病毒RNA”是指甲病毒基因组RNA(即(+)链)、甲病毒基因组RNA的互补链(即(-)链)和亚基因组转录物(即(+)链)或其任何片段中的任一种或更多种。
根据本发明，“甲病毒基因组”是指甲病毒的基因组(+)链RNA。
根据本发明，术语“天然甲病毒序列”和类似的术语通常是指天然存在的甲病毒(在自然界中发现的甲病毒)的(例如核酸)序列。在一些实施方案中，术语“天然甲病毒序列”还包括减毒甲病毒的序列。
根据本发明，术语“5’复制识别序列”优选是指与甲病毒基因组的5’片段相同或同源的连续核酸序列，优选核糖核酸序列。“5’复制识别序列”是可被甲病毒复制酶识别的核酸序列。术语5’复制识别序列包括天然5’复制识别序列及其功能等同物，例如在自然界中发现的甲病毒的5’复制识别序列的功能变体。5’复制识别序列是合成甲病毒基因组RNA的(-)链互补链所需要的，并且是基于(-)链模板合成(+)链病毒基因组RNA所需要的。天然5’复制识别序列通常编码nsP1的至少N端片段；但不包含编码nsP1234的整个开放阅读框。鉴于天然5’复制识别序列通常编码nsP1的至少N端片段的事实，天然5’复制识别序列通常包含至少一个起始密码子，通常为AUG。在一个实施方案中，5’复制识别序列包含甲病毒基因组的保守序列元件1(CSE 1)或其变体和甲病毒基因组的保守序列元件2(CSE 2)或其变体。5’复制识别序列通常能够形成四个茎环(stem loop，SL)，即SL1、SL2、SL3、SL4。这些茎环的编号从5’复制识别序列的5’端开始。
根据本发明，术语“3’复制识别序列”优选是指与甲病毒基因组的3’片段相同或同源的连续核酸序列，优选核糖核酸序列。“3’复制识别序列”是可被甲病毒复制酶识别的核酸序列。术语3’复制识别序列包括天然3’复制识别序列及其功能等同物，例如在自然界中发现的甲病毒的3’复制识别序列的功能变体。3’复制识别序列是合成甲病毒基因组RNA的(-)链互补链所需要的。在一个实施方案中，3’复制识别序列包含甲病毒基因组的保守序列元件4(CSE 4)或其变体和任选的甲病毒基因组的聚(A)尾。
术语“保守序列元件”或“CSE”是指在甲病毒RNA中发现的核苷酸序列。这些序列元件被称为“保守的”是因为直系同源物存在于不同的甲病毒的基因组中，并且不同的甲病毒的直系同源CSE优选地具有高百分比的序列同一性和/或类似的二级或三级结构。术语CSE包括CSE 1、CSE 2、CSE 3和CSE 4。
根据本发明，术语”CSE 1”或“44-nt CSE”同义地指对于从(-)链模板合成(+)链所需的核苷酸序列。术语“CSE 1”是指(+)链上的序列；并且CSE 1的互补序列(在(-)链上)用作(+)链合成的启动子。优选地，术语CSE 1包括甲病毒基因组的最5’核苷酸。CSE 1通常形成保守的茎环结构。不希望受特定理论的束缚，认为对于CSE 1，二级结构比一级结构(即线性序列)更重要。在模型甲病毒辛德毕斯病毒的基因组RNA中，CSE 1由44个核苷酸的连续序列组成，其由基因组RNA的最5’的44个核苷酸形成(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491-562页)。
根据本发明，术语“CSE 2”或“51-nt CSE”同义地指对于从(+)链模板合成(-)链所需的核苷酸序列。(+)链模板通常是甲病毒基因组RNA或RNA复制子(注意，不包含CSE 2的亚基因组RNA转录物不用作(-)链合成的模板)。在甲病毒基因组RNA中，CSE 2通常位于nsP1的编码序列内。在模型甲病毒辛德毕斯病毒的基因组RNA中，51-nt CSE位于基因组RNA的第155-205位核苷酸(Frolov等，2001，RNA，第7卷，第1638-1651页)。CSE 2通常形成两个保守的茎环结构。这些茎环结构被定名为茎环3(SL3)和茎环4(SL4)，因为从甲病毒基因组RNA的5’端开始计数，它们分别是甲病毒基因组RNA的第三和第四个保守茎环。不希望受特定理论的束缚，认为对于CSE 2，二级结构比一级结构(即线性序列)更重要。
根据本发明，术语“CSE 3”或“连接序列”同义地指来源于甲病毒基因组RNA并且包含亚基因组RNA的起始位点的核苷酸序列。(-)链中该序列的互补序列用于促进亚基因组RNA转录。在甲病毒基因组RNA中，CSE 3通常与编码nsP4的C端片段的区域重叠，并且延伸至位于编码结构蛋白的开放阅读框上游的短非编码区。
根据本发明，术语“CSE 4”或“19-nt保守序列”或“19-nt CSE”同义地指来自甲病毒基因组RNA、紧邻甲病毒基因组的3’非翻译区中聚(A)序列的上游的核苷酸序列。CSE 4通常由19个连续核苷酸组成。不希望受特定理论的束缚，CSE 4被理解为用作用于启动(-)链合成的核心启动子(José等，Future Microbiol.，2009，第4卷，第837-856页)；和/或甲病毒基因组RNA的CSE 4和聚(A)尾被理解为一起用于高效的(-)链合成(Hardy&Rice，J.Virol.，2005，第79卷，第4630-4639页)。
根据本发明，术语“亚基因组启动子”或“SGP”是指核酸序列(例如编码序列)的上游(5’)的核酸序列，其通过提供RNA聚合酶(通常是RNA-依赖性RNA聚合酶，特别是功能性甲病毒非结构蛋白的识别和结合位点)来控制所述核酸序列的转录。SGP可还包含其他因子的其他识别或结合位点。亚基因组启动子通常是正链RNA病毒(例如甲病毒)的遗传元件。甲病毒的亚基因组启动子是包含在病毒基因组RNA中的核酸序列。亚基因组启动子的特征通常在于其允许在RNA-依赖性RNA聚合酶(例如功能性甲病毒非结构蛋白)的存在下启动转录(RNA合成)。RNA(-)链(即甲病毒基因组RNA的互补链)用作用于合成(+)链亚基因组转录物的模板，并且该(+)链亚基因组转录物的合成通常在亚基因组启动子处或附近开始。本文中使用的术语“亚基因组启动子”不限于在包含这样的亚基因组启动子的核酸中的任何特定定位。在一些实施方案中，SGP与CSE 3相同或与CSE 3重叠或包含CSE 3。
术语“亚基因组转录物”或“亚基因组RNA”同义地指可由使用RNA分子作为模板(“模板RNA”)进行转录获得的RNA分子，其中模板RNA包含亚基因组启动子，其控制亚基因组转录物的转录。亚基因组转录物可在RNA-依赖性RNA聚合酶(特别是功能性甲病毒非结构蛋白)的存在下获得。例如，术语“亚基因组转录物”可以指在甲病毒感染的细胞中使用甲病毒基因组RNA的(-)链互补链作为模板制备的RNA转录物。然而，本文中使用的术语“亚基因组转录物”不限于此，并且还包括可通过使用异源RNA作为模板获得的转录物。例如，亚基因组转录物还可通过使用根据本发明包含SGP的复制子的(-)链互补链作为模板获得。因此，术语“亚基因组转录物”可以指可通过转录甲病毒基因组RNA片段获得的RNA分子，以及可通过转录根据本发明的复制子的片段获得的RNA分子。
根据本发明，能够通过复制酶(优选甲病毒复制酶)进行复制的核酸构建体称为复制子。根据本发明，术语“复制子”定义了可通过RNA-依赖性RNA聚合酶复制的RNA分子，产生RNA复制子的一个或多个相同或基本上相同的拷贝，而没有DNA中间物。“没有DNA中间物”意指在形成RNA复制子的拷贝的过程中没有复制子的脱氧核糖核酸(DNA)拷贝或互补序列形成，和/或在形成RNA复制子的拷贝或其互补序列的过程中没有脱氧核糖核酸(DNA)分子用作模板。复制酶的功能通常由功能性甲病毒非结构蛋白提供。
根据本发明，术语“可进行复制”和“能够进行复制”通常描述可制备核酸的一个或更多个相同或基本上相同的拷贝。当与术语“复制酶”一起使用时，例如在“能够通过复制酶进行复制”中，术语“可进行复制”和“能够进行复制”描述核酸分子(例如RNA复制子)关于复制酶的功能特征。这些功能特征包括以下的至少一种：(i)复制酶能够识别复制子和(ii)复制酶能够用作RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRP)。优选地，复制酶能够(i)识别复制子和(ii)用作RNA-依赖性RNA聚合酶二者。
表述“能够识别”描述了复制酶能够与复制子物理缔合，并且优选地，复制酶能够与复制子通常非共价地结合。术语“结合”可意指复制酶具有与以下一种或更多种结合的能力：保守序列元件1(CSE 1)或其互补序列(如果被复制子包含的话)、保守序列元件2(CSE2)或其互补序列(如果被复制子包含的话)、保守序列元件3(CSE 3)或其互补序列(如果被复制子包含的话)、保守序列元件4(CSE 4)或其互补序列(如果被复制子包含的话)。优选地，复制酶能够与CSE 2[即，与(+)链]和/或与CSE 4[即，与(+)链]结合，或者与CSE 1的互补序列[即，与(-)链]和/或与CSE 3的互补序列[即，与(-)链]结合。
表述“能够用作RdRP”意指复制酶能够催化甲病毒基因组(+)链RNA的(-)链互补链的合成，其中所述(+)链RNA具有模板功能，和/或复制酶能够催化(+)链甲病毒基因组RNA的合成，其中所述(-)链RNA具有模板功能。通常来说，表述“能够用作RdRP”还可包括复制酶能够催化(+)链亚基因组转录物的合成，其中(-)链RNA具有模板功能，并且其中(+)链亚基因组转录物的合成通常在甲病毒亚基因组启动子处开始。
表述“能够结合”和“能够用作RdRP”是指在正常生理条件下的能力。特别地，它们是指表达功能性甲病毒非结构蛋白或已经用编码功能性甲病毒非结构蛋白的核酸转染的细胞内的条件。细胞优选是真核细胞。结合能力和/或用作RdRP的能力可通过实验测试，例如，在无细胞的体外系统中或在真核细胞中。任选地，所述真核细胞是来自代表了复制酶来源的特定甲病毒对其具有感染性的物种的细胞。例如，当使用来自对人具有感染性的特定甲病毒的甲病毒复制酶时，正常生理条件是在人细胞中的条件。更优选地，真核细胞(在一个实例中是人细胞)来自代表了复制酶来源的特定甲病毒对其具有感染性的相同组织或器官。
根据本发明，“与天然甲病毒序列相比”和类似术语是指是天然甲病毒序列的变体的序列。该变体通常本身不是天然甲病毒序列。
在一个实施方案中，RNA复制子包含复制识别序列，例如5’复制识别序列和3’复制识别序列。复制识别序列是可被功能性甲病毒非结构蛋白识别的核酸序列。换句话说，功能性甲病毒非结构蛋白能够识别复制识别序列。优选地，5’复制识别序列位于复制子的5’端。在一个实施方案中，5’复制识别序列包含CSE 1和2或由其组成。优选地，3’复制识别序列位于复制子的3’端(如果复制子不包含聚(A)尾)，或紧邻聚(A)尾的上游(如果复制子包含聚(A)尾)。在一个实施方案中，3’复制识别序列包含CSE 4或由其组成。
在一个实施方案中，5’复制识别序列和3’复制识别序列能够在功能性甲病毒非结构蛋白的存在下指导RNA复制子的复制。因此，当单独存在或优选一起存在时，这些识别序列在功能性甲病毒非结构蛋白的存在下指导RNA复制子的复制。
优选地，能够识别复制子的5’复制识别序列和3’复制识别序列二者的功能性甲病毒非结构蛋白以顺式(通过复制子上的开放阅读框编码为目的蛋白质)或以反式(通过独立的复制酶构建体上的开放阅读框编码为目的蛋白质)提供。在一个实施方案中，当5’和3’复制识别序列对于从其中得到功能性甲病毒非结构蛋白的甲病毒是天然的时，实现这一点。天然意指这些序列的天然来源是相同的甲病毒。在一个替代实施方案中，5’复制识别序列和/或3’复制识别序列对于从其中得到功能性甲病毒非结构蛋白的甲病毒不是天然的，只要功能性甲病毒非结构蛋白能够识别复制子的5’复制识别序列和3’复制识别序列二者即可。换句话说，功能性甲病毒非结构蛋白与5’复制识别序列和3’复制识别序列相容。当非天然的功能性甲病毒非结构蛋白能够识别相应的序列或序列元件时，认为功能性甲病毒非结构蛋白是相容的(跨病毒相容性)。只要存在跨病毒相容性，(3’/5’)复制识别序列和CSE分别与具有功能性甲病毒非结构蛋白的任何组合都是可能的。在适合于RNA复制的条件下(例如在合适的宿主细胞中)，通过将待测试的功能性甲病毒非结构蛋白与RNA一起孵育，本发明的技术人员可容易地测试跨病毒的相容性，其中RNA具有待测试的3’-和5’复制识别序列。如果发生复制，则确定(3’/5’)复制识别序列和功能性甲病毒非结构蛋白是相容的。
在本发明的一个实施方案中，复制子是反式复制系统的一部分，并且因此，该复制子是反式复制子。在该实施方案中，优选RNA复制子不包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。因此，在该实施方案中，本发明提供了包含两种核酸分子的系统：用于表达功能性甲病毒非结构蛋白(即编码功能性甲病毒非结构蛋白)的第一RNA构建体；以及第二RNA分子RNA复制子。用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体在本文中同义地称为“用于表达功能性甲病毒非结构蛋白的RNA构建体”或“复制酶构建体”。功能性甲病毒非结构蛋白如上所定义并且通常由复制酶构建体包含的开放阅读框编码。由复制酶构建体编码的功能性甲病毒非结构蛋白可以是能够复制复制子的任何功能性甲病毒非结构蛋白。根据本发明，复制酶构建体可与复制子一起存在于相同的组合物中(例如作为混合的颗粒制剂或组合的颗粒制剂)，或在单独的组合物中(例如作为单独的颗粒制剂)。当将本发明的系统引入到细胞(优选真核细胞)中时，可翻译编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。在翻译之后，功能性甲病毒非结构蛋白能够反式复制单独的RNA分子(RNA复制子)。
在本文中，反式(例如在反式作用、反式调节的情况下)通常意指“从不同分子发挥作用”(即分子间)。其与顺式(例如在顺式作用、顺式调节的情况下)相反，后者通常意指“从相同分子发挥作用”(即分子内)。在RNA合成(包括转录和RNA复制)的情况下，反式作用元件包括包含编码能够进行RNA合成之酶(RNA聚合酶)的基因的核酸序列。RNA聚合酶使用第二核酸分子(即除了编码RNA聚合酶的核酸分子之外的核酸分子)作为RNA合成的模板。RNA聚合酶和包含编码RNA聚合酶之基因的核酸序列二者都被称为“反式作用”于第二核酸分子。在本发明的上下文中，由反式作用RNA编码的RNA聚合酶可以是功能性甲病毒非结构蛋白。功能性甲病毒非结构蛋白能够使用第二核酸分子(其为RNA复制子)作为用于RNA合成(包括RNA复制子的复制)的模板。根据本发明可通过反式复制酶进行复制的RNA复制子在本文中同义地称为“反式复制子”。
根据本发明，如果复制子上存在亚基因组启动子，则功能性甲病毒非结构蛋白的作用是扩增复制子，并制备亚基因组转录物。如果复制子编码用于表达的目的基因，则可通过改变功能性甲病毒非结构蛋白的水平来反式调节目的基因的表达水平和/或表达的持续时间。
本发明的反式复制系统包含至少两种核酸分子。在一个优选实施方案中，该系统由恰好两种RNA分子复制子和复制酶构建体组成。在一些替代的优选实施方案中，该系统包含多于一种复制子(每种复制子优选编码至少一种目的蛋白质)，并且还包含复制酶构建体。在这些实施方案中，由复制酶构建体编码的功能性甲病毒非结构蛋白可作用于每种复制子以分别驱动复制和任选地产生亚基因组转录物。例如，每种复制子可编码药学活性肽或蛋白质。这是有利的，例如如果期望针对数种不同抗原对对象进行疫苗接种。
优选地，复制酶构建体缺少基于(+)链模板的(-)链合成和/或基于(-)链模板的(+)链合成所需的保守序列元件(conserved sequence element，CSE)。更优选地，复制酶构建体不包含任何甲病毒保守序列元件(CSE)。特别地，在甲病毒的四种CSE中(Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491至562页；José等，Future Microbiol.，2009，第4卷，第837至856页)，以下CSE中的任何一种或更多种优选不存在于复制酶构建体上：CSE 1；CSE 2；CSE 3；CSE 4。特别地在不存在任何一种或更多种甲病毒CSE的情况下，与甲病毒基因组RNA相比，本发明的复制酶构建体与典型的真核mRNA更类似得多。
优选地，本发明的复制酶构建体与甲病毒基因组RNA的区别至少在于，其不能自复制和/或其不包含在亚基因组启动子控制下的开放阅读框。当不能自复制时，复制酶构建体也可称为“自杀构建体”。
