CN109311983A

CN109311983A - 人源化抗clever-1抗体及其用途

Info

Publication number: CN109311983A
Application number: CN201780024478.XA
Authority: CN
Inventors: M.马克西莫; M.雅卡恩; M.瓦伊尼奥
Original assignee: Faron Pharmaceuticals Oy
Current assignee: Faron Pharmaceuticals Oy
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-04-18
Also published as: KR20180134876A; BR112018070302A2; US20210332128A1; EP3445785A1; ES2926511T3; US20190194317A1; KR102354845B1; SMT202200360T1; MX2018012473A; HUE059732T2; AU2017252343A1; US11046761B2; CN109311983B; JP2019519475A; DK3445785T3; HRP20221149T1; AU2017252343B2; PL3445785T3; PT3445785T; CA3020523A1

Abstract

本发明涉及能够与人CLEVER‑1结合、识别CLEVER‑1的表位的试剂以及人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中所述表位为不连续的且包含序列：PFTVLVPSVSSFSSR和QEITVTFNQFTK。本发明亦涉及能够与人CLEVER‑1的表位结合以用于消除肿瘤或抗原诱导的免疫抑制的试剂。另外，本发明涉及包含所述能够与人CLEVER‑1结合的试剂和适当赋形剂的药物组合物。

Description

人源化抗CLEVER-1抗体及其用途

发明领域

本发明涉及通过识别特异性CLEVER-1表位而对CLEVER-1蛋白特异的试剂及其用途。

发明背景

在本文中用于阐述本发明背景的出版物及其它资料，以及具体而言，用以提供关于实施的额外详情的案例，通过引用来结合。

CLEVER-1为公开于WO 03/057130中的一种蛋白，普通淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞受体-1 (Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1)。其为一种结合蛋白，在全身脉管系统和淋巴管二者中介导淋巴细胞与内皮的黏附。通过阻断CLEVER-1与其淋巴细胞基底的相互作用，有可能同时控制淋巴细胞再循环和淋巴细胞迁移，以及控制在淋巴细胞流入及流出组织的部位的相关病况，例如炎症。WO 03/057130进一步公开了CLEVER-1介导诸如单核细胞和粒细胞等其它类型的淋巴细胞与HEV样血管的结合。因此，通过阻断CLEVER-1与恶性肿瘤细胞的相互作用，有可能通过阻止淋巴管摄入与CLEVER-1结合的恶性细胞来控制转移，从而阻止恶性肿瘤扩散到淋巴结中。

Kzhyshkowska J. (2010)，The Scientific World JOURNAL 10，2039-2053已对CLEVER-1 (即Stabilin-1)进行综述。Palani等(2016)，Journal of Immunology 196:115-123近期公开了通过CLEVER-1来抑制Th1淋巴细胞。

WO 2010/122217公开了在肿瘤、胎盘和孕妇血液中的一种巨噬细胞亚型。所述巨噬细胞亚型定义为CLEVER-1阳性巨噬细胞并提议为3型巨噬细胞。通过调节(即分别为抵消或刺激)该细胞中的CLEVER-1受体，个体中的免疫系统可受到影响。抵消或下调所述受体减小恶性肿瘤大小和/或减少恶性肿瘤生长。刺激或上调所述受体可用于产生胎母耐受和用于预防妊娠并发症。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的机制亦公开于Noy R.和Pollard J. W.的出版物“Tumour-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy (肿瘤相关巨噬细胞：从机制到疗法)”，出版于Immunity 41，2014年7月17日，第49-61页。M2巨噬细胞在人类癌症中占主导地位且刺激肿瘤生长，但亦可将这些促肿瘤巨噬细胞调变为抑制肿瘤生长的巨噬细胞，亦称为M1巨噬细胞或促炎巨噬细胞，旨在减缓或停止肿瘤生长。然而，已注意到的是，使用旨在靶向TAM的当前可得的疗法来治疗癌症的尝试，伴随有不合乎需要的副作用，例如巨噬细胞治疗方法可具有全身毒性或反常地促进肿瘤生长，因为其靶向所有巨噬细胞。

特别优选的CLEVER-1拮抗剂单克隆抗体3-266 (DSM ACC2519)和3-372 (DSMACC2520)公开于WO 03/057130中，二者均根据布达佩斯条约的条款，关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认，于2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg1b，D-38124 Braunschweig。

发明目标及概述

本发明的一个目标为提供能够与人CLEVER-1的特异性表位结合的试剂。特别地，已发现能够与人CLEVER-1的特异性表位结合的试剂可用于激活巨噬细胞以将其表型从M2巨噬细胞转换成M1巨噬细胞。

另外，本发明的一个目标为提供用于与人CLEVER-1结合的人源化抗体或者人源化单链Fv或Fab片段，其与单克隆抗体3-372 (DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)相比具有增加的结合活性。

因此，本发明提供能够与人CLEVER-1的表位结合的试剂，其中所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)。

特别地，本发明提供能够与人CLEVER-1结合、识别CLEVER-1的表位的试剂，其中所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)，

且所述试剂包含与选自以下的所述表位序列结合的互补决定区(CDR)的序列：

TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，

HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，

HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)，

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，

RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和

HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

根据本发明，在本申请中定义的能够与人CLEVER-1结合、识别CLEVER-1的表位的试剂可选自抗体、单链Fv或Fab片段、肽或具有足以与所述表位结合的亲和力的任何其它大分子。

在一方面，本发明提供能够与个体中的人CLEVER-1结合的试剂，用于通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除肿瘤或抗原诱导的免疫抑制，其中所述试剂与人CLEVER-1的表位结合，所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)。

能够与TAM上的人CLEVER-1、优选与CLEVER-1上的特异性表位序列结合的根据本发明的试剂，适用于通过减小恶性肿瘤大小；通过减少个体中的恶性肿瘤生长；和/或通过抑制癌细胞迁移和转移形成来治疗或预防癌症，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除所述恶性生长周围的免疫抑制。

能够与人CLEVER-1、优选与CLEVER-1上的特异性表位序列结合的根据本发明的试剂，亦适用于治疗个体中的慢性感染，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除对感染性抗原的免疫抑制。

