[go: up one dir, main page]

CN109517225B - 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法 - Google Patents

坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109517225B
CN109517225B CN201811414182.1A CN201811414182A CN109517225B CN 109517225 B CN109517225 B CN 109517225B CN 201811414182 A CN201811414182 A CN 201811414182A CN 109517225 B CN109517225 B CN 109517225B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
pit
emulsifier
hole
composite micro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811414182.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109517225A (zh
Inventor
石长灿
席光辉
冯亚凯
陈浩
刘雯
杨啸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Institute of UCAS
Original Assignee
Wenzhou Institute of Biomaterials and Engineering
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Institute of Biomaterials and Engineering filed Critical Wenzhou Institute of Biomaterials and Engineering
Priority to CN201811414182.1A priority Critical patent/CN109517225B/zh
Publication of CN109517225A publication Critical patent/CN109517225A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109517225B publication Critical patent/CN109517225B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0036—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0042—Materials resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/08—Polysaccharides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/14—Polymerisation; cross-linking
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C08J3/246—Intercrosslinking of at least two polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08L1/08—Cellulose derivatives
    • C08L1/26—Cellulose ethers
    • C08L1/28—Alkyl ethers
    • C08L1/286—Alkyl ethers substituted with acid radicals, e.g. carboxymethyl cellulose [CMC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/02—Dextran; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/04—Alginic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/04—Materials for stopping bleeding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/16—Halogen-containing compounds
    • C08K2003/162—Calcium, strontium or barium halides, e.g. calcium, strontium or barium chloride
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/16—Halogen-containing compounds
    • C08K2003/168—Zinc halides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种坑‑孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法，该方法包括如下步骤：(1)配制多聚糖水溶液；(2)将乳化剂加入油相中制备含乳化剂的油相；将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，搅拌乳化，得到均匀乳液；(3)将多价金属交联剂溶于超纯水配成交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到均匀乳液中；(4)用正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，清洗水相，冻干，得到坑‑孔复合微纳结构多聚糖微球。(1)本发明的微球，表面具有微米级的凹坑，坑内表面又有纳米级的细孔；粒径分布均匀，孔隙率高，吸水率高，吸附性强。具有良好的生物相容性，在20s～50s内能够有效完成止血。

Description

坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法
技术领域
本发明涉及一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法，属于高分子材料制备技术领域。
背景技术
天然高分子多糖具有资源丰富、绿色无污染、生物相容性好，可生物降解的优点，拥有多孔结构的高分子多糖微球在止血、载药、组织工程支架、蛋白纯化、金属离子吸附分离等领域具有很大的应用。
专利申请号为201610011690.X的专利报道了一种核壳结构复合多孔微球的制备方法，其使用海藻酸钠、壳聚糖、纤维素、明胶等为壳材，以壳聚糖多孔微球、纤维素多孔微球、聚乳酸多孔微球、明胶多孔微球等为内核，通过复乳液法，得到分散性好、不团聚，微球，但其表面壳层致密，不具有坑-孔结构。专利申请号为201611024927.4的专利以乳化交联法制备的海藻酸钙为核心球，利用层层自组装法在外层依次包覆了壳聚糖、海藻酸钠和壳聚糖，得到十微米级的多层核壳型载药微球，其中内核负载了内皮生长因子，外壳层负载了万古霉素，兼具促进血管生成和抗菌功能，但是，这种微球粒径小，表面没有分布均匀的微孔。
专利申请号为201710935220.7的专利用静电喷射法将羧甲基纤维素溶液喷射到稀硫酸凝固浴中，再生成型，然后洗涤和干燥，得到羧甲基纤维素多孔止血微球，该方法制备速率快、绿色环保、粒径均一，所制备的微球具有丰富的孔结构，但其表面不具有微米级坑状结构。专利申请号为201710318416.1的专利将明胶溶液通过乳化-脱水-洗涤-干燥-筛滤过程得到微球粗品，然后再以京尼平交联得到明胶微球，所制备的明胶微球毒性小，降解效果好。总之，采用以上方法制得的微球，存在结构单一、微观形貌难以调控、粒径分布过大的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种增加了高分子多糖微球形貌的多样性和应用的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
本发明的第二个目的是提供一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将天然多聚糖溶到超纯水中，配成质量浓度为2％～10％的多聚糖水溶液；
