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CN109550045B - 猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN109550045B CN201811603730.5A CN201811603730A CN109550045B CN 109550045 B CN109550045 B CN 109550045B CN 201811603730 A CN201811603730 A CN 201811603730A CN 109550045 B CN109550045 B CN 109550045B
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Abstract

本发明公开了猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备方法。本发明首先公开了一种防治猪圆环病毒综合症、猪细小病毒病和猪流感的三联灭活疫苗，包括：灭活的猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液和疫苗佐剂。本发明进一步公开了一种制备所述三联灭活疫苗的方法，包括：将灭活后的抗原液混合在一起后与疫苗佐剂混合均匀，乳化，即得。本发明三联灭活疫苗制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷；本发明所提供的三联疫苗安全性更佳，做到“一针三防”，避免了多次接种免疫出现的不良反应，降低了养殖成本、减少免疫次数，还能有效降低动物的应激反应，提高动物的福利待遇。

Description

猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)的三联灭活疫苗，本发明进一步涉及该三联灭活疫苗的制备方法以及在防治PMWS综合症、猪细小病毒病和猪流感中的应用，属于猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗疫苗的制备及应用领域。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种小而无囊膜、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。目前，PCV可分为3个基因型，即PCV-1、PCV-2和PCV3。PCV-1为非致病性PCV，PCV-2和PCV-3均对猪有致病性，可引起PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合征)，又称PMWS相关PCV。PCV-3是由Palinski等从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定，其基因组长2.0kb，随后世界上许多国家和地区都有该病的报道，中国学者对国内部分省区的PCV-3流行情况进行了调查，结果表明，安徽、江西、山东、福建、河南和广西存在PCV-3阳性猪场，给中国的养猪业造成严重的经济损失。
猪细小病毒病是由于感染猪细小病毒而导致的一种繁殖障碍病，主要特征是妊娠母猪发生流产、产木乃伊胎、死产。母猪和仔猪在急性感染后一般呈隐性，无明显临床症状。妊娠母猪感染后会呈现多次反复发情但无法受孕，或者子宫内感染病毒而发生流产、产木乃伊胎、死胎以及弱猪，或者只能够产出少量活仔猪，或者在每窝仔猪大约有20％～40％存在母源性繁殖障碍。经检查得知在世界各地的猪群中，该病毒是普遍存在的，在大多数猪场呈地方性流行。此病流行很广，在欧、美、亚及大洋洲很多国家均有报道。中国的各省市相继分离到猪细小病毒，血清阳性率很高，给我国的养猪业造成严重的经济损失。
猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。该病传染性强、发病率高，其临床症状表现为咳嗽、喷嚏、流涕、体温升高、呼吸困难和食欲下降、延迟出栏等症状等症状。各个年龄、性别和品种的猪对本病毒都有易感性。本病的流行有明显的季节性，天气多变的秋末、早春和寒冷的冬季易发生。本病传播迅速，常呈地方性流行或大流行。本病发病率高，但单纯感染死亡率不高(4％～10％)，会对猪的生长性能造成不良的影响；与其他病原混合感染，会使病情加重，死亡率增高，给养猪业造成严重经济损失，是危害我国养猪业较为严重的传染病之一。在中国猪群中，H3N2亚型猪流感病毒是最主要流行的猪流感之一。
目前，中国国内尚无猪圆环病毒3型疫苗，预防猪细小病毒病或猪流感(H3N2亚型)的单苗有企业生产和销售。因此，对于这几种疫病，需要各自的疫苗分别单独注射，免疫工作量大，成本很高，导致防控效果不佳，亟待改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗；