能够与人CLEVER-1、优选与CLEVER-1上的特异性表位序列结合的根据本发明的试剂，亦适于用作疫苗的佐剂，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除对疫苗抗原的免疫抑制。

在另一方面，本发明提供能够与人CLEVER-1的表位结合的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)，

且所述抗体或者单链Fv或Fab片段包含

a)人IgG4重链和κ轻链的恒定区，和

b)一个或多个下列互补决定区(CDR)的序列

i)重链的CDR

CDR 1：TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，和/或

CDR 2：HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，和/或

CDR 3：HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)；和

ii)轻链的CDR

CDR 1：TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，和/或

CDR 2：RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和/或

CDR 3：HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

本发明的另一个目标亦为提供一种药物组合物，其包含根据本发明的能够与人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段以及适当的赋形剂。

本发明亦提供一种药物组合物，其包含如上所定义的能够与人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段和适当的赋形剂，用于消除肿瘤或抗原诱导的免疫抑制。

根据本发明的药物组合物适用于通过减小恶性肿瘤大小；通过减少个体中的恶性肿瘤生长；和/或通过抑制癌细胞迁移和转移形成来治疗或预防癌症。根据本发明的药物组合物亦适用于治疗个体中的慢性感染或者适于用作疫苗的佐剂。

附图简述

图1a和1b说明对于抗体3-266和抗体AK FUMM 9-11获得的结果的热图图示。

图2说明对于抗体FU-HI-3-372获得的结果的热图图示。

图3图示说明了鉴定的结合基序的CLEVER-1位置的结构域组构。

图4说明杂交瘤3-372 RT-PCR产物的1%琼脂糖凝胶分离。

图5说明蛋白A纯化的嵌合3-372 IgG4的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。

图6说明CLEVER-1竞争ELISA。

图7说明Antitope pANT载体图。

图8说明挑选的蛋白A纯化抗体的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。

图9说明CLEVER-1竞争ELISA。

图10A显示从CD14阳性细胞测定HLA-DR表达的结果，和图10B显示使用TNF-αELISA试剂盒(Invitrogen)从培养基测得的可溶性TNF-α的结果。

图11A显示在给予与CLEVER-1结合的抗体之后的同基因的E0771乳腺癌中的TAM复极化，和图11B显示在给予与CLEVER-1结合的抗体之后来自E0771同基因的乳腺癌的TAM上的TNF-α分泌增加。

图12说明CLEVER-1与9-11和3-372抗体连接促进对人外周血单核细胞中的mTOR和c-Jun信号传导的反向作用。

发明详述

术语

术语“能够与人CLEVER-1的表位结合的试剂”，是指包括抗体及其片段、肽等的试剂，其能够与在本申请中定义的特异性表位序列结合。所述试剂亦可以是具有足以与所述表位结合的亲和力的任何其它大分子。

术语“抗体或其片段”以最广义使用，以涵盖能够结合个体中的CLEVER-1分子的抗体或其片段。特别地，其应理解为包括嵌合抗体、人源化抗体或灵长目化(primatized)抗体，以及抗体片段和单链抗体(例如Fab、Fv)，只要其表现出所需的生物活性便可。

术语人源化抗体是指这样的任何抗体，其中非人类抗体的恒定区完全替换成人类形式的恒定区，以及除与靶结构结合的各可变区外部的三个氨基酸序列环之外，所述非人类抗体的至少部分的可变区完全或部分替换成人类抗体的相应部分。因此，具体而言，通过用于药物的世界卫生组织国际非专利药名(World Health Organization’sInternational Nonproprietary Names，INN)或美国采用药名(United States AdoptedNames，USAN)的命名方案命名的具有亚词干-xizu-或-zu-的任何抗体，在本申请中均称为人源化抗体。

术语可变结构域，亦称为Fv区，对于与抗原结合而言为最重要的区域。具体而言，β链的可变环，在各轻链(V_L)和重链(V_H)上有三个，负责与抗原结合。这些环称为互补决定区(CDR)。

术语单链Fv片段或scFv，是指在单个多肽中通过接头连接V_H和V_L结构域获得的片段。术语人源化单链Fv片段或scFv，类比上文术语人源化抗体的定义，是指任何这样的单链 Fv片段或scFv，其中来源于非人类抗体的恒定区完全替换成人类形式的恒定区，以及除与靶结构结合的各可变区外部的三个氨基酸序列环之外，来源于非人类抗体的至少部分的可变区完全或部分替换成人类抗体的相应部分。

术语Fab片段是指与抗原结合的抗体上的区域。术语人源化Fab片段，亦类比上文术语人源化抗体的定义，是指任何这样的Fab片段，其中来源于非人类抗体的恒定区完全替换成人类形式的恒定区，以及除与靶结构结合的各可变区外部的三个氨基酸序列环之外，来源于非人类抗体的至少部分的可变区完全或部分替换成人类抗体的相应部分。

术语“肽”是指任何这样的肽，其包含在本申请中定义的互补决定区(CDR)的一个或多个氨基酸序列，且所述肽能够与人CLEVER-1的至少一个表位结合。

优选实施方案

本发明的一个实施方案涉及能够与人CLEVER-1结合、识别CLEVER-1的表位的试剂，其中所述表位为不连续的且包含氨基酸序列：

人CLEVER-1的PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)，

且所述试剂包含与选自以下的所述表位序列结合的互补决定区(CDR)的一个或多个氨基酸序列：

TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，

HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，

HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)，

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，

RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和

HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

在本发明的一些优选实施方案中，所述人CLEVER-1的不连续表位进一步包含选自以下的一个或多个氨基酸序列：

ATQTGRVFLQ (SEQ ID NO: 3)，

DSLRDGRLIYLF (SEQ ID NO: 4)，

SKGRILTMANQVL (SEQ ID NO: 5)，和

LCVYQKPGQAFCTCR (SEQ ID NO: 6)。

一部分的靶蛋白人CLEVER-1 (即人Stabilin-1)，已在SEQ ID NO: 31中定义。CLEVER-1上的表位SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 5和SEQ ID NO: 6，对应在SEQ ID NO: 31中定义的靶蛋白人CLEVER-1的氨基酸420-434、473-484、390-399、576-587、615-627和313-327。