(2)将乳化剂加入油相中，使乳化剂的质量分数为0.4％-5％，在40-80℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；在室温下将所述多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，搅拌乳化，得到均匀乳液；所述含乳化剂的油相和多聚糖水溶液的质量比为(10-3):1；
(3)将多价金属交联剂溶于超纯水配成质量浓度为20％～30％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比(2-5):10，滴完后继续搅拌反应2～12h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，用正己烷或石油醚清洗水相；再用乙醇清洗，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
天然多聚糖为取代度:≥80％，粘度为10-80mPa.s的羧甲基壳聚糖、粘度为1500-4500mPa.s羧甲基纤维素、重均分子量为50000-100000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为100000-500000透明质酸钠和粘度100-200mpa.s海藻酸钠至少一种。
步骤(2)所述油相为液体石蜡、植物油、正己烷中的至少一种，所述植物油为花生油，大豆油或菜籽油。
所述乳化剂为司盘85、司盘80、司盘60、吐温-80、吐温-60和Triton X-100中至少一种。
多价金属交联剂为CaCl2、ZnCl2、CuCl2或FeCl3中的至少一种。
步骤(2)的搅拌乳化的速率为500～800rpm，搅拌时间为1～4h。
步骤(3)的搅拌速率为300～500rpm。
步骤(4)为：用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层,保留水相，再用相当于水相体积3～10倍的正己烷或石油醚清洗水相1-3次；再用相当于水相体积3～10倍的乙醇清洗2-4次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
上述方法制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
本发明的优点：
(1)本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，表面具有微米级的凹坑，坑内表面又有纳米级的细孔，具有独特的表面“坑-孔”复合微纳米结构。
(2)本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球粒径分布均匀，孔隙率高，吸水率高，吸附性强。
(3)制备过程简单，不需要加热，能耗低。所制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在制备止血药物的应用。
(4)根据GB/T16886.5-2003体外细胞毒性评判标准，本发明各实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球浸提液在10～40μg/mL具有0级细胞毒性，显示出良好的生物相容性。
(5)经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在20s～50s内能够有效完成止血。
按照此技术制备得到的可吸收多孔止血粉综合性能优良，便于操作和保存，并且制备工艺简单，适合工业化生产。
(6)经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球具有良好理化性能。溶血率均小于5％，符合国家标准。
(7)结果表明坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，对于肝脏损伤创面，具有瞬间止血功能(止血时间小于5s)，并且在72h后，止血材料完全降解，无任何残留。对于股动脉大量出血，坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，能够在20s内完成止血，1周后手术创面回复正常，无任何止血微球样品残留。
附图说明
图1为实施例1所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球放大300倍的SEM图。
图2为实施例2所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球放大1200倍的SEM图。
图3为实施例3所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球放大10000倍的SEM图。
图4为实施例1所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的横截面放大1000倍的SEM图。
图5为实施例2所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的横截面放大5000倍的SEM图。
图6为实施例3所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球表面放大10000倍的SEM图。
图7为实施例1、实施例2和实施例3所制备微球的细胞毒性统计结果。
(A)利用MTT法测定的细胞存活率；
(B)采用荧光染色的方法，染色24小时后细胞，所示为细胞数目和细胞的存活状态。
图8为实施例3所得微球用于SD大鼠的肝脏止血实验(A)和SD大鼠股动脉止血实验(B)。
图9为实施例1-3所得止血微球的全血凝血指数测试结果，其中，伤口不做任何处理作为对照组。
具体实施方式
多孔微球的粒径大小、形貌结构和比表面积等对其性能有很大影响，本发明采用天然多聚糖为主要原材料，通过调控组分的分子量、溶液黏度、制备工艺条件等方法，克服了现有技术存在的问题，得到了一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
以下通过具体实施例，对本发明作进一步的说明。以下结合实施例及附图进一步阐明本发明的发明内容和实施方式，仅供参考和说明使用，不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将质量比为1:2:2的比例，将取代度:≥80％，粘度为10mPa.s的羧甲基壳聚糖、重均分子量为100000透明质酸钠和粘度100mpa.s海藻酸钠溶到超纯水中，配成质量浓度为2％的多聚糖水溶液；
(2)将质量比为1:1的司盘85和吐温-80混合得乳化剂加入液体石蜡中，使乳化剂的质量分数为0.4％，在40℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；在室温下将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，500rpm搅拌乳化，搅拌时间为4h，得到均匀乳液；含乳化剂的油相与多聚糖水溶液的质量比为10：1；
(3)将CaCl2溶于超纯水配成质量浓度为20％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到在300rpm搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比2:10，滴完后在继续在300rpm搅拌反应2h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积10倍的石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，再用相当于水相体积10倍的石油醚清洗水相1次；再用相当于水相体积10倍的乙醇清洗2次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球平均粒径为10.01μm，微球表面具有平均直径为0.98μm的圆形凹坑，凹坑内表面有平均孔径为50.05nm的孔，微球内部有平均孔径为0.502μm的孔隙，见图1和图4。
实验证明，用取代度:≥80％，粘度为80mPa.s的羧甲基壳聚糖替代本实施例的取代度:≥80％，粘度为10mPa.s的羧甲基壳聚糖；并用粘度200mpa.s海藻酸钠替代本实施例的粘度100mpa.s海藻酸钠，其它同本实施例，获得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，其性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实验证明，用吐温-60替代本实施例中的吐温-80，其它同本实施例，可以制备出性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实施例2.
