CN109520977B - 一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及复合功能芯片技术领域，提供了一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片、制备及应用；在单一超浸润微芯片上进行电化学，荧光和表面拉曼增强（SERS）多信号输出检测疾病标志物；通过电化学沉积，溶剂修饰，光掩膜板刻蚀和溶液蒸发法得到多功能超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片；这种微芯片结合了超浸润体系液滴操控的优点以及石墨烯和纳米枝状金的功能化优点，通过三种检测结果输出手段相互对比验证，提高了检测的准确性，可以有效避免假阳性诊断。
Description
技术领域
本发明复合功能芯片技术领域，特别涉及一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片、制备及应用。
背景技术
大部分疾病的发生都伴随着体内某些特异性生物标志物的调控失衡，通过对这些生物标志物的监测可以有效地控制预防，早期诊断甚至彻底治愈这些疾病。现今通过对血液内的生物标志物的检测已经可以早期诊断部分疾病，但繁琐的检测流程和昂贵的检测费用使得其很难普及。为了解决这些问题，科学家开发出了便携式设备通过汗液，唾液，尿液和呼出气体等对疾病标志物进行快速便宜的检测。这些设备极大地降低了检测时间和成本，而由于设备单一的检测手段加之体液，呼出气体内这些特异性标志物浓度过低，非特异性检测和环境等因素导致检测准确性降低，易出现假阳性诊断。
多体系检测是通过两种或两种以上检测技术相结合如电化学和SERS结合，荧光和比色结合等，对同种检测物进行多信号输出检测。多种检测互不干扰，检测结果相互印证，极大地解决了非特异性检测，检测物浓度低和环境因素等导致的检测准确性低的问题。多体系的检测对检测芯片要求很高，要适用于多种检测设备，对多种信号进行响应，对检测液抓取固定，对低浓度检测物信号放大等。目前大多数检测芯片只对一种信号进行响应，极大地限制了多体系检测的发展应用。
超浸润微芯片是指在微芯片表面制备出具有超亲水和超疏水的两部分区域，通过两种极端的界面状态将液滴捕获并固定在超亲水区域。超浸润微芯片可通过缩小亲水区域面积将微升级液滴固定，富集及快速检测。
发明内容
本发明的目的就是克服现有技术的不足，提供了一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片、制备及应用，解决在快速检测体液内，生物疾病标志物时单一检测手段受环境，设备等问题影响造成的检测准确性底和误差大等问题，通过荧光，电化学和SERS三种手段对同一滴体液进行多体系检测，三种检测结果相互验证提高检测准确性，有效避免假阳性的诊断。
本发明的技术方案如下：
一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片，所述微芯片用于荧光、电化学和SERS多体系检测；所述微芯片自上而下依次包括：导电玻璃基底、钛层、平面金层、纳米枝状金层、超疏水表面，所述超疏水表面设置有超亲水阵列，超亲水阵列为纳米枝状金/石墨烯基底。
进一步的，所述钛层、平面金层均通过磁控溅射的方法修饰到所述导电玻璃的导电一侧；所述纳米枝状金层以电化学沉积的方法修饰到所述平面金层；对所述纳米枝状金层进行疏水处理，得到所述超疏水表面；在所述超疏水表面形成超亲水阵列；将石墨烯水溶液滴加到超亲水阵列孔内，蒸发后得到纳米枝状金/石墨烯基底。
进一步的，所述超亲水阵列通过在所述超疏水表面进行掩膜版法刻蚀得到。
一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、纳米枝状金制备：将导电玻璃充分清洗，在导电一侧分别磁控溅射一层钛层和金层，利用电化学沉积方法在氯金酸溶液中以-1.8 V电压沉积1000 s 得到超亲水的纳米枝状金结构；
步骤二、超浸润表面的修饰：将步骤一得到的纳米枝状金结构进行疏水处理，得到超疏水表面；通过掩膜板在紫外光或者plasma刻蚀破坏超疏水表面，得到超亲水阵列；
步骤三、纳米枝状金/石墨烯基底制备：将石墨烯水溶液滴加到步骤二制备的超亲水阵列孔内，蒸发后得到纳米枝状金/石墨烯基底。
一种上述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的荧光检测中的应用，石墨烯可吸附单链DNA，将有荧光标记的探针DNA修饰到纳米枝状金/石墨烯基底，当加入检测的miRNA后，miRNA与探针DNA结合形成双链，石墨烯对双链吸附力较弱，将双链释放到上清液中，随着miRNA浓度增加，荧光信号逐渐增强。
