CN109535190B - meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种meso‑吡咯酮BODIPY染料粘度探针及其制备方法和应用，其中，所述meso‑吡咯酮BODIPY染料粘度探针的结构如式(I)所示；
其制备方法简单，而且对粘度具有高选择性和高灵敏度，可用于实时监测细胞凋亡过程中粘度的升高，也可作为一种实用的粘度探针用来实时定量检测细胞内不同区域的粘度值，进而探测细胞内微环境，为一些疾病的早期诊疗提供重要信息。
Description
技术领域
本发明涉及荧光染料探针领域，具体地，涉及meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物体系的微环境粘度与很多病理过程相关，对其生理功能具有重要的意义。例如微环境粘度的改变可能会导致老年痴呆症、糖尿病等很多疾病。氟硼二吡咯甲川荧光染料(BODIPY)凭借其优异的光化学物理性质，如高摩尔消光系数、高荧光量子产率、高光稳定性、窄尖的发射信号以及容易修饰衍生等，备受关注。近年来，目前以M.K.Kuimova为代表的科学家基于meso位芳环旋转的BODIPY设计开发了一系列粘度探针(Chem.Sci.2015,6,5773；J.Mater.Chem.C 2016,4,2828；Chem.Sci.2017,8,3523.)。
Figure 1.目前发展的在BODIPY分子骨架的1,7位都没有取代基同时在meso位有苯基的环境敏感粘度BODIPY荧光探针结构A，没有粘度相应的1,7位都取代基的BODIPY B，以及我们在本发明中发展的1,7位都有取代基的AIE型meso-2-吡咯酮BODIPY结构。
通过Figure 1可以看出，目前发展的这些粘度响应探针在BODIPY A分子骨架的1,7位都没有取代基同时在meso位有苯基，而且绝大多数都是聚集诱导荧光淬灭型(Aggregates-induced quenching,AIQ)的。在Figure 1的B结构中，1,7位有取代基的BODIPY的meso位芳环旋转受到限制，没有粘度响应活性，同时也是AIQ型。因此，设计开发新型的聚集荧光增强型(Aggregates-induced emission,AIE)的BODIPY粘度探针具有十分重要的意义。
在此基础上，本发明提供了一类聚集诱导荧光增强型的粘度探针，同时该类meso-吡咯酮BODIPY探针分子在分子骨架的1,7位都有取代基。其对粘度具有高选择性和高灵敏度，且在甲醇和甘油不同比例的体系中的荧光强度和荧光寿命和相应的溶液粘度指数呈正相关，其可作为一种实用的粘度探针用来实时定量检测细胞内不同区域的粘度值，进而探测细胞内微环境，为一些疾病的早期诊疗提供重要信息。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一类结构新颖的粘度探针及其应用。该类探针制备方法简单，对粘度具有高选择性和高灵敏度，可作为一种实用的粘度探针用来实时定量检测细胞内不同区域的粘度值，进而探测细胞内粘度的变化。
为了实现上述目的，本发明提供了一种meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针，其中，所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的结构如式(I)所示；
其中，R1、R2各自独立地选自H、C1-C12的直链或者支链烷基、C3-C12的直链或者支链环烷基团、卤素、芳香基团、-S-R3、-O-R3；
其中，R3选自H、C1-C12的直链或者支链烷基、C1-C12的直链或者支链环烷基团、芳香基团、(CH2)nCH2SO3H、(CH2)nCH2OH、(CHOH)nCH2OH、(CH2)nCH2Br、(CH2)nCH2(PPh3)Br、(CH2)nCH2(PPh3)I、(CH2)nCH2(NEt3)Br、(CH2)nCH2(NEt3)I；
且n为不小于0的整数。
本发明还提供了一种根据上述所述的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的制备方法，其中，所述制备方法包括：在第一溶剂存在的条件下，将草酰氯和吡咯衍生物混合进行第一接触反应，制得中间体M1；而后向中间体M1中依次加入三乙胺和三氟化硼乙醚进行第二接触反应，制得meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针。
本发明还提供了一种根据上述所述的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针在定量检测细胞粘度中的应用。
通过上述技术方案，本发明通过将草酰氯和吡咯衍生物通过“一锅法”直接制得meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针，其制备方法简单，且原料易得。同时，上述方法制得的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针在BODIPY分子骨架的1,7位都具有取代基，且其在溶液中的荧光强度和荧光寿命和相应的溶液粘度指数呈正相关，其可作为一种实用的粘度探针用来实时定量检测细胞内不同区域的粘度值，进而探测细胞内微环境，为一些疾病提供重要信息。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1a是实施例1中制得的A1在水和乙腈体系中的紫外可见吸收光谱图；
图1b是实施例1中制得的A1在水和乙腈体系中的荧光信号图；
图1c是实施例1中制得的A1在甲醇和甘油体系中不同粘度环境下的荧光寿命，曲线自下而上对应的粘度顺次为0.6cP、4.8cP、10cP、23cP、38cP、64cP、109cP、202cP、360cP；
