CN109350629B - 一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法 - Google Patents
一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法。本发明优选的益生菌均为人体常见的非致病的优势菌，这类细菌能定植到人体的肠道内，并大量增殖，通过优势菌群、生物拮抗、产生有益的代谢产物、直接刺激肠粘膜上皮等作用，改善肠道微生态环境，并通过“肠‑脑‑轴”作用于脑部，从而达到缓解和治疗酒精依赖综合征。本发明独特的包被工艺能延长益生菌活性的保存期限，克服现有益生菌产品保存期限短的缺点，另外能有效的抵抗由于饮酒使体内酒精对益生菌的影响。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法。
背景技术
饮酒是一种颇为悠久而普遍的生活习惯和社会风俗，但过度饮酒会造成躯体或精神的损害，并带来不良的社会后果。如果饮酒的时间和量达到一定程度，将导致饮酒者无法控制自己的饮酒行为，并出现躯体化和戒断症状，被称为酒精依赖综合征。临床主要表现为病人对酒精强烈渴求、酗酒等症状。强制戒酒后表现为震颤，乏力，出汗，反射亢进、胃肠道症状以及癫痫，严重的会表现为严重的意识模糊、定向力丧失、幻觉，焦虑不安、失眠等。酒精依赖给社会和家庭带来了很大的危害，目前酒精依赖及其相关问题是仅次于心血管疾病和肿瘤，位居第三的全球性公共卫生问题。每年由于戒酒和治疗戒断综合征花费巨大，给病人带来了很大的经济损失。因此，这类疾病应引起人们高度重视。
目前治疗酒精戒断综合征的药物主要有戒酒硫、阿坎酸、纳曲酮等，尽管这些药物被美国FDA批准在临床使用，这些药物主要作用于激发酒精依赖的奖赏系统，阻止酒精成瘾的形成。然而，使用这些药物治疗酒精成瘾和戒断综合征疗效有限，且有很大的副作用，如戒酒硫具有肝脏损害和中枢神经毒性。因此需要研制一种新型高效、副作用小、使用方便的药物来治疗酒精戒断综合征。申请人研究发现肠道微生物在酒精依赖形成中发挥着重要的作用，饮酒能诱导肠道菌群失调、导致肠壁通透性增加，从而使细菌的一些代谢产物如短链脂肪酸、胺和一些神经递质直接或间接通过“肠-脑-轴”作用于中枢神经系统，而引发依赖性疾病，包括酒精依赖。因此，本发明从肠道微生物平衡这个作用机制着手，研制一种新型的益生元益生菌复合物，用来调整酒精及酒精戒断导致肠道菌群失调，而达到缓解和治疗酒精戒断综合征。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂及其制备方法，该益生菌复合制剂为复方微生态制剂，不产生耐药性，无毒无副作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
①将丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌分别接种到各自最适培养基中，37℃培养24小时，各取培养液150mL转接到发酵罐中进行扩大培养，当发酵液中活菌浓度达到5×109CFU/ml以上时，停止培养，取发酵液进行离心，4000转/分进行离心20分钟，收集菌体；
②将步骤①收集的丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌按重量比2~3∶1∶1.5~2∶1~2混合均匀得到益生菌混合物；
③将益生菌混合物与吸附载体按重量比1︰2~3混合，在不高于10℃下搅拌，使菌体彻底吸附到吸附载体上；
④将步骤③制备得到的混合物与益生元按重量比1︰1.5~5混合，在室温下搅拌均匀；
⑤将步骤④制备得到的混合物按体积比1︰10~20加入到包被载体溶液中，继续搅拌30分钟，室温通风干燥，包装即得。
优选的，所述益生元由低聚半乳糖（GOS）、菊粉、水苏糖、壳聚糖中的任一种或几种组成。
优选的，所述吸附载体为麸皮、玉米淀粉、脱脂奶粉、沸石粉、蔗糖、海藻酸钠中的任一种或几种。
优选的，所述包被载体为蔗糖、糊精中任一种或两种。
优选的，所述包被载体溶液的浓度为5~10%（质量浓度）。
本发明的产生的有益效果是：1.本发明的目的是提供一种用于治疗酒精戒断综合征的复合益生元、益生菌制剂，该药物为复方微生态制剂。2.本发明优选的益生菌均为人体常见的非致病的优势菌，这类细菌能定植到人体的肠道内，并大量增殖，通过优势菌群、生物拮抗、产生有益的代谢产物、直接刺激肠粘膜上皮等作用，改善肠道微生态环境，并通过“肠-脑-轴”作用于脑部，从而达到缓解和治疗酒精依赖综合征。3.本发明采用独特三层包被工艺，最外层为载体保护层能使益生菌在体内外不被有害物质杀死，尤其是能保护益生菌进入胃内不被胃酸及蛋白酶破坏，进而到达肠道内发挥作用；在肠内，第二层益生元层为益生菌在肠道内提供了合适的生存环境，益生菌能大量增值而发挥作用。4. 本发明独特的包被工艺能延长益生菌活性的保存期限，克服现有益生菌产品保存期限短的缺点，另外能有效的抵抗由于饮酒使体内酒精对益生菌的影响。
