CN109423489B - 一种连续式微生物物理诱变育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种连续式微生物物理诱变育种方法，主要应用于生物发酵中菌种的快速诱变与高产菌种的获得。该方法由诱变盒与辐射遮挡板组成，诱变盒用于铺设待诱变的菌种，遮挡板可覆盖于诱变盒之上，在外力的作用下可匀速或变动地运动，并依次遮挡住物理的辐射。该发明能完整地保存从0时刻到T时刻的物理诱变信息，快速地进行物理诱变操作，简化了物理诱变育种的操作步骤。本发明主要应用于生物工程领域的微生物诱变育种领域，筛选更高活性的发酵菌种，提高发酵产量与质量，减低发酵成本。

Description

一种连续式微生物物理诱变育种方法

技术领域

本发明涉及一种连续式微生物物理诱变育种方法，主要应用于生物发酵中菌种的快速诱变与高性能菌种的获得，在药物、能源、化工、环境等生物发酵领域的均有应用。

背景技术

在工业生产中，发酵工业占有重要地位，大量的生物活性物质如抗生素、氨基酸、糖肽等均可由微生物发酵生产。发酵技术决定于三个因素，即菌种、发酵设备与发酵工艺。为了提高发酵水平，提高生产效率，人们也都从这三方面进行努力与突破，而菌种技术的突破具有事半而功倍的效果。通过育种技术可以人为地使某些代谢产物过量积累，使生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向加以引导。高产优质的菌种可以大大地降低生产成本，提高生产效率。菌种育种技术分为诱变育种与基因工程育种两大类。对于遗传背景清楚、代谢途径简单的菌种与代谢产物，用基因工程育种更为有效。而对于遗传背景不清楚、代谢调控复杂的菌种，用人工诱变育种的方法更为可行。这些方法虽然经典，但非常有效，因而泛应用于发酵工业的菌种改良中。微生物诱变处理一般采取物理诱变方法与化学诱变方法。物理诱变方法有紫外线(UV)、X射线、γ-射线，快中子，激光，微波，离子束、低温等离子体等；化学诱变方法是使用化学诱变剂使微生物的基因发生变化的方法。常见的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂甲基磺酸乙酯(EMS)等。化学诱变剂对人体危害甚大，有一定的致癌作用。操作过程需要严密防护。即使用过的工具，也要严格收藏隔离，以防失接触引起人体的损害。与化学诱变相比，物理诱变对环境与操作者的影响较小，且简便易行，因而受到育种者的青睐。

紫外诱变是物理诱变里最常用的方法。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm。因此，波长260nm的紫外辐射是最有效的诱变剂。紫外线能是使DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失等。

γ-射线也是一种典型的物理育种方法，它属于电离辐射，能产生电离作用，因而能直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是，脱氧核糖的碱基发生氧化，或脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键断裂，使得DNA的单链或双链键断裂。其间接效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基，这些自由基与细胞中的溶质分子起作用，发生化学变化，作用于DNA分子而引起缺失和损伤。此外，电离辐射还能引起染色体畸变，发生染色体断裂，形成染色体结构的缺失、易位和倒位等。

常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma缩写为ARTP)能够在一个大气压下产生温度在25～40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，导致微生物产生突变。该技术由清华大学邢新会教授的团队产业化，并在2017年第45届日内瓦国际发明展获得大会金奖。

尽管物理诱变技术取得了丰硕的成果，但对操作层面而言，物理诱变技术不可控因素多、操作繁琐、费时费力。一般需要先要进行繁琐的致死率测定，描绘致死率曲线。然后选择适当的时间与强度进行诱变操作。

本发明的目的就是针对上述物理诱变存在的问题，提供一种连续式的简便的微生物物理诱变方法。目的是提高微生物物理诱变的方便性，简化物理诱变过程，提高诱变育种的效率。

发明内容

为实现上述目的，我们创立了该连续式物理诱变方法。本发明的主要内容是：

一种可屏蔽物理诱变剂的可运动的遮挡板。对于紫外诱变而言，该遮挡板为不透明材料，对于γ射线而言，遮挡板选择3毫米以上的铅板。待诱变的菌种均匀地平铺于灭菌后的平板上。该遮挡板与可控的运动部件相连接，可以按设定的速度进行运动，并依次屏蔽掉物理诱变剂。这样，底层的微生物完整而连续地保存了从0时刻到T时刻全部的物理诱变效果。

诱变后的微生物直接进行培养，即可得到全部的诱变菌种。选择合适的时刻进行筛选，即可得到高产菌种。

上述的诱变装置可与自动控制装置连接，从而控制遮挡板的运动速度。与自控系统连接，即可有效控制遮挡板的运动。这样使多次操作过程一步完成，且实时记录了诱变的参数。

本发明可应用于生物发酵领域，进行菌种改造。

具体实施方式：下面通过阿维菌素生产菌阿维链霉菌连续诱变实例对本发明作进一步详细说明。

实施例1.阿维链霉菌培养

阿维链霉菌生产菌为国内阿维菌素生产企业提供。为了提高诱变的质量，选择高产的优良菌种进行育种。菌种首先进行斜面培养，以得到丰富的孢子。斜面培养基成份为葡萄糖1.5％、牛肉浸膏0.3％、天冬酰胺0.05％；K2HPO4 0.05％、琼脂2.0％；培养基用水为蒸馏水，灭菌前pH调整至7.2-7.4，灭菌温度121℃15～20min；该培养基可用于阿维菌素的斜面培养与平板培养。培养温度28℃，培养时间7-9天。

