CN109507250A - 检测d二聚体的电化学试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明采用金纳米粒子和3,4乙烯二氧噻吩(EDOT)为基底材料，通过Au‑NH2将抗体连接到基底材料表面，利用抗原抗体的特异性结合前后引起的电极表面导电性的变化引起电流信号的差异，实现对D‑二聚体的特异性检测，增强了传感器的灵敏度，有效降低了传感器的检出限，实现了对D‑二聚体的灵敏检测，该方法具有制备简单、重现性好、灵敏度高和特异性好等优点，有效克服了目前检测D‑二聚体方法的不足。
Description
技术领域
本发明涉及新型生物传感检测技术领域，具体的说是一种采用印刷电极的检测方法，利用D二聚体抗原抗体结合前后引起电极表面导电能力的不同而产生的信号强度的差异，来判断待测样品中D二聚体抗原的含量，从而实现对D二聚体的灵敏检测的一种检测D二聚体的电化学试剂盒及其制备方法。
背景技术
D-二聚体(D-Dimer):是纤维酶水解交联纤维蛋白形成的降解产物之一，为继发性纤维所特有的代谢产物。其含量变化可以作为体内高凝状态和作为原发性与继发性纤维鉴别的可靠指标。D-二聚体是辅助诊断或排除血栓疾病的重要标志，又是指导溶栓药物剂量应用的关键数据。因此，对于D-二聚体的准确检测可以实现对疾病的早期诊断和治疗。
目前检测D-二聚体的的方法有很多，但大多都操作较为复杂，易产生假阳性或假阴性信号。印刷电极，因其导电性好、重现性好、成本低、便于小型化实现在线检测等特点，能够适用于不同环境下的在线检测，减少了应用其他方法复杂的操作造成的不确定因素，因此，基于印刷电极的检测能达到良好的效果。
免疫传感器是利用抗原(抗体)对抗体(抗原)的识别功能而研制成的生物传感器。通过抗原抗体之间的特异性结合，使得传感器具有很高的选择性和灵敏度等优点。
发明内容：
本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种基于金纳米颗粒和3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)为基底材料，利用金纳米颗粒良好的生物相容性构建了一种特异性强、灵敏度高的检测D二聚体的电化学试剂盒及其制备方法。
本发明可以通过以下措施达到：
一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于自下而上依次设有基座、电极层、上盖，其中基座上开设用于安装电极的限位槽，所述限位槽的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座上限位槽的内径，条形部的宽度小于等于限位槽的缺口宽度，所述电极层设有PET基层，PET基层上设置工作电极、参比电极和对电极，其中工作电极为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极和对电极为等径的弧形，参比电极和对电极设置在工作电极外侧，工作电极、参比电极、对电极分别经银导线向外输出信号且位于条形部的PET基层上；所述上盖上开设样品加样孔，样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖的样品加样孔经卡槽与基座上的限位槽嵌合；所述工作电极上修饰D二聚体抗体。
本发明中基座呈条形，限位槽设置在基座的一端，基座的另一端设置检测插口，电极层的条形部的末端与检测插口相连，上盖也呈条形，基座内壁和上盖内壁可以对应设有相配合的扣槽和卡扣，便于上盖与基座扣合为一体。
本发明中所述电极层的PET基层厚度为0.3mm，工作电极通过丝网印刷印刷配置，工作电极的直径为3mm，银导线以及对电极、参比电极带宽为1mm。
本发明使用辰华电化学工作站进行测试，所制备的印刷电极为工作电极，将样品滴加到样品槽，进行孵化使抗体与基底材料结合，孵化时间为5-25min，优选为孵化10分钟，移走样品后，将电极浸入到铁标([Fe(CN)6]3-/4-)溶液中进行测试；用差分脉冲伏安法对D-二聚体进行检测，其电压测试范围为-0.2～0.6V；测量抗体抗原结合前后的传感器的峰电流值，然后记录电流的变化，绘制工作曲线。
本发明所述电极层的条形部的宽度为7mm，使用时将样品溶液滴入样品加样孔，由于上盖上样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖与基座能够将样品限制在电极层对应的圆形区域内，目标物抗原与工作电极表面的抗体结合，发生界面反应，进行电化学检测，产生电流信号。
本发明所述基座中限位槽内的圆形区域具有外凸的上表面，用于进一步延展电极层，并起到引导样品溶液均匀分布的作用，使电极层能够与样品充分接触。
本发明还提出了一种如上所述检测D二聚体的电化学试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：印刷电极的制备，通过丝网印刷烘干之后，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对印刷电极进行超声清洗后；氮气吹干，备用；
