CN109415378B - 水溶性Epothilone衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

提供水溶性的通式(I)所示的Epothilone衍生物、制备方法及其中间体，以及它们在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。

Description

水溶性Epothilone衍生物及其制备方法

本申请要求于2016年5月10日提交中国专利局、申请号为201610307285.2、发明名称为“水溶性Epothilone衍生物及其制备方法”以及2016年11月14日提交中国专利局、申请号为201611019538.2、发明名称为“水溶性Epothilone衍生物及其制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于有机化学和药物化学技术领域，具体涉及水溶性Epothilone B衍生物和其中中间体的制备，以及它们的肿瘤抑制活性。

背景技术

Epothilones是一类大环内酯类化合物，具有广谱抗肿瘤活性，它对乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌等人类肿瘤显示出强效的治疗作用。其抗肿瘤机制是与α,β-微管蛋白异二聚物的β亚单位结合，促进微管蛋白的聚合，抑制它的解聚，使细胞不能进行正常的有丝分裂，进而导致肿瘤细胞的死亡。所以，Epothilones家族化合物抗癌的作用机理与紫杉醇相似，但同时Epothilones家族化合物在许多方面优于紫杉醇。例如，抗癌活性比紫杉醇高；能抑制对紫杉醇过敏或对紫杉醇耐药的肿瘤细胞；对有多种抗药性的癌症有较好的活性；对一些多种药物治疗未果的癌症病人依然显示出治疗效果；不受细胞排毒蛋白的作用，故没有紫杉醇类的抗药性问题。此外，由于化学结构比紫杉醇简单，Epothilones家族化合物具有更好的化学修饰与优化潜力。

在Epothilones家族中，Epothilone B是被研究最多，也被认为在肿瘤治疗中最有前景的化合物之一，但Epothilone B本身结构、性质等多方面的缺陷导致其在临床上的应用受到局限。

(1)Epothilone B有严重的毒副作用，如神经毒性，肝脏毒性等。而作为用于人体治疗的安全性药物，要克服Epothilone B毒副作用方面的缺陷，需要对Epothilone B进行更多更广的结构优化，以便得到毒副作用更小、治疗窗口更大的目标化合物。

(2)Epothilone B在水中的溶解度极小，用于注射剂需要加入助溶剂，如蓖麻油、乙醇等。这些助溶剂在一定程度上加大了药物在人体中的副作用。所以改善Epothilone B的水溶性是丞待解决的问题之一。

(3)Epothilone B大环内酯结构不稳定，进入体内在人体酯解酶的作用下，大环内酯开环而导致失活。伊沙匹隆(Ixabepilone)便是以内酰胺键代替Epothilone B内酯键的衍生物，解决了Epothilone B体内不稳定这一缺陷，保留了较强的体内抗癌活性。但伊沙匹隆仍然存在毒副作用、水溶性差等缺陷。

综上所述Epothilone B及其衍生物Ixabepilone的缺陷，对Epothilone B、Ixabepilone进行进一步的结构改进，以期得到毒副作用更小、水溶性更好、抗癌活性仍较强的Epothilone衍生物。

由于目前没有有效的Epothilone B快速合成方法，对其结构改造非常不充分。所以，以微生物发酵得到的Epothilone B为先导药物分子进行新药开发，具有极大的潜力。

Epothilone B、Ixabepilone的结构

PEG是一种水溶性、无毒、生物相容性好的聚合物，经FDA批准可用于对静脉注射或口服药物分子进行修饰。并且已经成功将其同多种蛋白或多肽类药物偶联，改善这些药物的治疗效果。因为PEG能够增大药物分子的体积，从而降低了药物在体内的肾清除率；同时，PEG可以保护药物受到酶的影响而降解，从而改善药物的药代动力学性质。此外，小分子药物同PEG偶联产生的复合物能够起到体内缓释的作用，延长药物在体内的作用时间和改善药物的治疗效果。PEG同小分子药物形成复合物也可以改善小分子药物的水溶性。

多肽是人体一种内源性的物质，由多个氨基酸组成，其具有良好的水溶性和广泛的生物活性，通过多肽与小分子药物的结合可一方面改进小分子药物的溶解性能，另一方面在多肽的协助下实现体内靶向释放或改善生物活性。谷胱甘肽是一个常见的内源性多肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合。谷胱甘肽是含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽也是细胞生长的营养物质，易被细胞摄取，特别易被繁殖较快的肿瘤细胞摄取。利用谷胱甘肽同小分子药物偶联制备的复合物，极可能对快速繁殖的肿瘤细胞具有一定的选择性，同时在一定程度上可以降低抗肿瘤药物对人体正常细胞的毒性。而且，谷胱甘肽是一种水溶性三肽，与小分药物形成复合物，在很大程度上可以改善小分子药物的水溶性。

基于以上理念，本发明提供Epothilone B和Ixabepilone的水溶性衍生物的制备方法，得到了的药效优异、毒副作用更小、水溶性更好的目标化合物。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种毒副作用小、水溶性好、抗癌活性较强的水溶性Epothilone衍生物，结构如式Ⅰ所示：

其中，

X为O或者NH；

R₁和R₂各自独立地为H或COCH₂-R₃，但R₁和R₂不可同时为H；

R₃为S-(CH₂CH₂O)_nR₄,NH-(CH₂CH₂O)_nR₄或者多肽基，其中，多肽优选谷胱甘肽；

R₄为氢或烷基，优选甲基；

n大于或等于1，优选n大于或等于1，并且n小于或等于24，更优选n为3、5、7、12或24。

本发明的优选方案，提供式II所示的Epothilone衍生物：

其中，X和R₃如上所述。

本发明的另一个优选方案，提供式III所示的Epothilone衍生物：

其中，X和R₃如上所述。

具体地说，本发明所述式Ⅰ化合物选自：

本发明的另一个目的是提供了制备式(I)化合物所使用的中间体式IV化合物：

其中，

X为O或者NH；

R₅和R₆各自独立地为H或COCH₂-X₂，但R₅和R₆不可同时为H；

X₂为卤素原子，优选Br和I。

本发明的优选方案，提供式V所示的中间体：

其中，X，X₂如上所述。

本发明的另一个优选方案，提供式VI所示的中间体：

其中，X，X₂如上所述。

本发明进一步提供了水溶性Epothilone衍生物的制备方法，但不仅限于本发明中所提供的具体事例。它涵盖Epothilones家族其他化合物的NH-PEG，S-PEG，谷胱甘肽化以及多肽化的水溶性衍生物的制备。这些衍生物的制备方法和步骤如下：

