CN109529054A - 间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法和应用，涉及生物技术领域。该间充质干细胞制剂的评价方法包括提供接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物，然后根据预设指标评价间充质干细胞的致瘤性；其中，接受间充质干细胞制剂给药的受试动物的给药剂量为0.5×106～5×106cells/只；预设指标包括如下指标：(a1)体重变化；(a2)脏器重量和脏器系数；(a3)所述受试动物体内是否有结节形成。该评价方法缓解了现有技术中存在的缺乏一种有效地对间充质干细胞制剂的致瘤性的评价方法的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法和应用。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新和多向分化能力，促进骨、软骨、韧带、肌肉和脂肪组织等间质组织再生。间充质干细胞还具有其特殊的生物学特征，包括：免疫调节作用；造血支持功能和多种生物活性物质的分泌能力。间充质干细胞被称为进入临床试验，治疗免疫性疾病和多种组织损伤相关疾病，且最有希望成为继造血干细胞后，进入临床应用阶段的另一个成体干细胞。因间充质干细胞来源丰富、制备简单、多能性和低致瘤性具有很大的临床利用价值。目前，在许多国家间充质干细胞已经批准进入多个临床实验，用于治疗移植物抗宿主病、克罗恩氏病、肝脏纤维化和骨关节损伤等多种疾病。由于间充质干细胞来源广泛，体外易于操作，造血支持和免疫调节作用明确，因此间充质干细胞治疗具有广阔的前景。
虽然间充质干细胞已经进入III期临床试验，其安全性问题仍需得到重视。间充质干细胞在临床前的安全性评价，特别是致瘤性方面的评价缺乏评价指标和相应的技术手段。因此一种有效的间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法是保证间充质干细胞相关药物和治疗方法在临床上安全应用的保证。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法，缓解了现有技术中存在的缺乏有效地对间充质干细胞制剂进行致瘤性评价的技术问题。
本发明的第二目的在于提供间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供了一种间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法，所述评价方法包括：提供接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物，然后根据预设指标评价间充质干细胞的致瘤性；
所述接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物的给药剂量为0.5×106～5×106cells/只；
所述预设指标包括如下指标：
(a1)体重变化；
(a2)脏器重量和脏器系数；
(a3)所述受试动物体内是否有结节形成。
优选地，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始，每周获取所述受试动物的体重。
优选地，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始10周后，获取所述受试动物的脏器重量和脏器系数；
和，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始6个月后，获取所述受试动物的脏器重量和脏器系数；
优选地，所述脏器包括心、肝、脾、肺、肾和胸腺中的一种或者多种。
优选地，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始10周后，检查所述受试动物体内是否出现结节；
和，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始6个月后，检查所述受试动物体内是否出现结节；
优选地，所述检查所述受试动物体内是否出现结节包括如下(b1)和/或(b2):
(b1)处死受试动物后解剖，观察脏器是否有结节形成；
(b2)处死受试动物后获取受试动物脏器进行病理组织学检测。
优选地，所述评价方法还包括空白对照组；所述空白对照组包括接受生理盐水给药的受试动物；
优选地，所述空白对照组和所述接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物分别独立的包含3～5只受试动物。
优选地，所述受试动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、小型猪、猴、雪貂、土拨鼠和裸鼹鼠中的一种或者多种；优选为小鼠。
优选地，所述受试动物为BALB/c Nude小鼠；所述BALB/c Nude小鼠为6-8周龄，重量为18～20g的雌性小鼠。
优选地，所述BALB/c Nude小鼠的给药剂量为1×106～2.5×106cells/只；优选为2×106cells/只。
优选地，所述给药的给药方式包括皮下给药、肌内给药、静脉内给药、阴道内给药、子宫内给药、肺部给药或直肠给药；
优选地，所述给药方式包括静脉内给药；更优选为小鼠尾静脉输入给药。
本发明还提供了上述间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用；