一种上述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的电化学检测中的应用，将一端修饰二茂铁的探针DNA修饰到纳米枝状金/石墨烯基底，当加入检测的miRNA后，miRNA与探针DNA结合形成双链，石墨烯对双链吸附力较弱，将双链释放到上清液中，纳米枝状金/石墨烯基底二茂铁数量减少，利用枝状金超灵敏电化学信号响应进行电化学miRNA检测，随着miRNA浓度增加，电信号逐渐降低。
一种上述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的SERS检测中的应用，将一端修饰拉曼信号的探针DNA修饰到纳米枝状金/石墨烯基底，当加入检测的miRNA后，miRNA与探针DNA结合形成双链，石墨烯对双链吸附力较弱，将双链释放到上清液中，通过纳米枝状金对拉曼信号的增强效果在纳米枝状金/石墨烯基底进行SERS检测，随着miRNA浓度增加，SERS信号逐渐减小。
一种上述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的多体系检测中的应用，探针DNA一端修饰电化学信号分子二茂铁，另一端修饰拉曼与荧光特征信号分子ROX，探针DNA同时对荧光，电化学和SERS响应。
进一步的，所述生物疾病标志物包括蛋白、miRNA和ctDNA。
本发明的有益效果为：通过电沉积，溶液浸泡和溶液蒸发法制得超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片（生物传感器），通过石墨烯与纳米枝状金优异性能结合实现了对生物标志物的荧光，电化学和SERS多体系检测；该发明通过多体系对同一检测液检测，解决了现今通过体液快速直接检测疾病时标志物浓度过低，检测装置和环境影响导致的准确性底的问题，三种检测结果相互对比验证提高了检测的准确性，有效的避免了假阳性检测；微芯片生产工艺简单，应用前景广阔。
附图说明
图1a所示为纳米枝状金扫描电镜表征图。
图1b所示为纳米枝状金/石墨烯扫描电镜表征图。
图2a所示为超疏水枝状金微芯片接触角表征图片。
图2b所示为超亲水枝状金/石墨烯微芯片接触角表征图片。
图3所示为超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片实物图。
图4所示为石墨烯沉积过程示意图。
图5a所示为水冲洗纳米枝状金/石墨烯基底实物图。
图5b所示为乙醇冲洗纳米枝状金/石墨烯基底实物图。
图6所示为不同基底电化学信号对比图。
图7所示为不同体积石墨烯沉积的显微图。
图8a所示为不同石墨烯量微芯片的电化学检测对比图。
图8b所示为不同石墨烯量微芯片的荧光检测对比图。
图8c所示为不同石墨烯量微芯片的SERS检测对比图。
图9所示为超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片多体系检测示意图。
图10a所示为超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片荧光检测不同浓度miRNA标准曲线图。
图10b所示为超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片SERS检测不同浓度miRNA标准曲线图。
图10c所示为超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片电化学检测不同浓度miRNA标准曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中，各附图所出现的相同标号代表相同的特征或者部件，可应用于不同实施例中。
下述发明实施例为解决现今通过体液快速直接检测疾病时标志物浓度过低，检测装置和环境影响导致的准确性底的问题。
实施例1
1、纳米枝状金基底制备：将导电玻璃片裁成1.5×2.5 cm规格，在食人鱼洗液（98%H2SO4：30% H2O2，V/V=3:1）中浸泡1 h，取出玻璃片分别浸没在丙酮，乙醇和超纯水中超声清洗30-40 min，取出玻璃片用氮气吹干。通过万用表确定玻璃导电一面向上，放在氧等离子清洗仪中清洗4-5 min。彻底清理表面后用磁控溅射仪在导电的一侧蒸镀一层钛再蒸镀一层金以保证下一步的枝状金不会脱落。纳米枝状金（图1a）是通过电化学沉积方法修饰到导电玻璃上的，其中导电玻璃作为工作电极，铂片为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，沉积液为1 mg/mL氯金酸溶液，沉积电压为-1.8 V，沉积时间为1800 S，得到所需的超亲水纳米枝状金基底，用乙醇和超纯水冲洗基底待用。