a)以Epothilone B或伊沙匹隆为起始物料，卤代乙酸为连接基，制备得到式IV所示的化合物：

b)将步骤a)制备得到的式IV化合物和带有-NH₂或-SH基团的PEG衍生物或多肽反应，得到式I所示的化合物：

其中，

X为O或者NH；

R₁和R₂各自独立的是H或COCH₂-R₃，但R₁和R₂不可同时为H；

R₃为S-(CH₂CH₂O)_nR₄，NH-(CH₂CH₂O)_nR₄或者多肽基；

R₄独立的是氢或者烷基；

R₅和R₆各自独立地为H或COCH₂-X₂，但R₅和R₆不可同时为H；

X₂为卤素原子，优选Br和I。

n大于或等于1，优选n大于或等于1，并且n小于或等于24，更优选n为3、5、7、12或24。

其中，式IV所示的化合物为式V或式VI所示的化合物，

式I所示的化合物为式II或式III所示的化合物，

其中，X，X₂和R₃如上述所定义。

本发明提供了式I、II、III所示的水溶性Epothilone衍生物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。

本发明进一步提供了式I、II、III所示的水溶性Epothilone衍生物在制备抑制人体肝癌细胞的药物中的应用。

更近一步，本发明提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的式I、式II、式III所示的Epothilone衍生物或其药学上可接受的盐，及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。

如无特别定义，本发明中所使用的术语具有本领域普遍所接受的含义，进一步地，本发明所使用的部分术语定义如下：

“烷基”当作一基团或一基团的一部分是指直链或者带有支链的饱和脂肪烃基团。优选为C₁-C₁₀烷基，更优选为C₁-C₆烷基。烷基基团的实施例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。

“多肽基”当作一基团或一基团的一部分是指多肽或者蛋白基团。优先为含巯基的多肽或蛋白在巯基处脱H形成的多肽基。多肽基的实施例包括但不限于谷胱甘肽基。

“PEG衍生物”是指经过修饰后的聚乙二醇衍生物。优先为经-NH₂,-SH，COOH修饰后的聚乙二醇衍生物。

“药学上可接受的盐”是指上述化合物能保持原有生物活性并且适合于医药用途的某些盐类。式I化合物药学上可接受的盐可以为与合适的酸形成的盐，合适的酸包括无机酸和有机酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、甲磺酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。

具体实施方式

下面具体实施例可以使本专业技术人员全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度，除非另有指明，各种起始原料和试剂均来自市售。市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用，除非另有指明。

下面的实例仅仅是用来说明所发明的具体化合物的合成方法。但在合成方法上并没有任何限制。在下面未列出的化合物，也可以用与下面同样的合成路线与合成方法，选择适当的起始原材料、在有必要的地方稍加适当的常识性的反应条件调整即可加以制备。

实施例1

Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)和Epothilone B双卤代乙酸酯(VI-1)的制备

将Epothilone B(4.0g,7.9mmol)和碘乙酸(1.2g，6.5mmol)溶于20mL二氯甲烷中，搅拌至固体溶清。混合液冷却至0-5℃，加入DCC(1.55g，7.5mmol)，0-5℃搅拌10-15分钟，向反应液中加入DMAP(0.78g，6.4mmol)。反应液升温至室温，搅拌1.5-2小时。再次将反应液冷却至0-5℃，加入碘乙酸(1.8g，9.7mmol)和DCC(1.97g，9.5mmol)，0-5℃保持搅拌10-15分钟后，将反应液升温至室温，搅拌直至Epothilone B反应完毕。布氏漏斗抽滤不溶性固体，滤液减压浓缩至干，所得浆状物用硅胶柱分离纯化，分别得到化合物V-1(1.05g,1.55mmol)和化合物VI-1(2.8g,3.3mmol)。

化合物V-1:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.01(s,1H),6.67(s,1H),5.47(s,1H),5.34(m,1H),3.72(m,2H),3.51(m,2H),2.85(t,1H),2.74(s,3H),2.55(m,2H),2.14(d,3H),1.94(m,4H),1.72(m,4H),1.60(m,5H),1.50(s,4H),1.31(m,4H),1.12(m,3H),0.97(d,3H),0.88(t,1H).ESI-MS:[M+H]⁺675,[M+Na]⁺697,C₂₉H₄₂INO₇S。

化合物VI-1:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.04(s,1H),6.54(s,1H),5.67(t,1H),5.51(m,1H),5.21(m,1H),3.74(m,2H),3.62(d,1H),3.46(m,2H),2.81(m,1H),2.73(s,4H),2.72(s,1H),2.19(m,1H),2.09(s,3H),1.87(m,4H),1.48(s,3H),1.39(m,1H),1.28(m,7H),1.14(d,4H),1.08(m,6H).ESI-MS:[M+H]⁺843,[M+Na]⁺865,C₃₁H₄₃I₂NO₈S.