附图说明
图1为试验一中不同组酒精依赖大鼠戒断综合症评分结果；
图2为为试验二中不同组酒精依赖小鼠戒断综合症评分结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。本发明中所用丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌均为常规的市购菌种。
实施例1
一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
①将丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌分别接种到各自最适培养基中，37℃培养24小时，各取培养液150mL转接到发酵罐中进行扩大培养，当发酵液中活菌浓度达到5×109CFU/ml以上时，停止培养，取发酵液进行离心，4000转/分进行离心20分钟，收集菌体；
②将步骤①收集的丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌按重量比2∶1∶1.5∶2混合均匀得到益生菌混合物；
③将益生菌混合物与吸附载体按重量比1︰3混合，在10℃环境中，按75转/分的速度搅拌 25分钟，使菌体彻底吸附到载体上；吸附载体由以下重量份数的原料组成：麸皮50份、脱脂奶粉200份、蔗糖30份、海藻酸钠20份；
④将步骤③制备得到的混合物与益生元按重量比1︰3.33混合，在室温下，按50转/分的速度搅拌 30分钟；益生元由下述重量份数的原料组成：低聚半乳糖（GOS）30份、菊粉15份、水苏糖20份；
⑤将步骤④制备得到的混合物按体积比1︰20加入到包被载体溶液（包被载体溶液中含有5wt%的糊精和2wt%蔗糖）中，按100转/分的速度继续搅拌30分钟，室温通风干燥，包装即得。
实施例2
一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
①将丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌分别接种到各自最适培养基中，37℃培养24小时，各取培养液150mL转接到发酵罐中进行扩大培养，当发酵液中活菌浓度达到5×109CFU/ml以上时，停止培养，取发酵液进行离心，4000转/分进行离心20分钟，收集菌体；
②将步骤①收集的丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌按重量比3∶1∶2∶1混合均匀得到益生菌混合物；
③将益生菌混合物与吸附载体按重量比1︰2.1混合，在10℃环境中，按175转/分的速度搅拌 25分钟，使菌体彻底吸附到载体上；吸附载体由以下重量份数的原料组成：麸皮150份、脱脂奶粉100份、蔗糖20份、海藻酸钠40份；
④将步骤③制备得到的混合物与益生元按重量比1︰1.6混合，在室温下，按100转/分的速度搅拌 20分钟；益生元由下述重量份数的原料组成：低聚半乳糖（GOS）20份、菊粉45份、水苏糖10份、壳聚糖20份；
⑤将步骤④制备得到的混合物按体积比1︰10加入到包被载体溶液（包被载体溶液中含有6wt%的糊精和3wt%蔗糖）中，按100转/分的速度继续搅拌30分钟，室温通风干燥，包装即得。
实施例3
实施例3与实施例1的不同之外在于，步骤②中丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌菌体的重量比为1∶1∶1∶1。
本发明药物对酒精成瘾大鼠酒精戒断综合征的影响（试验一）
1.实验动物：6周龄Sprague Dawley(SD)大鼠60只，初始体重（190-201g），购于北京联合利华，动物编号SCXK (Jing) 2016-0011 (No. 11400700259454)。
酒精依赖模型的建立：按照完全随机法分为2组， 对照组（20只）与实验组（40只）。动物饲养于洁净动物房，温度21±2℃和湿度50±5%，适应性饲养1周后再进行实验。实验期间各组大鼠均自由采食，饲料为SPF级，购自北京科澳协力科技有限公司。实验组第一周按1%、2%、3%、4%、5%、6%递增的方式（每天递增1%，第七日也为6%）给大鼠自由饮酒，从第二周开始实验组给予6%（v/v）的酒精水溶液24h自由饮用6周，每天9点配制并置换酒精水溶液；对照一直给予自来水饮用。从第7周起，实验组撤除酒精，然后分为两组，一组为戒断组（20只），单独给予自来水，另一组为戒断干预组（20只），给予自来水加本发明实施例1益生菌复合制剂，给药剂量为5g/天/只，连续给药10天。