2、超疏水-超亲水阵列的制备：将得到的超亲水纳米枝状金基底浸泡在疏水修饰液（叔十二硫醇：乙醇，V/V=1：9）中，密封反应12-24 h，硫醇通过金硫键与枝状金稳定结合，用乙醇充分清洗除去未修饰上的硫醇，风干后得到超疏水纳米枝状金材料（图2a）。将订制的2.5×1.5 cm的铝质掩膜版盖在疏水芯片表面用长尾夹夹紧，模板上有2×3个大小相同的直径为1 mm的圆孔，将芯片与掩膜版一同放在等离子清洗仪中1-2 min，在圆孔处修饰的硫醇被等离子清洗仪分解掉形成亲水位点（图2b），由此制备出超疏水-超亲水阵列的表面材料（图3）。
3、纳米枝状金/石墨烯基底的制备：将5 mg石墨烯加入到10 mL水中，放在超声清洗仪中30-40 min使得石墨烯充分分散在水中，将石墨烯水溶液加入到得到的亲水位点中，待水分自然风干石墨烯沉到枝状金表面（图4），得到纳米枝状金/石墨烯基底（图1b）。
对超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片多体系检测可行性判断及优化分析：
（1）研究枝状金/石墨烯基底的稳定性。分别用水（图5a）和乙醇（图5b）冲刷亲水孔内沉积的石墨烯，石墨烯均稳定的存在于亲水孔内不会脱落，确认了纳米枝状金/石墨烯基底应用检测的可行性。
（2）研究枝状金/石墨烯对电化学检测的影响。采用两电极体系，微芯片为工作电极，Ag/AgCl 为对电极和参比电极，在工作电极滴加一滴检测液（包含0.1M KCL和5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.01 M的磷酸盐缓冲液）进行循环伏安扫描，对比导电玻璃，平面金，枝状金和枝状金/石墨烯基底的电化学信号（图6），四个基底都可测出完整的循环伏安曲线，枝状金与枝状金/石墨烯基底电化学信号相比于导电玻璃和平面金有明显增强，说明枝状金相对较大的比表面积提高了在电化学检测的灵敏度和检测限。在亲水位点滴加不同体积（2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL）的石墨烯水溶液得到的枝状金/石墨烯基底（图7）电化学信号与枝状金基底几乎相同（图8a），说明石墨烯的量不影响基底电化学信号的检测。
（3）研究枝状金/石墨烯基底对荧光检测的影响。将10 μL浓度为10 μM的探针DNA分别滴加到具有不同石墨烯量的枝状金/石墨烯基底，待探针DNA溶液蒸发干后，用超纯水清洗枝状金/石墨烯基底未吸附的探针DNA，稀释到100 μL并在578 nm激发波长下检测上清液荧光强度确定吸附DNA的量，得到的荧光谱图对比说明在直径1 mm亲水孔内加入6 μL石墨烯水溶液时吸附的探针DNA的量达到最大值（图8b）。
（4）研究枝状金/石墨烯基底对SERS检测的影响。将10 μL浓度为1 μM的罗丹明R6G滴加到具有不同石墨烯量（2 μL， 4 μL，6 μL，8 μL，10 μL ）的纳米枝状金/石墨烯基底，利用532 nm激发光检测不同基底的拉曼信号，拉曼图谱显示随着石墨烯量的增加拉曼信号逐渐减弱（图8c）。
实施例2
超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片（生物传感器）荧光，电化学和SERS多体系检测生物疾病标志物，以前列腺癌标志物miRNA-375为例:
（1）检测原理：探针DNA序列为5’ -ROX- TCACGCGAGCCGAACGAAC AAA-Ferrocene-3’，检测的miRNA序列为5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUG A-3’。探针序列一端修饰的ROX为一种罗丹明，可以对荧光和拉曼双响应的信号分子，另一端修饰的是二茂铁，可以对电化学信号相应的分子。当将探针DNA加入到纳米枝状金/石墨烯基底，单链的探针DNA会被吸附到石墨烯基底上，由此可以检测到很强的SERS信号和电化学信号，而上清液因为没有探针DNA的存在检测不到荧光信号。当加入检测的miRNA后，检测的miRNA与探针DNA相结合，石墨烯会将双链释放到上清液中，此时纳米枝状金/石墨烯基底由于探针DNA得数量减少使得电化学信号和SERS信号减弱，而上清液中荧光信号增强。由此可以通过一滴miRNA检测液通过三种信号来确定检测液中miRNA浓度（图9）。