实施例2

将Epothilone B(4.0g,7.9mmol)和溴乙酸(2.4g，17.3mmol)溶于20mL二氯甲烷中，搅拌至固体溶清。混合液冷却至0-5℃，加入DCC(1.55g，7.5mmol)，0-5℃搅拌10-15分钟，向反应液中加入DMAP(0.78g，6.4mmol)。反应液升温至室温，搅拌12小时。布氏漏斗抽滤不溶性固体，滤液减压浓缩至干，所得浆状物用硅胶柱分离纯化，得到化合物VI-2(5.09g,6.8mmol)。

化合物VI-2:

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.30(s,1H),6.56(s,1H),5.70(m,1H),5.50(m,1H),5.25(m,1H),4.86(s,1H),4.04(t,2H),3.99(d,1H),3.95(s,1H),3.83(d,1H),3.57(t,1H),2.89(m,1H),2.80(t,2H),2.71(s,3H),2.20(m,1H),2.07(d,2H),1.91(m,2H),1.74(t,3H),1.57(m,3H),1.49(m,2H),1.14(d,4H),1.07(m,7H),0.92(t,1H).¹³C-NMR(400MHZ,CDCl₃),δ212.8,168.9,166.9,165.7,151.5,137.4,121.0,117.2,62.0,61.9,53.1,48.2,48.0,47.4,42.3,36.4,33.4,32.8,32.6,31.3,29.8,25.4,24.9,24.6,22.3,21.4,21.1,17.4,16.5,13.3,13.0.ESI-MS:[M+H]⁺750,[M+Na]⁺772.C₃₁H₄₃Br₂NO₈S.

实施例3

将伊沙匹隆(6.0g,11.9mmol)和碘乙酸(1.8g，9.8mmol)溶于30mL二氯甲烷中，搅拌至固体溶清。混合液冷却至0-5℃，加入DCC(2.3g，11.3mmol),0-5℃搅拌10-15分钟，向反应液中加入DMAP(1.2g，9.6mmol)。反应液升温至室温，搅拌1.5-2小时。再次将反应液冷却至0-5℃，加入碘乙酸(2.7g，14.6mmol)和DCC(4.5g，14.3mmol)，0-5℃保持搅拌10-15分钟后，将反应液升温至室温，搅拌直至伊沙匹隆反应完毕。布氏漏斗抽滤不溶性固体，滤液减压浓缩至干，所得浆状物用硅胶柱分离纯化，分别得到化合物V-2(1.35g,2.0mmol)和化合物VI-3(4.0g,4.8mmol)。

化合物V-2：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),4.67(t,1H),4.25(s,1H),4.13(s,1H),4.02(s,1H),3.84(s,1H),3.75(s,2H),3.33-3.38(m,1H),2.83(t,1H),2.71(s,3H),2.68(d,1H),2.40-2.46(m,1H),2.35(d,1H),2.13(s,3H),1.94-1.98(m,2H),1.56-1.64(m,4H),1.37-1.42(m,6H),1.34(s,3H),1.28(d,3H),1.19(s,3H),0.99(d,3H).ESI-MS:[M+H]⁺674,C₂₉H₄₃IN₂O₆S。

化合物VI-3：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),4.67(t,1H),4.25(s,1H),4.13(s,1H),4.02(s,1H),3.84(s,1H),3.74(s,2H),3.49(s,2H),3.33-3.38(m,1H),2.83(t,1H),2.71(s,3H),2.68(d,1H),2.40-2.46(m,1H),2.35(d,1H),2.13(s,3H),1.94-1.98(m,2H),1.56-1.64(m,4H),1.37-1.42(m,6H),1.34(s,3H),1.28(d,3H),1.19(s,3H),0.99(d,3H).ESI-MS:[M+H]⁺842,C₃₁H₄₄I₂N₂O₇S.

PEG-Epothilone B的制备

Epothilone B双卤代乙酸酯(VI)(1eq)和mPEG_n-NH₂或mPEG_n-SH(m为甲基缩写)(2.1eq)溶于10体积的DMF中，加入1.1eq的K₂CO₃，室温搅拌3-16小时。加入8eq的甲酸铵淬灭反应，室温搅拌30分钟。反应液40℃减压浓缩至干。浆状物用20体积二氯甲烷溶解，用20体积10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，20体积饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到式III化合物。

实施例4

将500mg Epothilone B双卤代乙酸酯(VI-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入197mg mPEG₃-NH₂和87.8mg K₂CO₃，室温搅拌3小时。加入0.3g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物1(409mg)。

化合物1：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.60(s,1H),7.18(s,1H),6.55(s,1H),5.71(t,1H),5.47(m,1H),5.29(t,1H),4.61(s,5H),3.66(m,6H),3.62(d,4H),3.58(m,5H),3.40(s,3H),3.38(d,7H),3.35(s,2H),2.85(m,3H),2.75(m,2H),2.72(s,1H),2.18(d,1H),2.07(s,3H),1.88(m,2H),1.73(t,1H),1.68(m,2H),1.53(d,3H),1.43(m,4H),1.30(s,4H),1.27(s,3H),1.11(d,4H),1.08(s,3H),1.05(d,4H),0.91(m,4H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ213.2,172.0,171.4,169.1,151.4,137.0,121.3,117.3,78.3,70.3,70.2,70.1,70.0,69.9,69.7,62.1,62.0,58.5,53.1,50.0,49.8,48.8,48.6,48.4,48.3,48.2,48.0,47.7,42.1,36.9,34.9,33.6,33.0,32.7,31.8,30.2,29.5,25.5,24.8,22.3,21.9,18.4,17.1,14.1,14.0.ESI-MS:[M+H]⁺914,[M+Na]⁺936,C₄₅H₇₅N₃O₁₄S.

实施例5

将500mg Epothilone B双卤代乙酸酯(VI-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入423mg mPEG₇-NH₂和87.8mg K₂CO₃，室温搅拌3小时。加入0.3g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物2(790mg)。

化合物2：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.34(s,1H),6.55(s,1H),5.76(m,1H),5.51(m,1H),5.28(t,1H),3.55(m,61H),3.37(t,7H),2.86(m,5H),2.72(s,3H),2.65(m,2H),2.15(m,1H),2.08(d,4H),1.91(m,1H),1.73(m,2H),1.54(t,2H),1.43(t,2H),1.27(m,8H),1.12(d,3H),1.07(d,6H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ213.1,172.0,171.4,169.1,165.7,151.7,137.3,120.8,117.4,78.2,76.6,70.0,69.8,69.8,61.9,61.8,57.8,53.1,49.7,49.7,48.3,48.1,48.0,48.0,47.9,47.7,47.5,47.3,47.1,36.8,34.8,33.0,32.7,30.1,22.1,21.8,21.6,21.3,17.6,17.5,16.5,13.9,13.5,13.4.ESI-MS:[M+H]⁺1266,[M+Na]⁺1288,C₆₁H₁₀₇N₃O₂₂S.

