CN109337860A - 一种体外肝纤维化3d模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学技术与应用领域，具体涉及一种体外肝纤维化3D模型构建方法。该方法步骤为：采用酶消化法‑细胞培养法分别获得小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞，将各细胞与磁悬浮微粒混合孵育后进行消化获得含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞，并将含磁性微粒的三种细胞共同接种在3D培养基，在磁力驱动条件下培养15‑25天，获得3D共培养细胞，加入肝纤维化诱导剂，进行诱导获得肝纤维化3D模型。该方法能够很好的模拟各细胞体内的真实状态，同时能够快速获得肝纤维化3D模型，提高效率，节省时间成本，易于操作，适用于大规模药物筛选。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术与应用领域，具体涉及一种体外肝纤维化3D模型构建方法。
背景技术
肝纤维化是肝脏对各种病因所致的慢性损伤做出应答的结果，其本质是组织损伤后修复过程中细胞外基质的合成、降解与沉积。肝实质细胞和肝星状细胞是纤维化发生、发展过程中最重要的细胞，肝实质细胞损伤是肝纤维化的重要启动因素，肝星状细胞的激活是肝纤维化发生的中心环节。
随着人们研究的不断深入，人们对肝纤维化的发生机制有了更深的认识，近年来肝纤维化的逆转作为治疗肝硬化的可能性已受到国内外学者的广泛关注，并提供了一种新的治疗策略。目前肝纤维化的主要研究模型为以小鼠和大鼠为主的动物模型，利用四氯化碳、二甲基硝胺等试剂对动物进行给药，在正常饮食饲养的情况下连续给药6周，获得肝纤维化动物模型。
上述肝纤维化动物模型建立周期长，且由于每种体内的致病因素不同，其发生纤维化的具体机制不同，实验模型的稳定性、重复性差，不能够满足新药开发的需求。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种体外肝纤维化3D模型构建方法。具体步骤为：
采用酶消化法-细胞培养法分别获得小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞；
选取培养密度为75％-85％的所述小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞，各加入磁悬浮微粒，混合均匀并置于培养箱内孵育10-12h；
取所述孵育后的肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞，各加入胰酶-EDTA-消化液进行消化2-4min，再加入血清混匀，离心5-8min获得含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞。
将所述含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞接种至3D培养基上，在磁力驱动条件下培养15-25天，获得3D共培养细胞；
在所述3D共培养细胞中加入肝纤维化诱导剂，进行诱导获得肝纤维化3D模型。
所述离心过程的转速为300-400rpm。
所述将所述含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞接种至3D培养基过程中，肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞数量的比值为1∶0.8-1.2∶0.8-1.2，每个培养基接种的细胞数为4000-6000个。
所述3D培养基为10％-15％胎牛血清/DMEMF12。
所述肝纤维化诱导剂为对乙酰氨基酚、四氯化碳、二甲基硝胺中的任意一种，诱导的时间为20-30h。
本发明提供的技术方案包括以下有益效果：
通过采用磁悬浮3D培养系统对肝脏中主要的细胞种类--肝实质细胞、枯否细胞与星状细胞进行了3D共培养，一方面能够较好地模拟了肝实质细胞、枯否细胞与星状细胞在体内的真实状态；另一方面，能够快速获得肝纤维化3D模型，提高效率，节省时间成本，易于操作，适用于大规模药物筛选。
附图说明
附图1为3D共培养模型装置示意图。
附图2为3D共培养细胞的胶原蛋白染色。
附图3为共培养细胞使用对乙酰氨基酚处理前后胶原蛋白表达量对比。
附图4为显微镜下的3D共培养细胞。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