优选地，所述药物包括人脐带间充质干细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法，一方面提供了一个合理的给药的剂量范围，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题；另一方面，该方法综合评价了受试动物在接受了间充质干细胞制剂给药后的体重变化，脏器重量和脏器系数以及受试动物体内是否有结节形成共三项指标，使评价指标的设置更科学合理。传统的致瘤性评价往往只评价受试动物体内是否形成结节，而忽略了受试动物在实验过程中由于其他因素导致的身体机能下降，使受试动物更易患肿瘤的问题。本申请综合评价受试动物给药后的身体变化，不仅关注受试动物是否在体内出现结节，还关注受试动物的体征改变，综合的评价了间充质干细胞制剂对受试动物的致瘤程度。基于上述发明构思，本发明还提供了间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用，以协助间充质干细胞作为活性成分或者辅助成分的药物的开发。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后小鼠的体重变化；
图1B为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月内的小鼠的体重变化；
图2A为本发明实施例提供的正常对照组给药10周后对小鼠脏器的观察，脏器内无肉眼可见的结节形成；
图2B为本发明实施例提供的MSC注射组给药10周后对小鼠脏器的观察，脏器内无肉眼可见的结节形成；
图2C为本发明实施例提供的正常对照组给药6个月后对小鼠脏器的观察，脏器内无肉眼可见的结节形成；
图2D为本发明实施例提供的MSC注射组给药6个月后对小鼠脏器的观察，脏器内无肉眼可见的结节形成；
图3A为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后小鼠心的脏器系数；
图3B为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后小鼠肝的脏器系数；
图3C为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后小鼠脾的脏器系数；
图3D为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后小鼠肺的脏器系数；
图3E为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后小鼠肾的脏器系数；
图4A为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月后小鼠心的脏器系数；
图4B为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月后小鼠肝的脏器系数；
图4C为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月后小鼠脾的脏器系数；
图4D为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月后小鼠肺的脏器系数；
图4E为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月后小鼠肾的脏器系数；
图5A为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药10周后，小鼠主要脏器病理组织学检测；
图5B为本发明实施例提供的正常对照组和MSC注射组给药6个月后，小鼠主要脏器病理组织学检测。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
本发明提供了一种间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法，所述评价方法包括：提供接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物，然后根据预设指标评价间充质干细胞的致瘤性；
所述接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物的给药剂量为0.5×106～5×106cells/只，例如可以为但不限于为0.5×106cells/只、1×106cells/只、1.5×106cells/只、2×106cells/只、2.5×106cells/只、3×106cells/只、3.5×106cells/只、4×106cells/只、4.5×106cells/只、5×106cells/只、5.5×106cells/只或6×106cells/只；
所述预设指标包括如下指标：(a1)体重变化；(a2)脏器重量和脏器系数；和(a3)所述受试动物体内是否有结节形成。
间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，促进骨、软骨、韧带、肌肉和脂肪组织等间质组织再生。因间充质干细胞来源丰富、制备简单和多能性具有很大的临床利用价值。本发明提供的间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法，一方面提供了一个合理的给药的剂量范围，避免了由于给药量不合理导致的评价结果不准确的问题；另一方面，该方法综合评价了受试动物在接受了所述间充质干细胞制剂给药后的体重变化，脏器重量和脏器系数和所述受试动物体内是否有结节形成共三项指标，这三项指标能够全面评价间充质干细胞是否对小鼠身体存在不良影响，是否对各个器官存在不良影响，是否在各个器官内存在致瘤作用，使评价指标的设置更科学合理。传统的致瘤性评价往往只评价受试动物体内是否形成结节，而忽略了受试动物在实验过程中由于其他因素导致的身体机能下降，使受试动物更易患肿瘤的问题。本申请综合评价受试动物给药后的身体变化，不仅关注受试动物是否在体内出现结节，还关注受试动物的体征改变，综合的评价了间充质干细胞制剂对受试动物的致瘤程度。