实施例6

将408mg伊沙匹隆双卤代乙酸酯(VI-3)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入344mg mPEG₇-NH₂和67.0mg K₂CO₃，室温搅拌4小时。加入0.2g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物3(586mg)。

化合物3：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),5.52(m,1H),5.21(t,1H),3.56(m,61H),3.39(t,7H),2.86(m,5H),2.72(s,3H),2.60(m,2H),2.13(m,1H),2.08(d,4H),1.91(m,1H),1.73(m,2H),1.54(t,2H),1.43(t,2H),1.26(m,8H),1.12(d,3H),1.07(d,6H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ220.7,172.0,171.4,170.4,164.8,152.3,137.5,119.2,116.1,78.2,76.6,70.0,69.8,69.8,61.9,61.8,57.8,53.1,49.7,49.7,48.3,48.1,48.0,48.0,47.9,47.7,47.5,47.3,47.1,36.8,34.8,33.0,32.7,30.7,22.6,21.9,21.6,21.5,19.6,17.5,16.9,13.9,13.5,13.4.ESI-MS:[M+H]⁺1265,C₆₁H₁₀₈N₄O₂₁S.

实施例7

将412mg Epothilone B双卤代乙酸酯(VI-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入574mg mPEG₁₂-NH₂和74.5mg K₂CO₃，室温搅拌15小时。加入0.2g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物4(723mg)。

化合物4：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.69(s,1H),6.41(s,1H),5.38(t,1H),5.36(t,1H),5.15(t,1H),3.56(m,77H),3.44(m,10H),3.26(m,14H),2.74(m,3H),2.60(s,6H),2.52(m,1H),2.06(m,1H),1.99(s,3H),1.76(m,1H),1.62(m,1H),1.53(s,1H),1.34(m,5H),1.17(s,4H),1.07(s,4H),0.96(m,10H),0.79(m,1H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ212.6,171.7,171.5,168.8,164.9,152.0,136.6,121.5,117.4,78.3,77.0,71.8,70.6,70.5,70.4,70.2,70.2,61.8,61.7,58.9,53.2,50.3,50.3,48.5,41.9,37.1,34.7,33.2,32.7,30.3,22.8,22.2,19.2,18.2,17.3,14.3,14.0.ESI-MS:[M+H]⁺1707,[M+Na]⁺1729,C₈₁H₁₄₇N₃O₃₂S.

实施例8

将450mg Epothilone B双卤代乙酸酯(VI-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入1220mg mPEG₂₄-NH₂和81.0mg K₂CO₃，室温搅拌16小时。加入0.2g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物5(1350mg)。

化合物5：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),5.48(s,1H),5.28(t,1H),3.66(m,170H),3.52(d,9H),2.83(m,6H),2.72(s,4H),2.65(m,2H),2.18(m,2H),2.09(s,4H),1.90(m,2H),1.72(m,3H),1.56(m,3H),1.44(m,3H),1.29(t,15H),1.09(m,13H),0.89(m,3H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ220.7,171.9,171.4,170.4,164.8,152.3,137.5,119.2,116.1,78.2,76.7,71.6,71.1,69.6,61.9,61.8,57.8,53.0,49.6,49.6,48.3,48.1,47.9,47.7,47.5,47.3,47,0,42.0,36.7,34.9,33.0,32.7,31.7,30.0,29.4,22.2,21.8,21.3,17.7,17.6,16.6,13.5,13.4,13.2.ESI-MS:[M+H]⁺2763,[M+Na]⁺2785,C₁₂₉H₂₄₃N₃O₅₆S.

实施例9

将430mg伊沙匹隆双卤代乙酸酯(VI-3)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入1167mg mPEG₂₄-NH₂和77.6mg K₂CO₃，室温搅拌16小时。加入0.2g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物6(1180mg)。

化合物6：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.34(s,1H),6.55(s,1H),5.79(d,1H),5.49(s,1H),5.28(t,1H),3.65(m,170H),3.56(d,9H),2.84(m,6H),2.72(s,4H),2.66(m,2H),2.19(m,2H),2.10(s,4H),1.91(m,2H),1.70(m,3H),1.56(m,3H),1.44(m,3H),1.29(t,15H),1.10(m,13H),0.90(m,3H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ213.1,171.9,171.4,169.0,165.7,151.7,137.3,120.8,117.5,78.8,76.8,71.6,71.2,69.5,61.7,61.8,57.7,53.0,49.6,49.3,48.5,48.1,47.9,47.7,47.5,47.3,47,0,42.0,36.7,34.9,33.0,32.7,31.7,30.0,29.4,22.8,21.9,21.5,17.9,17.6,16.6,13.5,13.8,13.6.ESI-MS:[M+H]⁺2762,[M+Na]⁺2784,C₁₂₉H₂₄₄N₄O₅₅S.

实施例10

将503mg Epothilone B双卤代乙酸酯(VI-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入447mg mPEG₇-SH和90.7mg K₂CO₃，室温搅拌6小时。加入0.3g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物7(720mg)。

化合物7：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.99(s,1H),6.44(s,1H),5.60(t,1H),5.40(d,1H),5.14(t,1H),3.63(t,3H),3.46(t,5H),3.39(t,2H),3.27(d,9H),3.14(d,1H),3.00(d,1H),2.77(t,2H),2.70(m,9H),2.09(d,2H),1.98(d,4H),1.78(m,1H),1.66(t,1H),1.58(d,1H),1.36(m,5H),1.18(t,11H),1.04(d,5H),0.98(t,7H),0.80(m,2H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ212.0,169.9,169.5,168.5,164.6,151.9,136.5,121.6,117.3,78.1,70.9,70.4,70.3,70.2,70.1,61.5,58.8,53.6,53.2,42.0,36.9,34.8,33.7,33.5,33.1,32.6,31.8,31.8,31.7,30.7,30.1,29.5,22.5,22.4,22.3,22.1,19.1,18.1,17.3,14.3,14.0.ESI-MS:[M+H]⁺1301,[M+Na]⁺1323,C₆₁H₁₀₅NO₂₂S₃.