本发明的目的之二是提供一种猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明通过三联疫苗与单价疫苗免疫仔猪的效力比较发现，将猪圆环病毒3型Cap抗原、灭活的猪细小病毒抗原和猪流感病毒抗原这三种抗原成分配制同一针的三联疫苗中不仅不存在相互干扰的现象，而且三联疫苗单次注射仔猪的免疫效果高于三种单苗先后注射的免疫效果，基于上述发现，本发明提供了一种防治猪圆环病毒综合症、猪细小病毒病和猪流感的三联灭活疫苗，包括：灭活的猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液和疫苗佐剂。
本发明将灭活的猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液按照不同的配比比例进行配比，结果发现，不同的配比比例的免疫保护效力存在较大的差异，将猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液按照1：(1-2)：(1-2)的比例进行配比时所得到的三联疫苗在免疫保护效力上明显由于其它的配比；其中，将猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液按照1：1：2的比例所得到的三联疫苗具有最佳的免疫保护效果。
本发明中所述PCV3 Cap蛋白的抗原液可以按照本领域的常规制备方法制备得到，即，可以采用本领域常用的PCV3型毒株(通过各种商业途径购买或自行分离均可)采用常规的制备方法制备得到抗原液，所得到的抗原液均能适用于本发明。
作为一种参考，本发明提供了一种制备所述PCV3 Cap蛋白的抗原液的方法：将PCV3型毒株的Cap蛋白编码基因可操作性连接到杆状病毒载体得到重组杆状病毒，将重组杆菌病毒按MOI为1.0接种量接种到处于对数生长期Sf9细胞悬液(细胞数量为2×106/ml)，以110～130r/min 27℃培养96～120小时，当80％以上细胞发生病变时收获培养物；将收获的培养物反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，置2～8℃保存。
优选的，所述PCV3型毒株为ChS-1株，本发明所述PCV3 Cap蛋白的抗原液含量至少为灭活前20цg/头份。
本发明中所述猪细小病毒的抗原液可以按照本领域的常规制备方法制备得到，即，可以采用本领域常用的猪细小病毒株(通过各种商业途径购买或自行分离均可)采用常规的制备方法制备得到抗原液，所得到的抗原液均能适用于本发明。
作为参考，本发明提供了一种PPV抗原液的制备方法，包括：将PPV毒株按1％的接种量接种于处于对数生长期ST细胞悬液(细胞数量为2×106/ml)，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2，培养36～72小时，当80％以上细胞发生病变时收获培养物；将收获的培养物反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，置2～8℃保存。
优选的，本发明所述猪细小病毒病毒毒株为猪细小病毒病毒L株；所述PPV L株含量至少为灭活前107.0TCID50/头份。
本发明中所述猪流感病毒的抗原液可以按照本领域常规制备方法制备得到，即，可以采用本领域的常用猪流感病毒株(通过各种商业途径购买或自行分离均可)采用常规的制备方法制备得到抗原液，所得到的抗原液均能适用于本发明。
作为一种参考，本发明提供了一种制备所述猪流感病毒的的抗原液的方法，包括：将猪流感H3N2亚型病毒株按1％接毒量接种于处于对数生长期MDCK细胞悬液(细胞数量为2×106/ml)，并加入终浓度为2.5μg/ml的TPCK-胰酶，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2，37℃培养48～72小时；当80％以上细胞病变时收获病毒液。将收获的培养物反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，置2～8℃保存。
优选的，本发明所述SIV H3N2亚型毒株为猪流感H3N2亚型HLJ株。更优选的，本发明所述SIV H3N2亚型HLJ株含量至少为灭活前107.0TCID50/头份。
本发明中所述疫苗佐剂可以为Montanide ISA 15A VG佐剂、ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel 01、蜂胶或ISA760VG中的任何一种或一种以上按照任意比例组成的组合物；更优选地，本发明中所述疫苗佐剂为Montanide ISA 15A VG佐剂。
本发明的另一目的在于提供上述三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液灭活；(2)灭活后的抗原液混合在一起后再与疫苗佐剂混合均匀，乳化，即得。
优选的，所述的抗原液的灭活方法是向抗原液中加入BEI进行灭活；更优选的，向抗原液中所加入的BEI溶液至其终浓度为5mM，灭活时间为24～48h。
优选的，步骤(2)中将灭活后的抗原液混合在一起后与免疫佐剂按照9:1的体积比混合得到水相混合物；将水相混合物加入乳化罐中后再加入油相佐剂进行搅拌乳化，静止，即得；其中，所述的免疫佐剂优选为Montanide ISA 15A VG；所述的搅拌转速优选为800r/min，所述的搅拌时间优选为30分钟，所述的静止时间优选为30分钟。
