CN109490550A - 一种骨钙素检测试剂的校准品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学体外诊断领域，具体涉及一种骨钙素检测试剂的校准品及其制备方法。本发明制备的骨钙素检测试剂的校准品，由于加入赋形剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂组成的复合保护物质，使得校准品稳定性好，在室温条件下可稳定1个月，在‑20℃下可稳定1年，储存有效期长，所述制备方法可溯源至国际或国内参考物质，确保临床检验结果的准确性。本发明提供的稳定的骨钙素检测试剂的校准品适于工业化大规模生产，解决校准品保存不稳定的困难，同时降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断领域，具体涉及一种骨钙素检测试剂的校准品及其制备方法。
背景技术
骨钙素是骨基质中最重要的一种特异性非胶原蛋白，由骨和牙齿中的成骨细胞合成并分泌，其与骨钙的结合作用依赖于维生素K。骨钙素分子含49个氨基酸，分子量约为5800D。在骨合成中，成骨细胞产生骨钙素，此过程依赖于维生素K，同时维生素D3有促进产生骨钙素的作用。使用维生素K拮抗剂，可使此蛋白在骨中的含量减少，但并不影响其脯氨酸的含量，也不影响骨的机械强度。骨钙素产生后一部分进入骨基质，另一部分释放进入外周血。因此，血清(血浆)中骨钙素的含量与各种骨代谢紊乱中骨转化率有关。完整的骨钙素包含49个氨基酸，1-43氨基酸的片段为N-中端骨钙素(N-MID)。完整的骨钙素在外周血中不稳定，羧基端的43-44间的氨基酸易被蛋白酶水解，裂解下来的N-MID则稳定的多。因此，测定血清(血浆)中的稳定N-MID，从而确保检测结果的稳定性。
为了实现这种方法，需要与之相配套的校准品。目前制备校准品大多采用血清基质真空冷冻干燥所得。但血清基质仍存在一些问题。主要是其成份复杂、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂蛋白类等物质尚未充分认识，对实验会产生一定的影响；其次血清都是批量生产，各批量之间会存在一定差异，而且血清保存期也需要被考虑，容易引起细菌等污染，导致保质期缩短，因此，要保证每批血清的一致性较为困难，从而使实验的标准化受到一定的限制；而且进口血清的价格相对较高，因此选择血清作为基质成分，需要考虑的因素非常多，对实际应用产生了很大的限制。另一方面血清容易被细菌污染，因此会为校准品的效期稳定性带来一定的风险，高品质的血清价格也相对较高，会增加最终校准品的成本。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种骨钙素检测试剂的校准品及其制备方法，本发明以缓冲液为基质，通过对缓冲液种类及冻干保护剂的筛选，制备出了稳定性好、准确度高的骨钙素检测试剂校准品。本发明工艺简单、缓冲液基质替代了价格昂贵的血清基质大大降低了生产成本。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，包括以下步骤：
(a)、配制缓冲液；
(b)、将冻干保护剂和不同浓度的降钙素，加入步骤(a)获得的缓冲液中；
(c)、将步骤(b)中获得的缓冲液混合物进行冷冻干燥，由此获得所述校准品；
所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、MOPSO和巴比妥那-盐酸缓冲液中的一种或几种；
所述冻干保护剂是由氨基酸类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、多元醇、表面活性剂及防腐剂组成的混合物。
在上述技术方案中，所述缓冲液为pH为6.5-7.5、浓度为10mM-20mM的MOPSO缓冲液。
在上述技术方案中，所述缓冲液为pH为7.5、浓度为10mM的MOPSO缓冲液。
在上述技术方案中，
所述氨基酸类保护剂为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或几种的混合物；
所述蛋白类保护剂为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种或几种的混合物；
所述糖类保护剂为蔗糖、麦芽糖、海藻糖和葡聚糖中的一种或几种的混合物；
所述多元醇类甘油、甘露醇和山梨醇中的一种或几种的混合物；
所述表面活性剂为tween-20、tritonX-100和辛基酚氧乙烯醚中的一种或几种；
所述防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、庆大霉素、ProClin300和脱氢乙酸钠中的一种或几种的混合物。
在上述技术方案中，
所述氨基酸类保护剂为0.1％-5％的甘氨酸；
所述蛋白类保护剂为1％-5％的牛血清白蛋白；
所述糖类保护剂为1％-10％的海藻糖；
所述多元醇为1％-10％的甘露醇；
所述表面活性剂为0.1％-10％的tween-20；
所述防腐剂为0.01％-5％的ProClin300。
在上述技术方案中，
所述氨基酸类保护剂为1％的甘氨酸；
所述蛋白类保护剂为5％的牛血清白蛋白；
所述糖类保护剂为2％的海藻糖；
所述多元醇为2％的甘露醇；
所述表面活性剂为0.2％的tween-20；
所述防腐剂为0.2％的ProClin300。
在上述技术方案中，所述的制备方法还包括：以国际或国内参考物质对校准品进行量值溯源。
在上述技术方案中，步骤(c)中的冷冻干燥包括预冻阶段、主干燥阶段和解析干燥阶段；
预冻阶段工艺采用慢冻，慢冻稳定温度是-70～-30℃，持续时间1-5小时；
主干燥阶段工艺采用的温度是-50～-30℃，时间持续5-40小时；
解析干燥阶段采用的温度是30～40℃，时间持续1-8小时。
在上述技术方案中，
预冻阶段慢冻稳定温度是-50℃，持续时间为4小时；
主干燥阶段采用的温度是-40℃，持续时间为8小时；
解析干燥阶段采用的温度是30℃，持续3小时。
本发明还提一种上述制备方法制备的骨钙素检测试剂的校准品。
所述骨钙素检测试剂的校准品为冻干粉；
本发明所述各组分或原料均可市售获得。
本发明的有益效果是：
本发明制备的骨钙素检测试剂的校准品，由于加入赋形剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂组成的复合保护物质，使得校准品稳定性好，在室温条件下可稳定1个月，在-20℃下可稳定1年，储存有效期长，所述制备方法可溯源至国际或国内参考物质，确保临床检验结果的准确性。本发明提供的稳定的骨钙素检测试剂的校准品适于工业化大规模生产，解决校准品保存不稳定的困难，同时降低了生产成本。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为骨钙素校准曲线。
具体实施方式
本发明提供一种骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，所述方法包括：
(a)、配制缓冲液；
(b)、将冻干保护剂和不同浓度的降钙素，加入步骤(a)获得的缓冲液中；
(c)、将步骤(b)中获得的缓冲液混合物进行冷冻干燥，由此获得所述校准品；
在步骤(b)中，冻干保护剂和抗原降钙素的加入顺序没有特别限制，可以同时或顺序加入；
本发明的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、MOPSO或巴比妥那-盐酸缓冲液中的一种或几种，优选为pH6.5-7.5，浓度为10mM-20mM的MOPSO缓冲液，最优选为pH7.5，浓度为10mM的MOPSO缓冲液。
本发明的冻干保护剂是由氨基酸类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、多元醇、表面活性剂及防腐剂组成的混合物。
所述氨基酸类保护剂优选为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或几种混合物，更优选为0.1％-5％的甘氨酸，最优选为1％的甘氨酸；
所述蛋白类保护剂优选为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白等中的一种或几种，更优选为1％-5％的牛血清白蛋白，最优选为5％的牛血清白蛋白；
所述糖类保护剂优选为蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡聚糖中的一种或几种混合物。更优选为1％-10％的海藻糖，最优选为2％的海藻糖；
所述多元醇优选为甘油、甘露醇、山梨醇中的一种或几种混合物，更优选为1％-10％的甘露醇，最优选为2％的甘露醇；
所述表面活性剂优选为tween-20、tritonX-100、辛基酚氧乙烯醚等中的一种或几种。更优选为0.1％-10％的tween-20，最优选为0.2％的tween-20；
所述防腐剂优选为叠氮化钠、硫柳汞、庆大霉素、ProClin300、脱氢乙酸钠中的一种或几种混合物，更优选为0.01％-5％的ProClin300，最优选为0.2％的ProClin300；
进一步地，上述校准品的制备方法还包括以国际或国内参考物质对校准品进行量值溯源；
在本发明的方法中，步骤(c)中的冷冻干燥包括预冻阶段、主干燥阶段和解析干燥阶段。
预冻阶段工艺优选地采用慢冻，慢冻稳定温度是-70～-30℃，持续时间1-5小时，更优选预冻阶段慢冻稳定温度是-50℃，持续时间为4小时；
主干燥阶段工艺优选地采用的温度是-50～-30℃，时间持续5-40小时，更优选主干燥阶段用的温度是-40℃，持续时间为8小时；
解析干燥阶段优选地采用的温度是30～40℃，时间持续1-8小时，更优选解析干燥阶段温度是30℃，持续3小时。
本发明还提一种上述制备方法制备的骨钙素检测试剂的校准品。
所述骨钙素校准品为冻干粉；
本发明所述各组分或原料均可市售获得。
本发明制备的骨钙素检测试剂的校准品，由于加入赋形剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂组成的复合保护物质，使得校准品稳定性好，在室温条件下可稳定1个月，在-20℃下可稳定1年，储存有效期长，所述制备方法可溯源至国际或国内参考物质，确保临床检验结果的准确性。本发明提供的稳定的骨钙素检测试剂的校准品适于工业化大规模生产，解决校准品保存不稳定的困难，同时降低了生产成本。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
实施例1校准品的制备
配制pH7.5，浓度为10mM的MOPSO缓冲液100mL，向其中加入1g甘氨酸，5g牛血清白蛋白，甘露醇2g，海藻糖2g，0.2g的ProClin300，0.22μm滤膜过滤，向制备好的校准品基质中加入骨钙素的浓度分别为0，1.5，8.4，25.8，60.5，124.6，290.8ng/mL。
将制备好的校准品称重1g±0.005g/瓶，常温放入冷冻干燥机，温度降至-50℃，保持4小时，温度升至-40℃，保持8小时，主干燥阶段完成后，升温至30℃，保持3小时。
制备好的校准品以国际或国内参考物质对校准品进行定值溯源
向制备好的校准品冻干品中加入1g±0.005g纯水，室温复溶15min。
根据骨钙素标准液梯度浓度与所对应光量值，绘制标准曲线(参见图1)。
实施例2校准品的制备
配制pH7.5，浓度为10mM的巴比妥那-盐酸缓冲液100mL，向其中加入1g谷氨酸，5g牛血清白蛋白，山梨醇2g，蔗糖2g，0.2g叠氮钠，0.22μm滤膜过滤，向制备好的校准品基质中加入骨钙素的浓度分别为0，1.5，8.4，25.8，60.5，124.6，290.8ng/mL。
将制备好的校准品称重1g±0.005g/瓶，常温放入冷冻干燥机，温度降至-40℃，保持4小时，温度升至-30℃，保持8小时，主干燥阶段完成后，升温至25℃，保持3小时。
实施例3校准品的制备
配制pH7.5，浓度为20mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液100mL，向其中加入2g精氨酸，1g甘氨酸，5g牛血清白蛋白，甘油5g，甘露醇2g，葡聚糖2g，蔗糖2g，0.2g的ProClin300，0.1g叠氮钠，0.22μm滤膜过滤，向制备好的校准品基质中加入骨钙素的浓度分别为0，1.5，8.4，25.8，60.5，124.6，290.8ng/mL。
将制备好的校准品称重1g±0.005g/瓶，常温放入冷冻干燥机，温度降至-45℃，保持5小时，温度升至-40℃，保持10小时，主干燥阶段完成后，升温至25℃，保持4小时。
上述实施例中所用的pH值的缓冲液，氨基酸类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、多元醇、表面活性剂及防腐剂还可以替换成前述限定的任意一种或多种的组合，及冷冻冷冻阶段的温度及时间也可以为上述限定的范围内的任意值，制备得到的校准品均能够达到本发明所述的技术效果，这里不再一一列举。
以下对实施例1制备的校准品的性能进行验证
实施例4校准品准确度验证
对制备好的校准品进行赋值。用有证的骨钙素试剂及配套校准品校准检测系统后，对其进行检测。检测方法：每个浓度校准品重复测试3次，分别取测定结果的均值，计算测定结果均值与标示值的偏差。0浓度校准品的检测值与标示值的绝对偏差不超过0.05ng/mL。其他浓度校准品的检测值与标示值的相对偏差不超过±5％。检测结果见后附表1。计算公式为：
表1：骨钙素校准品准确度验证
由检测结果可知，制备的骨钙素校准品准确度满足要求。
实施例5校准品均匀性评估
检测方法：取同一批号的七个浓度的校准品每个浓度各10瓶，每瓶测试1次，根据下列公式分别计算测试结果的均值和标准差(SD1)，计算瓶间重复性(CV)。另用上述校准品的中的不同浓度各一瓶连续测试10次，计算测试结果的平均值和标准差SD2；按下列各公式计算瓶内、瓶间重复性CV％，结果应符合标准要求。均匀性CV≤5％，检测结果请见附表2、附表3。
式中：
—平均值；
SD—标准差；
CV—变异系数；
n—测量次数；
xi—指定参数第i次测量值。
表2：骨钙素校准品瓶内均匀性验证
表3：骨钙素校准品瓶间均匀性验证
由检测结果可见，制备好的校准品瓶内瓶间的均匀性在5％以内，满足检测的要求。
实施例6校准品效期稳定性评估
检测方法：制备好的骨钙素校准品每间隔3个月进行一次检测，按照公式1计算检测结果与标示值的相对偏差应不大于10％，结果见后附表4
表4骨钙素校准品效期稳定性验证
实施例7校准品37℃加速稳定性验证
检测方法：制备好的骨钙素校准品，放入37℃恒温培养箱，7天、14天进行一次检测，按照公式1计算检测结果与标示值的相对偏差，计算衰减率应不大于5％。结果见后附表5。
表5骨钙素校准品37℃加速稳定性验证
| 浓度值(ng/mL) | 7天 | 相对偏差 | 14天 | 相对偏差 |
| 0 | 0.02 | / | 0.05 | / |
| 1.5 | 1.54 | 2.7％ | 1.57 | 4.7％ |
| 8.4 | 8.65 | 3.0％ | 8.82 | 5.0％ |
| 25.8 | 26.4 | 2.3％ | 27.1 | 5.0％ |
| 60.5 | 61.2 | 1.2％ | 63.4 | 4.8％ |
| 124.6 | 128.3 | 3.0％ | 129.8 | 4.2％ |
| 290.8 | 297.1 | 2.2％ | 304.9 | 4.8％ |
实施例8校准品复溶稳定性验证
检测方法：取待检的校准品，准确复溶后，置于-20℃条件下保存，分别在保存7天、14天、21天、28天，计算衰减率应不大于5％。
表6骨钙素校准品复溶稳定性验证
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)、配制缓冲液；
(b)、将冻干保护剂和不同浓度的降钙素，加入步骤(a)获得的缓冲液中；
(c)、将步骤(b)中获得的缓冲液混合物进行冷冻干燥，由此获得所述校准品；
所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸、MOPSO和巴比妥那-盐酸缓冲液中的一种或几种；
所述冻干保护剂是由氨基酸类保护剂、蛋白类保护剂、糖类保护剂、多元醇、表面活性剂及防腐剂组成的混合物。
2.根据权利要求1所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pH为6.5-7.5、浓度为10mM-20mM的MOPSO缓冲液。
3.根据权利要求1所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pH为7.5、浓度为10mM的MOPSO缓冲液。
4.根据权利要求1所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，
所述氨基酸类保护剂为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或几种的混合物；
所述蛋白类保护剂为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种或几种的混合物；
所述糖类保护剂为蔗糖、麦芽糖、海藻糖和葡聚糖中的一种或几种的混合物；
所述多元醇为甘油、甘露醇和山梨醇中的一种或几种的混合物；
所述表面活性剂为tween-20、tritonX-100和辛基酚氧乙烯醚中的一种或几种；
所述防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、庆大霉素、ProClin300和脱氢乙酸钠中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求4所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，
所述氨基酸类保护剂为0.1％-5％的甘氨酸；
所述蛋白类保护剂为1％-5％的牛血清白蛋白；
所述糖类保护剂为1％-10％的海藻糖；
所述多元醇为1％-10％的甘露醇；
所述表面活性剂为0.1％-10％的tween-20；
所述防腐剂为0.01％-5％的ProClin300。
6.根据权利要求5所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，
所述氨基酸类保护剂为1％的甘氨酸；
所述蛋白类保护剂为5％的牛血清白蛋白；
所述糖类保护剂为2％的海藻糖；
所述多元醇为2％的甘露醇；
所述表面活性剂为0.2％的tween-20；
所述防腐剂为0.2％的ProClin300。
7.根据权利要求1所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括：以国际或国内参考物质对校准品进行量值溯源。
8.根据权利要求1所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，步骤(c)中的冷冻干燥包括预冻阶段、主干燥阶段和解析干燥阶段；
预冻阶段工艺采用慢冻，慢冻稳定温度是-70～-30℃，持续时间1-5小时；
主干燥阶段工艺采用的温度是-50～-30℃，时间持续5-40小时；
解析干燥阶段采用的温度是30～40℃，时间持续1-8小时。
9.根据权利要求8所述的骨钙素检测试剂的校准品的制备方法，其特征在于，
预冻阶段慢冻稳定温度是-50℃，持续时间为4小时；
主干燥阶段采用的温度是-40℃，持续时间为8小时；
解析干燥阶段采用的温度是30℃，持续3小时。
10.一种权利要求1-9任意一项所述的制备方法制备的骨钙素检测试剂的校准品。
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