步骤2：配制含有0.01-0.05M 3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和1.0mg/mL-5.0mg/mL聚苯乙烯磺酸钠pss的均一水溶液，采用循环伏安法法CV对步骤1得到的工作电极进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗工作电极表面；
步骤3：再配制含有1mM氯金酸和0.5M氯化钠NaCl的均一水溶液，采用循环伏安法CV对步骤2中所得印刷电极进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面；
步骤4：滴加15μL 15mg/ml的D-Dimer-L抗体于步骤3制备的工作电极上，用超纯水冲洗干净，制得一种检测D-二聚体的印刷电极传感器，将印刷电极传感器封装在试剂盒内，获得用于检测D二聚体的电化学试剂盒。
本发明步骤2中EDOT材料的电沉积包括如下步骤：工作电极的基底材料采用金纳米颗粒与3,4乙烯二氧噻吩(EDOT)纳米复合物，制备方法如下：
步骤2-1：将0.01g聚苯乙烯磺酸钠(pss)溶于5mL超纯水中，加入10μL EDOT单体，超声15min使其分散为均一水溶液；
步骤2-2：将印刷后的电极(包括工作电极、参比电极以及对电极)浸入均一水溶液中，对工作电极进行电沉积处理，在-0.2～1.2V的电压范围采用循环伏安法沉积5-20圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
本发明步骤3中将0.117gNaCl溶于3800μL的超纯水中，加入200μL 20mM氯金酸溶液，玻璃棒搅拌使其形成均一溶液；将步骤2所得印刷电极(包括工作电极、参比电极、对电极)浸入均一溶液中，对工作电极进行电沉积处理，在-1.5～0.5V的电压范围采用循环伏安法沉积1-10圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
本发明通过对3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)的使用，即增大了传感器的比表面积，同时也为负载更多的金纳米颗粒提供了位点，提高了检测的灵敏度；金纳米颗粒的使用，与抗体之间形成Au-NH2，使得抗体可以连接到电极基底表面并稳定存在；并基于印刷电极，实现了对D-二聚体的灵敏检测；同时采取了抗原抗体之间的特异性识别的原理，在进行灵敏定量检测的同时，保证了检测结果的准确性。
附图说明：
附图1是本发明的分解结构示意图。
附图2是本发明基座和电极层的结构示意图。
附图3是本发明上盖的仰视图。
附图4是本发明中电极层的结构示意图。
附图5是本发明中工作电极制备方法中噻吩类物质的聚合机理原理图。
附图6是本发明中线性检测曲线图。
附图7是本发明修饰过程裸印刷电极、PEDOT/金修饰的印刷电极、结合抗体的PEDOT/金修饰的印刷电极结合目标物的传感器在10mM[Fe(CN)6]3-/4-中的循环伏安图。
附图8是本发明中抗体孵育时间优化曲线图。
附图9是本发明中检测灵敏度示意图。
附图标记：基座1、电极层2、上盖3、限位槽4、工作电极5、参比电极6、对电极7、银导线8、样品加样孔9、环形凸台10、卡槽11、检测插口12、PET基层13。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
如附图所示，一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于自下而上依次设有基座、电极层、上盖，其中基座上开设用于安装电极的限位槽，所述限位槽的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座上限位槽的内径，条形部的宽度小于等于限位槽的缺口宽度，所述电极层设有PET基层，PET基层上设置工作电极、参比电极和对电极，其中工作电极为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极和对电极为等径的弧形，参比电极和对电极设置在工作电极外侧，工作电极、参比电极、对电极分别经银导线向外输出信号且位于条形部的PET基层上；所述上盖上开设样品加样孔，样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖的样品加样孔经卡槽与基座上的限位槽嵌合；所述工作电极上修饰D二聚体抗体。
本发明中基座呈条形，限位槽设置在基座的一端，基座的另一端设置检测插口，电极层的条形部的末端与检测插口相连，上盖也呈条形，基座内壁和上盖内壁可以对应设有相配合的扣槽和卡扣，便于上盖与基座扣合为一体。
本发明中所述电极层的PET基层厚度为0.3mm，工作电极通过丝网印刷印刷配置，工作电极的直径为3mm，银导线以及对电极、参比电极带宽为1mm。
本发明使用辰华电化学工作站进行测试，所制备的印刷电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，使用时将此印刷电极体系浸入到铁标([Fe(CN)6]3-/4-)溶液中进行测试；用差分脉冲伏安法对D-二聚体进行检测，其电压测试范围为-0.2～0.6V；测量抗体抗原结合前后的传感器的峰电流值，然后记录电流的变化，绘制工作曲线。