实施例：
采用酶消化法-细胞培养法分别获得小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞。
获得小鼠肝实质细胞的方法，具体包括以下步骤：
使用适量异氟烷麻醉小鼠，将小鼠腹部向上固定于工作平台上，大头针固定四肢；
彻底清洁腹部和胸部区域，用75％乙醇进行消毒，剪刀和直钳取下腹部切口，剪开表皮和肌肉层，继续直线剪开小鼠表皮与肌肉层直到肝脏、门静脉与下腔静脉充分暴露；
启动蠕动泵，待套管针前段有液体流出后，迅速将套管针置入门静脉中，此时可看到肝脏迅速变白，立即剪断下腔静脉；
当剪断下腔静脉后，立即将灌流速度加大到7ml/min，让所有提前预热的HBSS(Hank′s Balanced Salt Solution，Hank′s平衡盐溶液)通过肝脏灌注；
当盛放HBSS的容器中液体即将耗尽时，向容器中倒入70ml IV型胶原酶(购自worthington，9001-12-1)终浓度为100CDU/mL的消化液，将剩余的大约20ml消化液倒入10cm培养皿中并迅速盖上皿盖；
随着消化过程的进行，可逐渐观察到肝脏缓缓膨胀，1分钟后停止消化，关闭蠕动泵并小心地拆下套管；
用直镊小心理顺各个肝叶，并暴露肝脏的中央部位，找到各肝叶的纤维束连接点，换用弯镊钳夹稍稍将肝脏拉向自己，暴露胸腔和连接肝的各种结缔组织。小心仔细地切断这些连接，并去除胆囊；
立即将肝脏浸入盛有消化液的10cm培养皿中，盖上盖子并转移至生物安全柜中按照严格无菌的要求继续进行后续操作；
使用两副已灭菌的新镊子撕裂肝叶，用镊子夹住肝脏的纤维束连接点，轻轻摇动以分散残留的细胞，使用巴氏管在原10cm培养皿中吹打悬浮液三次，通过70μm滤网过滤细胞悬浮液；
使用预冷离心机对过滤后的细胞悬浮液进行离心，4℃离心2分钟；
用无菌巴氏管吸弃上清，加入25mL预冷生长培养基(10％胎牛血清/DMEMF12)，轻轻吹打几次以溶解底部的细胞团，并重悬；
重复步骤上述洗涤过程，共3次。第二次操作后上清应接近透明，第三次操作后上清应完全清亮；
最后一次离心完成后，吸弃上清并加入25mL冷培养基。巴氏管轻柔重悬细胞。用移液器吸取80uL重悬后的细胞悬液用于台盼蓝染色和计数；
向12孔板中加入2ml细胞密度为3x105个/ml的细胞悬液，轻轻晃动使得细胞分布均匀；
细胞接种后置于培养箱中孵育60分钟，5小时后更换为无血清培养基(DMEM/F12)；
次日更换新鲜生长培养基，之后每隔一天更换新鲜生长培养基，培养获得小鼠肝实质细胞。
获得小鼠原代肝星状细胞的方法，具体包括以下步骤：
使用适量异氟烷麻醉小鼠，皮肤常规消毒后打开腹腔，使得肝脏、门静脉与下腔静脉充分暴露；
以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；
以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3分钟，0.03％II型胶原酶5ml/min灌注3分钟；
取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10ug/ml。37℃，5％CO2培养箱内消化30分钟；
过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中；
4℃800rpm水平转子离心30分钟，吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；
加入无血清RPMII640培养液，于37℃ 5％CO2孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液并计数，以2x106个/ml的密度接种，后续培养每3天更换新鲜生长培养基(10％胎牛血清/DMEM)，培养获得小鼠原代肝星状细胞。
获得小鼠枯否细胞的方法，具体包括以下步骤：
使用适量异氟烷麻醉小鼠，皮肤常规消毒后打开腹腔，使得肝脏、门静脉与下腔静脉充分暴露；
以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；
取出小鼠肝脏，移入超净工作台中，称重并记录，使用眼科剪将肝脏剪碎至约1mm3大小，按照每克肝脏加入含0.05％链霉蛋白酶E和0.005％DNase l的RMPI1640液10mL，室温消化10分钟；
200目筛网过滤2遍得到肝组织液，4℃ 1000rpm离心7分钟；