根据本发明的复制酶构建体优选是单链RNA分子。根据本发明的复制酶构建体通常是(+)链RNA分子。在一个实施方案中，本发明的复制酶构建体是分离的核酸分子。
在一个实施方案中，RNA(例如根据本发明的复制子)包含编码目的肽或目的蛋白质的至少一个开放阅读框。在多个实施方案中，目的肽或蛋白质由异源核酸序列编码。根据本发明，术语“异源”是指核酸序列在功能或结构上并不是天然地与核酸序列(例如甲病毒核酸序列)连接的事实。
根据本发明的RNA可编码单个多肽或多个多肽。多个多肽可编码为单个多肽(融合多肽)或分开的多肽。在一些实施方案中，根据本发明的RNA可包含多于一个的开放阅读框，在复制子的情况下，每个开放阅读框可独立地选择在或不在亚基因组启动子的控制之下。或者，多蛋白或融合多肽包含由任选的自催化蛋白酶切割位点(例如口蹄疫病毒2A蛋白)或内含肽(intein)分开的单独的多肽。
目的蛋白质可例如选自报道蛋白(reporter protein)、药学活性肽或蛋白质、细胞内干扰素(IFN)信号传导抑制剂和功能性甲病毒非结构蛋白。
根据本发明，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选20个或更多个，并且多至优选50个、优选100个或优选150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，优选具有至少151个氨基酸的肽，但术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常用作同义词。
根据本发明，术语“肽”和“蛋白质”包括不仅含有氨基酸组分而且含有非氨基酸组分(例如糖和磷酸酯结构)的物质，并且还包含含有例如酯、硫醚或二硫键之键的物质。
根据本发明，关于例如核酸和氨基酸序列的术语“变体”包括任何变体，特别是突变体、病毒株变体、剪接变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其意义通常不清楚。全基因测序通常确定给定基因的许多等位基因变体。关于核酸分子，术语“变体”包含简并核酸序列，其中根据本发明的简并核酸是由于遗传密码的简并性(例如，由于密码子使用的适应)而在密码子序列中与参考核酸不同的核酸。物种同源物是具有与给定核酸或氨基酸序列不同的起源物种的核酸或氨基酸序列。病毒同源物是具有与给定核酸或氨基酸序列不同的起源病毒的核酸或氨基酸序列。
根据本发明，与参考核酸相比，核酸变体包括单个或多个核苷酸缺失、添加、突变、替换和/或插入。缺失包括从参考核酸中去除一个或更多个核苷酸。添加变体包含一个或更多个核苷酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个核苷酸)的5′-和/或3′-端融合。在替换的情况下，去除序列中的至少一个核苷酸并在其位置插入至少一个其他核苷酸(例如颠换和转换)。突变包括无碱基位点、交联位点和化学改变或修饰的碱基。插入包括向参考核酸中添加至少一个核苷酸。
根据本发明，“核苷酸变化”可以指与参考核酸相比单个或多个核苷酸缺失、添加、突变、替换和/或插入。在一些实施方案中，与参考核酸相比，“核苷酸变化”选自单核苷酸的缺失、单核苷酸的添加、单核苷酸的突变、单核苷酸的替换和/或单核苷酸的插入。根据本发明，核酸变体可包含与参考核酸相比一个或更多个核苷酸变化。
特定核酸序列的变体优选具有所述特定序列的至少一种功能特性，并且优选在功能上等同于所述特定序列，例如表现出与特定核酸序列相同或相似特性的核酸序列。
优选地，给定核酸序列与作为所述给定核酸序列之变体的核酸序列之间的同一性程度将为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。优选地，给出至少约30、至少约50、至少约70、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、或至少约400个核苷酸的区域的同一性程度。在一些优选实施方案中，给出参考核酸序列的整个长度的同一性程度。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸或核苷酸的百分比。
术语“％同一性”特别地旨在指两个待比较的序列之间最佳比对时相同核苷酸的百分比，所述百分比是纯粹统计学的，并且两个序列之间的差异可在序列的整个长度上随机分布，并且为了获得两个序列之间的最佳比对，待比较的序列与参考序列相比可包含添加或缺失。两个序列的比较通常通过在最佳比对后关于区段或“比较窗口”比较所述序列来进行，以确定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可手动进行或借助于Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法，借助于Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，以及借助于Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性搜索算法或借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)。
通过确定相应比较的序列中相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目并将该结果乘以100来获得百分比同一性。
例如，可使用BLAST程序“BLAST 2序列”，其可在网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi上可获得。
如果两个序列彼此互补，则核酸与另一个核酸“能够杂交”或“杂交”。如果两个序列能够彼此形成稳定的双链体，则核酸与另一个核酸“互补”。根据本发明，杂交优选在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件(严格条件)下进行。严格条件描述于例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等，编辑，第2版，Cold Spring HarborLaboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989或Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel等，编辑，John Wiley&Sons，Inc.，New York中，并且是指例如在65℃下，在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH 7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中杂交。SSC为0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH 7。杂交后，将DNA转移至其中的膜在室温下例如在2×SSC中并随后在高至68℃的温度下在0.1至0.5×SSC/0.1×SDS中洗涤。
百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完美互补”或“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键键合。优选地，根据本发明的互补性程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。最优选地，根据本发明的互补性程度是100％。
术语“衍生物”包括核酸在核苷酸碱基上、糖上或磷酸酯上的任何化学衍生化。术语“衍生物”还包括含有不是天然存在的核苷酸和核苷酸类似物的核酸。优选地，核酸的衍生化提高其稳定性。
根据本发明，“来自于核酸序列的核酸序列”是指核酸可以是其所来源的核酸的变体。
在一个实施方案中，开放阅读框编码报道蛋白。在该实施方案中，开放阅读框包含报道基因。可选择某些基因作为报道子，因为它们赋予表达它们的细胞或生物体可容易地确定和测量的特征，或者因为它们是选择标记。报道基因通常用作某种基因是否被细胞或生物群体吸收或表达的指示。优选地，报道基因的表达产物是可视觉检测的。常见的可视觉检测的报道蛋白通常具有荧光或发光蛋白。特定报道基因的实例包括编码水母绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的基因(其引起表达它的细胞在蓝光下发出绿光)、酶萤光素酶(其催化与萤光素的反应以产生光)和红色荧光蛋白(red fluorescentprotein，RFP)。任何这些特定报道基因的变体都是可能的，只要该变体具有可视觉检测的特性即可。例如，eGFP是GFP的点突变型变体。
根据本发明，在一个实施方案中，RNA包含药学活性RNA或由其组成。“药学活性RNA”可以是编码药学活性肽或蛋白质的RNA。优选地，根据本发明的RNA编码药学活性肽或蛋白质。优选地，开放阅读框编码药学活性肽或蛋白质。优选地，RNA包含编码药学活性肽或蛋白质的开放阅读框，任选地RNA复制子的情况下在亚基因组启动子控制下。
当以治疗有效量向对象施用时，“药学活性肽或蛋白质”对对象的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。优选地，药学活性肽或蛋白质具有治疗或缓和特性，并且可施用以改善、减轻、缓解、逆转疾病或病症的一种或更多种症状，延迟其发作或减轻其严重程度。药学活性肽或蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病的发作或减轻这样的疾病或病理状态的严重程度。术语“药学活性肽或蛋白质”包括整个蛋白质或多肽，并且还可以指其药学活性片段。其还可包括肽或蛋白质的药学活性类似物。术语“药学活性肽或蛋白质”包括作为抗原的肽和蛋白质，即肽或蛋白质在对象中引发免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。
在一个实施方案中，药学活性肽或蛋白质是或包含免疫活性化合物或抗原或表位。
根据本发明，术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选地通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成，和/或通过刺激B细胞的抗体产生来改变体液免疫。在一个实施方案中，免疫应答涉及刺激抗体应答(通常包括免疫球蛋白G(IgG))和/或细胞应答(例如T细胞应答)。免疫活性化合物可具有有效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可下调免疫应答的其他方面，例如使免疫应答转移远离TH2免疫应答，这可用于治疗很多种TH2介导的疾病。
根据本发明，术语“抗原”或“免疫原”涵盖会引发免疫应答的任何物质。特别地，“抗原”涉及与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质。根据本发明，术语“抗原”包括包含至少一个表位的任何分子。优选地，在本发明的上下文中抗原是任选地在加工后诱导免疫反应的分子，所述免疫反应优选地对抗原是特异性的。根据本发明，可使用作为免疫反应候选物的任何合适的抗原，其中所述免疫反应可以是体液免疫反应和细胞免疫反应二者。在本发明的一些实施方案的情况下，抗原优选地由细胞(优选地由抗原呈递细胞在MHC分子的情况下)呈递，这导致针对抗原的免疫反应。抗原优选是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可包括或可来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白质或其部分。在一些优选实施方案中，抗原是表面多肽，即天然展示在细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤的表面上的多肽。抗原可引发针对细胞、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤的免疫应答。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的意义使用以指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是包含表位的分子，所述表位将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。因此，疾病相关抗原可用于治疗目的。疾病相关抗原优选与微生物感染相关(通常是微生物抗原)或与癌症(通常是肿瘤)相关。
术语“病原体”是指能够在生物体(优选脊椎动物生物体)中引起疾病的致病生物物质。病原体包括微生物，例如细菌、单细胞真核生物(原虫)、真菌、以及病毒。
术语“表位”、“抗原肽”、“抗原表位”、“免疫原性肽”和“MHC结合肽”在本文中可互换使用，并且是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即，是指免疫活性化合物中由免疫系统识别(例如由T细胞识别)的部分或片段，特别是当在MHC分子的情况下呈递时。蛋白质的表位优选包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且优选长度为5至100、优选5至50、更优选8至30、最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。根据本发明，表位可与MHC分子(例如细胞表面上的MHC分子)结合，并因可以是“MHC结合肽”或“抗原肽”。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中所述MHC蛋白质或分子结合肽并将其呈递以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)展示给T细胞。优选的这样的免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。如本文中所用，如果使用本领域中已知的任何测定可检测到这样的结合，则将免疫原性部分称为与MHC I类或II类分子“结合”。术语“MHC结合肽”涉及与MHC I类和/或MHC II类分子结合的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常为8至10个氨基酸长，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常为10至25个氨基酸长，并且特别是13至18个氨基酸长，然而更长和更短的肽可以是有效的。
在一个实施方案中，根据本发明的目的蛋白质包含适于靶生物体的疫苗接种的表位。本领域技术人员将知晓，免疫生物学和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用与待治疗疾病在免疫学上相关的抗原对生物体进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护反应。根据本发明，抗原选自自身抗原和非自身抗原。非自身抗原优选为细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、变应原或寄生虫抗原。优选的是，抗原包含能够在靶生物体中引发免疫应答的表位。例如，表位可引发针对细菌、病毒、真菌、寄生虫、变应原或肿瘤的免疫应答。
在一些实施方案中，非自身抗原是细菌抗原。在一些实施方案中，抗原引发针对感染动物的细菌的免疫应答，所述动物包括鸟类、鱼类和哺乳动物，包括驯养的动物。优选地，针对其引发免疫应答的细菌是致病性细菌。
在一些实施方案中，非自身抗原是病毒抗原。病毒抗原可例如是来自病毒表面蛋白质(例如膜结合糖蛋白、衣壳蛋白或多肽或刺突蛋白或多肽)的蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，抗原引发针对感染动物之病毒的免疫应答，所述动物包括鸟类、鱼类和哺乳动物，包括驯养的动物。优选地，针对其引发免疫应答的病毒是致病性病毒。
在一些实施方案中，非自身抗原是来自真菌的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，抗原引发针对感染动物之真菌的免疫应答，所述动物包括鸟类、鱼类和哺乳动物，包括驯养的动物。优选地，针对其引发免疫应答的真菌是致病性真菌。