图1d是实施例1中制得的A1的荧光寿命值与不同环境中的粘度指数之间的线性关系图；
图2是不同浓度的实施例1中制得的A1对细胞的毒性试验数据图；
图3A是应用例中A1(5μM,λex＝515nm,λem＝520-600nm)在MCF-7细胞内的荧光成像照片；
图3B是应用例中A1在MCF-7细胞内的明场照片；
图3C是应用例中A1在MCF-7细胞内的荧光成像照片和明场照片的叠加图；
图4A-图4E是应用例中在药物依托泊苷刺激细胞不断凋亡促使MCF-7细胞粘度逐渐变大的试验中的荧光寿命成像图
图4F是不同时间下荧光寿命与细胞内相应的粘度之间的关系图；
图5a是实施例1中制得的A1在MCF-7细胞中的荧光寿命成像图；
图5b是在图5a中的A1的平均寿命曲线图；
图5c是在图5a中标识为1n的细胞区的荧光寿命曲线图；
图5d是在图5a中标识为2n的细胞区的荧光寿命曲线图。
附图标记说明
1、在乙腈和含水量为10％-70％的水和乙腈体系中的紫外可见吸收光谱；
2、在含水95％的水和乙腈体系中的紫外可见吸收光谱；
3、在含水99％的水和乙腈体系中的紫外可见吸收光谱；
4、在含水90％的水和乙腈体系中的紫外可见吸收光谱；
5、在含水80％的水和乙腈体系中的紫外可见吸收光谱；
6、在含水90％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
7、在含水95％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
8、在含水99％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
9、在含水80％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
10、在乙腈中的荧光发射光谱；
11、在含水10％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
12、在含水20％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
13、在含水30％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
14、在含水40％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
15、在含水50％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
16、在含水60％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱；
17、在含水70％的水和乙腈体系中的荧光发射光谱。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针，其中，所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的结构如式(I)所示；
其中，R1、R2各自独立地选自H、C1-C12的直链或者支链烷基、C3-C12的直链或者支链环烷基团、卤素、芳香基团、-S-R3、-O-R3；
其中，R3选自H、C1-C12的直链或者支链烷基、C1-C12的直链或者支链环烷基团、芳香基团、(CH2)nCH2SO3H、(CH2)nCH2OH、(CHOH)nCH2OH、(CH2)nCH2Br、(CH2)nCH2(PPh3)Br、(CH2)nCH2(PPh3)I、(CH2)nCH2(NEt3)Br、(CH2)nCH2(NEt3)I；
且n为不小于0的整数。其中，这里的PPh3为三苯基膦基，NEt3为三乙胺基。
本发明通过将草酰胺和吡咯衍生物通过“一锅法”直接制得meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针，其制备方法简单，且原料易得。同时，上述方法制得的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针在BODIPY分子骨架的1,7位都具有取代基，且其在溶液中的荧光强度和荧光寿命和相应的溶液粘度指数呈正相关，其可作为一种实用的粘度探针用来实时定量检测细胞内不同区域的粘度值，进而探测细胞内微环境，为一些疾病提供重要信息。
进一步优选的实施方式中，R1选自甲基，R2选自乙基。
本发明还提供了一种根据上述所述的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在第一溶剂存在的条件下，将草酰氯和吡咯衍生物混合进行第一接触反应，制得中间体M1；而后向中间体M1中加入三氟化硼乙醚进行第二接触反应，制得meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针。
一种更为优选的实施方式中，所述制备方法还包括对第一接触反应制得的中间体蒸发浓缩后，在第二溶剂存在的条件下，将中间体M1与三氟化硼乙醚混合进行第二接触反应。
上述原料的用量可以在宽的范围内选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，相对于1mmol的草酰氯，所述吡咯衍生物的用量为2-10mmol，所述三氟化硼乙醚的用量为1-20mL。
上述第一溶剂和第二溶剂可以采用本领域技术人员常规能够使用的类型，例如，一种优选的实施方式中，所述第一溶剂和所述第二溶剂各自独立地选自三氯甲烷、1,2-二氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、乙腈、四氢呋喃和乙酸乙酯中的一种或多种。
进一步优选的实施方式中，所述第一溶剂和所述第二溶剂为1,2-二氯甲烷。
一种优选的实施方式中，所述第一接触反应的反应温度为-20℃～35℃，反应时间为1-100h；所述第二接触反应的反应温度为60～120℃，反应时间为1-100h。