实施例2.阿维链霉菌诱变出发菌株孢子制备

选用实施例1的培养方法进行平板培养，28℃培养8天后选择菌形丰满孢子量丰富的菌落进行小斜面培养。8天后小斜面培养完成，转入大孢子瓶进行孢子的大量培养，28℃下大约需要培养8天孢子成熟。在该培养基上，阿维链霉菌的孢子呈白色。

实施例3.阿维链霉菌诱变平板的制作

诱变盒为200×130×10mm的铝制盒容器，为了方便以后的培养与观察，同时制作202×132×10mm的玻璃容器盖。诱变遮挡板用铝板制成，大小为220×130×1mm.为了能让该遮挡板均匀运动，在遮挡板的边沿打一1mm的小孔，同时系一细绳。盖板的两侧加一组平行的导轨槽，槽宽略大于诱变盒的板材厚度，槽深0.5毫米，这样遮挡板可以在拉力下平行移动。

实施例4.阿维链霉菌诱变平板的铺设

实施例3中的容器及遮挡板使用前需要121℃灭菌15分钟以上，取出超净工作台上放凉备用。灭菌后的培养基100毫升～300毫升(成份同实施例1)，放凉至60℃左右时，倒入诱变盒，制成营养平板，凝固后备用。

选实施例2中大茄子瓶培养的斜面，用灭菌的小铲刮下菌苔，并溶于20毫升的灭菌水中(灭菌前加入10颗灭菌的2-3mm的玻璃)，震荡5分钟，打碎孢子并用滤纸(事先灭菌)过滤，得到孢子悬液。取该孢子悬液1毫升～5毫升，用三角棒(事先灭菌)均匀地涂布在诱变盒的营养平板上。

实施例5.阿维链霉菌平板的连续紫外诱变

将诱变盒固定于单人单面紫外诱变台(垂直)超净工作台的内，打开紫外诱变灯，同时拉动盖板，使期平行运动，控制速度为44mm/分钟，5分钟后盖板完全盖住营养平板。关闭紫外灯，在红光保护下移去盖板，盖上玻璃盒盖后，用锡纸包裹。此盒中即记录了0-5分钟的全部紫外诱变的信息。

实施例6.阿维链霉菌平板连续紫外诱变后的挑选

实施例5中的诱变盒培养后3天后，平板会长出2毫米左右的菌落。从0时刻到5分钟的时段，菌落逐步减少，显示紫外线对阿维链霉菌的致死作用与时间成正比。标记合适致死率的时间段。本次实验中发现合适的诱变在55mm-90mm处(大约是80s至120s)，90mm至220mm的菌落非常稀少。

每日观察菌落生长情况，并选择孢子产生早，菌落丰满的菌落，转移其至小斜面试管培养(培养基成份见实施例1)。小试管斜面培养8天后成熟，通过摇瓶试发酵进行进一步的筛选。

实施例7.阿维链霉菌平板连续紫外诱变后的初筛

摇瓶发酵采用斜面挖块接种法，接入种子摇瓶。种子摇瓶的培养基成份为玉米淀粉3％(需液化处理)，玉米浆0.5％，酵母膏1.5％，KH2PO4 0.4％，消前pH7.0～7.2。种瓶装液量为40mL/250mL，于28℃、250r/m旋转式摇床上培养40～48h左右。发酵培养基的成份：玉米淀粉12％，酵母粉1.5％，豆粕粉0.5％，花生饼粉0.5％，KH2PO4 0.5％，消前pH7.0～7.2.发酵摇瓶接种体积分数为5％，装液量为30mL/250mL，于28℃、250r/m旋转式摇床上培养240～260h左右后，用HPLC进行发酵分析，确定发酵的效果与效价。

实施例8.阿维链霉菌平板连续紫外诱变后的试发酵的HPLC分析

取发酵液1.0mL，加入无水乙醇3.0mL，超声波振荡30min后，离心取上清液进行HPLC测定。分析条件为：日本岛津公司HPLC-10A高效液相色谱仪；反相柱(250×4.6mm)；流动相为甲醇水(87∶13)；流速为1mL/min；检测波长为246nm；进样量为20微升。发酵液B1a含量高的菌株即为目标菌株。

Claims (3)

1.一种连续式微生物物理诱变育种方法，其特征在于，所述连续式微生物物理诱变育种步骤为：待诱变育种的菌种以孢子悬液或菌悬液的形式涂布于诱变盒的培养基上，进入射线的辐射范围进行诱变育种，同时用运动的遮挡板依次遮挡住物理射线，并最后完成封闭诱变盒，这样诱变盒内的菌会连续受到从0-T时刻的辐射诱变，诱变后的微生物直接进行培养，即可得到全部的诱变菌种，选择合适的时刻进行筛选，即可得到高产菌种；

所述遮挡板与可控运动部件相连接，可按设定的速度进行运动。

2.按权利要求1所述的一种连续式微生物物理诱变育种方法，其特征在于，所述的遮挡板运动方法可以是匀速的，也可以是变速的；可以是手动的，也可以是机械的。

3.按权利要求1所述的一种连续式微生物物理诱变育种方法，其特征在于，所述的遮挡板材质，可以是柔性的，也可以是刚性的。