在一些实施方案中，非自身抗原是来自单细胞真核寄生虫的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，抗原引发针对单细胞真核寄生虫(优选致病性单细胞真核寄生虫)的免疫应答。致病性单细胞真核寄生虫可例如来自疟原虫属(Plasmodium)，例如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵形疟原虫(P.ovale)；来自利什曼原虫属(Leishmania)；或来自锥虫属(Trypanosoma)，例如克氏锥虫(T.cruzi)或布氏锥虫(T.brucei)。
在一些实施方案中，非自身抗原是变应原性多肽或变应原性蛋白质。变应原性蛋白质或变应原性多肽适用于变应原免疫治疗，也称为脱敏作用(hypo-sensitization)。
在一些实施方案中，抗原是自身抗原，特别是肿瘤抗原。肿瘤抗原及其确定是本领域技术人员已知的。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”涉及在正常条件下在有限数量的组织和/或器官中或在特定发育阶段中特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤抗原可在正常条件下在胃组织中(优选在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如，在睾丸中)、在滋养层组织中(例如，在胎盘中)、或在种系细胞中特异性表达，并且在一种或更多种肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在这种情况下，“有限数量”优选地意指不多于3，更优选不多于2。在本发明的上下文中，肿瘤抗原包括例如分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即，在正常条件下在特定分化阶段的特定细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌/睾丸抗原，即，在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤抗原优选地与癌细胞的细胞表面缔合，并且优选地不在或仅很少地在正常组织中表达。优选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达指示癌细胞。在本发明的情况下，由对象(例如患有癌症疾病的患者)中的癌细胞表达的肿瘤抗原优选地为所述对象中的自身蛋白质。在一些优选实施方案中，本发明的情况下的肿瘤抗原在正常条件下在非必需的组织或器官(即当被免疫系统损伤时不会导致对象死亡的组织或器官)中，或在免疫系统无法或几乎无法进入的身体器官或结构中特异性表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤抗原与在癌组织中表达的肿瘤抗原之间，肿瘤抗原的氨基酸序列是相同的。
可用于本发明的肿瘤抗原的一些实例是p53、ART-4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密封蛋白家族的细胞表面蛋白质(例如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A(优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NFl、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190小BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT。特别优选的肿瘤抗原包括CLAUDIN-18.2(CLDN18.2)和CLAUDIN-6(CLDN6)。在一些实施方案中，不要求药学活性肽或蛋白质是引发免疫应答的抗原。合适的药学活性蛋白质或肽可选自细胞因子和免疫系统蛋白质，例如免疫活性化合物(例如，白介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白)、激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、催乳素、催产素、多巴胺、牛促生长素、瘦素等)、生长激素(例如，人生长激素)、生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)、生长因子受体、酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解、类固醇激素生产酶(steriodogenic enzyme)、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经酰胺酶等)、受体(类固醇激素受体、肽受体)、结合蛋白(生长激素或生长因子结合蛋白等)、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白(例如，抑制血管生成的蛋白质)、结构蛋白(例如胶原、丝心蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白C、von Wilebrand因子、抗凝血酶III、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)或经修饰的因子VIII、抗凝剂等。在一个实施方案中，根据本发明的药学活性蛋白质是参与调节淋巴稳态(lymphoid homeostasis)的细胞因子，优选的是参与并优选地诱导或增强T细胞的发育、致敏、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是白介素，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21。
由开放阅读框编码的另一种合适的目的蛋白质是干扰素(IFN)信号传导的抑制剂。虽然已经报道了已经引入RNA用于表达的细胞的生存力可降低，特别是如果用RNA转染细胞多次的话，但发现IFN抑制剂增强RNA将被表达的细胞的生存力(WO 2014/071963 A1)。优选地，抑制剂是IFN I型信号传导的抑制剂。防止IFN受体被细胞外IFN接合并抑制细胞内的细胞内IFN信号传导允许细胞中RNA的稳定表达。作为替代或补充，防止IFN受体被细胞外IFN接合并抑制细胞内IFN信号传导增强细胞的存活，特别是如果用RNA重复转染细胞的话。不希望受理论束缚，考虑细胞内IFN信号传导可导致翻译的抑制和/或RNA降解。这可通过抑制一种或更多种IFN诱导型抗病毒活性效应蛋白来解决。IFN诱导型抗病毒活性效应蛋白可选自RNA依赖性蛋白激酶(RNA-dependent protein kinase，PKR)、2′，5′-寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase，OAS)和RNaseL。抑制细胞内IFN信号传导可包括抑制PKR依赖性途径和/或OAS依赖性途径。合适的目的蛋白质是能够抑制PKR依赖性途径和/或OAS依赖性途径的蛋白质。抑制PKR依赖性途径可包括抑制eIF2-α磷酸化。抑制PKR可包括用至少一种PKR抑制剂处理细胞。PKR抑制剂可以是PKR的病毒抑制剂。PKR的优选病毒抑制剂是痘苗病毒(vaccinia virus)E3。如果肽或蛋白质(例如E3、K3)要抑制细胞内IFN信号传导，则肽或蛋白质的细胞内表达是优选的。痘苗病毒E3是25kDa dsRNA结合蛋白(由基因E3L编码)，其结合并隔离dsRNA以阻止PKR和OAS的激活。E3可直接与PKR结合并抑制其活性，导致eIF2-α的磷酸化降低。IFN信号传导的另一些合适的抑制剂是单纯疱疹病毒ICP34.5、托斯卡纳病毒(Toscana virus)NS、家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒PK2和HCV NS34A。
在一个实施方案中，细胞内或细胞外IFN信号传导的抑制剂由复制子编码。复制子包含允许通过甲病毒复制酶进行复制的核酸序列元件，通常是CSE 1、CSE 2和CSE 4；并且优选地，还有允许产生亚基因组转录物的核酸序列元件，即亚基因组启动子，其通常包含CSE 3。复制子可另外包含一个或更多个如本文中所述的非多肽序列修饰的修饰，例如帽、聚(A)序列、密码子使用的适应。如果复制子上存在多个开放阅读框，则细胞内IFN信号传导的抑制剂可由它们中的任一种编码，任选地在或不在亚基因组启动子的控制下。在一个优选实施方案中，细胞内IFN信号传导的抑制剂由RNA复制子的最上游开放阅读框编码。当细胞内IFN信号传导的抑制剂由RNA复制子的最上游开放阅读框编码时，编码细胞内IFN信号传导抑制剂的遗传信息将在将RNA复制子引入到宿主细胞中之后早期翻译，并且所得蛋白质随后可抑制细胞内IFN信号传导。
由开放阅读框编码的另一种合适的目的蛋白质是功能性甲病毒非结构蛋白。术语“甲病毒非结构蛋白”包括甲病毒非结构蛋白的各种和每种共翻译或翻译后修饰形式，包括碳水化合物修饰(例如糖基化)和脂质修饰形式。
在一些实施方案中，术语“甲病毒非结构蛋白”是指甲病毒来源的任何一种或更多种单独的非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)，或者是指多蛋白，其包含甲病毒来源的多于一种的非结构蛋白的多肽序列。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP123和/或nsP4。在另一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP1234。在一个实施方案中，由开放阅读框编码的目的蛋白质由所有的nsP1、nsP2、nsP3和nsP4组成为单个的、任选可切割的多蛋白：nsP1234。在一个实施方案中，由开放阅读框编码的目的蛋白质由nsP1、nsP2和nsP3组成为单个的、任选可切割的多蛋白：nsP123。在该实施方案中，nsP4可以是另一种目的蛋白质，并且可由另一个开放阅读框编码。
在一些实施方案中，甲病毒非结构蛋白能够例如在宿主细胞中形成复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP123(与P123同义)和nsP4的复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP1、nsP2和nsP3的复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的复合物或缔合物。在一些实施方案中，“甲病毒非结构蛋白”是指选自nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的任何一种或更多种的复合物或缔合物。在一些实施方案中，甲病毒非结构蛋白至少包含nsP4。
术语“复合物”或“缔合物”是指在空间上接近的两个或更多个相同或不同的蛋白质分子。复合物的蛋白质优选彼此直接或间接物理或物理化学接触。复合物或缔合物可由多种不同的蛋白质(异多聚体)和/或一种特定蛋白质的多个拷贝(同多聚体)组成。在甲病毒非结构蛋白的情况下，术语“复合物或缔合物”描述了大量至少两种蛋白质分子，其中至少一种是甲病毒非结构蛋白。复合物或缔合物可由一种特定蛋白质的多个拷贝(同多聚体)和/或多种不同的蛋白质(异多聚体)组成。在多聚体的情况下，“多”意指多于一个，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个。
术语“功能性甲病毒非结构蛋白”包括具有复制酶功能的甲病毒非结构蛋白。因此，“功能性甲病毒非结构蛋白”包括甲病毒复制酶。“复制酶功能”包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的功能，即能够基于(+)链RNA模板催化(-)链RNA的合成的酶，和/或能够基于(-)链RNA模板催化(+)链RNA的合成的酶。因此，术语“功能性甲病毒非结构蛋白”可以指使用(+)链(例如基因组的)RNA作为模板合成(-)链RNA的蛋白质或复合物，使用基因组RNA的(-)链互补链作为模板合成新(+)链RNA的蛋白质或复合物，和/或使用基因组RNA的(-)链互补链的片段作为模板合成亚基因组转录物的蛋白质或复合物。功能性甲病毒非结构蛋白质可另外具有一种或更多种另外的功能，例如，蛋白酶(用于自切割)、解旋酶、末端腺苷转移酶(用于聚(A)尾添加)、甲基转移酶和鸟苷酸转移酶(guanylyl transferase)(用于提供具有5′帽的核酸)、核定位位点、三磷酸酶(Gould等，2010，Antiviral Res.，第87卷，第111至124页；Rupp等，2015，J.Gen.Virol.，第96卷，第2483至500页)。
根据本发明，术语“甲病毒复制酶”是指甲病毒RNA依赖性RNA聚合酶，其包括来自天然存在的甲病毒(在自然界中发现的甲病毒)的RNA依赖性RNA聚合酶和来自甲病毒的变体或衍生物(例如来自减毒的甲病毒)的RNA依赖性RNA聚合酶。在本发明的上下文中，除非上下文规定任何特定的复制酶不是甲病毒复制酶，否则术语“复制酶”和“甲病毒复制酶”可互换使用。
术语“复制酶”包括甲病毒复制酶的所有变体(特别是翻译后修饰变体、构象、同种型和同源物)，其由甲病毒感染的细胞表达或者其由已用编码甲病毒复制酶的核酸转染的细胞表达。此外，术语“复制酶”包括已通过或可通过重组方法产生的所有形式的复制酶。例如，可通过重组方法产生包含有助于在实验室中检测和/或纯化复制酶之标签(例如myc标签、HA标签或寡组氨酸标签(His标签))的复制酶。
任选地，甲病毒复制酶另外在功能上由与以下中的任一个或更多个结合的能力来进行限定：甲病毒保守序列元件1(CSE 1)或其互补序列、保守序列元件2(CSE 2)或其互补序列、保守序列元件3(CSE 3)或其互补序列、保守序列元件4(CSE 4)或其互补序列。优选地，复制酶能够与CSE 2[即与(+)链]和/或与CSE 4[即与(+)链]结合，或者能够与CSE 1的互补序列[即与(-)链]结合和/或与CSE 3的互补序列[即与(-)链]结合。
复制酶的来源不限于任何特定的甲病毒。在一个优选实施方案中，甲病毒复制酶包含来自塞姆利基森林病毒的非结构蛋白，所述塞姆利基森林病毒包括天然存在的塞姆利基森林病毒和塞姆利基森林病毒的变体或衍生物，例如减毒的塞姆利基森林病毒。在一个替代的优选实施方案中，甲病毒复制酶包含来自辛德毕斯病毒的非结构蛋白，所述辛德毕斯病毒包括天然存在的辛德毕斯病毒和辛德毕斯病毒的变体或衍生物，例如减毒的辛德毕斯病毒。在一个替代的优选实施方案中，甲病毒复制酶包含来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的非结构蛋白，所述委内瑞拉马脑炎病毒包括天然存在的VEEV和VEEV的变体或衍生物，例如减毒的VEEV。在一个替代的优选实施方案，甲病毒复制酶包含来自屈曲病毒(CHIKV)的非结构蛋白，所述屈曲病毒包括天然存在的CHIKV和CHIKV的变体或衍生物，例如减毒的CHIKV。
复制酶还可包含来自多于一种甲病毒的非结构蛋白。因此，包含甲病毒非结构蛋白并具有复制酶功能的异源复合物或缔合物同样包含在本发明中。仅用于举例说明目的，复制酶可包含来自第一甲病毒的一种或更多种非结构蛋白(例如nsP1、nsP2)和来自第二甲病毒的一种或更多种非结构蛋白(nsP3、nsP4)。来自多于一种的不同甲病毒的非结构蛋白可由单独的开放阅读框编码，或者可由单个开放阅读框编码为多蛋白，例如nsP1234。
在一些实施方案中，功能性甲病毒非结构蛋白能够在表达功能性甲病毒非结构蛋白的细胞中形成膜复制复合物和/或液泡(vacuole)。