实施例11

将480mg伊沙匹隆双卤代乙酸酯(VI-3)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入427mg mPEG₇-SH和86.6mg K₂CO₃，室温搅拌6小时。加入0.25g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物8(635mg)。

化合物8：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),5.42(d,1H),5.18(t,1H),3.64(t,3H),3.45(t,5H),3.39(t,2H),3.26(d,9H),3.15(d,1H),3.08(d,1H),2.77(t,2H),2.72(m,9H),2.09(d,2H),1.97(d,4H),1.77(m,1H),1.65(t,1H),1.56(d,1H),1.32(m,5H),1.17(t,11H),1.03(d,5H),0.98(t,7H),0.80(m,2H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ220.7,170.4,169.9,169.5,164.8,152.3,137.5,119.2,116.1,78.3,70.8,70.5,70.2,70.1,70.0,61.6,58.9,53.4,53.2,42.3,36.8,34.8,33.6,33.4,33.1,32.6,31.8,31.7,31.6,30.6,30.1,29.8,22.8,22.5,22.3,22.1,19.1,18.1,17.3,14.3,14.2.ESI-MS:[M+H]⁺1300,[M+Na]⁺1322,C₆₁H₁₀₆N₂O₂₁S₃。

Epothilone B单卤代乙酸酯(V)(1eq)和mPEG_n-NH₂或mPEG_n-SH(m为甲基缩写)(1.2eq)溶于10体积的DMF中，加入0.55eq的K₂CO₃，室温搅拌3-16小时。加入4eq的甲酸铵淬灭反应，室温搅拌30分钟。反应液40℃减压浓缩至干。浆状物用20体积二氯甲烷溶解，用20体积10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，20体积饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到式II化合物。

实施例12

将206mg Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入50.3mg mPEG₃-NH₂和25.7mg K₂CO₃，室温搅拌3小时。加入0.15g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物9(159mg)。

化合物9：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.15(s,1H),6.62(s,1H),5.45(d,1H),5.31(m,1H),4.27(t,1H),3.67(s,6H),3.48(m,4H),3.40(s,3H),2.90(m,1H),2.83(s,2H),2.71(s,3H)2.54(d,2H),2.14(m,1H),2.08(s,3H),1.99(m,1H),1.85(m,1H),1.69(m,3H),1.57(t,3H),1.11(m,5H),1.08(s,4H),0.97(d,4H),0.91(m,2H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ216.6,170.7,165.6,151.6,137.8,119.4,116.4,78.3,76.7,69.5,62.0,61.7,58.4,53.6,48.8,48.6,48.4,48.0,47.8,47.6,42.6,39.0,34.9,33.5,32.4,31.7,29.8,29.5,25.5,24.8,22.5,21.9,21.4,19.0,18.1,14.9.ESI-MS:[M+H]⁺711,[M+Na]⁺733,C₃₆H₅₈N₂O₁₀S.

实施例13

将248mg Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入110.8mg mPEG₅-NH₂和27.9mg K₂CO₃，室温搅拌5小时。加入0.15g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物10(236mg)。

化合物10：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.10(s,1H),6.62(s,1H),5.44(d,1H),5.32(d,1H),4.24(m,1H),3.63(m,14H),3.55(m,2H),3.49(s,2H),3.45(t,1H),3.37(d,4H),2.89(m,1H),2.82(t,2H),2.70(s,3H),2.53(m,2H),2.89(m,1H),2.82(t,7H),2.70(s,3H),2.53(m,2H),2.12(m,1H),2.07(m,1H),1.97(m,1H),1.67(m,2H),1.54(d,2H),1.44(m,1H),1.34(s,3H),1.24(m,8H),1.10(d,4H),1.04(s,3H),0.95(d,3H),0.89(m,1H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ216.6,172.1,170.7,165.5,151.6,137.7,119.3,116.4,78.5,70.2,69.9,69.6,61.9,58.6,53.5,50.0,49.4,48.7,48.4,48.3,48.1,47.9,42.7,39.0,34.9,33.6,32.4,31.6,29.8,29.5,25.6,24.9,22.2,21.5,19.3,18.4,17.3,15.3,15.1.ESI-MS:[M+H]⁺799,[M+Na]⁺821,C₄₀H₆₆N₂O₁₂S.

实施例14

将265mg Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入160mg mPEG₇-NH₂和29.8mg K₂CO₃，室温搅拌6小时。加入0.15g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物11(260mg)。

化合物11：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.92(s,1H),6.56(s,1H),5.39(s,1H),5.30(d,1H),4.07(m,1H),3.50(t,3H),3.41(s,3H),3.36(s,5H),3.30(s,4H),2.63(s,4H),2.42(m,3H),2.02(s,4H),1.90(m,4H),1.61(d,3H),1.49(t,3H),1.38(m,2H),1.29(s,4H),1.19(d,10H),1.08(t,3H),1.00(s,8H),0.85(d,4H),0.80(m,2H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ216.5,171.9,170.5,165.0,152.0,136.8,119.6,116.3,73.0,71.8,70.5,70.4,70.2,61.2,60.9,59.0,52.7,50.6,49.4,48.8,48.7,43.3,38.7,34.7,33.9,31.8,31.2,30.6,29.6,29.5,29.3,25.6,24.9,22.9,22.8,22.6,21.0,20.7,19.0,17.7,17.6,15.8,15.4,14.1.ESI-MS:[M+H]⁺888,[M+Na]⁺910,C₄₄H₇₄N₂O₁₄S.