现有技术对于猪圆环病毒3型、猪细小病毒病与猪流感病毒的预防，至少需要打2针才能预防以上三种疾病，不仅成本高，动物的应激反应也高。本发明预防猪圆环病毒3型、猪细小病毒病与猪流感病毒(H3N2亚型)三联灭活疫苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷；本发明的三联疫苗安全性更佳，做到“一针三防”，避免了多次接种免疫出现的不良反应，不仅降低了养殖成本、减少免疫次数，能有效降低动物的应激反应，提高动物的福利待遇。
附图说明
图1为表达PCV3型Cap蛋白重组杆状病毒载体、PPV和SIV(H3N2亚型)三联灭活疫苗的制备工艺流程图。
图2为不同配比比例的表达PCV3型Cap蛋白重组杆状病毒载体、PPV和SIV(H3N2亚型)三联灭活疫苗免疫后血清抗体水平；1PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝1:1:2；2PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝1:1:1；3PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝2:1:1；4PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝1:2:1；5PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝1:2:2；6PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝2:2:1；7PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV＝2:1:2；8PCV3 Cap蛋白单苗(图2A)；8PPV单苗(图2B)；8SIV H3N2单苗(图2C)；9对照组。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1表达PCV3型Cap蛋白重组杆状病毒载体、PPV和S IV(H3N2亚型)三联灭活疫苗的制备
1猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液的获得
1.1表达PCV3型Cap蛋白重组杆状病毒载体的构建
用下表1中引物对从吉林疑似猪圆环病毒发病的病料中提取的PCV3毒株DNA中分别扩增Cap蛋白基因(ORF2)，回收后，用BamH I和Xho I分别酶切回收产物，然后与同样酶切的质粒pOET1进行连接，获得的重组质粒经酶切和PCR鉴定，确定获得重组质粒pOET1-ORF2-ChS-1。将英国Oxford Expression Technologies公司昆虫病毒DNA(flashBACPrime)与转移质粒pOET1-ORF2-ChS-1共转染Sf9昆虫细胞(Invitrogen)，获得1株PCV3重组杆状病毒，命名为CHs-1株。本发明中获得的表达量稳定、病毒效价良好ChS-1株的PCV3重组杆状病毒ORF2基因全长645bp，表达214个氨基酸。
表1扩增PCV3的Cap蛋白基因引物
Figure BDA0001923120580000071
1.2细胞培养
1.2.1细胞制备
将冻存的Sf9工作细胞库细胞进行无血清培养，待细胞形成单层后，按1:5比例进行传代。以同样的方法进行传代，扩大培养，直到扩增到需要的细胞数量。
1.2.2一级生物反应器细胞培养
取上述培养的细胞，调整细胞浓度至4.0×106.0cells/ml，按一定比例加入一级生物反应器，使细胞浓度达到0.5×106.0cells/ml，27℃培养48～72h，待细胞密度达4.0×106.0cells/ml时，接种到二级生物反应器扩大，进行扩大细胞培养。
1.2.3二级生物反应器培养
将一级生物反应器细胞按一定比例接种至二级生物反应器，扩大培养，使细胞密度为0.5×106.0cells/ml，进行全悬浮无血清培养。待细胞密度达1.5～2.0×106.0cells/ml时，进行病毒接种。
1.3病毒接种
当生物反应器中细胞密度达到1.5～2.0×106.0cells/ml时，将生产用毒种按MOI为1.0接种量进行接种，调整生物反应器搅拌转速为110r/min，溶氧为70％，pH为6.2左右。接毒后逐日取样观察细胞病变状况，当80％以上细胞病变时收获。反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，依次经过用孔径为0.45μm滤膜和0.22μm滤膜进行过滤除菌，2～8℃保存过滤液。
1.4病毒灭活
向收获的抗原液中加入终浓度为5.0mM的BEI溶液，充分搅拌，在pH7.8±0.2、37℃条件下搅拌灭活24小时，加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液，以中和BEI保证PCV3重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的安全性。
取灭活后的抗原液，按培养基总量的5％接种于已形成良好单层的Sf9细胞，置27℃培养观察4日，冻融2次后，再盲传2代，最后一代培养7日后进行间接免疫荧光检测。没有出现特异性荧光，抗原液灭活完全。