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将质量比为1:1:1的粘度为4500mPa.s羧甲基纤维素、重均分子量为100000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为500000透明质酸钠溶到超纯水中，配成质量浓度为10％的多聚糖水溶液；
(2)将乳化剂司盘80加入大豆油中，使乳化剂的质量分数为5％，在80℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；然后在室温下将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，800rpm搅拌乳化，搅拌时间为1h，得到均匀乳液；含乳化剂的油相与多聚糖水溶液的质量比为3：1；
(3)将ZnCl2溶于超纯水配成质量浓度为30％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到500rpm搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比5:10，滴完后在继续在500rpm搅拌反应12h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积3倍的正己烷加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，再用相当于水相体积3倍的正己烷清洗水相3次；再用相当于水相体积3倍的乙醇清洗4次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球平均粒径为198μm，微球表面具有平均直径为5.23μm的圆形凹坑，凹坑内表面又具有平均孔径为200.04nm的孔，微球内部具有平均孔径为2.1μm的孔隙，见图2和图5。
实验证明，用粘度为1500mPa.s羧甲基纤维素替代本实施例的粘度为4500mPa.s羧甲基纤维素；用重均分子量为50000的羧甲基葡聚糖替代本实施例的重均分子量为100000的羧甲基葡聚糖，其它同本实施例，获得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，其性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实验证明，本实施例中的大豆油用其它植物油，如花生油或菜籽油替代，获得的获得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，其性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实施例3
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将质量比为2:1:1的重均分子量为80000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为400000透明质酸钠、粘度150mpa.s海藻酸钠溶到超纯水中，配成质量浓度为6％的多聚糖水溶液；
(2)将质量比为4:1的司盘60和Triton X-100混合得乳化剂加入质量比为5：1的液体石蜡和正己烷中，使乳化剂的质量分数为1％，在50℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；然后在室温下将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，600rpm搅拌乳化，搅拌时间为2h，得到均匀乳液；含乳化剂的油相和多聚糖水溶液的质量比为5：1；
(3)将CuCl2溶于超纯水配成质量浓度为25％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到400rpm搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比3:10，滴完后在继续在400rpm搅拌反应6h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积5倍的石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，再用相当于水相体积5倍的石油醚清洗水相2次；再用相当于水相体积5倍的乙醇清洗3次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球平均粒径为100.04μm，微球表面具有平均直径为2.88μm的圆形凹坑，凹坑内表面又具有平均孔径为99.99nm的孔，微球内部具有平均孔径为1.1μm的孔隙，见图3和图6。
实验例1
细胞毒性实验
实验细胞使用48h～72h生长旺盛的L929细胞系细胞(市售)。
培养基为加入10％(V/V)胎牛血清的RAPI1640。
阴性对照组为加入10％(V/V)胎牛血清的RAPI1640；
实验组(分别取0.5g实施例1、实施例2和实施例3制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球与10mL加入10％(V/V)胎牛血清的RAPI1640，于37℃浸提24h，得到浸提液)；
阳性对照组(质量分数为5％的苯酚水溶液)；
试验在96孔板上进行。初始培养液的细胞(L929细胞系细胞)密度约为5万/mL，每孔加入200μL细胞培养液,使每孔中细胞个数约10000个。每孔重复三次，在37℃5％(V/V)二氧化碳/空气的恒温培养箱内培养24h，然后弃去原培养基。
阴性对照组中加200μL；
实验组分别加10μL、20μL、30μL、40μL、50μL浸提液，再加入阴性对照液使每孔中溶液体积为200μL；
阳性对照组分别加10μL、20μL、30μL、40μL、50μL质量分数为5％的苯酚溶液，再加入阴性对照液使每孔中溶液体积为200μL。
随后，将该96孔板放入37℃恒温培养箱中再培养48h后取出培养板，弃去培养板内溶液，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h,接着吸去原液，加入150μL二甲亚砜，震荡十分钟，在免疫酶标仪上570nm波长处测定吸光度值(ABS)。
相对细胞活性(％)＝(ABS570实验组/ABS570阴性对照)×100％
根据GB/T16886.5-2003体外细胞毒性评判标准，实施例1、实施例2和实施例3所述的微球浸提液在10～40μg/mL具有0级细胞毒性，显示出良好的生物相容性。结果如图7所示。图7(A)中所得数据表明，实施例1-实施例3所得微球的细胞毒性为0级，没有明显的细胞毒性。图7(B)为实施例1-实施例3细胞荧光染色结果，图示细胞生长状态良好，细胞的生长状态未受到微球浸提液的影响。
实验例2
体表止血性能测试
对实施例1、实施例2和实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，进行体外止血功能检测，具体检测方法为：
将SD大鼠麻醉，固定，在背部左右两侧对称制造4个圆形伤口(直径2cm，深度0.5cm)，出血后，在出血部位涂洒0.05g坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在20s～50s内能够有效完成止血(表3)。
表1 SD为实施例1-3大鼠体表止血时间统计结果
编号 阴性对照 实施例1 实施例2 实施例3
止血时间(s) 170±20 20±3 25±5 22±2