酒精戒断综合征评分：酒精戒断综合征（ethanol withdrawal syndrome, EWS）评分参照改进的Erden等（1999）方法，分别于酒精戒断第1天、第3天、第5天和第9天评估戒断组大鼠的戒断综合征，主要检测刻板行为、激惹性、尾巴强直、异常姿势和听源性癫痫等戒断症状的发生情况，为保证测试结果的准确性，所有的测试均选择在上午9:00进行，并采用双盲实验，详细的评分标准参考文献（B. F. ERDEN, S. OZDEMIRCI, G. YILDIRAN, T.UTKAN, N. GACAR AND G. ULAK，1999，Dextromethorphan Attenuates EthanolWithdrawal Syndrome in Rats，Pharmacology Biochemistry and Behavior, 62（3）：537–541）。
统计分析：所有数据均以x±S表示，采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，两组比较采用 t 检验 ；多组间比较采用 One-Way ANOVA 分析。
实验结果
5.1戒断评分结果：本研究采用自由饮用6%酒精建立了酒精依赖大鼠模型，通过双盲检测法测定了酒精戒断综合症指标，结果显示饮酒组与对照组相比，酒精戒断评分有显著差异（图1）。实验组酒精依赖在戒断后活动性增加，最高的戒断评分在戒断3天出现。与对照组相比，戒断9天后，戒断总评分无显著差异。而使用本发明实施例1益生菌复合制剂后在前三天酒精戒断组和戒断干预组无显著性差异，但在从第5天后，戒断组和戒断干预组差异显著，而且戒断干预后5天达到了对照组水平（图1），表明实施例1益生菌复合制剂对酒精依赖综合征有很好的疗效。
听源性癫痫结果：用100分贝声音刺激1分钟，结果见表1。第一天酒精依赖戒断组听源性癫痫的发病率达到80%，而对照组仅为10%，这些结果表明了6%酒精长期饮用能使大鼠产生躯体依赖。但在戒断第一天戒断组和戒断干预组无显著性差异，从第三天开始，使用本发明药物干预后能大大降低听源性癫痫的发生率，到第五天听源性癫痫发生率降到15%，而未使用药物的大鼠听源性癫痫发生率为65%。 可见，本发明实施例1益生菌复合制剂能大大降低酒精依赖大鼠听源性癫痫发生率。
表1.听源性癫痫发生率
本发明药物对慢性酒精成瘾小鼠酒精戒断综合征的影响（试验二）
1.实验动物：6周龄BALB/c小鼠60只，初始体重（19-25g），购于北京联合利华，动物编号SCXK (Jing) 2017-0014 (No. 11000830258653)。
酒精依赖模型的建立：按照完全随机法分为2组， 对照组（15只）与实验组（45只）。动物饲养于洁净动物房，温度21±2℃和湿度50±5%，适应性饲养1周后再进行实验。实验期间各组小鼠均自由采食，饲料为SPF级，购自北京科澳协力科技有限公司。实验组第一周按1%、2%、3%、4%、5%、6%递增的方式（每天递增1%，第七日也为6%）给小鼠自由饮酒，以后连续自由饮含低浓度乙醇（6%）的水溶液6周（每天9点配制并置换酒精水溶液），建立酒精依赖动物模型。对照给予自来水饮用。从第7周起，实验组撤除酒精，然后分为三组，一组为戒断组（15只），单独给予自来水，第二组为戒断干预组I（15只），给予自来水加本发明实施例2益生菌复合制剂，给药剂量为5g/天/只，连续给药10天；第三组为戒断干预组II（15只），给予自来水和本发明实施例3益生菌复合制剂。
酒精戒断综合征评分：酒精戒断综合征（ethanol withdrawal syndrome, EWS）评分参照改进的Erden等（1999）方法，分别于酒精戒断第1天、第3天、第5天和第9天评估戒断组小鼠的戒断综合征，主要检测刻板行为、激惹性、尾巴强直、异常姿势和听源性癫痫等戒断症状的发生情况，为保证测试结果的准确性，所有的测试均选择在上午9:00进行，并采用双盲实验，详细的评分标准参考文献（B. F. ERDEN, S. OZDEMIRCI, G. YILDIRAN, T.UTKAN, N. GACAR AND G. ULAK，1999，Dextromethorphan Attenuates EthanolWithdrawal Syndrome in Rats，Pharmacology Biochemistry and Behavior, 62（3）：537–541）。