2猪细小病毒L株抗原液的获得
2.1细胞培养
2.1.1细胞制备
将冻存的ST工作细胞库细胞进行无血清培养，待细胞形成单层后，按1:5比例进行传代。以同样的方法进行传代，扩大培养，直到扩增到需要的细胞数量。
2.1.2一级生物反应器细胞培养
取上述培养的细胞，调整细胞浓度至4.0×106.0cells/ml，按一定比例加入一级生物反应器，使细胞浓度达到1.0×106.0cells/ml，27℃培养48～72h，待细胞密度达4.0×106.0cells/ml时，接种到二级生物反应器扩大，进行扩大细胞培养。
2.1.3二级生物反应器培养
将一级生物反应器细胞按一定比例接种至二级生物反应器，扩大培养，使细胞密度为1.0×106.0cells/ml，进行全悬浮无血清培养。待细胞密度达2.0～2.5×106.0cells/ml时，进行病毒接种。
2.2病毒接种
当生物反应器中细胞密度达到2.0～2.5×106.0cells/ml时，将生产用毒种猪细小病毒L株(微生物保藏编号：CGMCC No.3352)按1％的接种量进行接种，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2。接毒后逐日取样观察细胞病变状况，当80％以上细胞病变时收获。反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，依次经过用孔径为0.45μm滤膜和0.22μm滤膜进行过滤除菌，2～8℃保存过滤液。
2.3病毒灭活
向收获的抗原液中加入终浓度为5.0mM的BEI溶液，充分搅拌，在pH7.8±0.2、37℃条件下搅拌灭活72小时，加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液，以中和BEI。以保证三联灭活疫苗疫苗的安全性。
取灭活后的抗原液，按培养基总量的5％接种于处于对数生长期的ST细胞，置37℃培养观察4日，冻融2次后，再盲传2代，最后一代培养7日后进行判定。没有出现细胞病变，抗原液灭活完全。
3猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的获得
3.1细胞培养
3.1.1细胞制备
将冻存的MDCK工作细胞库细胞进行无血清培养，待细胞形成单层后，按1:4比例进行传代。以同样的方法进行传代，扩大培养，直到扩增到需要的细胞数量。
3.1.2一级生物反应器细胞培养
取上述培养的细胞，调整细胞浓度至4.0×106.0cells/ml，按一定比例加入一级生物反应器，使细胞浓度达到1.0×106.0cells/ml，37℃培养48～72h，待细胞密度达4.0×106.0cells/ml时，接种到二级生物反应器扩大，进行扩大细胞培养。
3.1.3二级生物反应器培养
将一级生物反应器细胞按一定比例接种至二级生物反应器，扩大培养，使细胞密度为1.0×106.0cells/ml，进行全悬浮无血清培养。待细胞密度达1.5～2.0×106.0cells/ml时，进行病毒接种。
3.2病毒接种
当生物反应器中细胞密度达到1.5～2.0×106.0cells/ml时，将生产用毒种猪流感病毒细胞适应株SIV-H3N2-HLJ株(微生物保藏编号为CGMCC No.14740)按1％的接种量进行接种，调整生物反应器搅拌转速为50-80r/min，溶氧为50-80％，pH值为7.0-7.2。接毒后逐日取样观察细胞病变状况，当80％以上细胞病变时收获。反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，依次经过用孔径为0.45μm滤膜和0.22μm滤膜进行过滤除菌，2～8℃保存过滤液。
3.3病毒灭活
向收获的抗原液中加入终浓度为5.0mM的BEI溶液，充分搅拌，在pH7.8±0.2、37℃条件下搅拌灭活48小时，加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液，以中和BEI。以保证三联灭活疫苗的安全性。
取灭活后的抗原液，按培养基总量的5％接种于已形成良好单层的MDCK细胞，置37℃培养观察4日，冻融2次后，再盲传2代，最后一代培养7日后进行细胞病变观察。没有出现细胞病变，抗原液灭活完全。
4灭活疫苗的制备
将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照1:1:2的比例均匀混合制备成水相，将水相与Montanide ISA 15A VG佐剂按照9:1的体积比例混合得到水相混合物，先将水相混合物加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，得到三联灭活疫苗；最终疫苗中猪圆环病毒3型Cap蛋白抗原含量应≥20μg/头份；猪细小病毒抗原含量≥107.0TCID50/头份；猪流感H3N2亚型抗原含量≥107.0TCID50/头份。
实施例2三联灭活疫苗的制备
猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液，猪细小病毒L株抗原液以及猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的制备按照实施例1的方法进行制备，将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照1:1:1的比例进行配比制备三联灭活疫苗，其余均与实施例1相同。
实施例3三联灭活疫苗的制备
猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液，猪细小病毒L株抗原液以及猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的制备按照实施例1的方法进行制备，将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照2:1:1的比例进行配比制备三联灭活疫苗，其余均与实施例1相同。
实施例4三联灭活疫苗的制备
猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液，猪细小病毒L株抗原液以及猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的制备按照实施例1的方法进行制备，将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照1:2:1的比例进行配比制备三联灭活疫苗，其余均与实施例1相同。
实施例5三联灭活疫苗的制备
猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液，猪细小病毒L株抗原液以及猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的制备按照实施例1的方法进行制备，将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照1:2:2的比例进行配比制备三联灭活疫苗，其余均与实施例1相同。
实施例6三联灭活疫苗的制备
猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液，猪细小病毒L株抗原液以及猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的制备按照实施例1的方法进行制备，将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照2:2:1的比例进行配比制备三联灭活疫苗，其余均与实施例1相同。
实施例7三联灭活疫苗的制备
猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液，猪细小病毒L株抗原液以及猪流感H3N2亚型HLJ株抗原液的制备按照实施例1的方法进行制备，将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液、PPV L株抗原液和SIV H3N2亚型HLJ株抗原液按照2:1:2的比例进行配比制备三联灭活疫苗，其余均与实施例1相同。
实验例1三联灭活疫苗中各抗原组分之间配比比例的优化试验
1试验用疫苗
表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201801，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝1:1:2，为实施例1中制备的制品)；表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201802，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝1:1:1，实施例2制备)；表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201803，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝2:1:1，实施例3制备)；表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201804，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝1:2:1，实施例,4制备)；表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201805，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝1:2:2，实施例,5制备)；表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201806，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝2:2:1，实施例6制备)；表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒、猪细小病毒和猪流感(H3N2亚型)三联灭活疫苗，(批号为201807，PCV3Cap：PPV：SIV:H3N2亚型＝2:1:2，实施例7制备)。猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗单苗(批号201801)；猪细小病毒灭活疫苗单苗(批号：201801)；猪流感灭活疫苗(H3N2亚型)(批号：201801)。