实施例15

将240mg伊沙匹隆单卤代乙酸酯(V-2)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入145mg mPEG₇-NH₂和27mg K₂CO₃，室温搅拌6小时。加入0.15g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物12(230mg)。

化合物12：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),4.67(t,1H),4.08(m,1H),3.52(t,3H),3.46(s,3H),3.38(s,5H),3.35(s,4H),2.68(s,4H),2.44(m,3H),2.06(s,4H),1.91(m,4H),1.60(d,3H),1.47(t,3H),1.36(m,2H),1.22(s,4H),1.16(d,10H),1.05(t,3H),0.98(s,8H),0.85(d,4H),0.80(m,2H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ220.7,171.9,170.4,164.8,152.3,137.5,119.2,116.1,73.1,71.6,70.5,70.4,70.2,61.5,60.8,59.2,52.8,50.6,49.5,48.9,48.5,43.6,38.8,34.5,33.6,31.7,31.2,30.6,29.7,29.5,29.3,25.68,24.9,22.6,22.8,22.6,21.0,20.7,19.0,17.8,17.6,15.8,15.3,14.0.ESI-MS:[M+H]⁺887,[M+Na]⁺909,C₄₄H₇₅N₃O₁₃S.

实施例16

将305mg Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入304mg mPEG₁₂-NH₂和34.5mg K₂CO₃，室温搅拌15小时。加入0.18g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物13(486mg)。

化合物13：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ7.04(s,1H),6.53(s,1H),5.28(m,2H),4.49(s,5H),4.16(d,1H),3.57(s,27H),3.42(s,6H),3.25(m,9H),2.78(d,3H),2.62(s,4H),2.44(s,2H),2.02(t,1H),1.89(m,3H),1.61(s,3H),1.47(s,3H),1.22(d,11H),0.95(m,12H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ215.7,170.9,170.0,164.8,150.9,137.0,118.6,115.8,76.7,75.9,70.9,70.8,69.4,69.3,69.2,68.7,61.3,60.9,57.8,52.9,49.0,48.5,48.3,48.1,47.9,47.7,47.5,47.4,47.2,47.0,41.9,38.3,34.2,32.9,31.7,31.0,29.1,24.8,24.1,21.8,18.4,17.6,16.5,14.4,14.2.ESI-MS:[M+H]⁺1107,[M+Na]⁺1129,C₅₄H₉₄N₂O₁₉S.

实施例17

将310mg Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入600mg mPEG₂₄-NH₂和35mg K₂CO₃，室温搅拌16小时。加入0.2g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物14(788mg)。

化合物14：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.94(s,1H),6.54(s,1H),5.40(s,1H),5.27(s,4H),4.05(s,1H),3.52(m,41H),3.29(s,8H),2.78(s,5H),2.63(s,6H),2.46(m,4H),2.05(s,6H),1.94(d,4H),1.62(s,4H),1.48(s,4H),1.48(m,3H),1.28(s,6H),1.19(d,20H),0.86(s,14H),0.80(d,9H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ216.4,170.4,164.7,152.0,136.5,119.6,116.4,78.7,75.9,73.2,71.8,70.4,70.4,70.2,60.9,60.6,58.9,53.6,52.5,43.3,38.6,34.6,31.8,31.6,31.0,29.5,29.4,22.9,22.8,22.5,21.3,20.4,19.1,17.7,15.7,15.4,14.0.ESI-MS:[M+H]⁺1636,[M+Na]⁺1658,C₇₈H₁₄₂N₂O₃₁S.

实施例18

将301mg伊沙匹隆单卤代乙酸酯(V-2)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入583mg mPEG₂₄-NH₂和34mg K₂CO₃，室温搅拌16小时。加入0.18g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物15(670mg)。

化合物15：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),5.27(s,4H),4.05(s,1H),3.50(m,41H),3.28(s,8H),2.78(s,5H),2.60(s,6H),2.45(m,4H),2.07(s,6H),1.93(d,4H),1.60(s,4H),1.48(s,4H),1.47(m,3H),1.25(s,6H),1.19(d,20H),0.89(s,14H),0.80(d,9H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ220.7,170.4,164.8,152.3,137.5,119.2,116.1,78.8,75.7,73.3,71.8,70.5,70.4,70.2,60.8,60.6,58.9,53.5,52.5,43.8,38.9,34.5,31.8,31.6,31.3,29.5,29.4,22.9,22.8,22.6,21.3,20.4,19.1,17.8,15.5,15.4,14.1.ESI-MS:[M+H]⁺1635,[M+Na]⁺1657,C₇₈H₁₄₃N₃O₃₀S.

实施例19

将305mg Epothilone B单卤代乙酸酯(V-1)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入195mg mPEG₅-NH₂和34.5mg K₂CO₃，室温搅拌6小时。加入0.15g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物16(381mg)。

化合物16：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.93(s,1H),6.55(s,1H),5.40(s,1H),5.32(d,1H),4.06(m,1H),3.63(t,2H),3.57(s,23H),3.47(t,3H),3.40(t,1H),3.36(s,1H),3.30(s,3H),3.24(s,2H),2.78(t,4H),2.69(s,4H),2,43(m,2H),2.03(s,3H),1.92(m,2H),1.61(t,2H),1.49(d,2H),1.39(m,1H),1.29(s,3H),1.02(t,7H),0.87(d,3H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ216.5,170.5,170.0,164.9,152.0,136.7,119.6,116.3,79.2,76.0,73.2,71.8,70.5,70.5,70.4,70.4,70.2,61.1,60.8,58.9,52.6,50.2,43.5,38.6,32.8,33.9,31.9,31.7,31.1,29.6,29.5,22.9,21.2,20.6,19.1,17.6,15.8,15.4.ESI-MS:[M+H]⁺905,[M+Na]⁺927,C₄₄H₇₃NO₁₄S₂.