注：阴性对照为国产金创(壳聚糖止血粉)(商品名：
Figure BDA0001879073890000071
壳聚糖止血粉，湖北普爱药业有限公司)
实验例3
溶血率：按照GB/T 16175-1996规定方法测定实施例1-3坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的溶血率。经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球具有良好理化性能。微球的溶血率均小于5％(表2)，符合国家标准。
表2为实施例1-3的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的溶血率统计结果
Figure BDA0001879073890000072
注：阳性对照组为蒸馏水；阴性对照组为生理盐水；实验组为坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的生理盐水浸提液；X为545nm波长下吸光度；s为吸光度测量值偏差。
实验例4
以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型：
对实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，进行体内止血功能检测，具体检测方法为：以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型，通过水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉，用手术刀在肝脏表面制造1cm×1cm伤口。喷涂量为20μg的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球于创面。观察血情，记录时间和出血量,如图8A，其中a为创面形成，开始流血；b喷涂上坑-孔复合微纳结构多聚糖微球；c用生理盐水清除表面微球，创面止血完成。术后，缝合腹部。1周后，开线观察恢复情况。结果表明实施例3制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，对于肝脏损伤创面，具有瞬间止血功能(止血时间小于5s)，并且在72h后，残留的微球完全降解。
实验例5.
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球止血功能测试(股动脉出血模型)：
以SD大鼠的股动脉损伤大量成出血模型，测试实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的止血性能。
SD大鼠麻醉后，解剖露出股动脉，利用手术刀剪切动脉制造大出血。将0.2g样品洒在伤口处，直到止血结束，观察出血和止血情况(图8B，a为创面形成，开始喷血；b喷涂上坑-孔复合微纳结构多聚糖微球；c用生理盐水清除表面微球)。术后，缝合腹部。1周后，开线观察恢复情况。实验结果表明，对于股动脉大量出血，实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，能够在20s内完成止血，1周后手术创面恢复正常，无任何微球样品残留。
实验例6.
全血凝血指数测定：
对实施例1-3所制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，进行全血凝血指数测定
具体实验步骤：20mg样品放置于塑料盘上，37℃下放置5min，200μL抗凝血缓慢滴加到样品表面，然后加入20μl 0.2M氯化钙水溶液，继续37℃培养5min。加入25ml蒸馏水，摇床30rpm震荡培养10min，分离上清，将上清在540nm处测得的吸光度记作A值，抗凝血在去离子水中的吸光度用作参考B值。
血液凝固指数计算：
Figure BDA0001879073890000081
所得结果如图9所示。
全血凝血指数结果表明与对照组相比，实施例1-3的凝血指数显著降低。这表明实施例1-3所制备的多孔微球，具有很好的促凝血功能。
以上实施例为本发明相对较优的实施例，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化、改进和等效置换，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将天然多聚糖溶到超纯水中，配成质量浓度为2％～10％的多聚糖水溶液；
(2)将乳化剂加入油相中，使乳化剂的质量分数为0.4％-5％，在40-80℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；在室温下将所述多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，搅拌乳化，得到均匀乳液；所述含乳化剂的油相和多聚糖水溶液的质量比为(10-3):1；
(3)将多价金属交联剂溶于超纯水配成质量浓度为20％～30％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比(2-5):10，滴完后继续搅拌反应2～12h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，用正己烷或石油醚清洗水相；再用乙醇清洗，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球；
所述天然多聚糖为取代度:≥80％，粘度为10-80mPa.s的羧甲基壳聚糖、粘度为1500-4500mPa.s羧甲基纤维素、重均分子量为50000-100000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为100000-500000透明质酸钠和粘度100-200mpa.s海藻酸钠至少一种；
所述多价金属交联剂为CaCl2、ZnCl2或CuCl2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)所述油相为液体石蜡、植物油、正己烷中的至少一种，所述植物油为花生油，大豆油或菜籽油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述乳化剂为司盘85、司盘80、司盘60、吐温-80、吐温-60和Triton X-100中至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)的搅拌乳化的速率为500～800rpm，搅拌时间为1～4h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(3)的搅拌速率为300～500rpm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(4)为：用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层,保留水相，再用相当于水相体积3～10倍的正己烷或石油醚清洗水相1-3次；再用相当于水相体积3～10倍的乙醇清洗2-4次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
7.权利要求1-6之一的方法制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