2疫苗的检验
2.1全身不良反应安全检验
取50头4周龄左右的将康仔猪(猪圆环病毒3型血清抗体阴性、猪细小病毒血清HI抗体效价＜1:8，猪流感病毒H3N2亚型HI抗体效价＜1:10)，随机分成10组，每组5头。分别接种上述10种疫苗，每种疫苗每头猪经颈部肌肉接种4.0ml，观察14日。结果免疫猪全部健活，且没有出现由疫苗引起的局部和
2.2效力检验
取55头4周龄左右的健康仔猪(猪圆环病毒3型血清抗体阴性、猪细小病毒血清HI抗体效价＜1:8，猪流感病毒H3N2亚型HI抗体效价＜1:10)，随机分成11组，每组5头。选择其中10组，分别接种上述10种疫苗，每种疫苗每头猪经颈部肌肉接种2.0ml；第11组作为非免疫空白对照，每头猪经颈部肌肉接种灭菌PBS 2.0ml。免疫组和对照组在相同条件下饲养。免后28天采血，分离血清，测定PCV3的ELISA抗体效价、PPV血清HI抗体效价以及猪流感H3N2亚型亚型血清HI抗体效价，结果见附图2。试验结果表明，不同配比比例的疫苗免疫动物后，PCV3 Cap蛋白：PPV：SIV:H3N2的比例为1:1:2、1:1:1及1:2:2的比例时，能取得良好的免疫效果，其中疫苗的配苗比例为1:1:2时，免疫效果最好。
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<110> 哈药集团生物疫苗有限公司
<120> 猪圆环病毒3型、猪细小病毒和猪流感三联灭活疫苗及其制备方法
<130> HLJ-3002-181119A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Aritifical sequence
<400> 1
cgcggatccc cgccatgaga cacagagcga ggcg 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Aritifical sequence
<400> 2
ccgctcgagt cacttagaga acggacttgt aac 33

Claims (4)

1.一种防治猪圆环病毒综合症、猪细小病毒病和猪流感的三联灭活疫苗，其特征在于，包括：灭活的猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和灭活的猪流感病毒的抗原液和疫苗佐剂；其中，灭活的猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、灭活的猪细小病毒的抗原液和灭活的猪流感病毒的抗原液的配比比例为1：1：2；
所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液的制备方法包括：（1）将表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的ORF2基因构建到杆状病毒上，得到重组杆状病毒，将重组杆菌病毒按MOI为1.0接种量接种到处于对数生长期Sf9细胞悬液进行病毒的增殖培养；（2）收获病毒培养物；（3）将收获的病毒培养物冻融后离心去除细胞碎片，收集上清，即得；
所述猪细小病毒的抗原液的制备方法包括：（1）将猪细小病毒L毒株按1%的接种量接种于处于对数生长期ST细胞悬液进行病毒的增殖培养；（2）收获病毒培养物；（3）将收获的病毒培养物冻融后，离心去除细胞碎片，收集上清，即得；
所述猪流感病毒的的抗原液的制备方法包括：（1）将猪流感H3N2亚型HLJ病毒株按1%接毒量接种于处于对数生长期MDCK细胞悬液并加入终浓度为2.5μg/ml的TPCK-胰酶进行病毒的增殖培养；（2）收获病毒培养物；（3）将收获的病毒培养物冻融后，离心去除细胞碎片，收集上清，即得；
所述疫苗佐剂为Montanide ISA 15A VG佐剂。
2.一种制备权利要求1所述三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原液、猪细小病毒的抗原液和猪流感病毒的抗原液灭活；（2）灭活后的抗原液混合在一起后再与疫苗佐剂混合均匀，乳化，即得。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的抗原液的灭活方法是向抗原液中加入BEI进行灭活；其中，向抗原液中所加入的BEI溶液至其终浓度为5mM，灭活时间为24~48h。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中将灭活后的抗原液混合在一起后与Montanide ISA 15A VG按照9:1的体积比混合得到水相混合物；将水相混合物加入乳化罐中后再加入油相佐剂进行搅拌乳化，静止，即得；其中，所述的搅拌转速为800 r/min，所述的搅拌时间为30分钟，所述的静止时间为30分钟。
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