更为优选的实施方式中，所述制备方法还包括对制得的中间体M1进行碱处理。
进一步优选的实施方式中，碱处理过程包括加入有机碱使中间体M1呈碱性，和/或，采用无机碱进行萃取和洗涤后使中间体M1呈碱性。
上述有机碱和无机碱的类型可以在宽的范围内选择，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述有机碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯和二乙胺中的至少一种；所述无机碱为碳酸氢钠及其水溶液、碳酸氢钾及其水溶液、碳酸钠及其水溶液、氢氧化钠及其水溶液、氢氧化钾及其水溶液和碳酸钾及其水溶液中的至少一种。
本发明还提供了一种根据上述所述的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的应用，其中，所述应用方法为将所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针用于定量检测细胞内微环境粘度。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述应用方法为：通过检测所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的荧光寿命实现细胞内微环境粘度的检测，为一些疾病的早期诊疗提供重要信息。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
在氩气保护下取2,4-二甲基-3-乙基吡咯(0.95mL，7mmol)(表示此处使用0.95mL的2,4-二甲基-3-乙基吡咯，换算为物质的量为7mmol，下同)加入60mL1,2-二氯乙烷中，然后在冰水浴条件下缓慢滴加被10mL重蒸1,2-二氯乙烷稀释的草酰氯(0.17mL，2mmol)，将混合液室温搅拌3h。然后加入2mL三乙胺和3mL三氟化硼乙醚，回流过夜。反应结束后冷却到室温后，反应中间体转移到分液漏斗中，加入二氯甲烷和水。分离有机相，相应的水相用二氯甲烷萃取数次，合并有机层。水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，真空下除去溶剂。粗产品用硅胶柱层析法纯化，用二氯甲烷和正己烷重结晶得到化合物红色固体meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A1。其产量为163mg，产率为18％。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):9.49(brs,1H；NH),2.52(s,6H；CH3),2.36-2.28(m,9H；CH2,CH3),1.86(s,9H；CH3),1.00(t,J＝7.2Hz,9H；CH3)；13C NMR(75MHz,CDCl3,δ):179.2,154.8,136.9,136.7,136.3,132.7,130.5,128.4,128.2,126.1,17.1,15.2,14.7,12.7,11.9,11.1,11.0,10.6.HRMS(APCI)m/z:[M+H]+calcd forC26H35BF2N3O,454.2841；found 454.2831.
并对A1在不同种溶剂中的光谱性质进行了检测，测试结果如表1所示：
表1
表1中：λabs max为最大吸收波长；logεmax为摩尔吸光系数的log值；λem max最大发射波长；φ为荧光量子产率；Stokes Shift为斯托克斯位移。
其中，制得的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A1在不同比例的水和乙腈混合体系中的紫外可见吸收光谱图如图1a所示。其在不同比例的水和乙腈混合体系中的荧光信号图如图1b所示。从1b可以看出，A1在70％-99％的含水体系中有聚集荧光增强，即证明其具有AIE活性。其在甲醇和甘油体系中在不同粘度环境下的荧光寿命图如图1c所示，其在不同粘度体系中的荧光寿命值与粘度指数之间的关系如图1d所示。
通过图1d可以看出，所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A1荧光寿命值与粘度指数之间呈良好的正相关线性关系。并且A1的荧光寿命(τ)与细胞内粘度(η)之间的线性关系绘制的曲线方程为：y＝0.29616x-0.15324；其中，y为logτ，x为logη，τ为所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的荧光寿命，单位为ns，η为细胞微环境内的粘度，单位为cP。这里的细胞内粘度即为试验中所测试的细胞内粘度。
应用例
A1在各种条件下的荧光寿命都是在515nm的激发波长下进行的，信号收集范围为520-600nm。其荧光成像照片和明场照片及二者的叠加图如图3A-图3C所示，可以看出，细胞在拍摄时均为活细胞，并且成像良好。不同浓度下的A1对细胞的毒性试验如图2所示，可以看出，其存活率均在85％以上，其对于细胞毒性还是比较小的。
浸染A1的MCF-7细胞用PBS缓冲溶液冲洗后，加入依托铂苷药物以刺激细胞凋亡使其粘度逐渐增大。然后，分别在0、5、15、30、45、60min时间段对其进行双光子进行荧光寿命成像。通过图4A-图4E可以看出，随着细胞的凋亡，粘度变大，A1的荧光寿命也逐渐变长，通过图4F可以看出，A1的荧光寿命与细胞内相应的粘度指数之间呈良好的正相关线性关系。
通过图5b可以看出，A1在MCF-7细胞中的平均寿命在0.80-4.50ns之间，A1在标识为1n区域中的寿命基本为2.25ns，1在标识为2n区域中的寿命基本为2.11ns。