统计分析：所有数据均以x±S表示，采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，两组比较采用 t 检验 ；多组间比较采用 One-Way ANOVA 分析。
实验结果
5.1戒断评分结果：本研究采用自由饮用6%酒精建立了酒精依赖小鼠模型，通过双盲检测法测定了酒精戒断综合症指标，结果显示饮酒组与对照组相比，酒精戒断评分有显著差异（图2）。实验组酒精依赖在戒断后活动性增加，最高的戒断评分在戒断3天出现。与对照组相比，戒断9天后，戒断总评分无显著差异。而使用本发明药物后在前三天酒精戒断组和戒断干预组无显著性差异，但在从第5天后，戒断组和戒断干预组差异显著，而且戒断干预后5天达到了对照组水平（图2），表明本发明益生菌益生元制剂对酒精依赖综合征有很好的疗效；同时和戒断干预组II相比，在戒断干预组II中，尽管使用了实施例3益生菌复合剂，但其效果较差，整个实验期其戒断症状和戒断组相似，但与戒断干预组I有显著差异，说明不同的丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌比例对本发明的益生菌复合制剂的效果具有显著的影响。
听源性癫痫结果：用100分贝声音刺激1分钟，结果见表2。第一天酒精依赖戒断组听源性癫痫的发病率达到86.67%，而对照组仅为13.34%，这些结果表明了6%酒精长期饮用能使大鼠产生躯体依赖。但在戒断第一天戒断组和戒断干预组无显著性差异，从第三天开始，使用本发明药物干预后能大大降低听源性癫痫的发生率，到第五天听源性癫痫发生率降到20%，而未使用药物的大鼠听源性癫痫发生率为73.33%。同时从戒断干预组I的结果来看，采用益生菌复合剂对酒精依赖症状物显著改善，可见，本发明实施例2益生菌复合制剂能大大降低酒精依赖大鼠听源性癫痫发生率。
表2.听源性癫痫发生率
Claims (6)
1.一种用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
①将丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌分别接种到各自最适培养基中，37℃培养24~48小时，取培养液转接到发酵罐中进行扩大培养，当发酵液中活菌浓度达到5×109CFU/ml以上时，停止培养，取发酵液进行离心，收集菌体；
②将步骤①收集的丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌按重量比2~3∶1∶1.5~2∶1~2混合均匀得到益生菌混合物；
③将益生菌混合物与吸附载体按重量比1︰2~3混合，搅拌，使菌体彻底吸附到吸附载体上；
④将步骤③制备得到的混合物与益生元按重量比1︰1.5~5混合，在室温下搅拌均匀；
⑤将步骤④制备得到的混合物按体积比1︰10~20加入到包被载体溶液中，搅拌均匀，室温通风干燥，包装即得。
2.如权利要求1所述用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，其特征在于所述益生元由低聚半乳糖GOS、菊粉、水苏糖、壳聚糖中的任一种或几种组成。
3.如权利要求1所述用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，其特征在于所述吸附载体为麸皮、玉米淀粉、脱脂奶粉、沸石粉、蔗糖、海藻酸钠中的任一种或几种。
4.如权利要求1所述用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，其特征在于：所述包被载体为蔗糖、糊精中任一种或两种。
5.如权利要求1所述用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂的制备方法，其特征在于：所述包被载体溶液的浓度为5~10wt%。
6.如权利要求1－5任一方法制备得到的用于治疗酒精戒断综合征的益生菌复合制剂。
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| Favaron et al. | The Ageing Microbiome, Pharmaceutical Considerations, and Therapeutic Opportunities |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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