如果功能性甲病毒非结构蛋白(即具有复制酶功能的甲病毒非结构蛋白)由根据本发明的核酸分子编码，则优选的是，复制子的亚基因组启动子(如果存在的话)与所述复制酶相容。在这种情况下，相容意味着甲病毒复制酶能够识别亚基因组启动子(如果存在的话)。在一个实施方案中，当亚基因组启动子对于得到复制酶的甲病毒是天然的(即这些序列的天然来源是相同的甲病毒)时实现了这一点。在一个替代实施方案中，亚基因组启动子对于得到甲病毒复制酶的甲病毒不是天然的，前提是甲病毒复制酶能够识别亚基因组启动子。换句话说，复制酶与亚基因组启动子相容(交叉病毒相容性)。关于来源于不同甲病毒的亚基因组启动子和复制酶的交叉病毒相容性的实例是本领域中已知的。亚基因启动子和复制酶的任何组合都是可能的，只要存在交叉病毒相容性即可。本领域技术人员可通过在适合于从亚基因组启动子合成RNA的条件下将待测试的复制酶与RNA一起孵育来容易地测试交叉病毒相容性，其中所述RNA具有待测试的亚基因组启动子。如果亚基因组转录物被制备，则确定亚基因组启动子与复制酶是相容的。交叉病毒相容性的多种实例是已知的(由Strauss&Strauss，Microbiol.Rev.，1994，第58卷，第491至562页进行的综述)。
在本发明中，编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框可在RNA复制子上提供，或者作为替代地，可作为单独的核酸分子(例如mRNA分子)提供。单独的mRNA分子可任选地包含例如帽、5′-UTR、3′-UTR、聚(A)序列和/或密码子使用的适应。如本文中所述，可反式提供单独的mRNA分子。
当在RNA复制子上提供编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框时，复制子可优选地被功能性甲病毒非结构蛋白复制。特别地，编码功能性甲病毒非结构蛋白的RNA复制子可由复制子编码的功能性甲病毒非结构蛋白复制。当没有反式提供编码功能性甲病毒非结构蛋白的核酸分子时，该实施方案是极为优选的。在该实施方案中，旨在实现复制子的顺式复制。在一个优选实施方案中，RNA复制子包含编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框以及编码目的蛋白质的至少一个另外的开放阅读框，并且可由功能性甲病毒非结构蛋白复制。
如果复制子上存在多个开放阅读框，则功能性甲病毒非结构蛋白可由它们中的任一个编码，任选地在或不在亚基因组启动子的控制下，优选地不在亚基因组启动子的控制下。在一个优选实施方案中，功能性甲病毒非结构蛋白由RNA复制子的最上游开放阅读框编码。当功能性甲病毒非结构蛋白由RNA复制子的最上游开放阅读框编码时，编码功能性甲病毒非结构蛋白的遗传信息将在将RNA复制子引入到宿主细胞中之后早期翻译，并且所得蛋白质随后可在宿主细胞中驱动复制，并任选地产生亚基因组转录物。
由复制子包含或由反式提供的单独核酸分子包含的编码功能性甲病毒非结构蛋白的开放阅读框的存在允许复制子复制，并且因此，任选地在亚基因组启动子的控制下，以高水平表达由复制子编码的目的基因。
RNA复制子适于表达编码目的肽或目的蛋白质的一种或更多种基因，任选地在亚基因组启动子的控制下。多种实施方案都是可能的。在RNA复制子上可存在一个或更多个开放阅读框，其各自编码目的肽或目的蛋白质。RNA复制子的最上游开放阅读框被称为“第一开放阅读框”。在一些实施方案中，所述“第一开放阅读框”是RNA复制子仅有的开放阅读框。任选地，一个或更多个另外的开放阅读框可存在于第一开放阅读框的下游。第一开放阅读框下游的一个或更多个另外的开放阅读框按照它们存在于第一开放阅读框的下游的顺序(5′到3′)可被称为“第二开放阅读框”、“第三开放阅读框”等。优选地，每个开放阅读框包含起始密码子(碱基三联体)，通常是AUG(在RNA分子中)，其对应于ATG(在相应的DNA分子中)。
如果复制子包含3′复制识别序列，则优选的是所有开放阅读框位于3′复制识别序列的上游。
当将包含一个或更多个开放阅读框的RNA复制子被引入到宿主细胞中时，复制子可直接用作用于翻译第一开放阅读框的模板。优选地，复制子包含5′-帽。这有助于直接从复制子表达由第一开放阅读框编码的基因。
在一些实施方案中，复制子的至少一个开放阅读框在亚基因组启动子(优选甲病毒亚基因组启动子)的控制下。甲病毒亚基因组启动子非常高效，并因此适合于高水平的异源基因表达。优选地，亚基因组启动子是甲病毒中亚基因组转录物的启动子。这意味着亚基因组启动子是甲病毒天然的并且优选地控制编码所述甲病毒中一种或更多种结构蛋白的开放阅读框之转录的启动子。或者，亚基因组启动子是甲病毒的亚基因组启动子的变体；任何在宿主细胞中发挥亚基因组RNA转录之启动子作用的变体都是合适的。如果复制子包含亚基因组启动子，则优选的是复制子包含保守序列元件3(CSE 3)或其变体。
优选地，所述在亚基因组启动子控制下的至少一个开放阅读框位于亚基因组启动子的下游。优选地，亚基因组启动子控制包含开放阅读框之转录物的亚基因组RNA的产生。
在一些实施方案中，第一开放阅读框在亚基因组启动子的控制下。当第一开放阅读框处于亚基因组启动子控制下时，其定位类似于编码甲病毒基因组中结构蛋白的开放阅读框的定位。当第一开放阅读框处于亚基因组启动子控制下时，优选的是由第一开放阅读框编码的基因可从复制子以及其亚基因组转录物(在存在功能性甲病毒非结构蛋白的情况下为后者)二者表达。各自在亚基因组启动子控制下的一个或更多个另外的开放阅读框可存在于亚基因组启动子控制下的第一开放阅读框的下游。由一个或更多个另外的开放阅读框(例如由第二开放阅读框)编码的基因可从一个或更多个亚基因组转录物翻译，其各自在亚基因组启动子的控制下。例如，RNA复制子可包含控制编码第二目的蛋白质之转录物的产生的亚基因组启动子。
在另一些实施方案中，第一开放阅读框不在亚基因组启动子的控制下。当第一开放阅读框不在亚基因组启动子控制下时，可从复制子表达由第一开放阅读框编码的基因。各自在亚基因组启动子控制下的一个或更多个另外的开放阅读框可存在于第一开放阅读框的下游。可从亚基因组转录物表达由所述一个或更多个另外的开放阅读框编码的基因。
在包含根据本发明的复制子的细胞中，复制子可通过功能性甲病毒非结构蛋白扩增。另外，如果复制子包含在亚基因组启动子控制下的一个或更多个开放阅读框，则预期将由功能性甲病毒非结构蛋白来制备一个或更多个亚基因组转录物。功能性甲病毒非结构蛋白可反式提供，或者可由复制子的开放阅读框编码。
如果复制子包含多于一个编码目的蛋白质的开放阅读框，则优选的是，每个开放阅读框编码不同的蛋白质，例如不同的药学活性肽或蛋白质。例如，由第二开放阅读框编码的蛋白质与由第一开放阅读框编码的蛋白质不同。
在一些实施方案中，由第一和/或另外的开放阅读框(优选由第一开放阅读框)编码的目的蛋白质是功能性甲病毒非结构蛋白或IFN信号传导的抑制剂，例如E3。在一些实施方案中，由第一和/或另外的开放阅读框(例如由第二开放阅读框)编码的目的蛋白质是药学活性肽或蛋白质，或者报道蛋白。
在一个实施方案中，由第一开放阅读框编码的目的蛋白质是功能性甲病毒非结构蛋白。在该实施方案中，复制子优选地包含5′-帽。特别地当由第一开放阅读框编码的目的蛋白质是功能性甲病毒非结构蛋白，并且优选地当复制子包含5′-帽时，编码功能性甲病毒非结构蛋白的核酸序列可高效地从复制子翻译，并且所得蛋白质随后可驱动复制子的复制并驱动亚基因组转录物的合成。当编码功能性甲病毒非结构蛋白的另外的核酸分子未被使用或者未与复制子一起存在时，该实施方案可以是优选的。在该实施方案中，旨在实现复制子的顺式复制。
可施用本文中所述的组合物用于治疗例如本文中所述的那些疾病，例如与由施用的RNA所编码的抗原相关的疾病。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常病症。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由来源于外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者可由内部功能障碍(例如自身免疫病)引起。在人中，“疾病”通常更广泛地用于指造成患病个体疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡，或者对与该个体接触的那些人造成类似问题的任何病症。在这个更广泛的意义上，其有时包括损伤、残疾、障碍、综合征、感染、孤立症状(isolatedsymptom)、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下以及用于另一些目的时，这些可被认为是可区分的类别。疾病通常不仅影响个体的身体，而且影响其情绪，因为具有并伴随许多疾病生活可改变人的对生活的观点和人的性格。
术语“与抗原相关的疾病”或“涉及抗原的疾病”是指涉及抗原的任何疾病，例如以抗原的存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是感染性疾病、自身免疫病或癌症疾病或简单地癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。
术语“感染性疾病”是指可从个体传播至到个体或从生物体传播至生物体的任何疾病，并且由微生物剂引起(例如普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生虫引起。就这一点而言，感染性疾病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感、流行性感冒、动物疾病(例如口蹄疫、小反刍动物瘟疫(Peste de petits ruminant)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus))或寄生虫病(例如锥虫病(Chagas)、疟疾等)。
术语“自身免疫病”是指身体对其自身组织的某一成分产生免疫原性(即免疫系统)应答的任何疾病。换句话说，免疫系统失去了其识别体内某一组织或系统为自身的能力，并且将其作为靶标并进行攻击，就好像其为外来的一样。自身免疫病可分为主要影响一个器官的那些(例如溶血性贫血和抗免疫甲状腺炎)，以及自身免疫病过程通过许多组织扩散的那些(例如系统性红斑狼疮)。例如，多发性硬化被认为是由T细胞攻击围绕脑和脊髓神经纤维的鞘引起的。这导致协调性丧失、虚弱和视力模糊。自身免疫病是本领域中已知的，并且包括例如桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、格雷夫斯病(Grave′sdisease)、狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫甲状腺炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻(celiac disease)、克罗恩病(Crohn′s disease)、结肠炎、糖尿病、硬皮病、银屑病等。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌、脊髓轴肿瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包含癌症转移。
术语“免疫应答”涉及免疫系统例如对于免疫原性生物体(例如细菌或病毒)、细胞或物质的反应。术语“免疫应答”包括固有免疫应答和适应性免疫应答。优选地，免疫应答与免疫细胞的激活、细胞因子生物合成的诱导和/或抗体产生相关。
优选的是，由本发明的组合物诱导的免疫应答包括以下步骤：激活抗原呈递细胞(例如树突细胞和/或巨噬细胞)，通过所述抗原呈递细胞呈递抗原或其片段，以及由于这种呈递而激活细胞毒性T细胞。
术语“免疫细胞”是指参与保卫个体身体的免疫系统的细胞。术语“免疫细胞”涵盖特定类型的免疫细胞及其前体，包括白细胞，白细胞包括巨噬细胞、单核细胞(巨噬细胞的前体)、粒细胞(例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、树突细胞、肥大细胞和淋巴细胞(例如B细胞、T细胞和自然杀伤(natural killer，NK)细胞)。巨噬细胞、单核细胞(巨噬细胞的前体)、中性粒细胞、树突细胞和肥大细胞是吞噬细胞。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病或病症。设计用于引发或增强免疫应答的免疫治疗被归类为激活免疫治疗，而降低或抑制免疫应答的免疫治疗被归类为抑制免疫治疗。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种，或者肿瘤免疫接种或肿瘤疫苗接种。术语“免疫治疗”还涉及免疫应答的操纵，使得在自身免疫病(例如风湿性关节炎)、变态反应、糖尿病或多发性硬化的情况下，将不适当的免疫应答调节成更适当的免疫应答。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了为了诱导免疫应答而向个体施用抗原的过程，例如出于治疗或预防的原因。
术语“治疗性治疗”或简单地“治疗”涉及改善个体健康状况和/或延长(提高)其寿命的任何治疗。所述治疗可在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发生、在个体中抑制或减缓疾病的发生、在个体中降低症状的频率或严重程度、和/或在目前患有或先前曾患有疾病的个体中降低复发。
术语“预防性治疗”或“预防性治疗”涉及旨在在个体中预防疾病发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防性治疗”在本文中可互换使用。
术语“保护”、“预防”、“预防性”、“预防的”或“保护性”涉及在个体中预防和/或治疗疾病(例如肿瘤)的发生和/或传播。例如，预防性施用免疫治疗，例如通过施用本发明的组合物，可保护接受个体免于肿瘤的发生。例如，治疗性施用免疫治疗(例如通过施用本发明的组合物)可阻止疾病的发生，例如导致抑制肿瘤的进展/生长。这包括肿瘤进展/生长的减速，特别是肿瘤进展的破坏，其优选地导致肿瘤的消除。治疗性施用免疫治疗可保护个体例如免于现有肿瘤的播散或转移。
术语“个体”或“对象”涉及脊椎动物，特别是哺乳动物。例如，在本发明上下文中的哺乳动物是人、非人灵长类、驯养的哺乳动物(例如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等)、实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)，以及圈养动物(例如动物园的动物)。术语“对象”还涉及非哺乳类脊椎动物，例如鸟类(特别是驯养的鸟类，例如鸡、鸭、鹅、火鸡)，并且涉及鱼类(特别是养殖鱼类，例如鲑鱼或鲶鱼)。本文中使用的术语“动物”还包括人。
可以以任何合适的药物组合物的形式施用例如本文中所述的聚合复合物颗粒的药剂。术语“药物组合物”涉及包含治疗有效的药剂或其盐(优选地连同药物赋形剂(例如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂))的制剂。所述药物组合物用于通过向个体施用所述药物组合物来治疗、预防疾病或病症或者降低其严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。药物组合物可局部或全身施用。在本发明的上下文中，药物组合物包含本文中所述的颗粒。
术语“全身施用”是指施用治疗有效药剂使得该药剂变得以显著的量广泛分布于个体体内并发生生物学作用。根据本发明，优选通过肠胃外施用进行施用。
术语“肠胃外施用”是指施用治疗有效药剂以使该药剂不通过肠。术语“肠胃外施用”包括静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用，但不限于此。
在一个特别优选的实施方案中，将根据本发明的组合物施用于肌肉组织，例如骨骼肌。因此，肌内施用(例如通过肌内注射)是优选的施用途径。
施用可以以多种方式来实现。在一个实施方案中，根据本发明的组合物通过注射来施用。在一个优选实施方案中，注射是通过针来进行的。可使用无针注射作为替代方案。