通过上述应用例可知，我们可以根据上述meso-吡咯酮BODIPY的荧光寿命与细胞内相应的粘度指数的线性关系，分别求出1n区域和2n区域的具体粘度指数，进而可以更多的疾病信息等。
实施例2
将实施案例1中的2,4-二甲基-3-乙基吡咯换成2,4-二甲基吡咯(0.73mL，7mmol)，其他条件和操作不变，得到红色固体meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A2。产量为169mg，产率为23％。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):9.39(brs,1H；NH),6.01(s,2H),5.84(s,1H),2.54(s,6H；CH3),2.32(s,3H；CH3),1.95(s,6H；CH3),1.93(s,3H；CH3)；13C NMR(75MHz,CDCl3,δ):178.9,156.8,141.6,138.7,137.8,133.3,129.1,128.7,121.0,113.8,14.8,13.6,13.4,13.0.HRMS(APCI)m/z:[M+H]+calcd for C20H23BF2N3O,370.1902；found 370.1907.
并对A2在不同种溶剂中的光谱性质进行了检测，测试结果如表2所示：
表2
表2中：λabs max为最大吸收波长；logεmax为摩尔吸光系数的log值；λem max最大发射波长；φ为荧光量子产率；Stokes Shift为斯托克斯位移。
同样地，我们通过测定本发明制备的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A2在不同粘度(η)环境下的荧光寿命(τ)，经过整合数据分析也得到了与A1类似的线性关系。其荧光寿命(τ)与细胞内粘度(η)的线性关系方程为y＝0.56887x-1.17651，Pearson’s r＝0.997.
同样，按照本发明meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A1的操作方式，我们也可以测试meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针A2在细胞或其他粘度环境的荧光寿命数值，带入这个方程，进而得到细胞内或者其他粘度环境中的粘度指数，为一些疾病早期诊疗提供一些信息。
A2的应用例与A1类似，在此不再赘述。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (11)
1.一种meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针，其特征在于，所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的结构如式(I)所示；
其中，R1选自甲基，R2选自乙基或氢。
2.一种根据权利要求1所述的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在第一溶剂存在的条件下，将草酰氯和吡咯衍生物混合进行第一接触反应，制得中间体M1；而后向中间体M1中加入三氟化硼乙醚进行第二接触反应，制得meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针；
其中，所述吡咯衍生物为2,4-二甲基-3-乙基吡咯或2,4-二甲基吡咯。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括对第一接触反应制得的中间体蒸发浓缩后，在第二溶剂存在的条件下，将中间体M1与三氟化硼乙醚混合进行第二接触反应。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，相对于1mmol的草酰氯，所述吡咯衍生物的用量为2-10mmol，所述三氟化硼乙醚的用量为1-20mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述第一溶剂和所述第二溶剂各自独立地选自三氯甲烷、1,2-二氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、乙腈、四氢呋喃和乙酸乙酯中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述第一溶剂和所述第二溶剂为1,2-二氯甲烷。
7.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述第一接触反应的反应温度为-20℃～35℃，反应时间为1-100h；
所述第二接触反应的反应温度为60～120℃，反应时间为1-100h。
8.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括对制得的中间体M1进行碱处理。
9.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，碱处理过程包括加入有机碱使中间体M1呈碱性。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述有机碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯和二乙胺中的至少一种。
11.一种根据权利要求1所述的meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针的应用，其特征在于，所述应用方法为将所述meso-吡咯酮BODIPY染料粘度探针用于定量检测细胞内微环境粘度；
其中，所述定量检测细胞内微环境粘度不用于疾病的诊断和治疗。
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