需要说明的是，本发明所述的间充质干细胞制剂指的是包含人间充质干细胞的试剂、药物或者间充质干细胞本身；本发明所述的给药剂量，是以间充质干细胞制剂中起到活性成分的间充质干细胞的数量计算的。所述间充质干细胞分离自例如可以为但不限于为骨髓、骨膜、血管、脂肪、肌肉、外周循环、脐带血、皮肤或牙体组织等；所述间充质干细胞例如可以为但不限于为实验室分离得到的细胞或者市售细胞系；所述间充质干细胞的来源例如可以为但不限于为人或者其他可分离到间充质干细胞的受试动物；所述间充质干细胞例如可以为但不限于为通过本领域可接受的手段得到的经诱变、突变或者经基因工程的改造得到的间充质干细胞。可以理解的是，本发明的目的是评价间充质干细胞制剂的致瘤性，因此对间充质干细胞的来源不做限制。
在一些优选的实施方式中，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始，每周获取所述受试动物的体重。
在一些优选的实施方式中，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始10周后，获取所述受试动物的脏器重量和脏器系数；和，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始6个月后，获取所述受试动物的脏器重量和脏器系数；其中，脏器系数＝器官重量/体重；所述脏器优选包括受试动物的主要内脏器官，例如可以为但不限于为心、肝、脾、肺、肾和胸腺中的一种或者多种。
在一些优选的实施方式中，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始10周后，检查所述受试动物体内是否出现结节；和，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始6个月后，检查所述受试动物体内是否出现结节。优选按照如下两种方法中的至少一种检查所述受试动物体内是否出现结节：(b1)处死受试动物后解剖，观察脏器是否有结节形成，解剖可以直接的观察受试动物的内脏病变；(b2)处死小鼠后获取小鼠脏器进行病理组织学检测，以进一步确定受试动物的病变状况。
在一些优选的实施方式中，所述评价方法还包括设置空白对照组进行方法学验证，从而进一步减小评价误差；所述空白对照组包括接受生理盐水给药的受试动物。在一些优选的实施方式中，所述空白对照组和所述接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物分别独立的包含3～5只受试动物。
在一些优选的实施方式中，所述受试动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、小型猪、猴、雪貂、土拨鼠和裸鼹鼠中的一种或者多种；优选为小鼠。所述受试动物优选为BALB/cNude小鼠；所述BALB/c Nude小鼠为6-8周龄，重量为18～20g的雌性小鼠。
在一些优选的实施方式中，所述接受所述间充质干细胞制剂给药的BALB/c Nude小鼠的给药剂量为1×106～2.5×106cells/只，例如可以为但不限于为1×106cells/只、1.5×106cells/只、2×106cells/只或2.5×106cells/只；优选的给药剂量为2×106cells/只。
在一些优选的实施方式中，所述给药的给药方式包括皮下给药、肌内给药、静脉内给药、阴道内给药、子宫内给药、肺部给药或直肠给药；优选地，所述给药方式包括静脉内给药；更优选为小鼠尾静脉输入给药。
本发明还提供了上述间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用，以协助以间充质干细胞作为活性成分或者辅助成分的药物的开发。在一些优选的实施方式中，所述药物包括人脐带间充质干细胞，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能。脐带间充质干细胞拥有MSC的全部特性，并且含量丰富，易于分离培养。与其他来源的MSC相比，UC-MSC更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，UC-MSC不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。因此UC-MSC在制备药物的应用中越加广泛，使用上述间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法可为UC-MSC在制备药物的研究中提供安全性资料，为临床安全用药提供参考。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例
本实施例评价的间充质干细胞制剂为人脐带间充质干细胞(MSC)，即送达即给药。
实验设计：
(1)实验受试动物：BALB/c Nude小鼠，6-8周龄，雌性，19±1g。
(2)组别设置：全部小鼠随机分为正常对照组(control)和MSC注射组，正常对照组和MSC注射组各4只。
(3)给药途径：尾静脉给药。
(4)给药剂量：正常对照组(control)尾静脉注射200μl氯化钠注射液；MSC注射组尾静脉注射2×106个/只的MSC。
试验方法：
(1)实验受试动物：
受试动物接收：实验受试动物由实验人员、受试动物保障部门人员及兽医共同接收。接收时运输工具符合要求，受试动物供应单位提供的受试动物合格证明内容与申请购买的受试动物种属、级别、数量一致。外包装符合要求且无破损。受试动物外包装经75％酒精喷雾消毒、紫外灯照射3分钟后由传递柜传入检疫室。
检验：在检疫室打开受试动物外包装，受试动物性别及数量与受试动物合格证明所载事项一致。用标记笔在小鼠尾根部编号标记，然后逐一对受试动物进行检查，包括检查性别、体重、头部、躯干、尾部、四肢、皮毛、精神和活动等，所有受试动物均未见明显异常。受试动物检验后放入受试动物饲养笼中，分笼饲养，每笼3-5只，并在笼具上悬挂标签，放在检疫室中进行适应期饲养，检验中所有受试动物均未见异常。
(2)供试品配制：
供试品配制方法：正常对照组(control)直接取用市购0.9％氯化钠注射液，无需配制；MSC注射组使用的人脐带间充质干细胞即送即用。
供试品保存：脐带间充质干细胞如不立即使用，暂存于2-8℃冰盒，8小时内有效。
实验剩余供试品的处理：供试品为细胞制品，剩余供试品高压灭活后放置-20℃冰柜中，进行统一处理。