在本发明的一些优选实施方案中，能够与人CLEVER-1的表位结合的试剂包含上文定义的互补决定区(CDR)的至少两个、优选三个、更优选四个、还更优选五个以及最优选全部六个氨基酸序列。

根据本发明，与人CLEVER-1结合的试剂可选自抗体、单链Fv或Fab片段、肽或大分子。

在本发明的一些优选实施方案中，能够与人CLEVER-1结合的试剂为人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，且所述抗体或者人源化单链Fv或Fab片段包含

a)人IgG4重链和κ轻链的恒定区，和

b)一个或多个下列互补决定区(CDR)的序列

i)重链的CDR

CDR 1：TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，和/或

CDR 2：HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，和/或

CDR 3：HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)；和

ii)轻链的CDR

CDR 1：TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，和/或

CDR 2：RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和/或

CDR 3：HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段能够与人CLEVER-1的表位结合，识别如上所定义的不连续表位序列。人CLEVER-1的不连续表位至少包含序列SEQ ID NO: 1和SEQ IDNO: 2。在一些实施方案中，人CLEVER-1的不连续表位进一步包含选自SEQ ID NO: 3、SEQID NO: 4、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6的一个或多个序列。

在上文提及的本发明的一些实施方案中，至少两个、优选三个、更优选四个、还更优选五个以及最优选全部六个上文定义的CDR包含在所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段中。

在本发明的一些实施方案中，所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段的人IgG重链可变区序列选自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 20，优选SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 20。在本发明的一些实施方案中，所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段的人IgG轻链可变区序列选自SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 30，优选SEQ ID NO: 30。

在根据本发明的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段的许多实施方案中，人IgG重链和κ轻链的恒定区为原样。人IgG4恒定区为优选的。许多优选的实施方案包含具有突变L248E和/或优选和S241P的人IgG4重链和IgG4 κ轻链。

在本发明的一些实施方案中，与单克隆抗体3-372 (DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)的IC50相比，所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段能够以相对IC50 < 1.0、优选< 0.8、更优选< 0.6和最优选< 0.5与人CLEVER-1结合。

根据本发明的一个实施方案，人IgG重链和轻链可变区的组合选自表5中所示的组合，与单克隆抗体3-372 (DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)的IC50相比，能够以相对IC50 < 1.0与人CLEVER-1结合。

根据本发明的药物组合物包含上述能够与人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，以及适当的赋形剂。

促肿瘤巨噬细胞(M2)调变为促炎巨噬细胞(M1)

已发现的是，能够与人CLEVER-1结合、特别是与本申请中定义的CLEVER-1上的特异性表位序列结合的试剂，可用于激活巨噬细胞以将其表型从M2巨噬细胞转化成M1巨噬细胞。特别地，能够与TAM上的CLEVER-1结合的试剂可用于实现将促肿瘤巨噬细胞(M2)调变为促炎巨噬细胞(M1)。该调变增加T细胞激活且最终导致例如消除源于癌症的免疫抑制。更确切地说，已发现的是，能够与CLEVER-1分子上的特异性序列结合的试剂可用于通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除免疫抑制。因此，本研究结果提供用于影响个体中的免疫系统的方法，且在治疗癌症或预防转移上尤其有用，但不限于该方法。

巨噬细胞可分为两种不同的表型：M1和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞为经典的促炎巨噬细胞，其产生大量促炎细胞因子和共刺激分子，且在激活T细胞反应上非常有效。相比之下，M2巨噬细胞为免疫抑制细胞，其合成抗炎细胞因子且诱导调节性T细胞，因此极大地抑制抗原驱动的T细胞激活。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)被认为是有害的，因为其在肿瘤环境中成熟为M2巨噬细胞(促肿瘤巨噬细胞)并且抑制抗肿瘤免疫反应和介导血管生成开关(肿瘤生长中的关键步骤)。M2巨噬细胞可调变为M1巨噬细胞(促炎巨噬细胞)，且所述从M2向M1的表型调变可直接或间接导致肿瘤排斥(tumour rejection)。

在本发明的背景下，表述“M1巨噬细胞”或“促炎巨噬细胞”是指以测得的巨噬细胞/单核细胞TNF-α分泌或HLA-DR表达水平增加为特征的巨噬细胞。M2巨噬细胞向M1巨噬细胞的调变，与给予能够与人CLEVER-1结合的试剂之前测得的对照值或者在相同患者中于不同时间点进行的一个或多个先前测定的值相比，将增加单核细胞TNF-α分泌且亦增加HLA-DR表达。将单核细胞TNF-α分泌和HLA-DR表达的测定值与相同患者的所述值进行比较很重要，因为这些标志物的水平在个体之间可能不同，且例如细胞因子(诸如干扰素-γ)和LPS激活可增加M2巨噬细胞的TNF-α表达。

已出人意料地发现，通过使M2巨噬细胞接触能够与人CLEVER-1结合的试剂，例如接触如在本申请中所定义的抗体或其片段、肽或大分子，可将所述巨噬细胞激活以调变为M1巨噬细胞。尤其已发现，通过使与恶性肿瘤相关的M2巨噬细胞接触能够与TAM上的人CLEVER-1结合的试剂，可将所述巨噬细胞调变或复极化为M1巨噬细胞。两种表型可同时存在，且两种表型均可在肿瘤中发现。

能够与人CLEVER-1结合的试剂，例如抗原或其片段、肽或大分子结合至人CLEVER-1以实现巨噬细胞表型的所述调变或复极化。已鉴定的是，对CLEVER-1蛋白特异的试剂识别在本申请中定义的特异性CLEVER-1表位序列。