本发明的药物组合物可包含至少一种佐剂。术语“佐剂”涉及这样的化合物，当将其与抗原或抗原肽组合施用于个体时，延长或增强或加速免疫应答。据推断，佐剂通过一种或更多种机理发挥其生物活性，所述机理包括增大抗原的表面、延长抗原在体内的保留、延迟抗原释放、使抗原靶向巨噬细胞、提高抗原的摄取、增强抗原加工、刺激细胞因子释放、刺激和激活免疫细胞(例如B细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞)以及非特异性激活免疫细胞。佐剂包含化合物的异质组，例如油乳剂(例如弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿质化合物(例如矾(alum))、细菌产物(例如百日咳包特菌(Bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括皂苷、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、生育酚或矾，但不限于此。
根据本发明的药物组合物通常以“药学有效量”并在“可药用制剂”中施用。
术语“药学有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望反应或期望作用的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病的进程。这包括减慢疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中期望的反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发作或者预防其发作。本文中所述的组合物的有效量将取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型大小和体重)、治疗持续时间、伴随治疗(如果存在的话)的类型、具体的施用途径和类似因素。因此，本文中所述组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可使用更高剂量(或通过不同的更局部的施用途径来实现有效地更高剂量)。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
本发明的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂、载体和任选的其他治疗剂。优选地，本发明的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
术语“赋形剂”旨在表示药物组合物中不是活性成分的所有物质，例如黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或稀释剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬液和/或混合介质中的任意一种或更多种。
术语“载体”涉及适合于向人施用的一种或更多种相容性固体或液体填充剂或稀释剂。术语“载体”涉及天然或合成的有机或无机组分，其与活性组分结合以促进活性组分的应用。优选地，载体组分是无菌液体(例如水或油)，其包括来源于矿物油、动物或植物(例如花生油、大豆油、芝麻油、向日葵油等)的那些无菌液体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用作水性载体化合物。
用于治疗用途的可药用载体或稀释剂在制药领域中是公知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaro编辑1985)中。合适的载体的实例包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。合适稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
可针对预期的施用途径和标准药学实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。本发明的药物组合物可作为载体、赋形剂或稀释剂包含或者除了载体、赋形剂或稀释剂外还包含：任何合适的黏合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或增溶剂。合适黏合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(例如阿拉伯树胶、西黄蓍胶)或藻酸钠、羧甲基纤维素以及聚乙二醇。合适润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至矫味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。还可使用抗氧化剂和助悬剂。
在一个实施方案中，组合物是水性组合物。水性组合物可任选地包含溶质，例如盐。在一个实施方案中，组合物为冻干组合物的形式。冻干组合物可通过冷冻干燥相应的水性组合物而获得。
本文中提供的药剂和组合物可单独使用或与其他治疗方案(例如外科手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或无关的))组合使用。
通过附图和实施例详细描述和举例说明本发明，这些附图和实施例仅用于说明性目的而并不意在是限制性的。由于本说明书和实施例，技术人员可获得同样包含在本发明中的另一些实施方案。
实施例
实施例1：聚合复合物的体外毒性
材料和方法
In vivo-jetPEITM试剂(Cat.#201-50G)购自Polyplus-Transfection(Illkirch，France)。In vivo-jetPEITM在无菌无热原水中以150mM(表示为氮残余物的浓度)提供。将JetPEI在HEPES 10mM，pH 7.1，葡萄糖5％(HBG×1)缓冲液中稀释至期望的浓度(表示为氮残余物的浓度)。
体外细胞毒性测定
将HEK-293细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种在96孔板(平底)中。将细胞维持在37℃和7.5％CO2下。24小时之后，将上清液弃去并替换为50μL的DMEM培养基(+10％FCS)。将PEI在含有10％FCS的RPMI培养基中稀释(1∶5)并预孵育约15分钟。然后将50μl的PEI溶液添加到细胞至最终培养基体积为100μl。在另外18小时之后，根据操作说明书进行XTT-测定(XTT Cell Viability Kit#9095，New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)。使用以下的S形方程(sigmoidal equation)拟合作为PEI浓度之函数的细胞死亡数据：
图1A示出了游离的纯PEI对体外HEK-293细胞的毒性。IC50＝77μM氮(游离)。图1B示出了PEI/复制子-RNA聚合复合物对体外HEK-293细胞的毒性。IC50＝542μM氮(聚合复合物制剂)。
结果和结论
游离PEI在氮浓度高于18μM时导致细胞死亡(图1A)。为了避免毒性问题，细胞培养基中游离PEI的终浓度应低于上述限值。
聚合复合物比游离PEI引起更少的细胞死亡，但当PEI浓度提高时其毒性也提高(图1B)。添加聚合复合物之后的细胞死亡可使用以下方程来计算：
细胞死亡％＝21.13+78.59/(1+10^((-0.27-log(浓度))*3.13))
对于N/P为11.6的聚合复合物(RNA浓度为10mg/l，PEI＝348μM)，细胞死亡为36.8％，而对于N/P为15.8的聚合复合物，细胞死亡为52.3％。
实施例2：聚合复合物的稳定性研究
材料和方法
使用来自实施例1的In vivo-jetPEITM试剂。编码萤光素酶的RNA Construct D1-824 Replicon，ID R076 1由RNA Biochemistry unit(BioNTech RNA PharmaceuticalsGmbH，Mainz，Germany)提供。
聚合复合物的制备
在制备之前，将in-vivo jetPEITM和糖溶液在室温下平衡。使用无菌糖溶液在层流罩(laminar flow hood)中进行in-vivo jetPEITM/RNA复合物的制备(表1)。制剂中糖的终浓度为5％至10％w/v。
所有制剂都是在RNA浓度为250mg/l且N/P比为11.6下制备的。
制备步骤是：
1.使用浓缩糖缓冲液(HBG×2、MBG×2或HBT×2)稀释RNA以制备最终体积的1/2的溶液。施加温和的涡旋。
2.使用相同的糖缓冲液和无菌水稀释in-vivo jetPEITM试剂以制备最终体积的3/5的溶液。施加温和的涡旋。
3.将来自经稀释的in-vivo jetPEITM的一半体积一次性迅速添加至经稀释的RNA中，并施加温和的涡旋。
4.将聚合复合物在室温下孵育15至20分钟，并随后转移至适当的储存条件。
表1用于制备和储存聚合复合物的介质
| # | 介质 | 缩写 |
| 1 | 葡萄糖5％，HEPES10mM，pH 7.1 | HBG×1 |
| 2 | 海藻糖10％，HEPES10mM，pH 7.1 | HBT×1 |
| 3 | 海藻糖10％，HEPES 2.8mM和EDTA 80μM，pH 7.1 | HBT×1+EDTA |
| 4 | 葡萄糖10％，HEPES 20mM，pH 7.1 | HBG×2 |
| 5 | 海藻糖20％，HEPES 20mM，pH 7.1 | HBT×2 |
聚合复合物的冻干
将制剂置于台式歧管冷冻干燥机Epsilon 2-4 LSCplus(Martin ChristGefriertrocknungsanlagen GmbH，Osterode，Germany)中。
将样品在1ATM下冷冻至-40℃(～2℃/分钟)。花费60至90分钟。
在-40℃下将压力降至0.2ATM，持续10分钟。
将样品在0.2ATM和-40℃下干燥4小时。
将样品在0.2ATM下加热至-16℃持续2小时(渐变(ramp))。
将样品在-16℃和0.2ATM下继续干燥4小时。
在-16℃下将压力降至0.01ATM，持续10分钟。
将样品在-16℃和0.01ATM下继续干燥4小时。
将样品在0.01ATM下加热至20℃持续2小时(渐变)。
将样品在20℃和0.01ATM下继续干燥8小时。
从聚合复合物的RNA释放
根据表2制备12个具有90μl样品的试管。
表2.用于RNA完整性和浓度测量的样品制备物
| # | 描述 |
| 1 | 在RT下储存的HBG中的聚合复合物 |
| 2 | 在4℃下储存的HBG中的聚合复合物 |
| 3 | 在-20℃下储存的HBG中的聚合复合物 |
| 4 | 在RT下储存的HBT中的聚合复合物 |
| 5 | 在4℃下储存的HBT中的聚合复合物 |
| 6 | 在-20℃下储存的HBT中的聚合复合物 |
| 7 | 在4℃下储存的HBT中的冻干聚合复合物 |
| 8 | HBG×1中的游离RNA 250mg/l |
| 9 | HBG×1中的游离RNA 125mg/l |
| 10 | HBG×1中的游离RNA 63mg/l |
| 11 | HBG×1中的游离RNA 31mg/l |
| 12 | HBG×1 |
向每个管添加10μL在500mM NaCl中的50g/l肝素。在30℃下将混合物在涡旋机中以300rpm的摇动速度孵育20分钟。
RNA完整性
将5μl释放的RNA用于生物分析仪测量。将RNA与5μl甲酰胺混合。使用Agilent2100生物分析仪仪器进行RNA完整性定量。将Agilent RNA 6000 Nano试剂盒在室温下平衡30分钟。将“纳米凝胶基质(Nano Gel Matrix)”400μl以1500g离心10分钟。将65μL上清液与1μL充分涡旋的“纳米染料浓缩物(Nano Dye Concentrate)”混合，并以15000g离心10分钟，以获得“凝胶-染料-混合物(Gel-Dye-Mix)”。通过在70℃下加热10分钟使制备的样品变性，并且在相同温度下将“纳米梯状物(Nano Ladder)”也加热2分钟。使用“灌注站(PrimingStation)”通过将9μL“凝胶-染料-混合物”添加到标记的G位置中并对芯片加压30秒对芯片进行灌注。然后将9μL“凝胶-染料-混合物”添加到其他两个G位置中。将7.5μL“标记物(Marker)”添加到梯状物位置中，并将5μL添加到每个样品位置中。将变性的“纳米梯状物”(1.5μL)添加到梯状物位置，然后将1μL样品添加到所有12个样品孔中(向未使用的孔中添加1μL H2O)。将芯片置于IKA涡旋机上并以2000rpm施加涡旋1分钟。在仪器中测量该芯片，并以47至57秒检测复制子RNA峰。通过选择复制子RNA区域使用Smear分析在Expert 2100软件中计算RNA完整性。
使用以下方程计算相对RNA完整性％：
体外转染测定
将C2C12细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种在96孔板(平底)中。将细胞维持在37℃和7.5％CO2下。24小时之后，将上清液弃去并替换为50μL DMEM培养基(+10％FCS)。将聚合复合物在含有10％FCS的DMEM培养基中稀释(1∶5)并预孵育约15分钟。然后将50μl的聚合复合物溶液添加至细胞至最终培养基体积为100μl。在另外48小时之后，根据操作说明书进行Bright-GloTM萤光素酶测定(Cat.#E2610，Promega GmbH，Mannheim，Germany)。
使用以下方程计算相对发光％：
图2示出了在不同储存条件下储存1周之后，与PEI/复制子-RNA聚合复合物(N/P为11.6)孵育之后来自C2C12肌细胞的相对发光。
图3示出了在不同储存条件下储存2周之后，PEI/复制子-RNA聚合复合物(N/P为11.6)的相对RNA完整性。
结果和结论
聚合复合物在液态(4℃和25℃)下具有差的储存稳定性。在固态(冷冻或冻干)下聚合复合物的稳定性显著优于在液态下。固态下HBT+EDTA缓冲剂中聚合复合物的储存稳定性显著优于在HBG×1缓冲液中的储存稳定性。
对于HBT+EDTA中的聚合复合物，固态长储存稳定性是可能的，而对于HBG×1中的聚合复合物，液态长储存稳定性是不太可能的。
具有复制子-RNA的聚合复合物制剂可通过添加以下来稳定化：海藻糖5％至20％(w/v)，EDTA 80μM至5mM。
实施例3：线型PEI的Mw计算的描述
线型PEI在以下两个步骤中从2-乙基-2-唑啉合成：首先，在存在引发剂的情况下，通过2-乙基-2-唑啉的开环异构化聚合获得聚(2-乙基-2-唑啉)(图4)。然后，将PEOX(N-丙酰基-PEI)酸水解以裂解掉N-丙酰基以产生PEI(图5)。
分子量为50kDa的PEOX(N-丙酰基-PEI)的完全脱酰基产生分子量为22kDa的线型PEI。利用折射率检测器或多角度光散射检测器通过凝胶渗透色谱来进行中间产物(PEOX)分子量的确定。完格的技术细节描述于Adib，Abdennaji，Fabrice Stock和PatrickErbacher.″Method for Manufacturing Linear Polyethylenimine(PEI)forTransfection Purpose and Linear PEI Obtained with Such Method.″美国专利申请No.12/671，312中。
根据本发明，由MW为40至60kDa的PEOX合成的PEI是用于复制子-RNA的强效转染试剂。
根据本发明使用的PEI可购自Polyplus-Transfection SA(Illkirch-Graffenstaden，France)：in-vivo JetPEI，Polysciences Europe GmbH(Eppelheim，Germany)：PEI MAX 40000和Euromedex(Souffelweyersheim，France)：Exgen 500。
实施例4：聚合复合物的聚集动力学
材料和方法
如先前在实施例2中所述，在RNA浓度为200mg/L时，在HBG×1中制备聚合复合物。将其在HBG×1和磷酸缓冲盐水pH 7.4(PBS)中稀释至RNA浓度为10mg/l。使用PBS以提高溶液的离子强度。通过经过滤的空气清洁96孔板，然后将经稀释的聚合复合物添加至板。通过来自WYATT technology GmbH(Dembach，Germany)的DynaPro板阅读仪II仪器测量尺寸。单峰样品(monomodal sample)的尺寸计算使用累积量拟合，而多峰样品(multimodalsample)使用正则化拟合(regularization fit)。