弃上清，并向管内加入5mL三蒸水，孵育10秒再加入5mL 1.8％NaCl，4℃ 1000rpm离心7分钟；
将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，4℃离心1000rpm梯度离心15分钟，取中间层细胞；
对细胞进行计数并按照106个/mL的细胞密度进行接种，后续使用10％胎牛血清/RPMI 1640进行培养，每隔两天更换新鲜生长培养基，获得小鼠枯否细胞。
将磁悬浮微粒从冰箱中移出，并在室温解冻15min。选取培养密度约为80％的小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞，向培养瓶或培养皿中加入磁悬浮微粒，按照培养瓶皿底面积每平方厘米加入8ul的磁悬浮微粒，轻晃培养瓶使得磁悬浮微粒均匀分布在培养基中。
将培养瓶放回培养箱中，使得细胞与磁悬浮微粒孵育并与磁悬浮微粒结合，孵育12h，弃去培养瓶或培养皿中的培养基，使用胰酶-EDTA消化液(购自Corning，25-053-Cl)消化细胞2分钟，当细胞从培养皿或培养瓶底部脱落时，向培养瓶或培养皿中加入四倍于胰酶-EDTA消化液体积的血清，混匀并转入离心管中，300rpm离心5分钟，同时将磁驱动器、96孔板及盖垫用70％酒精喷洒消毒并放入生物安全柜。
用3D共培养细胞生长培养基重悬细胞，混匀并对离心管中的细胞进行计数。
将小鼠原代肝实质单细胞、枯否单细胞、星状单细胞按照1∶1∶1的比例进行接种，使得96孔板每孔细胞数约为5000个，液体体积为75ul，轻轻晃动96孔板使得加入的培养基在孔内均匀分布。
在96孔板上依次覆盖盖垫，磁驱动器以及96孔板盖子，具体设置见附图1，将96孔培养板放入培养箱中培养，每隔一天更换新鲜生长培养基，最终获得3D共培养细胞。
其中培养基的更换方法具体包括：将96孔板从培养箱中移出，并用70％酒精喷洒孔板外表面，移入生物安全柜中；依次打开96孔板盖子，磁驱动器以及盖垫并翻转放置；将磁驱动器放置于96孔板底部，此时3D细胞共培养物应受磁力吸引并移动至孔板底部，轻晃96孔板使得3D共培养物偏离孔中心，此时移除培养基防止3D共培养物的损伤，加入新的培养基，移除96孔板底部的磁驱动器，在96孔板上依次覆盖盖垫，磁驱动器以及96孔板盖子，放入培养箱中培养。
对96孔板中的3D共培养细胞加入肝纤维化诱导剂20mM对乙酰氨基酚，对乙酰氨基酚处理24h后获得肝纤维化3D模型。
对比例：
不加肝纤维化诱导剂对乙酰氨基酚，其他步骤均与实施例相同。
肝纤维化3D模型的性能测试：
肝纤维化程度观测：
对上述实施例和对比例获得的肝纤维化3D模型进行染色处理，获得肝纤维化程度，染色具体步骤为：移除3D共培养细胞的培养基，更换为PBS(phosphate buffer saline)磷酸缓冲盐溶液，再用PBS润洗一次，移除PBS，向孔内加入4％PFA多聚甲醛，依次覆盖盖垫，磁驱动器以及96孔板盖子，室温固定15分钟后，移除孔内PFA并更换为PBS，再次用PBS润洗一次，移除PBS；将3D共培养细胞制作为5微米石蜡切片；使用胶原蛋白特异性抗体进行染色，DAB法(细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显示法)发色，并使用苏木精-伊红染色法复染，结果用莱卡显微镜白场进行观察，其结果详见附图2。
胶原蛋白mRNA表达量的测定：
使用RNA Miniprep试剂盒提取3D共培养细胞的总RNA，并使用ThermoScript RT-PCR系统进行反转录。将所得的cDNA用SYBR-Green Master PCR Mix(Applied Biosystem)一式三份进行qPCR，获得实施例与对比例共培养细胞胶原蛋白mRNA表达量，其结果如附图3所示。
3D共培养细胞形态观测方法：
使用磁悬浮系统对小鼠原代肝实质细胞、枯否细胞、星状细胞进行3D共培养，按照所述密度接种至96孔板中，培养24小时后进行观察，打开显微镜电源，将96孔板放置于载物台上，对准需要观察的细胞，调整为白场模式，镜下调整粗准焦螺旋，使得视野清晰；进一步使用细准焦螺旋调节焦距，使用显微镜拍摄软件进行拍摄。3D共培养细胞形态如附图4所示。
根据上述各项检测试验可知，利用20mM对乙酰氨基酚进行肝纤维化诱导获得的肝纤维化模型纤维化程度高，胶原蛋白mRNA表达量大，采用磁悬浮3D培养系统能够快速获得3D模型，提高效率，节省时间成本，并且磁悬浮微粒对敏感的肝脏细胞无不良影响，不改变细胞活力，易于操作。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用酶消化法-细胞培养法分别获得小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞；