与TAM上的CLEVER-1的两个或更多个所述表位序列的特异性结合将提供用于治疗癌症或预防转移而无有害副作用的新方法，因为所述治疗可靶向特异性表位以实现所需的巨噬细胞表型调变。因此，本文所述的研究结果尤其用于治疗或预防与增加数量的促肿瘤巨噬细胞有关的所有类型的恶性肿瘤或者其中个体显示免疫抑制主导的诸如慢性炎症等其它病理。因此，用于治疗癌症或预防转移的方法包括给予个体能够与人CLEVER-1、优选与上文定义的CLEVER-1分子上的特异性表位结合的试剂。所述方法包括通过减小肿瘤大小和/或；通过减少个体中的肿瘤生长；和/或抑制癌细胞迁移和转移形成来治疗或预防癌症。因此，任何良性或恶性肿瘤或者恶性肿瘤转移(例如皮肤癌和结肠癌)均可得到治疗。白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤亦可得到治疗。特别地，基于动物模型，预期黑素瘤和淋巴瘤对所述治疗有非常好的反应。

除影响肿瘤的生长或消退之外，巨噬细胞在炎症和感染清除期间亦起重要作用。在感染中，可发生从M1向M2巨噬细胞的转化，导致产生废除效应器免疫的抑制性环境。因此，调变巨噬细胞表型的本文所述的研究结果，亦用于治疗慢性感染以消除对感染性抗原的免疫抑制。本发明亦关注用于治疗慢性感染的方法，所述方法包括给予个体能够与CLEVER-1、优选与在本申请中所定义的CLEVER-1分子上的两个或更多个特异性表位序列结合的试剂，其中所述试剂可激活巨噬细胞以将其表型从M2转化成M1。

另外，能够与个体中的巨噬细胞和单核细胞上的CLEVER-1分子结合的试剂可用作疫苗中的佐剂。所述试剂实现巨噬细胞的复极化并因而消除或至少降低对疫苗抗原的免疫抑制。如果宿主或疫苗接种部位可暂时性去除免疫抑制成分，那么任何抗原诱导的疫苗接种均可受益。

可通过测定来自人血样品的单核细胞TNF-α分泌来验证M2向M1巨噬细胞的调变。因此，TNF-α分泌增加可用作监测个体中的治疗反应的标志物。可从取自患者的血液中富集的外周血单核细胞确定TNF-α分泌。当将测得的TNF-α水平与在患者中给予所述试剂之前从相同患者测得的对照水平或者在相同患者中于不同时间点进行的一个或多个先前测定的值进行比较时，所述水平可用作患者对治疗的反应的标志物，所述治疗包括给予能够与所述患者中的CLEVER-1结合的试剂。

一种用于评估抗-CLEVER-1疗法的功效的方法，其通过当在患者中给予能够与CLEVER-1结合、优选与CLEVER-1上的所述一个、两个或更多个特异性表位序列结合的试剂时，监测M2巨噬细胞至M1巨噬细胞的调变的进展来进行，所述方法包括以下步骤：

(a)从取自所述患者的血样中获得外周血单核细胞(PBL)，

(b)测定所述PBL的TNF-α分泌，和/或

(c)测定CD14阳性PBL上的HLA-DR表达，和

(e)将在步骤(b)和(c)中测得的TNF-α分泌和/或HLA-DR表达的值与对照值进行比较以评估抗CLEVER-1治疗的功效，其中对照值为在患者中给予能够与CLEVER-1结合的试剂之前测得的值或者在相同患者中于不同时间点进行的一个或多个先前测定的值，且其中增加的TNF-α分泌或HLA-DR表达表明M2巨噬细胞至M1巨噬细胞的调变。

确定来自从取自患者的血样中获得的外周血单核细胞的TNF-α分泌可通过通常已知的方法进行，例如通过使用市售TNF-α ELISA试剂盒。CD14阳性单核细胞上的HLA-DR表达亦可通过流式细胞术用已知方法来监测。

M2巨噬细胞至M1巨噬细胞的调变的进展可通过将测得的单核细胞TNF-α分泌水平与在患者中给予能够与CLEVER-1结合的试剂之前测得的对照值或者在相同患者中于不同时间点进行的一个或多个先前测定的值进行比较来监测。例如，与来自先前测定的结果或者与对照相比降低的单核细胞TNF-α分泌水平可用于指示M2巨噬细胞的更高表达，而与来自先前测定的结果或与对照相比升高的TNF-α水平可用于指示具有较低M2巨噬细胞表达的更多的M1巨噬细胞表达，其中其亦可用于指示抗CLEVER-1治疗的功效。升高的TNF-α水平指示具有较低M2巨噬细胞表达的更多的M1巨噬细胞表达，即，其归因于对所述疗法的反应性。能够与CLEVER-1结合的试剂将激活至少一部分M2巨噬细胞复极化成M1巨噬细胞，且在给予所述试剂之后，两种巨噬细胞表型均可存在，但与给予所述试剂之前的情况相比，可观察到M1巨噬细胞的表达增加。通常，与对照值相比测得TNF-α分泌的至少两倍升高，表明M2巨噬细胞至M1巨噬细胞的调变，并因而表明患者对所述疗法的反应性。

对治疗有反应的疾病

在对抗产生于人(或动物)或进入人(或动物)的外源材料中，平衡免疫激活和抑制对于人稳态极其重要。Palani等(2016)的实例为此的生理学实例且显示局部免疫抑制对于胚胎在母体免疫防御主导的环境中保持良好状态的关键程度。相同的情况可在慢性感染中发生，因为某些病原体(例如结核)学会了利用类似的藏匿机制对抗宿主免疫系统且可建立慢性感染部位(肝炎)。消除该局部免疫抑制可帮助宿主对抗这些感染，如同其会起作用以改进针对这些抗性病原体的疫苗接种。

肿瘤亦使该免疫抑制适应其益处。通过减小恶性肿瘤大小；通过减少恶性肿瘤生长；和/或通过抑制癌细胞迁移和转移形成来治疗或预防癌症的根据本发明的方法，适用于所有形式的癌症。因此，任何良性或恶性肿瘤或者恶性肿瘤转移(例如皮肤癌和结肠癌)均可得到治疗。白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤亦可得到治疗。特别地，基于动物模型，预期黑素瘤和淋巴瘤对所述治疗有非常好的反应。