图6示出了在递增的盐浓度下具有JetPEI的IVT(A)和复制子(B)聚合复合物的聚集动力学。
结果和结论
高离子强度导致聚合复合物的尺寸提高(图6)。聚合复合物制剂的离子强度必须≤20mM，以防止聚合复合物的聚集。
实施例5：通过过滤对聚合复合物进行灭菌
材料和方法
如先前在“聚合复合物的稳定性研究”部分中所述的，在RNA浓度为100mg/L且N/P比为11.5、13.5和15.5下制备聚合复合物。
RNA浓度和完整性
通过与肝素一起孵育从聚合复合物中释放RNA。将90μl游离RNA(100mg/l)或聚合复合物与在10μl在Hepes 10mM，pH 7.4，EDTA 1mM中的肝素20μg/l混合。将混合物在涡旋机中在30℃下孵育20分钟。将5μl的该混合物与5μl的甲酰胺混合。接下来，通过具有微微芯片(pico-chip)的生物分析仪测量RNA完整性。如实施例2中所述计算RNA完整性。根据高灵敏度方法的制造商说明书，通过Ribogreen测定用“Quant-iT RiboGreen RNA试剂和试剂盒”(Cat.#R11490，Thermo Fischer Scientific)测量RNA浓度。简单地说，将聚合复合物与肝素的混合物与在Tris 10mM，pH 7.5，EDTA 1mM缓冲液中的Ribogreen荧光团一起孵育。在485nm的激发波长和535nm的发射下测量Ribogreen的荧光。
PEI浓度
制备CuSO423mg(无水)在100ml乙酸钠0.1M，pH 5.4中的溶液(CSS试剂)。将CSS试剂600μl与聚合复合物混合，并在环境温度下孵育5分钟。使用1cm比色皿，使用UV分光光度计在285nm处测量每种溶液相对于空白的吸收。制备具有已知PEI浓度(0至1.55mM)的校正曲线，并将其用于计算未知样品中的PEI浓度。从所有样品中减去游离RNA的背景吸收。
电泳迁移率(μ)的测量
将聚合复合物在3.1ml HBG×1中稀释至RNA浓度为20mg/l。然后将其在600g下离心2分钟。在塑料比色皿中制备每种制剂的三个1.05ml的样品。用ζ-Wallis仪器(Corduantechnologies，France)通过激光多普勒电泳测量聚合复合物的电泳迁移率。每个样品使用具有1个10次运行的序列的中等分辨率测量。从最终分析中排除具有低信噪比或极端μ(＞3或＜-3μm*cm/V*S)的测量。一式三份测量所有制剂。
聚合复合物的过滤
制备具有2.68ml的三种不同N/P比的聚合复合物的三个管。将聚合复合物(1.34ml)通过具有220nm孔的无菌Millex-GP Med针筒式滤器装置(Cat.#SLMPL25SS，MerckMillipore)过滤。在过滤之前和之后测量物理化学性质。
图7示出了在过滤之前(制备的)和之后(经过滤的)的聚合复合物的物理化学参数。A和B，通过肝素从聚合复合物中释放RNA。然后用生物分析仪仪器通过毛细管电泳测量复制子-RNA完整性(A)。通过Ribogreen荧光测量复制子-RNA浓度(B)。C，通过CuSO4测定测量PEI浓度。D，通过激光多普勒电泳测量电泳迁移率(μ)。
结果和结论
针筒式滤器装置是用于聚合复合物灭菌的合适方法。聚合复合物必须小(＜120nm)，以便通过过滤对其进行灭菌。在N/P比为11.6时，聚合复合物的物理化学性质不会因过滤而改变。然后当N/P比提高到高于11.6时，则过滤期间RNA有损失。
实施例6：PEI纯度对复制子-RNA/PEI制剂转染的影响
材料和方法
以下高纯度PEI购自Polyplus-Transfection SA(Illkirch-Graffenstaden，France)：in-vivo JetPEI，以及购自Polysciences Europe GmbH(Eppelheim，Germany)：PEI MAX 40000。
以下常规纯度PEI购自Polysciences Europe GmbH(Eppelheim，Germany)：PEI25000。
如先前在实施例2中所述，在RNA浓度为100mg/L下在HBG×1中制备聚合复合物。
体内转染
将小鼠用异氟烷麻醉，并将后肢的后侧剃毛并用70％EtOH溶液消毒。将20μl所研究制剂用预先配备有30G大小的套管的胰岛素注射器注射到胫骨后肌中。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。
在测量当天，用萤光素溶液i.p.注射小鼠。随后，将小鼠用异氟烷麻醉并置于Spectrum(Perkin Elmer)成像室内的加热垫(37℃)上，通过单独的麻醉面罩恒定供应异氟烷/氧气。注射萤光素之后5分钟，进行通过照相机检测生物发光一分钟。使用软件“LivingImage”(Perkin Elmer)分析所得图像。
图8示出了高纯度PEI和常规纯度PEI的化学结构的比较。对于25kDa的PEI，n＝58。PEI 25kD中-CH2CH2NH-单体的平均数目为581，这也是潜在可质子化氮的连续段的长度。假设在常规PEI25中N-丙酰基部分均一分布，其可质子化的氮的连续段仅为64。
图9示出了通过使用不同纯度水平的PEI制备的不同N/P比的复制子-RNA聚合复合物体外转染C2C12肌细胞。
根据图10，用高纯度PEI(jetPEI)和常规纯度PEI(25kDa)制备N/P比为1(-)和11.6(+)的复制子-RNA聚合复合物。游离RNA用作对照。将制剂i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
结果和结论
使用高纯度PEI制备的聚合复合物在体外比常规纯度PEI更好地转染肌细胞。i.m.注射后，在N/P为11.6时聚合复合物具有最高的体内转染效力。
与游离复制子-RNA相比，N/P为11.6的高纯度PEI的阳离子聚合复合物可显著更好地(4至5倍差异)转染体内肌肉组织。
与游离复制子-RNA相比，N/P为1的高纯度PEI的阴离子聚合复合物、N/P为1的常规纯度PEI的聚合复合物和N/P为11.6的常规纯PEI的阳离子聚合复合物更差地转染肌肉组织。
实施例7：来自不同供应商和冻干聚合复合物的纯PEI的复制子-RNA的高转染效力
材料和方法
以下高纯度PEI购自Polyplus-Transfection SA(Illkirch-Graffenstaden，France)：in-vivo JetPEI；以及购自Euromedex(Souffelweyersheim，France)：Exgen 500；以及购自Polysciences Europe GmbH(Eppelheim，Germany)：PEI MAX 40000。
如先前在实施例2中所述，在RNA浓度为100mg/L下在HBG×1中制备聚合复合物。除了冻干制剂在HBT×1缓冲液中制备之外，所有制剂在HBG×1缓冲液中制备。如先前在实施例2中所述，进行在HBT×1缓冲液中的聚合复合物的冻干。如先前在实施例6中所述的，将制剂i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢，并记录来自小鼠肌肉的发光信号。
对于图11的实验，用以下高纯度PEI制备N/P比为7.7和11.6的复合子-RNA聚合复合物：jetPEI(来自Polyplus)、PEI-MaX 40000(来自Polyscience)和Exgen 500(来自Eurodamex)。
表3.用于图11中制剂之间差异的统计显著性(P值)的双尾Mann Whitney检验。
| 假设 | 天数 | P值 |
| 新鲜的JetPEI与PEI MAX 40000N/P 11.6不同 | 4 | 0.474 |
| 新鲜的JetPEI与Exgen N/P 7.7不同 | 4 | 0.065 |
| 新鲜的JetPEI与冻干的JetPEI不同 | 4 | 0.387 |
| 新鲜的JetPEI与PEI MAX 40000N/P 11.6不同 | 7 | 0.180 |
| 新鲜的JetPEI与Exgen N/P 7.7不同 | 7 | 0.009* |
| 新鲜的JetPEI与冻干的JetPEI不同 | 7 | 0.065 |
| 新鲜的JetPEI与PEI MAX 40000N/P 11.6不同 | 10 | 0.132 |
| 新鲜的JetPEI与Exgen N/P 7.7不同 | 10 | 0.788 |
| 新鲜的JetPEI与冻干的JetPEI不同 | 10 | 0.093 |
| 新鲜的JetPEI与PEI MAX 40000N/P 11.6不同 | 4至10 | 0.7 |
| 新鲜的JetPEI与Exgen N/P 7.7不同 | 4至10 | 0.7 |
| 新鲜的JetPEI与冻干的JetPEI不同 | 4至10 | 0.7 |
图12示出了用不同缓冲剂制备的N/P为11.6的JetPEI/复制子-RNA聚合复合物的冻干饼。
结果和结论
在i.m注射之后复制子-RNA的聚合复合物高效地转染肌肉组织(图11)。以下高纯度PEI可用于制备聚合复合物：jetPEI(来自Polyplus)、PEI-Max 40000(来自Polyscience)和Exgen 500(来自Eurodamex)。N/P为7.7下Exgen-500聚合复合物的转染优于N/P为11.6下。
海藻糖中的聚合复合物的冻干物(lyophilizate)具有饼样形态，而在葡萄糖中，冻干物塌陷，并且难以将其溶解在水中(图12)。
对于聚合复合物的冻干，海藻糖优于葡萄糖。冻干的聚合复合物在体内的表现类似于新鲜制备的液体-聚合复合物。
实施例8：通过纯PEI聚合复合物用IVT-RNA转染肌细胞
材料和方法
In vivo-jetPEITM试剂(Cat.#201-50G)购自Polyplus-Transfection(Illkirch，France)。编码萤光素酶的体外转录(IVT)mRNA构建体pSTI-475由RNA Biochemistry unit(Biontech RNA Pharmaceuticals，Mainz，Germany)提供。
如先前在实施例2中所述制备IVT-RNA和PEI的聚合复合物。通过保持RNA浓度恒定并提高PEI浓度制备不同的N/P比。
如先前在实施例2中所述进行体外肌细胞的转染。
如先前在实施例6中所述进行体内转染研究。
根据图13，通过编码萤光素酶的IVT-RNA体外转染C2C12肌细胞。在HBP×1缓冲液中将RNA与JetPEI以不同N/P比复合。在转染之后24小时测量发光信号。
根据图14，在HBG×1缓冲液中用纯PEI制备N/P比为5.8和11.6的IVT-RNA聚合复合物。HBG×1缓冲液中的游离IVT-RNA用作对照。将制剂以每次注射2至8μg的RNA剂量i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。在注射之后6小时记录来自小鼠肌肉的发光信号。
结果和结论
IVT-RNA和高纯度PEI的聚合复合物可高效地在体外转染肌细胞。转染效率于N/P比之间存在正相关(图13)。游离IVT-RNA在体外不转染细胞。
与游离的IVT-RNA相比，具有高度纯度PEI的N/P比为5.8和11.6的聚合复合物在体内转染肌肉组织显著更差(图14)。
实施例9：颗粒尺寸和制备条件对复制子-RNA聚合复合物转染的影响
材料和方法
如先前在实施例2中所述制备复制子-RNA和PEI的聚合复合物。以如下5种不同的RNA制备聚合复合物：100、250、500、750、1000mg/l。适当提高PEI浓度以使所有制剂的N/P比保持在11.6。
如先前在实施例4中所述测量聚合复合物的尺寸。
如先前在实施例2中所述进行体外肌细胞转染。
如先前在实施例6中所述进行体内转染研究。
根据图15，在HBG×1缓冲液中以不同的RNA浓度制备N/P比11.6的复制子-RNA和jetPEI的聚合复合物。对于通过DLS的尺寸测量，将聚合复合物稀释至RNA浓度为10mg/l。
根据图16，通过来自图16的聚合复合物体外转染C2C12肌细胞。转染之后24小时测量发光信号。
根据图17，在HBG×1缓冲液中以如图16中所示的不同RNA浓度用纯PEI制备N/P比为11.6的Rep-RNA聚合复合物。将制剂以每次注射2至8μg的RNA剂量i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
结果和结论
-聚合复合物是用于复制子-RNA的良好转染剂。就肌肉组织中的RNA翻译效率而言，聚合复合物的生物活性不受聚合复合物形成时的RNA浓度(0.1至1g/l)的影响。
-60至200nm的聚合复合物尺寸对聚合复合物的体外和体内转染效力没有影响(i.m.注射)。
实施例10：不同聚合复合物在s.c.或i.m注射到小鼠中之后表现不同
材料和方法
In vivo-jetPEITM试剂(Cat.#201-50G)购自Polyplus-Transfection SA(Illkirch，France)。线型PEI 22kDa由Cheradame教授(Polytheragene，EVRY cedex，France)提供。编码萤光素酶的RNA(构建体D1-824复制于，ID 1600801)由RNABiochemistry unit(Biontech RNA Pharmaceuticals，Mainz，Germany)提供。
如先前在实施例2中所述，在HBG×1中RNA浓度为500mg/L下制备具有JetPEI的聚合复合物。
制备具有Polytheragene-PEI的聚合复合物，其操作类似于制备具有JetPEI的聚合复合物，但有两处修改：
1.使用HEPES10mM，pH 7.4缓冲液代替HBG×1用于制备聚合复合物。
2.使用15.8的N/P比而不是11.6。
根据以下文章制备具有Polytheragene-PEI的聚合复合物：Démoulins，Thomas，等″Polyethylenimine-based polyplex delivery of self-replicating RNAvaccines.″Nanomedicine：Nanotechnology，Biology and Medicine(2015)。
将聚合复合物在HBG×1或Opti-MEM(Cat.#31985062，Thermo FisherScientific，Schwerte，Germany)缓冲液中稀释至最终RNA浓度为5mg/l用于体外研究以及为100mg/l用于体内研究。
如先前在实施例1和2中所述进行体外研究。
如先前在实施例6中所述进行体内研究。
结果和结论
图18示出了PEI/复制子-RNA聚合复合物对人树突细胞(DC)和小鼠肌细胞(C2C12)的体外研究A.毒性(表示为用聚合复合物处理之后活细胞的％)B.转染(表示为用聚合复合物处理之后的发光发射)。仅显示C2C12细胞的转染结果。
对于图19的结果，在HBG×1或Hepes 10mM缓冲液中用来自Polyplus或Polytheragene的PEI制备N/P比为11.6或15.8的复制子-RNA聚合复合物。在向小鼠注射之前，将聚合复合物在HBG×1或Opti-MEM缓冲液中稀释。将制剂以每次注射2μg的RNA剂量i.m.注射至小鼠(n＝3)的后肢。记录来自小鼠肌肉的发光信号。
结果和结论
表4.不同聚合复合物的尺寸之间的比较
| # | PEI制造商 | N/P | 制备缓冲液 | 稀释缓冲液 | 直径(nm) | PDI |
| 1 | Polyplus | 11.6 | HERES 10mM，pH 7.1 | HBG×1 | 112 | 0.277 |
| 2 | Polyplus | 15.8 | HBG×1 | HBG×1 | 107 | 0.239 |
| 3 | Polytheragene | 15.8 | HERES 10mM，pH 7.4 | Opti-MEM | ＞1000 | 多峰 |
| 4 | Polytheragene | 15.8 | HEPES 10mM，pH 7.4 | HBG×1 | 94 | 0.237 |
Opti-MEM具有高于20mM的离子强度。在Opti-MEM中，聚合复合物快速聚集(表4)，因此该制剂不适用于药物开发。
本文中所述的聚合复合物(来自polyplus的PEI，N/P 11.6，HBG×1)具有与先前描述的聚合复合物(来自polytheagene的PEI，N/P 15.8，Opti-MEM)非常不同的特征。在Opti-MEM中，聚合复合物具有＞1000nm的直径和多峰尺寸分布。本文中所述的聚合复合物具有～100nm的直径和低的多分散性。