实施例20

将315mg伊沙匹隆单卤代乙酸酯(V-2)加入50mL反应瓶中，加入5mL DMF，加入200mg mPEG₅-NH₂和35mg K₂CO₃，室温搅拌6小时。加入0.18g甲酸铵淬灭反应，反应液于40℃减压浓缩至干。浆状物用10mL二氯甲烷溶解，用10mL 10g/L甲酸胺溶液分两次洗涤二氯甲烷层，10mL饱和食盐水分两次洗涤二氯甲烷层。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，35℃减压浓缩至干，所得浆状物高效制备液相制备得到化合物17(401mg)。

化合物17：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ6.97(s,1H),6.86(d,1H),6.54(s,1H),5.32(d,1H),4.08(m,1H),3.65(t,2H),3.56(s,23H),3.48(t,3H),3.41(t,1H),3.35(s,1H),3.30(s,3H),3.22(s,2H),2.76(t,4H),2.68(s,4H),2,45(m,2H),2.01(s,3H),1.90(m,2H),1.62(t,2H),1.51(d,2H),1.38(m,1H),1.27(s,3H),1.02(t,7H),0.89(d,3H).¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃),δ220.7,170.4,170.0,164.8,152.3,137.5,119.2,116.1,79.5,76.2,73.5,71.6,70.6,70.5,70.4,70.4,70.2,61.0,60.4,58.8,52.6,50.1,43.8,38.6,32.8,33.7,31.8,31.6,31.1,29.6,29.5,22.9,21.2,20.6,19.1,17.6,15.7,15.4.ESI-MS:[M+H]⁺904,[M+Na]⁺926,C₄₄H₇₄N₂O₁₃S₂.

实施例21

Glutathione-Epothilone的制备

将化合物V-1(0.51g,0.76mmol)和谷胱甘肽(0.31g,1mmol)加至50mL反应瓶中，加入DMF/EtOH/H₂O混合溶液16mL，加入碳酸K₂CO₃(56.6mg，0.41mmol)，反应混合室温搅拌约24h。加入NaHCO₃(21.9mg)淬灭反应。反应液50℃减压浓缩至干，所得浆状物经乙醇打浆的白色固体化合物18(429mg)。

化合物18：

¹H-NMR(400MHz,D₂O),δ7.25(s,1H),6.55(s,1H),5.48(s,1H),5.11(s,1H),4.69(m,2H),4.48(m,2H),3.82(m,7H),3.53(d,3H),3.26(m,3H),2.73(s,4H),2.66(d,6H),2.54(m,7H),1.98(s,4H),1.77(s,3H),1.51(s,4H),0.98(d,9H).ESI-MS:[M+H]⁺855,[M+Na]⁺877,C₃₉H₅₈N₄O₁₃S₂.

实施例22

将化合物V-2(0.4g,0.59mmol)和谷胱甘肽(0.22g,0.72mmol)加至50mL反应瓶中，加入DMF/EtOH/H₂O混合溶液16mL，加入碳酸K₂CO₃(45mg，0.33mmol)，反应混合室温搅拌约24h。加入NaHCO₃(20mg)淬灭反应。反应液50℃减压浓缩至干，所得浆状物经乙醇打浆的白色固体化合物19(390mg)。

化合物19：

¹H-NMR(400MHz,D₂O),δ6.99(s,1H),6.87(d,1H),6.60(s,1H),5.12(s,1H),4.68(m,2H),4.45(m,2H),3.80(m,7H),3.51(d,3H),3.25(m,3H),2.72(s,4H),2.65(d,6H),2.55(m,7H),1.96(s,4H),1.72(s,3H),1.50(s,4H),0.98(d,9H).ESI-MS:[M+H]⁺854,[M+Na]⁺876,C₃₉H₅₉N₅O₁₂S₂.

实施例23

将化合物VI-1(0.6g,0.71mmol)和谷胱甘肽(0.55g,1.79mmol)加至50mL反应瓶中，加入DMF/EtOH/H₂O混合溶液16mL，加入碳酸K₂CO₃(100.5mg，0.73mmol)，反应混合室温搅拌约24h。加入NaHCO₃(303mg)淬灭反应。反应液50℃减压浓缩至干，所得浆状物经乙醇打浆的白色固体化合物20(510mg)。

化合物20：

¹H-NMR(400MHz,D₂O),δ7.33(s,1H),6.53(s,1H),5.69(s,1H),5.55(s,1H),5.43(s,2H),5.07(s,1H),4.54(m,3H),3.94(s,6H),3.79(d,3H),3.68(m,4H),3.46(m,2H),3.12(m,8H),2.88(m,3H),2.69(s,4H),2.53(d,6H),2.14(d,7H),1.96(s,4H),1.81(d,3H),1.42(s,5H),0.98(m,10H).ESI-MS:[M+H]⁺1202,[M+Na]⁺1224,C₅₁H₇₅N₇O₂₀S₃.

实施例24

将化合物VI-3(0.5g,0.74mmol)和谷胱甘肽(0.48g,1.56mmol)加至50mL反应瓶中，加入DMF/EtOH/H₂O混合溶液16mL，加入碳酸K₂CO₃(112.7mg，0.82mmol)，反应混合室温搅拌约24h。加入NaHCO₃(300mg)淬灭反应。反应液50℃减压浓缩至干，所得浆状物经乙醇打浆的白色固体化合物21(538mg)。

化合物21：

¹H-NMR(400MHz,D₂O),δ7.06(s,1H),6.80(s,1H),6.52(s,1H),5.50(s,1H),5.46(s,2H),5.02(s,1H),4.50(m,3H),3.95(s,6H),3.75(d,3H),3.68(m,4H),3.46(m,2H),3.11(m,8H),2.89(m,3H),2.65(s,4H),2.53(d,6H),2.13(d,7H),1.96(s,4H),1.810(d,3H),1.45(s,5H),0.98(m,9H).ESI-MS:[M+H]⁺1201,[M+Na]⁺1223,C₅₁H₇₆N₈O₁₉S₃.