我们相信，根据本发明的能够与CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段或者根据本发明的药物组合物，可用于治疗或预防所有类型的肉瘤，例如纤维肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤(lymphangisarcoma)、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤，间皮瘤、脑膜瘤、白血病、淋巴瘤以及所有类型的癌，例如鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、乳头状癌、囊腺癌、支气管癌、黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤和胚胎性癌。

根据本发明的能够与个体中的人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段或者药物组合物，适用于通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除肿瘤或抗原诱导的免疫抑制，其中所述试剂与在本申请中定义的人CLEVER-1的表位序列结合。

根据本发明的能够与个体中的人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段或者药物组合物，适用于通过减小恶性肿瘤大小；通过减少个体中的恶性肿瘤生长；和/或通过抑制癌细胞迁移和转移形成来治疗或预防癌症，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除恶性生长周围的免疫抑制。

根据本发明的能够与个体中的人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段或者药物组合物，适用于治疗个体中的慢性感染，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除对感染性抗原的免疫抑制。

根据本发明的能够与个体中的人CLEVER-1结合的试剂或者人源化抗体或者单链Fv或Fab片段或者药物组合物，亦适用于作为疫苗的佐剂，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除对疫苗抗原的免疫抑制。

一种用于将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞的方法，所述方法包括给予有需要的受试者能够与CLEVER-1结合、优选能够与如在本申请中定义的CLEVER-1分子上的特异性序列结合的试剂。所述方法可用于在个体中治疗癌症或预防转移，或者在个体中治疗慢性感染。如在本申请中所述，可通过测定所述PBL的TNF-α分泌和/或CD14阳性PBL上的HLA-DR表达来验证治疗反应。

给药途径、制剂和所需剂量

待用于本发明的药物组合物可通过实现其预期目的的任何方式来给予。例如，给予可以是静脉内、关节内、肿瘤内或皮下给予。除药理学活性化合物之外，化合物的药物制剂优选含有合适的药学上可接受的载体，其包括可药用的利于将活性化合物加工成制剂的赋形剂和辅料。

所选剂量就治疗的疾病而言应为治疗上有效的。因此，免疫抑制应足以治疗疾病而没有实质上危害治疗寻求的结果的效果。当治疗或预防癌症时，剂量应足以减小恶性肿瘤大小、减少恶性肿瘤生长和/或抑制癌细胞迁移和转移形成。剂量取决于给予试剂的周转(turnover)，但通常这些治疗遵循每隔2-4周1-5 mg/kg的方案。

实施例

以下试验部分通过提供实施例来阐述本发明。

实施例1-10阐述人CLEVER-1的不连续表位作图和使用复合人类抗体(CompositeHuman Antibody)^TM技术从3-372小鼠单克隆抗体(DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)生成人源化抗体。抗CLEVER-1抗体促进免疫激活的能力在实施例11-14中阐述。

实施例1阐述靶向人CLEVER-1的抗体的完全不连续表位作图。

实施例2-6阐述抗Clever 1抗体克隆3-372的重链和轻链V区(V_H和V_κ)序列的确定，以及包含3-372可变区和人IgG4重链和κ轻链恒定区的嵌合抗体的产生。从杂交瘤克隆3-372提取mRNA，进行反转录、PCR扩增并克隆抗体特异性转录物。确定抗体重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列，并使用Antitope专有复合人类抗体(Composite HumanAntibodies)^TM技术，分析序列数据的人源化。

实施例2-6证实：来自3-372小鼠抗Clever-1抗体的可变区已经克隆和测序。可变区基因已与人IgG4(S241P)重链和κ轻链恒定区进行组合并在NS0细胞中表达以产生嵌合抗Clever 1抗体。使用来自NS0来源的嵌合抗体的竞争ELISA测定证实，嵌合抗体对Clever-1的结合效率类似于亲本鼠抗体的结合效率。

实施例7-10阐述：已被表达并测试与人Clever-1结合的抗CLEVER-1复合人类抗体^TM的设计。通过结构和同源性建模来确定涉及抗CLEVER-1的结构和结合的关键残基，以生成‘限制性残基图谱’。所述限制性残基图谱用作模板以从包含不相关的人类抗体序列的数据库中寻求人V区序列的区段。对各选择的序列区段以及区段之间的连接，均使用计算机(iTope^TM和TCED^TM)分析来测定潜在T细胞表位的存在。使用该方法，对所有复合人类抗体^TM序列变体进行设计以避免T细胞表位。使用编码所选人类序列区段的组合的合成寡核苷酸来生成复合人类抗体^TM V区基因。然后将这些基因克隆到含人IgG4(S241P)重链和κ轻链恒定区的载体中，产生抗体并通过与原始参照鼠单克隆抗体进行比较的竞争ELISA来测定与靶抗原的结合。

实施例7-10显示四个VH和五个Vκ复合人类抗体^TM V区的构建。将复合重链和轻链的组合在NS0细胞中表达、纯化并在竞争ELISA测定中测试与CLEVER-1的结合。结果证实，许多复合人类抗体^TM与CLEVER-1的结合效率至少与嵌合参照抗体的结合效率同样好，且数个复合人类抗体^TM显著更好。基于不存在潜在糖基化位点和未成对半胱氨酸，以及生成的表达和结合效率数据集，指定了如下三个潜在的先导物：VH2/Vκ5、VH3/Vκ5和VH4/Vκ5。

实施例11-12阐述抗CLEVER-1抗体与人外周血单核细胞结合并激活人外周血单核细胞上的TNF-α分泌。实施例13阐述在小鼠同基因癌症模型中抗CLEVER-1抗体对肿瘤相关巨噬细胞的作用模式。

实施例14阐述CLEVER-1与9-11和3-372抗体的连接促进对人外周血单核细胞中的mTOR和c-Jun信号传导的反向作用。

实施例1

人CLEVER-1的完全不连续表位作图

使用肽扫描(Pepscan)分析确定了四个抗体的假定不连续表位。抗体FAR02 VH3/Vκ5和FU-HI-3-372靶向相同的不连续表位，而抗体3-266和AK FUMM 9-11靶向其它不同的表位。研究在Pepscan Presto BV (Zuidersluisweg 2，8243RC Lelystad，荷兰)进行。

抗体3-266、FAR02 VH3/Vκ5、FU-HI-3-372和AK FUMM 9-11由FaronPharmaceuticals Oy提供。

靶蛋白人CLEVER-1 (即人Stabilin-1)通过SEQ ID NO: 31定义。二硫键连接残基(编号Uniprot STAB1_HUMAN)：

112 126 | 120 136 | 138 147 | 160 171 | 164 181 | 183 192

199 210 | 204 217 | 236 247 | 241 257 | 259 270 | 732 746

740 756 | 758 767 | 822 837 | 831 846 | 865 879 | 873 889

891 902 | 908 922 | 916 932 | 934 945 | 951 964 | 958 974

CLIPS技术

所采用的CLIPS技术在结构上将肽组装成确定的三维结构。这产生甚至最复杂的结合部位的功能模拟物。CLIPS技术目前常规用于使肽文库形成单环、双环或三环结构以及片层状和螺旋状折叠。CLIPS反应在CLIPS支架的溴基团和半胱氨酸的巯基侧链之间发生。反应在温和条件下为快速且特异性的。使用精妙的化学法，将天然蛋白质序列转化成具有一系列结构的CLIPS构建体。(Timmerman等，J. Mol. Recognit. 2007；20: 283-29)。

使用组合矩阵设计，以将靶蛋白转变成多达10,000个重叠肽构建体的文库来开始CLIPS文库筛选。在固体载体上，合成线性肽矩阵，随后使其形成空间上确定的CLIPS构建体。以正确构象展示不连续表位的两部分的构建体，以高亲和力结合已进行检测和定量的抗体。呈现不完整表位的构建体以较低的亲和力结合抗体，而不含表位的构建体完全不会结合。将亲和力信息用于迭代筛选以详细地定义表位的序列和构象。将含不连续构象表位的靶蛋白转换成矩阵文库。在专有的微型卡(minicard)上合成组合肽并将其以化学方法转化成空间确定的CLIPS构建体。

热图分析

热图为其中将二维图中变量具有的值显示为颜色的数据图示。

对于双环CLIPS肽，所述二维图可来源于第一环和第二环的独立序列。例如，16个CLIPS肽的序列实际上为例如环1中的例如4个独特子序列和例如环2中的例如4个独特子序列的排列。因此，可以4×4矩阵绘制观察到的ELISA数据，其中各X坐标对应于第一环的序列，和各Y坐标对应于第二环的序列。

为进一步利于可视化，可使用来自连续梯度的颜色替换ELISA值。例如极低值可用绿色显示，极高值可用红色显示，和平均值用黑色显示。

肽的合成

为重建靶分子的表位，合成了肽的文库。通过移植专有的亲水聚合物制剂来获得氨基酸官能化聚丙烯支持物，接着使用二环己基碳二亚胺(DCC)连同N羟基苯并三唑(HOBt)与叔丁氧羰基-六亚甲基二胺(BocHMDA)反应，并随后使用三氟乙酸(TFA)切割Boc基团。通过定制的改良JANUS液体操作台(Perkin Elmer)，使用标准Fmoc-肽合成在氨基官能化固体支持物上合成肽。

使用Pepscan专有的在支架上以化学连接肽(Chemically Linked Peptides onScaffolds，CLIPS)技术进行结构模拟物的合成。CLIPS技术允许将肽构建成单环、双环、三环、片层状折叠、螺旋状折叠及其组合。CLIPS模板与半胱氨酸残基偶联。肽中的多个半胱氨酸的侧链与一个或两个CLIPS模板偶联。例如，将P2 CLIPS (2,6-双(溴甲基)吡啶)的0.5mM溶液溶于碳酸氢铵(20 mM，pH 7.8)/乙腈(1:3 (v/v))。将该溶液加至肽阵列上。CLIPS模板将与如存在于肽阵列(具有3 μl孔的455孔板)的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链结合。在完全被溶液覆盖的同时，将肽阵列在溶液中轻微摇动30-60分钟。最后，使用过量的H₂O全面洗涤肽阵列并在含1% SDS/0.1% β-巯基乙醇/PBS (pH 7.2)的裂解缓冲液中于70℃超声处理30分钟，接着在H₂O中再超声处理45分钟。以类似方式但现在使用三个半胱氨酸来制备载有肽的T3 CLIPS。

ELISA筛选

用基于肽扫描的ELISA测定抗体与各合成肽的结合。将肽阵列与第一抗体溶液一起孵育(4℃过夜)。洗涤之后，将肽阵列与1/1000稀释的适当的抗体过氧化物酶缀合物(SBA；表1)一起于25℃孵育一小时。洗涤之后，加入过氧化物酶底物2,2’-连氮基-二-3-乙基苯并二氢噻唑磺酸盐(ABTS)和20 μl/ml的3% H₂O₂。一小时之后，测定显色。使用电荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统对显色进行定量。

表1抗体详述

名称	供应商	目录号
			山羊抗人HRP缀合物	Southern Biotech	2010-05
兔抗小鼠IgG (J+L) HRP缀合物	Southern Biotech	6175-05
			山羊抗大鼠IgM+IgG (H+L) HRP缀合物	Southern Biotech	3010-05

Langedijk等(2011). Helical peptide arrays for lead identification andinteraction site mapping (用于先导物鉴定和相互作用位点作图的螺旋肽阵列)，Analytical Biochemistry417: 149-155

肽的设计

根据下列设计合成不同的肽集合。注意在某些集合中以随机顺序来合成肽。下文显示实际的肽顺序。

集合1

集合2

集合3

集合4

集合5

集合6

集合7

集合8

筛选详情

抗体结合取决于组合因素，包括抗体的浓度以及ELISA缓冲液中竞争蛋白质的量和性质。另外，预包被条件(在与实验样品一起孵育之前对肽阵列的特殊处理)影响结合。这些详情在表2中概述。对于肽扫描缓冲液和预处理(SQ)，数字指示竞争蛋白质(马血清和卵清蛋白的组合)的相对量。