在体外，所有的聚合复合物对树突细胞的毒性比对肌细胞更大。可能是树突细胞在s.c.注射之后摄取聚合复合物，而肌细胞在i.m.注射之后被聚合复合物转染。
本文中所述的聚合复合物与先前描述的聚合复合物进行的体外肌细胞转染相似。
本文中所述的聚合复合物和先前描述的聚合复合物进行的体内转染不同，并且其取决于施用途径。本文中所述的聚合复合物在i.m.注射之后转染良好而在s.c.注射之后转染更差。先前描述的聚合复合物在i.m.注射之后完全不转染，而在s.c.注射之后观察到微弱信号。
实施例11：通过i.m.注射对比于i.d.注射向小鼠中施用复制子RNA
将编码萤光素酶的复制子-RNA溶解于HBG×1缓冲液中或如实施例2中所述在聚合复合物中复合。将这些制剂以2μg RNA的剂量i.m.注射到Balb/c小鼠的胫骨后肌中。在注射之后4、7和10天通过异氟烷对小鼠进行麻醉。然后，向其注射萤光素底物，并通过CCD照相机记录来自肌肉的发光发射。
收集来源于萤光素酶蛋白的光子一分钟，并显示为与所成像小鼠照片的重叠(图20A)。图20B示出了在注射部位测量的光子/秒(p/s)的图形显示。
向Balb/c小鼠的背部皮肤上的两个注射部位皮内(i.d.)施用2μg非配制的HBG×1)或配制的编码萤光素酶的复制子-RNA之后7天，对动物进行非侵入性体内生物发光成像。收集来源于萤光素酶蛋白的光子一分钟，并显示为与所成像小鼠照片的重叠。黑色箭头指示注射部位(图21A)。图21B示出了在注射部位测量的光子/秒(p/s)的图形显示。
实施例12：RNA制剂作为疫苗的有益效果
在测试第0天和第21天，使用N/P比为11.6的与PEI配制的编码H1N1流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1/PR8)的血凝素(HA)的单链复制子-RNA的组合物或者非配制的单链RNA对小鼠进行免疫接种两次。所有动物均接受1.25μg RNA的剂量。第三组仅接受盐水作为缓冲液对照组。如图22A中所示，通过病毒中和测定(VNT，检测限1280)分析，在第一次免疫接种之后19天和第二次免疫接种之前不久，所有接受配制的RNA的动物产生针对HA的免疫应答。相比之下，接受非配制的RNA的8只动物中只有5只针对HA发生了血清转化。如图22B中所示，在第一次免疫接种之后35天，所有接受RNA的动物对HA特异性抗体呈阳性，并且抗HA的抗体滴度提高。与盐水对照组相比，配制的RNA组的动物滴度变得显著更高，而非配制的RNA组没有。如图22C中所示，免疫接种之后54天，与接受1.25μg非配制的编码H1N1/PR8-HA的RNA的动物相比，接受1.25μg配制的编码H1N1/PR8-HA的RNA的小鼠产生显著更高的抗体滴度(使用单因素ANOVA计算显著性；*p≤0.001)。
在测试第0天，使用特定N/P比为11.6的与PEI配制的编码H1N1流感病毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1/PR8)的血凝素(HA)的单链复制子-RNA的组合物或者非配制的单链RNA对小鼠进行免疫接种一次。所有动物均接受0.25μg RNA。第三组仅接受盐水作为缓冲液对照组。如图23A中所示，在免疫接种之后54天，所有接受RNA的动物均对HA特异性抗体呈阳性，与盐水对照组和接受0.25μg非配制的编码H1N1/PR8-HA的RNA的动物相比，配制的RNA组的滴度变得显著更高(使用单因素ANOVA计算显著性；**p≤0.001；*p≤0.05)。免疫接种之后55天，将所有小鼠用10倍半致死剂量(MLD50)的H1N1/PR8感染。观察存活。如图23B中所示，所有对照动物在8天内死亡。5只接受非配制的编码H1N1/PR8-HA的RNA的动物中有4只在攻击感染中存活。相比之下，所有接受配制的编码H1N1/PR8-HA的RNA的小鼠在攻击感染中存活，表明RNA/聚亚烷基亚胺组合物的有益效果。
实施例13：与PEI配制的复制子RNA的喷雾干燥
按照表1中给出的移液管方案制备N∶P比为12的制剂两次并随后将获得的材料组合。从而，获得5.0mL RNA浓度为0.1mg/mL RNA的复制子RNA聚合复合物。
将3.5mL该制剂喷雾干燥，并收集到533mg物质(收率：76.1％)。由于该物质在Büchi demo lab中排出，因此未确定新鲜制备的复制子RNA聚合复合物的颗粒尺寸。用水重构(混合物：20mg喷雾干燥的聚合复合物和200μL wfi；导致10mM海藻糖和RNA浓度为0.1mg/mL)之后的颗粒尺寸(z-平均值)为289nm，并且PDI为0.238(Nicomp，15分钟)。图24A示出了喷雾干燥之后和之前saRNA聚合复合物的萤光素酶表达的体外研究。saRNA的萤光素酶活性未因为喷雾干燥过程而损失。信号绝对高度的差异应归于测定的方差。
在另外的一个实验中，将在10％(w∶v)海藻糖中的未复合的mRNA喷雾干燥，并通过毛细管电泳测量研究喷雾干燥之后mRNA的完整性。
将2.50mL信使RNA(R36-05.2-DP；c(RNA)＝0.5mg/mL；10mM Hepes；0.1mM EDTA；pH7.0)与2.50mL 20％(w∶v)海藻糖溶液混合(体积比为1∶1)获得以下组合物：c(RNA)＝0.25mg/mL；10％(w/v)海藻糖；5mM Hepes；0.05mM EDTA。在喷雾干燥期间，将样品物质保持在冰上。总共将2.5mL该溶液喷雾干燥。在喷雾干燥期间，出口温度在10分钟内从33℃升高至37℃。为了降低温度升高，气流从98L/分钟升高至101L/分钟。在喷雾干燥期间，温度在接下来的60分钟内进一步升高至41℃。完全喷雾之后，收集165mg干燥物质(收率：66.0％)。为了分析RNA完整性，将材料溶解于wfi(混合物：20mg喷雾干燥的RNA和200μL wfi；导致海藻糖含量为10％并且RNA浓度为0.25mg/mL)中。通过使用Agilent 2100生物分析仪分析溶解的RNA。这些分析的结果显示为图24B中喷雾干燥的RNA的电泳图。
示出了未复合的RNA的完整性得以维持，喷雾干燥不导致可测量的RNA降解。
喷雾干燥实验如下进行：
来自Büchi的Nano喷雾干燥器B-90用于含有RNA的制剂的喷雾干燥。为制备这些制剂，使用以下化合物：
·信使RNA(R36-05.2-DP，c(RNA)＝0.5mg/mL；10mM Hepes；0.1mM EDTA；pH 7.0)
·编码萤光素酶的复制子RNA(D2 RNA-A1310 29-01 pST1-SFV4-TRON-I2m2-A30L70，wfi，c(RNA)＝1mg/mL)
·注射用水(wfi)
·NaCl(Wfi中1.5M)
·wfi中海藻糖20％(w∶v)(Pfanstiehl.批号：35261A)
·wfi中2×Hepes缓冲海藻糖20％(w∶v)(Pfanstiehl.批号：35261A，20mM Hepes)
·JetPEI(Polyplus；Lot.Nr.：13081A1S；150mM氮)
对于喷雾干燥，选择以下方法参数：
·喷嘴：4μM
·入口温度：80℃
·出口温度：30℃
·气流：98mL/分钟
·施加电流：15.000V；350μA
在所有实验之前，将装置用RNAse Zapp清洗并用乙醇擦拭，并将盖在超声浴中清洁。
实施例14：用于聚合复合物制备的微流控
使用由制造商(1029-036)提供的具有微流控芯片的NanoAssemblrTM(PrecisionNanosystems，BC，Vancouver，Canada)。对于RNA，使用内部制备的复制子RNA(批号R071_1_2)。聚乙烯亚胺(Max PEI 40)来自Polysciences(Eppelheim，Germany)。使用BD Plastipak1ml；1508006，BD Biosciences(Heidelberg，Germany)作为注射器。使用12ml/分钟的流量将两种组分以1∶1的比例混合。以两种不同的浓度(即50mg/l和250mg/l)制备样品。
对于使用动态光散射的颗粒尺寸测量，使用来自Nicomp(PSS Nicomp，SantaBarbara，CA)的380 ZLS亚微颗粒/ζ电位分析仪。
对于每种条件，制备1.5ml。用HBG缓冲液稀释样品用于尺寸测量。
移液管方案如下：
使用包含Y型微流控混合器的装置进行微流控混合实验，其中混合在标准注射器中提供的两种组分。使用12ml/分钟的恒定流量将两种组分以1∶1的比例混合。以两种不同的浓度(即50mg/l和250mg/l)制备样品，并测量获得的聚合复合物的颗粒尺寸。
用微流控装置制备聚合复合物，表明用于放大和GMP制备的连续流制备的可行性。可形成颗粒而没有问题，并且没有观察到聚集体形成或堵塞的迹象。通过动态光散射测量颗粒尺寸。对于以0.05mg/l制备的聚合复合物，尺寸为约123nm，并且对于以0.25mg/ml制备的颗粒，尺寸为约314nm。获得的结果的细节在下表中给出。
| 浓度mg/ml | 尺寸(nm) | PDI | ND | 通道宽度 |
| 0.05 | 122.8 | 0.31 | 167 | 17 |
| 0.25 | 314.2 | 0.247 | 116 | 45 |
在RNA浓度为0.02mg/ml下测量所有样品(用HBG×1稀释)
示出了通过微流控制备聚合复合物的可行性。用简单的Y型混合器进行制备，并且为了实现顺利制备，不需要特别的操作，例如流体动力学聚焦。在合适的条件下，可制备尺寸远低于200nm的颗粒，使得能够用已建立的且符合GMP标准的无菌滤器进行终端无菌过滤。由于没有注意到聚集或堵塞的迹象，因此可得出结论：可放大到更大的制备批次而没有问题。用于放大的另一些选项包括数个相同设备的并行化。总之，结果可作为符合GMP的微流控制备PEI/RNA聚合复合物的一般可行性的指示。
实施例15：通过过滤对聚合复合物进行灭菌
如先前在“聚合复合物的稳定性研究”部分中所述，制备复制子-RNA浓度为100mg/L且N/P比为11.5、13.5和15.5的聚合复合物。
制备具有三种不同N/P比的2.68ml聚合复合物的三个管。将聚合复合物(1.34ml)通过具有220nm孔的无菌Millex-GP Med针筒式滤器装置(Cat.#SLMPL25SS，MerckMillipore)过滤。
将聚合复合物在HBG×1中稀释至RNA浓度为10mg/L。接下来，在将聚合复合物添加至细胞之前30分钟，将其在NaCl 0.9％中稀释至RNA浓度为5mg/l。
将C2C12细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种在96孔板(平底)中。将细胞维持在37℃和7.5％CO2下。24小时之后，将上清液弃去并替换为50μL DMEM培养基(+10％FCS)。将聚合复合物在含有10％FCS的DMEM培养基中稀释(1∶5)并预孵育～15分钟。然后将50μl的聚合复合物溶液添加至细胞至最终培养基体积为100μl。在另外48小时之后，根据操作说明书进行Bright-GloTM萤光素酶测定(Cat.#E2610，Promega GmbH，Mannheim，Germany)。
与转染平行，还使用细胞增殖试剂盒II(XTT.Roche，#11465015001)测量细胞数目。在这两种测定中，每种聚合复合物样品以生物学一式三份进行测试。作为阴性对照，将在不进行处理的情况下接种细胞(“未处理”)。对于XTT-测定，还有不含细胞的培养基(相当于背景(background，BG))也一式三份接种。最后，用“infinite 200pro”阅读仪(Tecan)测量发光(Bright-GloTM)以及吸光度(XTT)。通过将发光信号除以吸光度(与细胞数目成比例)计算归一化发光。
图25示出了在用无菌过滤之前(制备的)和之后(灭菌的)的不同N/P比的PEI/复制子-RNA聚合复合物孵育之后，来自C2C12肌细胞的归一化发光。
可得出结论，针筒式滤器单元适用于聚合复合物的灭菌。聚合复合物的转染效力不因灭菌过程而改变。
实施例16：通过将短PEI和长PEI组合来优化聚合复合物转染
将编码萤光素酶的复制子-RNA与0.6至11kDA的短PEI(例如线型短PEI 2.5kDA或支化短PEI 1.8kDA)和20至40kDa的长PEI(例如22kDa in vivo/Jet PEI)的真正组合在MBG缓冲液(终浓度5％w/v葡萄糖，10mM MES，pH 6.1)中复合，不同组合的总NP为10或12。使用单独的in vivo/Jet PEI NP12作为基准。短PEI和长PEI聚合复合物的复合以两个步骤进行：在第一步中，用in vivo/Jet PEI调节复制子-RNA的复合以获得期望的NP。在第二步中，将过量的短PEI添加至制剂以达到期望的总NP比；即，第一个数字限定长PEI NP并且第二个数字限定短PEI(例如NP4+8＝NP4长PEI和NP8短PEI)。如先前在实施例15中所述的进行萤光素酶测定。结果示于图26中。图26A)显示短线型PEI和长in vivo Jet PEI聚合复合物在250ng RNA/孔下的转染效力。图27B)显示短支化PEI和长in vivo Jet PEI聚合复合物在250ng RNA/孔下的转染效力。
结论：与仅使用长PEI(例如in vivo Jet PEI)的基准结果相比，通过使用长PEI和短PEI的组合可显著提高转染效力。
有趣的是，对于与线型短PEI的组合，萤光素酶表达信号在转染之后的最初24小时达到峰值，而对于与支化的短PEI的组合，萤光素酶表达信号在转染之后最初48小时达到峰值。因此，在期望在特定时间框架内表达的情况下，仔细选择正确的短PEI/长PEI组合是合理的。
实施例17：通过降低长PEI的量来优化聚合复合物转染
将编码分泌型纳米萤光素酶的复制子-RNA与短PEI(例如支化的1.8kDA)和长PEI(例如in vivo/Jet PEI)的真正组合在MBG缓冲液(终浓度5％w/v葡萄糖，10mM MES，pH6.1)中复合，不同组合的总NP为12。将in vivo/Jet PEI NP12用作基准。短+长PEI聚合复合物的复合以两个步骤进行：在第一步中，用in vivo/Jet PEI调节复制子-RNA的复合以获得期望的NP。在第二步中，将过量的短PEI添加至制剂以达到期望的总NP比；即，第一个数字限定长PEI NP并且第二个数字限定短PEI(例如NP4+8＝NP4长PEI和NP8短PEI)。根据制造商方案(Nano-GLO，Promega，USA)在125ng的RNA/孔下测量分泌型萤光素酶。如先前在实施例15中所述进行细胞生存力测定。
结果示于图27中。与基准相比并且对于相同的总NP比，用组合(例如，NP4+8和NP1.15+11)获得更高的表达水平。因此，通过降低制剂中长PEI的浓度并提高毒性较小的短PEI(例如支化的1.8kDa)的浓度，可显著提高转染效力。
实施例18：盐变化和/或pH对体内转染效率的影响
BALB/c小鼠购自Janvier Laboratories并在8周龄时实施实验。在注射指定的测试项目之前，对小鼠进行异氟烷麻醉并使用电剃刀从后腿去除毛。随后，向每组三只小鼠的每个胫骨后肌以RNA剂量为2μg施用20μL总体积的复制子-RNA(saRNA)-PEI-聚合复合物(例如saRNA-in vivo Jet PEI聚合复合物NPl2)。制剂在pH和/或盐浓度(例如NaCl)方面变化。在指定的时间点，向小鼠腹膜内注射D-萤光素溶液(100mg/kg体重)，并通过光谱设备(Perkin Elmer)在异氟烷麻醉的小鼠中非侵入性地捕获生物发光1分钟。图显示通过软件(Perkin Elmer)在涉及这些图片中的小鼠肌肉(注射部位)的人工限定的目的区域(region of interest，ROI)中确定的生物发光信号的每秒光子数[p/s]，总共六个值/组。
盐变化(例如NaCl)对转染效率的影响示于图28中。肌内注射不同N/P比的复制子-RNA-PEI聚合复合物导致了在第3、6、9和13天测量之后的小鼠肌肉区域中持久的生物发光信号。检测到的信号强度从施用之后第3天提高至第6天(峰值)，但即使在第13天也可检测到。在i.m.注射之后第6天，可在接受复制子-RNA-PEI聚合复合物(例如长PEI N/P 12)并添加低浓度(5至10mM)盐的小鼠中检测到小鼠肌肉区域中的最强信号。