选取培养密度为75％-85％的所述小鼠原代肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞，分别加入磁悬浮微粒，混合均匀并置于培养箱内孵育10-12h；
取所述孵育后的肝实质细胞、肝星状细胞和枯否细胞，分别加入胰酶-EDTA-消化液进行消化2-4min，再加入血清混匀，离心5-8min获得含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞；
将所述含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞接种至3D培养基上，在磁力驱动条件下培养15-25天，获得3D共培养细胞；
在所述3D共培养细胞中加入肝纤维化诱导剂，进行诱导获得肝纤维化3D模型。
2.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述采用酶消化法-细胞培养法获得小鼠原代肝实质细胞的步骤具体包括：
小鼠肝脏使用HBSS溶液进行灌流并使用IV型胶原酶灌流以消化组织，获得肝脏I；
将所述肝脏I移入含有消化液的培养皿，撕裂肝叶并轻晃肝叶纤维束连接点得到肝细胞悬浮液I；
将所述肝细胞悬浮液I过滤并进行离心和重悬，使用生长培养基洗涤细胞3次，将所述洗涤后的肝细胞悬浮液I使用预冷的生长培养基重悬细胞，接种培养，获得小鼠原代肝实质细胞。
3.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述采用酶消化法-细胞培养法获得小鼠原代肝星状细胞的步骤具体包括：
小鼠肝脏使用D-Hanks进行灌流，并使用链霉蛋白酶E和II型胶原酶分别进行灌流消化，获得肝脏II；
将所述肝脏II去除肝包膜并剪碎，加入链霉蛋白酶E与DNase l，放置于培养箱内消化获得肝细胞悬浮液II；
将所述肝细胞悬浮液II过筛并用使用生长培养基清洗，离心并吸取上层细胞；
将所述上层细胞采用生长培养基清洗并使用预冷的生长培养基重悬细胞，接种培养获得小鼠原代肝星状细胞。
4.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述采用酶消化法-细胞培养法获得小鼠原代枯否细胞的步骤具体包括：
小鼠肝脏使用D-Hanks进行灌流，获得肝脏III；
将所述肝脏III剪碎，加入链霉蛋白酶E与DNase l消化，获得肝组织滤液；
将所述肝组织滤液过滤获得肝组织液，将所述肝组织液离心取下层细胞液加三蒸水孵育10-15s后加入1.8％的氯化钠，离心获得细胞混悬液III，接种培养获得小鼠原代枯否细胞。
5.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述离心过程的转速为300-400rpm。
6.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述将所述含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞接种至3D培养基过程中，肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞数量的比值为1∶0.8-1.2∶0.8-1.2。
7.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述将所述含磁性微粒的肝实质细胞单细胞、肝星状细胞单细胞和枯否细胞单细胞接种至3D培养基，每个培养基接种的细胞数为4000-6000个。
8.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述3D培养基为10％-15％胎牛血清/DMEMF12。
9.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述肝纤维化诱导剂为对乙酰氨基酚、四氯化碳、二甲基硝胺中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的体外肝纤维化3D模型构建方法，其特征在于，所述诱导的时间为20-30h。
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