表2 筛选条件

标签	稀释	样品缓冲液	预处理
				3-266	5 µg/ml	10% SQ	10% SQ
AK FUMM 9-11	1 µg/ml	50% SQ	50% SQ
				FAR02 VH3/Vκ5	3 µg/ml	1% SQ	1% SQ
FU-HI_3-372	5 µg/ml	1% SQ	1% SQ

结果

抗体3-266

当在高严格条件下测定时，抗体3-266不结合存在于阵列上的任何肽。当在低严格条件下测定时，抗体结合来自所有集合的肽。使用简单表位模拟物获得的结果表明，序列₁₀₃₀QWLKSAGITLPADRR₁₀₄₄代表表位的主导部分。使用组合表位模拟物获得的数据(图1)表明，抗体另外识别序列₈₅₇LHARCVSQEGVARCR₈₇₁。此外，对具有序列₄₃₅TMNASLAQQLCRQHI₄₅₀的肽记录了微弱且一致的信号。图1a显示使用集合8 (不连续表位模拟物)对抗体3-266获得的结果的热图图示。用黑色绘制平均信号和用浅色绘制极高信号。方框区域为放大的。

抗体AK FUMM 9-11

当在高严格条件下测定时，抗体AK FUMM 9-11结合来自所有集合的肽。使用简单表位模拟物获得的结果表明，抗体₈₈₅PSNPCSHPDRGG₈₉₆，其代表表位的主导部分。使用组合表位模拟物获得的数据表明，抗体另外识别含有序列₁₆₆FRGSACQECQDPNRF₁₈₀的组合表位模拟物(图1b)。图1b说明使用集合8 (不连续表位模拟物)对抗体AK FUMM 9-11获得的结果的热图图示。用黑色绘制平均信号和用浅色绘制极高信号。方框区域为放大的。

抗体FAR02 VH3/Vκ5和FU-HI:3-372

当在高严格条件下测定时，抗体FAR02 VH3/Vκ5和FU-HI-3-372不结合存在于阵列上的任何肽。当在低严格条件下测定时，这些抗体仅特异性结合来自集合8的肽(图2)。使用不连续模拟物获得的结果的分析表明，抗体识别由序列₃₉₀ATQTGRVFLQ₃₉₉ (SEQ ID NO: 3)、₄₂₀PFTVLVPSVSSFSSR₄₃₄ (SEQ ID NO: 1)、₄₇₃QEITVTFNQFTK₄₈₄ (SEQ ID NO: 2)、₅₇₆DSLRDGRLIYLF₅₈₇ (SEQ ID NO: 4)、₆₁₅SKGRILTMANQVL₆₂₇ (SEQ ID NO: 5)构成的不连续表位，其中序列₄₇₃QEITVTFNQFTK₄₈₄ (SEQ ID NO: 2)和₄₂₀PFTVLVPSVSSFSSR₄₃₄ (SEQ ID NO:1)显示出代表核心表位。对含有序列₃₁₃LCVYQKPGQAFCTCR₃₂₇ (SEQ ID NO: 6)的不连续模拟物记录额外的较弱信号。使用简单表位模拟物获得的结果不允许表位识别(epitopecalling)。图2阐述使用集合8 (不连续表位模拟物)对抗体FU-HI-3-372获得的结果的热图图示。用黑色绘制平均信号和用浅色绘制极高信号。方框区域为放大的。

结论

针对Pepscan肽阵列测定了抗体。有可能鉴定出用于所有单克隆抗体的假定不连续表位。包含表位的肽序列在表3中列出。抗体3-266和AK FUMM 9-11结合不同的不连续表位。当在阵列上测定时，抗体FAR02 VH3/Vκ5和FU-HI-3-372基本上展示高度相似的结合模式，并因此显示为识别FAS1/FAS2结构域中相同的不连续表位。

表3 发现的表位

为了可视地比较对上文提及的抗体鉴定的假定表位，使用图3中的示意图。该示意图改编自图1 (来自Kzhyshkowska，The Scientific World JOURNAL (2010) 10，2039-2053)，展示Stabilin-1 (CLEVER-1)结构域组构。图3图示阐述了CLEVER-1的结构域组构(根据靶序列的aa_25-1027)。箭头指示鉴定的结合基序的相对位置。带圈箭头指示主导表位核心的位置。

实施例2

mRNA提取、RT-PCR和克隆

从杂交瘤细胞(PolyA Tract系统，Promega目录号Z5400)中成功提取mRNA。使用含单个恒定区引物的针对鼠信号序列的简并引物池进行RT-PCR。使用一组六个简并引物池(HA至HF)扩增重链可变区mRNA，和使用一组八个简并引物池(κA至κG和λA)扩增轻链可变区mRNA。使用重链引物池HD和轻链引物池κB、κC和κG获得了扩增产物，证实轻链来自κ聚簇(图4)。将各产物克隆并将来自各自的数个克隆测序。

使用该方法，用引物池HD鉴定了单个VH序列[SEQ ID NO: 32 (碱基序列)和NO:33 (氨基酸序列)]，和用引物池κG鉴定了单个功能性Vκ序列[SEQ ID NO: 34 (碱基序列)和NO: 35 (氨基酸序列)]。重链的CDR从第91位碱基延伸至第111位碱基(SEQ ID NO: 7)、从第154位碱基延伸至第210位碱基(SEQ ID NO: 8)和从第298位碱基延伸至第333位碱基(SEQ ID NO: 9)；和轻链的CDR从第70位碱基延伸至第105位碱基(SEQ ID NO: 10)、从第151位碱基延伸至第171位碱基(SEQ ID NO: 11)和从第268位碱基延伸至第294位碱基(SEQID NO: 12)。CDR定义和蛋白质序列编号是根据Kabat。用引物池κB和κC亦鉴定了通常与杂交瘤融合配偶体SP2/0 (GenBank M35669)相关的异常的κ轻链转录物。