（2）检测步骤：将10 μL的浓度为10 μM的探针DNA滴加到亲水纳米枝状金/石墨烯阵列孔内，放在室温下使水分蒸发后用水流冲洗亲水孔，清洗掉未被吸附的的探针DNA，将用PBS稀释的不同浓度（10-9 M，10-10 M，10-11 M，10-12 M，10-13 M，10-14 M）的miRNA-375溶液滴加到亲水孔内，在37℃恒温恒湿箱中反应1.5 h使DNA与miRNA充分杂交。将亲水孔内的上清液放入荧光皿中稀释到100 μL，在578 nm波长的激发光下检测加入不同浓度miRNA-375上清液的荧光强度，整合不同浓度荧光强度曲线并绘制标准曲线（图10a）。将去掉上清液的纳米枝状金/石墨烯阵列孔在633 nm激发光下进行拉曼检测，整合不同浓度下的拉曼曲线图谱得到标准曲线图（图10b）。在SERS检测后的亲水基底滴加10 μL含有100 mM氯化钠的0.01 M的磷酸盐缓冲液，用差分脉冲法测得不同浓度的电化学曲线整合得到标准曲线（图10c）。
生物疾病标志物不仅限于miRNA，还可以是蛋白或ctDNA，均能得到理想的检测结果。
本文虽然已经给出了本发明的几个实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (7)
1.一种用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片，其特征在于，所述微芯片用于荧光、电化学和SERS多体系检测；所述微芯片自上而下依次包括：导电玻璃基底、钛层、平面金层、纳米枝状金层、超疏水表面，所述超疏水表面设置有超亲水阵列，超亲水阵列为纳米枝状金/石墨烯基底；
所述钛层、平面金层均通过磁控溅射的方法修饰到所述导电玻璃的导电一侧；所述纳米枝状金层以电化学沉积的方法修饰到所述平面金层；对所述纳米枝状金层进行疏水处理，得到所述超疏水表面；在所述超疏水表面形成超亲水阵列；将石墨烯水溶液滴加到超亲水阵列孔内，蒸发后得到纳米枝状金/石墨烯基底；
探针DNA一端修饰电化学信号分子二茂铁，另一端修饰拉曼与荧光特征信号分子ROX，探针DNA修饰到纳米枝状金/石墨烯基底；探针DNA同时对荧光，电化学和SERS响应。
2.如权利要求1所述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片，其特征在于，所述超亲水阵列通过在所述超疏水表面进行掩膜版法刻蚀得到。
3.如权利要求1-2任一项所述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、纳米枝状金制备：将导电玻璃充分清洗，在导电一侧分别磁控溅射一层钛层和金层，利用电化学沉积方法在氯金酸溶液中以-1.8 V电压沉积1000 s 得到超亲水的纳米枝状金结构；
步骤二、超浸润表面的修饰：将步骤一得到的纳米枝状金结构进行疏水处理，得到超疏水表面；通过掩膜板在紫外光或者plasma刻蚀破坏超疏水表面，得到超亲水阵列；
步骤三、纳米枝状金/石墨烯基底制备：将石墨烯水溶液滴加到步骤二制备的超亲水阵列孔内，蒸发后得到纳米枝状金/石墨烯基底。
4.如权利要求1-2任一项所述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的荧光检测中的应用，其特征在于，石墨烯可吸附单链DNA，当加入检测的miRNA后，miRNA与探针DNA结合形成双链，石墨烯对双链吸附力较弱，将双链释放到上清液中，随着miRNA浓度增加，荧光信号逐渐增强。
5.如权利要求1-2任一项所述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的电化学检测中的应用，其特征在于，当加入检测的miRNA后，miRNA与探针DNA结合形成双链，石墨烯对双链吸附力较弱，将双链释放到上清液中，纳米枝状金/石墨烯基底二茂铁数量减少，利用枝状金超灵敏电化学信号响应进行电化学miRNA检测，随着miRNA浓度增加，电信号逐渐降低。
6.如权利要求1-2任一项所述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的SERS检测中的应用，其特征在于，当加入检测的miRNA后，miRNA与探针DNA结合形成双链，石墨烯对双链吸附力较弱，将双链释放到上清液中，通过纳米枝状金对拉曼信号的增强效果在纳米枝状金/石墨烯基底进行SERS检测，随着miRNA浓度增加，SERS信号逐渐减小。
7.如权利要求1-2任一项所述的用于多体系检测的超浸润纳米枝状金/石墨烯微芯片在生物疾病标志物的多体系检测中的应用，其特征在于，所述生物疾病标志物包括蛋白、miRNA和ctDNA。
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