CN201811414182.1A 2018-11-26 2018-11-26 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法 Active CN109517225B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811414182.1A CN109517225B (zh) 2018-11-26 2018-11-26 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811414182.1A CN109517225B (zh) 2018-11-26 2018-11-26 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109517225A CN109517225A (zh) 2019-03-26
CN109517225B true CN109517225B (zh) 2021-04-02

Family

ID=65779187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811414182.1A Active CN109517225B (zh) 2018-11-26 2018-11-26 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109517225B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111887244A (zh) * 2020-07-15 2020-11-06 中国农业科学院植物保护研究所 羧甲基壳聚糖-金属离子交联法制备丙硫菌唑缓释凝胶颗粒的方法
CN114150022B (zh) * 2021-12-06 2023-08-22 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7094369B2 (en) * 2002-03-29 2006-08-22 Scimed Life Systems, Inc. Processes for manufacturing polymeric microspheres
CN100367933C (zh) * 2006-02-28 2008-02-13 中国人民解放军第二军医大学 一种可生物降解的止血粉
CN104262667A (zh) * 2014-09-18 2015-01-07 哈尔滨工业大学 一种藻酸盐基材料外部可控离子交联方法
CN107596431B (zh) * 2017-09-29 2021-02-19 温州生物材料与工程研究所 一种天然聚糖基多功能微球及制备方法及用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN109517225A (zh) 2019-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101874751B (zh) 一种多层多孔支架及其制备方法
Choi et al. Chitosan-based inverse opals: three-dimensional scaffolds with uniform pore structures for cell culture
Wei et al. Nanocellulose based hydrogel or aerogel scaffolds for tissue engineering
US6984671B2 (en) Sinterable structures and method
CN109364288B (zh) 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在制备止血敷料的用途
Pezeshki Modaress et al. Fabrication of a porous wall and higher interconnectivity scaffold comprising gelatin/chitosan via combination of salt-leaching and lyophilization methods
CN101015712B (zh) 聚己内酯－壳聚糖网络/羟基磷灰石复合多孔支架材料的制备方法
WO2001087575A2 (en) Reverse fabrication of porous materials
CN102178980A (zh) 天然高分子复合多孔纤维支架及其制备方法
CN104001208B (zh) 一种生物可降解高分子/甲壳素纳米晶复合支架材料的制备方法
KR102316548B1 (ko) 나노섬유형 콜라겐 필라멘트로 이루어진 매크로/나노 다공성 콜라겐 지지체 제조를 위한 2단계 상분리 기반 3d 바이오플라팅 기술
Clyne Thermal processing of tissue engineering scaffolds
Chen et al. Physical properties of microporous membranes prepared by hydrolyzing cellulose/soy protein blends
CN109517225B (zh) 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法
CN107670108A (zh) 一种组织工程支架用聚乳酸多孔材料及其制备方法
KR20050040187A (ko) 조직 재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와마이크로 섬유의 복합지지체 및 그의 제조방법
Ashraf et al. The cross-linked polyvinyl alcohol/hydroxyapatite nanocomposite foam
Rafiq et al. Improvisations to electrospinning techniques and ultrasonication process to nanofibers for high porosity: Ideal for cell infiltration and tissue integration
CN107198791A (zh) 静电喷射制备多孔交联淀粉止血微球的方法
CN115873299B (zh) 一种多孔性纤维素/明胶复合止血气凝胶及其制备方法和应用
CN100356989C (zh) 热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法
Knotek et al. Cryogenic grinding of electrospun poly-ε-caprolactone mesh submerged in liquid media
CN1765423A (zh) 生物活性多孔支架材料的制备方法
Blaker et al. Ice-microsphere templating to produce highly porous nanocomposite PLA matrix scaffolds with pores selectively lined by bacterial cellulose nano-whiskers
CN101703807A (zh) 聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant