CN109439607B - 一种麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明构建的基因工程菌发酵48h麦芽糖淀粉酶的产量可达462.8U/mL优于现有文献报道的水平。由于枯草芽孢杆菌属于食品级微生物，发酵过程安全，具有重要的工业化应用前景。

Description

一种麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用

技术领域

本发明涉及一种麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用，属于基因工程和酶工程领域。。

背景技术

麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase或maltogenase，EC 3.2.1.133)是糖苷水解酶GH-H系成员。目前，麦芽糖淀粉酶主要的细菌来源为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热放线菌(Thermus vulgaris)以及栖热菌属(Thermus sp.)等。不同来源的麦芽糖淀粉酶，在性质上也有很大的区别。目前应用于麦芽糖浆制备和抗面包老化的麦芽糖淀粉酶，主要来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。

麦芽糖是由两个葡萄糖单位经α-1，4糖苷键连接组成的还原性二糖，化学名称是4-O-D-六环葡萄糖基-D-六环葡萄糖。其甜度柔和，又因低粘度、低吸湿性及良好的热稳定性特点，可作为食品增甜剂取代葡萄糖和蔗糖，在食品工业领域具有巨大的应用潜力。工业上麦芽糖的制备，是以淀粉质为原料，经过α-淀粉酶，麦芽(或β-淀粉酶，真菌淀粉酶)水解工艺，制得一种以麦芽糖为主(40％-60％)的糖浆，若麦芽糖含量超过45％(最好在50％以上)，则被称为高麦芽糖浆。在食品工业中高麦芽糖浆的用途之一是制作糕点、糖果等产品。糖浆熬煮温度远高于饴糖，一般超过140℃。麦芽糖含量大于70％，甚至高达90％以上，则被称为超高麦芽糖浆。麦芽糖相比葡萄糖可避免血糖升高，对于应用于抗体、疫苗等的制备具有优于葡萄糖的应用优势。因此超高纯度的麦芽糖浆在医药领域的应用也引起了越来越多的关注。

当前麦芽糖生产工艺已较为成熟，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶生产麦芽糖时，产物中麦芽糖含量可高达90％，葡萄糖、三糖、四糖以及部分低聚糖和糊精是主要的转化副产物。其中糊精和部分低聚糖，可通过乙醇沉淀去除。超高纯度麦芽糖的制备，则要通过色谱分离和结晶等方法获得。由于麦芽糖黏度大、难结晶，通常要求结晶原料中麦芽糖纯度在90％以上，因此色谱分离的纯度，对麦芽糖结晶起着至关重要的作用。色谱分离基本可去除葡萄糖和五糖及以上的小分子糖类，对麦芽糖纯度影响较小。但产物中的三糖和四糖由于与麦芽糖性质较为相近，往往成为分离纯化中的主要杂质，不仅直接降低了产品纯度，还给麦芽糖结晶性、糖浆粘度以及最终产品的水分含量带来很大不利影响，使麦芽糖最终收率大大降低。

麦芽糖淀粉酶具有小分子糖水解活性，可水解三糖、四糖等小分子糖，形成葡萄糖和麦芽糖，因此在超高麦芽糖生产中通常与α-淀粉酶、β-淀粉酶和普鲁兰酶等复配使用以降低副产物比例，使麦芽糖更利于结晶。据报道，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶具有较高的最适反应温度和较低的最适pH反应条件，可满足较为苛刻的工业生产条件，将产物中麦芽糖比例提高至92％，在工业上有极大的应用优势。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产麦芽糖淀粉酶的基因工程菌，表达SEQ IDNO.1所示的麦芽糖淀粉酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以细菌细胞为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述细菌细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌通过信号肽wapA、yvgO、bpr、yfkD或oppA促进麦芽糖淀粉酶的分泌。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌在生产麦芽糖淀粉酶中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至培养基中，38～42℃培养42～60h。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基以酵母浸膏和大豆蛋白胨为氮源，以可溶性淀粉为碳源。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为酵母浸膏25g/L，大豆蛋白胨5g/L、可溶性淀粉5g/L、KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 16.4g/L。

本发明还要求保护所述基因工程菌在制备含麦芽糖的产品方面的应用。

有益效果：本发明构建的基因工程菌发酵48h麦芽糖淀粉酶的产量可达462.8U/mL优于现有文献报道的水平。由于枯草芽孢杆菌属于食品级微生物，发酵过程安全，具有重要的工业化应用前景。

具体实施方式

麦芽糖淀粉酶酶活分析

(1)酶活单位定义

采用3，5-二硝基水扬酸法(DNS法)测定麦芽糖淀粉酶活时，每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量作为一个活力单位。

(2)酶活力测定步骤

预热：取2mL的0.5％可溶性淀粉溶液(50mM pH5.5柠檬酸缓冲液)于试管中，置于60℃水浴锅中预热10min。

反应：加入0.1mL样品酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mL DNS振荡均匀，放入冰水中终止反应，沸水浴煮沸7min。冷却。

测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀。在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。

实施例1：野生麦芽糖淀粉酶的制备。

(1)麦芽糖淀粉酶重组菌的构建

根据NCBI上的amyM氨基酸序列(NCBI编号：AAA22233.1)，对序列进行密码子优化，采用化学全合成方法合成麦芽糖淀粉酶的基因序列amyM。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a(+)。将pET24a(+)质粒和带有amyM基因的质粒分别进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒验证，结果正确，得到富集的amyM/pET24a质粒。将质粒amyM/pET24a转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转化子在LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中37℃培养过夜，保存甘油管，命名为amyM/pET24a/BL21(DE3)。

(2)麦芽糖淀粉酶的表达与纯化

从甘油管接种amyM/pET24a/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.01mM终浓度的IPTG进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集发酵上清。

在上清液中缓慢加入50％(NH₄)₂SO₄,4℃放置过夜，4℃、8000rpm离心20min，收集沉淀。用pH7.5的20mM柠檬酸缓冲液复溶沉淀后，在20mM柠檬酸缓冲液中透析过夜。期间更换2-3次缓冲液。通过0.22μm膜过滤后制成上样样品，采用avant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。阴离子交换色谱纯化步骤：(1)平衡：用5倍体积的20mM缓冲液平衡DEAE阴离子交换色谱柱；(2)上样：预先处理好的样品以1mL/min的流速上样；(3)洗脱：流速1mL/min进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分步收集含麦芽糖淀粉酶活力的洗脱液。得到纯化的野生麦芽糖淀粉酶。

实施例2：麦芽糖淀粉酶突变体制备

将麦芽糖淀粉酶中第115位的丙氨酸(Ala)突变成缬氨酸(Val)，并将麦芽糖淀粉酶中第288位的酪氨酸(Tyr)突变成谷氨酰胺(Gln)，标记为A115V/Y288Q。

引入A115V突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-ACCTGGACACCCTGGTCGGTACCGACAACA-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-TGTTGTCGGTACCGACCAGGGTGTCCAGGT-3’(下划线为突变碱基)

引入Y288Q突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TTCCTGGTTGGTGACAGGTACGGTGACGAC-3’(下划线为突变碱基)

反向引物：5’-GTCGTCACCGTACCTGTCACCAACCAGGAA-3’(下划线为突变碱基)

以amyM/pET24a质粒为模板，进行PCR反应。反应在50μL体系中进行，反应条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃10s，53℃10s，72℃7min20s)；72℃延伸10min；最后4℃保温。PCR产物经DpnⅠ(Fermentas公司)消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒amyMT/pET-24a(+)，经测序均正确，保存甘油管。

(2)突变体酶的表达与纯化

突变体表达及纯化过程如实施例1所述。

实施例3：重组菌的构建

(1)以构建好的重组质粒amyMT/pET-24a(+)为模板，采用BamHⅠ和HindⅢ酶进行双酶切，获得A115V/Y288Q突变体片段；同时，同样采用BamHⅠ和HindⅢ对载体pMA5进行双酶切，并通过胶回收获得目的片段后，与突变体A115V/Y288Q基因在T4连接酶的作用下连接过夜。按上述相同策略构建未突变的对照菌株pMA5-amyM。

(2)分别向重组质粒pMA5-amyMT中插入信号肽wapA、yvgO、bpr、yfkD、oppA，获得pMA5-wapA-amyMT、pMA5-yvgO-amyMT、pMA5-bpr-amyMT、pMA5-yfkD-amyMT、pMA5-oppA–amyMT，将上述质粒采用电转化法转化至枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，37℃，过夜培养，挑取阳性克隆，进行验证，验证正确后进行摇瓶发酵产酶。

实施例4：摇瓶发酵产酶及麦芽糖淀粉酶酶活的测定

将实施例3中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8-10h后以5％接种量转接至TB发酵培养基中，于37℃、200rpm培养2h，再移至33℃恒温培养48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。

以未引入信号肽的枯草芽孢杆菌pMA5-amyMT为对照，引入不同信号肽后的重组菌产酶酶活如表1所示。

表1不同重组菌的麦芽糖淀粉酶产量

实施例5：摇瓶发酵产酶及麦芽糖淀粉酶酶活的测定

以含pMA5-wapA-amyMT重组质粒的重组菌为发酵菌株，在发酵培养基(酵母浸膏25g/L，大豆蛋白胨5g/L、可溶性淀粉5g/L、KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 16.4g/L，初始pH7.0)，200rpm 40℃培养48小时，将获得的发酵液12000rpm离心5min除去菌体，获得的发酵上清液即为粗酶液，得到的发酵上清液酶活为462.8U/mL。

对比例1：摇瓶发酵产酶及麦芽糖淀粉酶酶活的测定

以甘油替换培养基中的可溶性淀粉，其他实施方式同实施例5。发酵相同时间，酶活为393.6U/mL。

对比例2：摇瓶发酵产酶及麦芽糖淀粉酶酶活的测定

以麦芽糊精替换培养基中的可溶性淀粉，其他实施方式同实施例5。发酵相同时间，酶活为404.2U/mL。

对比例3：摇瓶发酵产酶及麦芽糖淀粉酶酶活的测定

以玉米浆替换培养基中的大豆蛋白胨，其他实施方式同实施例5。发酵相同时间，酶活为365.3U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南汇升生物科技有限公司

<120> 一种麦芽糖淀粉酶生产菌株的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 717

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Lys Lys Thr Leu Ser Leu Phe Val Gly Leu Met Leu Leu Ile

1 5 10 15

Gly Leu Leu Phe Ser Gly Ser Leu Pro Tyr Asn Pro Asn Ala Ala Glu

20 25 30

Ala Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile

35 40 45

Ile Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys

50 55 60

Ser Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp

65 70 75 80

Gly Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln

85 90 95

Leu Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asn Asn Leu Asp

100 105 110

Thr Leu Val Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg

115 120 125

Asp Phe Lys Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp

130 135 140

Thr Leu Val Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp

145 150 155 160

Phe Val Pro Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe

165 170 175

Ala Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr

180 185 190

Phe Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser

195 200 205

Asn Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro

210 215 220

Ala Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala

225 230 235 240

Gln Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Leu Arg

245 250 255

Ile Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys Ser Leu Ala

260 265 270

Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly Glu Trp Gln

275 280 285

Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val Arg Tyr Ala

290 295 300

Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn Thr Val Ile

305 310 315 320

Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp Leu Asn Asn

325 330 335

Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu Asn Leu Ile

340 345 350

Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser Val Asn Ser

355 360 365

Lys Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Arg Leu Leu Ser Phe Ser Leu Arg

370 375 380

Gly Val Arg Pro Pro Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Ala Gly

385 390 395 400

Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp Thr Thr

405 410 415

Thr Thr Ala Phe Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg Arg Asn

420 425 430

Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile Asn Asn

435 440 445

Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val Leu Val

450 455 460

Ala Ile Asn Arg Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly Leu Gln

465 470 475 480

Thr Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly Leu Leu

485 490 495

Gly Gly Asn Gly Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser Phe Thr

500 505 510

Leu Ala Pro Gly Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser Ala Ser

515 520 525

Ala Pro Gln Ile Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro Gly Asn

530 535 540

Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly Thr Val

545 550 555 560

Thr Phe Gly Gly Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser Asn Arg

565 570 575

Ile Glu Val Tyr Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp Val Lys

580 585 590

Val Thr Ala Gly Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn Ile Leu

595 600 605

Ser Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala Pro Pro

610 615 620

Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro Glu Leu

625 630 635 640

Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala Gln Gly

645 650 655

Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe Ser Val

660 665 670

Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg Ala Asp

675 680 685

Gly Thr Ile Gln Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr Thr Pro

690 695 700

Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn

705 710 715

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acctggacac cctggtcggt accgacaaca 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgttgtcggt accgaccagg gtgtccaggt 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcctggttg gtgacaggta cggtgacgac 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgtcaccg tacctgtcac caaccaggaa 30

Claims (7)

1.一种产麦芽糖淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5为载体，表达SEQ ID NO.1所示的麦芽糖淀粉酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过信号肽wapA、yvgO、bpr、yfkD或oppA促进麦芽糖淀粉酶的分泌。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌在生产麦芽糖淀粉酶中的应用。

4.一种生产麦芽糖淀粉酶的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌接种至培养基中，38～42℃培养42～60h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基以酵母浸膏和大豆蛋白胨为氮源，以可溶性淀粉为碳源。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述培养基为酵母浸膏25g/L，大豆蛋白胨5g/L、可溶性淀粉5g/L、KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 16.4g/L。

7.权利要求1或2所述的基因工程菌在制备含麦芽糖的产品方面的应用。