本发明所述电极层的条形部的宽度为7mm，使用时将样品溶液滴入样品加样孔，由于上盖上样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖与基座能够将样品限制在电极层对应的圆形区域内，目标物抗原与工作电极表面的抗体结合，发生界面反应，进行电化学检测，产生电流信号。
本发明所述基座中限位槽内的圆形区域具有外凸的上表面，用于进一步延展电极层，并起到引导样品溶液均匀分布的作用，使电极层能够与样品充分接触。
实施例：
一种如上所述检测D二聚体的电化学试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：印刷电极的制备，通过丝网印刷烘干之后，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对抛光的印刷电极进行超声清洗后；氮气吹干，备用；
步骤2：配制含有0.02M 3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和2.0mg/mL聚苯乙烯磺酸钠pss的均一水溶液，采用循环伏安法法CV对步骤1得到的工作电极进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗工作电极表面；
步骤3：再配制含有1mM氯金酸和0.5M氯化钠NaCl的均一水溶液，采用循环伏安法CV对步骤2中产品进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面；
步骤4：滴加15μL 15mg/ml的D-Dimer-L抗体于步骤3制备的工作电极上，室温下孵育8h，用超纯水冲洗干净，制得一种检测D-二聚体的印刷电极传感器。
本发明步骤2中工作电极的基底材料采用金纳米颗粒与3,4乙烯二氧噻吩(EDOT)纳米复合物，电沉积处理如下：
步骤2-1：将0.01g聚苯乙烯磺酸钠(pss)溶于5mL超纯水中，加入10μL EDOT单体，超声15min使其分散为均一水溶液；
步骤2-2：将印刷后的工作电极浸入上述均一溶液中，在-0.2～1.2V的电压范围采用循环伏安法沉积15圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
本发明步骤3中电沉积处理如下：将0.117gNaCl溶于3800μL的超纯水中，加入200μL 20mM氯金酸溶液，玻璃棒搅拌使其形成均一溶液；将印刷电极即工作电极浸入均一溶液中在-1.5～0.5V的电压范围采用循环伏安法沉积2圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
本发明在使用时，使用电化学检测仪器进行测试，所制备的印刷电极为工作电极，将此印刷电极浸入到铁标([Fe(CN)6]3-/4-)溶液中进行测试；用差分脉冲伏安法对D-二聚体进行检测，其电压测试范围为-0.2～0.6V；测量抗体抗原结合前后的传感器的峰电流值，然后记录电流的变化，绘制工作曲线。
本发明通过对3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)的使用，即增大了传感器的比表面积，同时也为负载更多的金纳米颗粒提供了位点，提高了检测的灵敏度；金纳米颗粒的使用，与抗体之间形成Au-NH2，使得抗体可以连接到电极基底表面并稳定存在；并基于印刷电极，实现了对D-二聚体的灵敏检测；同时采取了抗原抗体之间的特异性识别的原理，在进行灵敏定量检测的同时，保证了检测结果的准确性。
Claims (9)
1.一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于自下而上依次设有基座、电极层、上盖，其中基座上开设用于安装电极的限位槽，所述限位槽的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座上限位槽的内径，条形部的宽度小于等于限位槽的缺口宽度，所述电极层设有PET基层，PET基层上设置工作电极、参比电极和对电极，其中工作电极为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极和对电极为等径的弧形，参比电极和对电极设置在工作电极外侧，工作电极、参比电极、对电极分别经银导线向外输出信号且位于条形部的PET基层上；所述上盖上开设样品加样孔，样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖的样品加样孔经卡槽与基座上的限位槽嵌合；所述工作电极上修饰D二聚体抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于基座呈条形，限位槽设置在基座的一端，基座的另一端设置检测插口，电极层的条形部的末端与检测插口相连，上盖也呈条形，基座内壁和上盖内壁对应设有相配合的扣槽和卡扣，便于上盖与基座扣合为一体。
3.根据权利要求1所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于所述电极层的PET基层厚度为0.3mm，工作电极通过丝网印刷印刷配置，工作电极的直径为3mm，银导线以及对电极、参比电极带宽为1mm。