给药：小鼠单次静脉给药，尾静脉缓慢注射。
(3)检查指标
(ⅰ)小鼠行为观察：在饲养中，每周定期观察小鼠的状况，并至少称重一次，并记录体重。
(ⅱ)脏器是否有结节形成：在注射MSC后，饲养周期达到10周和6个月时，通过颈椎脱臼的方法处死小鼠，并解剖。观察主要脏器是否有结节形成，拍照。
(ⅲ)脏器重量及脏器系数统计：饲养周期达到10周和6个月时，剖检后取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺，剔除各脏器附着的脂肪，称取各脏器重量，并计算脏器系数(脏器系数＝脏器重量/体重×1000)。计算器官系数(mg/g)(器官系数＝器官重量/体重)。
(ⅳ)病理组织学检测：为了观察脏器内部是否有结节的形成，对小鼠的主要脏器进行分离，制备石蜡切片，通过HE染色观察小鼠各器官的情况。
实验结果：
(ⅰ)对照组和MSC注射组在给药后，6个月的饲养时间内，无死亡现象，精神状态和自主活动均正常，分泌物和排泄物亦未见异常，体重变化趋势相同，正常对照组和MSC注射组的小鼠体重变化如图1A和图1B所示。
(ⅱ)正常对照组和MSC注射组给药10周以及6个月后，MSC注射组和正常对照组营养状况都良好，各脏器均未见肉眼可见的显著变化，结果如图2A、图2B、图2C和图2D所示，各个脏器形态、色泽及质地均正常，且无肉眼可见的结节形成。
(ⅲ)脏器重量及系数统计显示正常对照组和MSC注射组的在分别给药注射氯化钠注射液和2×106个/只的MSC后10周和六个月后，小鼠脏器系数均无显著性差别，结果如图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图4A、图4B、图4C、图4D和图4E所示。
(ⅳ)病理组织学检测：正常对照组和MSC注射组给药10周以及6个月后主要脏器在组织学上没有显著差别，也未观察到结节的形成，结果如图5A和图5B所示。
实验结论：人脐带间充质干细胞在2×106个/只的剂量下对BALB/c Nude小鼠不致瘤。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法，其特征在于，所述评价方法包括：提供接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物，然后根据预设指标评价间充质干细胞的致瘤性；
所述接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物的给药剂量为0.5×106～5×106cells/只；
所述预设指标包括如下指标：
(a1)体重变化；
(a2)脏器重量和脏器系数；
(a3)所述受试动物体内是否有结节形成。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始，每周获取所述受试动物的体重。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始10周后，获取所述受试动物的脏器重量和脏器系数；
和，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始6个月后，获取所述受试动物的脏器重量和脏器系数；
优选地，所述脏器包括心、肝、脾、肺、肾和胸腺中的一种或者多种。
4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始10周后，检查所述受试动物体内是否出现结节；
和，以所述受试动物接受所述间充质干细胞制剂给药的时间开始6个月后，检查所述受试动物体内是否出现结节；
优选地，所述检查所述受试动物体内是否出现结节包括如下(b1)和/或(b2):
(b1)处死受试动物后解剖，观察脏器是否有结节形成；
(b2)处死受试动物后获取受试动物脏器进行病理组织学检测。
5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括空白对照组；所述空白对照组包括接受生理盐水给药的受试动物；
优选地，所述空白对照组和所述接受所述间充质干细胞制剂给药的受试动物分别独立的包含3～5只受试动物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的评价方法，其特征在于，所述受试动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、小型猪、猴、雪貂、土拨鼠和裸鼹鼠中的一种或者多种；优选为小鼠。
7.根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述受试动物为BALB/c Nude小鼠；所述BALB/c Nude小鼠为6-8周龄，重量为18～20g的雌性小鼠。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，所述BALB/c Nude小鼠的给药剂量为1×106～2.5×106cells/只；优选为2×106cells/只。
9.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述给药的给药方式包括皮下给药、肌内给药、静脉内给药、阴道内给药、子宫内给药、肺部给药或直肠给药；
优选地，所述给药方式包括静脉内给药；更优选为小鼠尾静脉输入给药。
10.权利要求1-9中任一项所述的间充质干细胞制剂致瘤性的评价方法在制备包含间充质干细胞的药物中的应用；
优选地，所述药物包括人脐带间充质干细胞。
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| CN104357383A (zh) * | 2014-10-11 | 2015-02-18 | 张炳强 | 人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用 |
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