pH变化对转染效率的影响示于图29中。用pH值为6.5至7.1(优选6.5至6.9)的复制子RNA(saRNA)-PEI聚合复合物制剂获得了良好的结果。用调节至pH 6.5的复制子-RNA-长PEI NP12制剂可检测到最强信号。使用具有未调节的pH的复制子-RNA-Jet PEI聚合复合物NP12(BM)或HBG(20mM HEPES，pH 7.4，5wt.％葡萄糖)作为基准。
实施例19：体外PEI聚合复合物的电泳迁移率和转染效率的pH依赖性影响
在室温下，将编码萤光素酶的复制子-RNA与长PEI(例如in vivo Jet PEI)以N/P比为4在HBG缓冲液(终浓度4.5％w/v葡萄糖，10mM HEPES，pH 7.1)中复合15分钟并等分为11份样品。根据待测试的最终本体pH，通过添加HCl或NaOH调节样品的pH。如实施例5中所述进行电泳迁移率(μ)的测量。如先前在实施例15中所述进行C2C12小鼠肌细胞的体外转染、萤光素酶和细胞生存力测定。
体外PEI聚合复合物的电泳迁移率和转染效率的pH依赖性影响示于图30和31中。图30示出了调节至不同pH值的in vivo JetPEI/复制子-RNA聚合复合物(N/P 4)的电泳迁移率。图31示出了用不同剂量的N/P比为4且具有不同pH值(pH 6.5至pH 8.5)的in vivoJetPEI/复制子-RNA聚合复合物孵育之后，来自C2C12肌细胞的归一化发光。
聚合复合物的电泳迁移率与pH呈负相关。在大约pH 8.9时获得中性聚合复合物。通过降低聚合复合物的本体pH(优选至pH值为6.5至7.1)提高PEI聚合复合物的正电荷密度，从而实现在不影响细胞生存力的情况下C2C12细胞的更高转染效率。PEI聚合物包含伯胺和仲胺，其质子化状态取决于本体pH。因此，结果表明了通过调节和优化本体pH来控制聚合复合物的电荷及其转染效率的高效方法。
实施例20：长PEI制剂中正电荷过量的影响
编码分泌型纳米萤光素酶的复制子-RNA以2至12的不同NP比在MBG缓冲液(终浓度5％w/v葡萄糖，10mM MES，pH 6.1)中复合。根据制造商方案(Nano-GLO，Promega，USA)在125ng的RNA/孔下测量分泌型萤光素酶。基于长PEI(即in vivo/Jet PEI)-复制子RNA NP比和该复制子-RNA与in vivo Jet PEI发生总复合的精确NP比来计算正电荷的过量。使用的NP比和总复合的已知NP比之间的差异允许计算制剂中正电荷的过量。
作为一个实例，与在250ng RNA下用in vivo Jet PEI聚合复合物转染相关的结果示于图32中。通常来说，制剂中正电荷浓度的提高与萤光素酶表达水平成指数比例。通过提高PEI的量而使正电荷过量至30nM已被证明是有益的。
实施例21：通过使用2步复合来优化单组分PEI聚合复合物转染
如果仅使用一种PEI变体(例如长PEI)，则通过使用2步复合方法可提高转染效率。将编码分泌型纳米萤光素酶的复制子-RNA以两个步骤在MBG缓冲液(终浓度5％w/v葡萄糖，10mM MES，pH 6.1)中复合，总NP为12。使用in vivo/Jet PEI NP12的1步复合作为基准。例如，使用in vivo Jet PEI的2步复合如下进行：在第一步中，调节复制子-RNA的复合以获得期望的初始NP。在第二步中，将过量的in vivo/Jet PEI添加至制剂以达到期望的总NP比；即，第一个数字限定初始PEI NP，并且第二个数字限定第二步中给定的过量的in vivo JetPEI(例如NP4+8：第一步中的NP4 Jet PEI和第二步中的NP8 Jet PEI)。根据制造商方案(Nano-GLO，Promega，USA)在125ng的RNA/孔下测量分泌型萤光素酶。如先前在实施例15中所述进行细胞生存力测定。
2步复合的结果示于图33中。与in vivo/Jet PEI NP12的1步复合的基准相比并且对于相同的总NP比，用两步复合实现更高的表达水平。
实施例22：复合制剂缓冲液对免疫接种效率的影响
通过使用In vivo-jetPEI将saRNA配制成聚合复合物。通过使用Hepes缓冲的葡萄糖(HBG)或MES缓冲的葡萄糖(MBG)(5％D-葡萄糖，10mM MES，pH 6.1)制备聚合复合物。在一次注射实验中在第0天对小鼠进行免疫接种。在免疫接种之后第45天收集血清，并使用HA特异性ELISA分析血清中Cf07-HA特异性抗体的量。已经进行了血清稀释的终点滴定，并确定了曲线下面积(AUC)。与设定为100％的HBG产生的聚合复合物相比，描述MBG产生的聚合复合物的曲线下面积的提高百分比。
结果示于图34中。与用HBG配制的聚合复合物相比，通过使用MES缓冲的葡萄糖制备的聚合复合物在对小鼠的一次疫苗接种之后产生高得多的ELISA信号。
缩写和 定义的列表
ATM 大气压
C 浓度
CSS CuSO423mg在100ml乙酸钠0.1M，pH 5.4中的溶液
DLS 动态光散射
EDTA 乙二胺四乙酸
FCS 胎牛血清
h 小时
HBG×1 HEPES 10mM缓冲的(pH 7.1)葡萄糖5％
HBG×2 HEPES 20mM缓冲的(pH 7.1)葡萄糖10％
HBT×1 HEPES10mM缓冲的(pH 7.1)海藻糖10％
HBT×2 HEPES 20mM缓冲的(pH 7.1)海藻糖20％
HBT×1+EDTA HEPES 2.8mM缓冲的(pH 7.1)海藻糖10％，EDTA 80μM
HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
IVI 病毒学和免疫学研究所(Institute of Virology andimmunology)，Switzerland
IVT 体外转录的mRNA
kDa 1000道尔顿
Lyo 冻干
Min 分钟
MBG×1 5％D-葡萄糖，10mM MES，pH 6.1
MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸
N/P PEI中胺基团数目与RNA中磷酸酯基团数目之间的比值
PEI 聚乙烯亚胺
RNA 核糖核酸
UV 紫外线
Claims (51)
1.药物组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺。
2.组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
所述组合物用作药物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述聚亚烷基亚胺中氮原子(N)数目与所述单链RNA中磷原子(P)数目的摩尔比(N∶P比)为2.0至15.0，优选6.0至12.0。
4.组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
其中所述聚亚烷基亚胺中氮原子(N)数目与所述单链RNA中磷原子(P)数目的摩尔比(N∶P比)为2.0至15.0，优选6.0至12.0。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中离子强度为50mM或更低，优选地其中单价阳离子的浓度为25mM或更低，并且二价阳离子的浓度为20μM或更低。
6.组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
其中离子强度为50mM或更低。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中单价阳离子的浓度为25mM或更低，并且二价阳离子的浓度为20μM或更低。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其用于肌内施用，例如通过肌内注射。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA和所述聚亚烷基亚胺存在于聚合复合物颗粒中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述聚亚烷基亚胺包含以下通式(I)：
其中
R是H、酰基或包含以下通式(II)的基团：
其中R1是H或包含以下通式(III)的基团：
n、m和1独立地选自2至10的整数；并且
p、q和r是整数，其中p、q和r的总和使得所述聚合物的平均分子量为1.5·102至107Da，优选5000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中n、m和l独立地选自2、3、4和5，优选选自2和3。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中R1是H。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中R是H或酰基。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述聚亚烷基亚胺包含聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述聚亚烷基亚胺中至少92％的N原子是可质子化的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其还包含一种或更多种添加剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述一种或更多种添加剂选自缓冲物质、糖类、稳定剂、冷冻保护剂、冻干保护剂和螯合剂。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述缓冲物质包含选自以下的至少一种：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)，乙酸、乙酸盐缓冲剂及类似物，磷酸及磷酸盐缓冲剂，以及柠檬酸及柠檬酸盐缓冲剂。
19.根据权利要求17或18所述的组合物，其中所述糖类包含选自以下的至少一种：单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖，优选选自葡萄糖、海藻糖和蔗糖。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述冷冻保护剂包含选自以下的至少一种：二醇，例如乙二醇、丙二醇，以及甘油。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中所述螯合剂包含EDTA。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中脂质包含选自以下的至少一种：阳离子脂质、中性脂质和阴离子脂质。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含HEPES缓冲的葡萄糖(HBG)或HEPES缓冲的海藻糖(HBT)。
24.根据权利要求9至23中任一项所述的组合物，其中来自所述颗粒的动态光散射测量的z-平均值小于200nm，优选小于150nm，并且更优选小于100nm，和/或来自所述颗粒的动态光散射测量的多分散性指数小于0.5，优选小于0.3，并且更优选小于0.2。
25.根据权利要求9至24中任一项所述的组合物，其中所述颗粒的ζ-电位为20mV或更高，优选25至40mV。
26.根据权利要求23至26中任一项所述的组合物，其中所述HBG包含5％葡萄糖(w/v)和10mM HEPES，pH 7.1。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的组合物，其中所述HBT包含10％海藻糖(w/v)和10mM HEPES，pH7.1。
28.根据权利要求9至27中任一项所述的组合物，其中所述颗粒在生理pH下为中性或带正电荷。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA是具有6000至15000个碱基、优选9000至12000个碱基的分子。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA编码至少一种目的蛋白质。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA是复制子，优选自复制或自扩增RNA。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述复制子可通过来自甲病毒的复制酶进行复制，并且其中所述复制子优选包含来自甲病毒的5’复制识别序列或其变体和来自甲病毒的3’复制识别序列或其变体。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述单链RNA包含编码目的肽或蛋白质例如药学活性肽或蛋白质的开放阅读框。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的组合物，其用于治疗。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物，其是疫苗组合物。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物用于将RNA引入到细胞中、特别是用于在细胞中表达RNA的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述细胞是肌细胞。
38.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物用于肌内施用RNA的用途。
39.肌内施用RNA的方法，其包括肌内施用根据权利要求1至35中任一项所述组合物的步骤。
40.经冷冻、经冻干或经喷雾干燥组合物，其包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺，
其中所述组合物包含冷冻保护剂和/或冻干保护剂，优选二糖例如海藻糖，或多糖例如葡聚糖。
41.根据权利要求40所述的组合物，其还包含螯合剂例如EDTA。
42.根据权利要求40或41所述的组合物，其由包含5％至20％(w/v)的二糖和任选的80μM至10mM的所述螯合剂的水性组合物制备。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述水性组合物包含海藻糖、HEPES和EDTA，例如10％海藻糖(w/v)、2.8mM HEPES、80μM EDTA，pH 7.1。
44.水性组合物，其可通过使根据权利要求40至43中任一项所述的经冷冻组合物解冻或使根据权利要求40至43中任一项所述的经冻干或经喷雾干燥组合物重构来获得。
45.制备经冷冻、经冻干或经喷雾干燥组合物的方法，其包括：
(i)制备水性组合物，其包含单链RNA、聚亚烷基亚胺和冷冻保护剂和/或冻干保护剂，优选二糖例如海藻糖，或多糖例如葡聚糖，以及
(ii)将所述组合物冷冻、冻干或喷雾干燥。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述水性组合物还包含螯合剂例如EDTA。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述水性组合物包含5％至20％(w/v)的二糖和任选的80μM至10mM的所述螯合剂。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述水性组合物包含海藻糖、HEPES和EDTA，例如10％海藻糖(w/v)、2.8mM HEPES、80μM EDTA，pH 7.1。
49.冷冻保护剂和/或冻干保护剂，优选二糖例如海藻糖，或多糖例如葡聚糖用于制备经冷冻、经冻干或经喷雾干燥组合物的用途，所述组合物包含：
(a)单链RNA；以及
(b)聚亚烷基亚胺。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述二糖与螯合剂例如EDTA组合使用。
51.用于通过使用连续流动泵和混合装置对RNA聚合复合物制剂进行连续流制备的方法，其中两种水性流体通过mm或μm尺寸的通道进行混合。
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