4.根据权利要求1所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于所述电极层的条形部的宽度为7mm，使用时将样品溶液滴入样品加样孔，由于上盖上样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖与基座能够将样品限制在电极层对应的圆形区域内。
5.根据权利要求1所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于所述基座中限位槽内的圆形区域具有外凸的上表面。
6.一种如权利要求1-5中任意一项所述检测D二聚体的电化学试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：工作电极的制备，通过丝网印刷烘干之后，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对印刷电极进行超声清洗后；氮气吹干，备用；
步骤2：配制含有0.01-0.05M 3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和1.0mg/mL-5.0mg/mL聚苯乙烯磺酸钠pss的均一水溶液，采用循环伏安法法CV对步骤1得到的工作电极进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗工作电极表面；
步骤3：再配制含有1mM氯金酸和0.5M氯化钠NaCl的均一水溶液，采用循环伏安法CV对步骤2中产品进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面；
步骤4：滴加15μL 15mg/ml的D-Dimer-L抗体于步骤3制备的工作电极上，用超纯水冲洗干净，制得一种检测D-二聚体的印刷电极传感器。
7.根据权利要求6所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒的制备方法，其特征在于步骤2中EDOT材料的电沉积包括如下步骤：中工作电极的基底材料采用金纳米颗粒与3,4乙烯二氧噻吩(EDOT)纳米复合物，制备方法如下：
步骤2-1：将0.01g聚苯乙烯磺酸钠(pss)溶于5mL超纯水中，加入10μL EDOT单体，超声15min使其分散为均一水溶液；
步骤2-2：将印刷后的工作电极浸入均一水溶液中，在-0.2～1.2V的电压范围采用循环伏安法沉积5-20圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
8.根据权利要求6所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒的制备方法，其特征在于步骤3中将0.117gNaCl溶于3800μL的超纯水中，加入200μL 20mM氯金酸溶液，玻璃棒搅拌使其形成均一溶液；将步骤2所得印刷电极即工作电极浸入均一溶液中在-1.5～0.5V的电压范围采用循环伏安法沉积1-10圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
9.根据权利要求6所述的一种检测D二聚体的电化学试剂盒，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：工作电极的制备，通过丝网印刷烘干之后，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对抛光的印刷电极进行超声清洗后；氮气吹干，备用；
步骤2：配制含有0.02M 3,4-乙烯二氧噻吩EDOT和2.0mg/mL聚苯乙烯磺酸钠pss的均一水溶液，采用循环伏安法法CV对步骤1得到的工作电极进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗工作电极表面；
步骤3：再配制含有1mM氯金酸和0.5M氯化钠NaCl的均一水溶液，采用循环伏安法CV对步骤2中产品进行电沉积，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面；
步骤4：滴加15μL 15mg/ml的D-Dimer-L抗体于步骤3制备的工作电极上，室温下孵育8h，用超纯水冲洗干净，制得一种检测D-二聚体的印刷电极传感器；
其中步骤2中工作电极的基底材料采用金纳米颗粒与3,4乙烯二氧噻吩(EDOT)纳米复合物，电沉积处理如下：
步骤2-1：将0.01g聚苯乙烯磺酸钠(pss)溶于5mL超纯水中，加入10μL EDOT单体，超声15min使其分散为均一水溶液；
步骤2-2：将印刷后的工作电极浸入上述均一溶液中，在-0.2～1.2V的电压范围采用循环伏安法沉积15圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面；
所述步骤3中电沉积处理如下：将0.117gNaCl溶于3800μL的超纯水中，加入200μL 20mM氯金酸溶液，玻璃棒搅拌使其形成均一溶液；将印刷电极即工作电极浸入均一溶液中在-1.5～0.5V的电压范围采用循环伏安法沉积2圈，电沉积成功之后，用超纯水彻底清洗电极表面。
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