活性及毒性测试

本发明的这些化合物的抗肿瘤活性及毒性，可通过用标准的药理实验操作程序来证实，该实验可测量本发明的化合物对人体肝癌细胞HepG2、肺癌细胞NCI460、乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制情况或对人原代肝细胞的致死情况。以人体肝癌细胞HepG2抑制活性测试为例简要地描述所用的操作程序和获得的结果。

人体肝癌细胞HepG2在以下介质中生长：

生长介质：带Earle盐类的BRL最小必需介质(500毫升)，再向该介质中分别加入如下试剂：

加5毫升BRL MEM非必需的氨基酸(10mM)；

加5毫升BRL青霉素-链霉素(10000国际单位/毫升，10000微克/毫升)；

加5毫升BRL丙酮酸钠溶液(100mM)；

加5毫升BRL L-谷氨酰胺(200mM)；

加50毫升BRL小牛血清(合格品)，如上所述制得的生长介质备用。

试验操作程序如下：

1、将细胞胰蛋白酶化并在96孔板上布板，使每个小孔中细胞浓度约为10⁴/孔，并使之在200微升最终体积的介质中生长，布板在37摄氏度条件下允许粘附24小时；

2、小心地通过抽吸除去介质，不扰动单细胞层。在每个孔中加入200微升的新鲜介质，允许有足够多的孔被点样以便进行3个平行的试验。

3、被测试的本发明中的化合物被溶解到10微升磷酸盐缓冲溶液中(PBS)，并在37摄氏度孵育48小时。

4、在孵育最后6小时期间，96孔板的每个小孔用1微居里T胸腺嘧啶脱氧核苷标记(New England Nuclear thymidine)。1微居里被加进10微升PBS中(采集试样测试当天)。96孔板放回孵育器中孵育最后的6小时。

5、在不扰动单细胞层的前提下，通过抽吸除去待放射性的介质。然后往每个小孔中加入50微升BRL 10×胰蛋白酶，并继续在37摄氏度的条件下孵育10分钟或直到单细胞层从孔底(或孔壁)松脱。用Skatron 96孔板采集器把试样采集在玻璃纤维簇上。纤维簇在Wallac Betaptate计数器中计数。

表1化合物1-21的体外抗肿瘤活性筛选结果

注：本表中IC₅₀为化合物对人体肝癌细胞的半抑制活性浓度，IC₅₀值越小，说明化合物对癌细胞的抑制活性越强；本表中LC₅₀为化合物对人原代肝细胞的半致死浓度，即对人体肝细胞的毒性，LC₅₀越大，化合物的毒性越小。

在这种标准的药理试验操作程序中得到的结果(表1)显示，与阳性对照Epothilone B(或伊沙匹隆)相比较，本发明中的这些化合物表现出对人体肝癌细胞HepG2的生长具有抑制作用。同时，与阳性对照Epothilone B(或伊沙匹隆)相比较，本发明中的这些化合物对人体正常肝细胞(原代肝细胞)的毒性明显下降。其中，以谷胱甘肽修饰的Epothilone类化合物19、20、21改善效果最为明显，化合物19、20、21对人体肝癌细胞的抑制活性优于原化合物Epothilone B和伊沙匹隆，但毒性明显降低。这一结果为本发明中的这些化合物在肝癌治疗中可能提供积极的信号。

水溶性测定

本发明中的化合物溶解度测定参照《中华人民共和国药典》(2010年版)凡例中有关溶解度测定的方法。简述如下：

称取样品，加至10mL容量瓶中，并加入水，定容至10mL，在25℃±2℃每隔5分钟强力振摇30秒钟，30分钟观察溶解情况，如看不见溶质颗粒或液滴时，即认为完全溶解。

本发明中的化合物溶解度测定结果仅用于初步判断化合物相对于阳性对照Epothilone B(或伊沙匹隆)溶解度的改善情况。

表2化合物1-21水溶性试验结果

溶解度测试结果显示，相对于阳性对照Epothilone B(或伊沙匹隆)，本发明中的化合物均表现出明显的溶解度改善。其中，谷胱甘肽修饰的Epothilone所得的衍生物水中溶解性改善作用更为明显，如化合物18、19、20、21。

结论：通过对Epothilone B和伊沙匹隆的结构修饰，经谷胱甘肽修饰得到的衍生物19、20、21对人体肝癌细胞的生长抑制活性比原化合物更好；同时，衍生物19、20、21对人体原代肝细胞(正常肝细胞)的毒性相对于原化合物降低了至少1000倍；而且，衍生物19、20、21的水溶性得到了明显的改善。

Claims (15)

1.式I化合物或其药学上可接受的盐：

其中，

X为O或者NH；

R₁和R₂各自独立的是H或COCH₂-R₃，但R₁和R₂不可同时为H；

R₃为S-(CH₂CH₂O)_nR₄，NH-(CH₂CH₂O)_nR₄或者多肽基,其中所述多肽基为谷胱甘肽基；

R₄独立的是氢或者C₁-C₆烷基；

n为3、5或7。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中，当R₁为COCH₂-R₃且R₂为H，即式Ⅱ所示的化合物，或当R₁及R₂同时为COCH₂-R₃，即式III所示的化合物：

其中，X和R₃的定义如权利要求1所述。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，R₄为C₁-C₆烷基。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中R₄为甲基。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述的式Ⅰ化合物选自：

6.权利要求1-5中任一项所述的化合物的合成方法，其特征在于，

a)以Epothilone B或伊沙匹隆为起始物料，卤代乙酸为连接基，制备得到式IV所示的化合物：

b)将步骤a)制备得到的式IV化合物和带有-NH₂或-SH基团的PEG衍生物或多肽反应，得到式I所示的化合物：

其中，

X、R₁、R₂、R₃和R₄如权利要求1-5中任一项所定义；

R₅和R₆各自独立地为H或COCH₂-X₂，但R₅和R₆不可同时为H；

X₂为卤素原子；

n为3、5或7。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其中X₂为Br或I。

8.根据权利要求6或7所述的合成方法，其中，式IV所示的化合物为式V或式VI所示的化合物

9.根据权利要求6或7所述的合成方法，其中，式I所示的化合物为式II或式III所示的化合物

10.权利要求1-5中任一项所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其中所述肿瘤细胞为人体肝癌细胞。

12.一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效剂量的权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学可接受的盐，及可药用的载体、赋形剂或它们的组合。

13.式IV所示的化合物：

其中，

X为O或者NH；

R₅和R₆各自独立地为H或COCH₂-X₂，但R₅和R₆不可同时为H；

X₂为卤素原子。

14.根据权利要求13所述的化合物，其为式V所示的化合物：

或式VI所示的化合物：

15.根据权利要求13或14所述的化合物，其中X₂为Br或I。