图4说明杂交瘤3-372 RT-PCR产物的1%琼脂糖凝胶分离。用SYBR® Green染料(Invitrogen目录号S-7567)将凝胶染色并在紫外光下成像。大小标志物为GeneRuler^TM 1KbPlus (Fermentas目录号SM1331)。方框指示进行分离以用于克隆和测序的条带。

实施例3

序列分析

从表达3-372的杂交瘤中获得的序列的分析在表4中概述。

表4 3-372抗体序列分析^a

	H链	L链
			CDR 1长度	7aa	12aa
CDR 2长度	16aa	7aa
			CDR 3长度	12aa	9aa

			最接近的人类种系<sup>b</sup>	IGHV2-5*10 (73%)	IGKV3D-20*01 (65%)
最接近的人类FW1<sup>b</sup>	IGHV2-70*06 (73%)	IGKV1D-17*01 (68%)
			最接近的人类FW2<sup>b</sup>	IGHV2-5*09 (86%)	IGKV1D-39*01 (73%)
最接近的人类FW3<sup>b</sup>	IGHV2-70*13 (72%)	IGKV1D-43*01 (78%)
			最接近的人类J<sup>b</sup>	IGHJ1 (91%)	IGKJ4 (80%)

^a CDR定义和序列编号是根据Kabat

^b指示的种系ID随后是%同源性

鼠3-372可变结构域序列的结构和同源性分析鉴定了重链可变区中的四个框架残基和轻链可变区中的五个框架残基，认为其对于抗原结合而言极其重要或可能重要(“限制性残基”)。另外的序列数据库分析显示，可发现人类框架区段包含全部所需的限制性残基和全部CDR残基，因而允许构建复合人类抗体^TM。

亦注意到，3-372 V区包含一些罕见特征。VH链在CDR1的起始包含N糖基化位点，因为第30位残基为N且第32位残基为S (N糖基化信号为NXS或NXT，其中X可以是任何氨基酸)。因为该基序可能暴露在抗体的表面上，所以很可能该位点将被糖基化。因此在复合人类抗体中避免该位点以避免将来的任何制备问题，将是有利的(如果不涉及抗原结合)。Vκ链亦包含糖基化位点但仅在人κ恒定区的情况下，因为Vκ结构域的末位氨基酸为天冬酰胺。小鼠κ恒定结构域以RA起始，而人κ恒定结构域以RT起始，因而形成糖基化信号。因此将对用于复合人类抗体的序列进行选择以避免天冬酰胺。

κ结构域亦在第47位包含未成对半胱氨酸。分子建模表明，该残基将埋藏在结构之内并因此无法用于二硫键键合；然而其可为用于维持Vκ CDR2构象的关键残基，并因此将选择具有和不具有该残基(后者在该位置上包含共有人类L)的用于复合人类抗体的序列，以研究其对抗原结合的作用。

实施例4

嵌合抗体的表达

将3-372可变区转入用于IgG4 (S241P)重链和κ轻链的Antitope表达载体系统。经由电穿孔转染NS0细胞并使用甲氨蝶呤(MTX)进行选择。使用Fc捕获/κ链检测ELISA鉴定了许多抗MTX菌落，在含渐增浓度的MTX的培养基中将IgG表达阳性的细胞系从96孔板不断扩增到T175烧瓶中，并随后在液氮下冷冻。在各阶段，对IgG表达进行定量。

用蛋白A琼脂糖凝胶柱从细胞培养上清液中纯化嵌合3-372 IgG4，并基于对嵌合IgG4预测的氨基酸序列，使用1.55的消光系数(Ec (0.1%))值通过OD280nm进行定量。纯化了约90 μg抗体并通过还原SDS-PAGE分析样品(图5)。观察到对应于重链和轻链的预测大小的条带，未见任何污染迹象；然而值得注意的是，嵌合轻链显示为糖基化的，如通过大于小鼠轻链的表观分子量所证实。重链亦显示较其通常跑得更慢，表明其亦为N糖基化的；然而将需要用糖苷酶消化来证实其的确如此。

图5说明蛋白A纯化的嵌合3-372 IgG4的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。将1 μg样品上样至NuPage 4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen目录号NP0322BOX)并于200 V运行30min。泳道1&4：预染蛋白标准品(Fermentas PageRuler目录号SM1811)。泳道2：1.0 μg嵌合3-372 IgG4抗体。泳道3：1.0 μg鼠3-372抗体。

实施例5

嵌合抗体与CLEVER-1的结合

通过竞争ELISA来评价NS0来源的嵌合3-372与CLEVER-1的结合。简言之，用含1 μg/mlCLEVER-1的PBS (100 μl/孔)将Nunc Immulon 96孔maxisorp板(Fisher目录号DIS-971-030J)于4℃包被过夜，在第二天上午于37℃再包被1小时。用PBS/0.1% Tween 20洗涤孔并随后用1% Marvel/1% BSA/PBS于室温封闭45 min。

将嵌合3-372和参照小鼠3-372的稀释系列(5-0.078 µg/ml)与含恒定浓度(0.6 μg/ml)生物素化小鼠3-372抗体的2% BSA/PBS预混合。如前述洗涤封闭的ELISA板并向各孔中加入100 μl预混合抗体。将板于室温孵育1小时。使用链霉抗生物素-HRP (Sigma目录号S5512)和TMB单底物溶液(Invitrogen目录号00-2023)检测生物素化小鼠3-372与CLEVER-1的结合。使用3M HCl终止反应，用Dynex Technologies MRX TC II酶标仪在450nm读取吸光度并将嵌合3-372的结合曲线与参照小鼠3-372抗体的结合曲线进行比较(图6)。

图6显示与生物素化小鼠抗体竞争的小鼠抗体和嵌合抗体对CLEVER-1的结合概况。曲线几乎相同，与对于小鼠抗体的0.77 μg/ml相比，对于嵌合抗体得到0.89 μg/ml的IC50值。这证实正确的可变区序列已得到鉴定并在嵌合抗体中表达。

实施例7

复合人类抗体 ^TM 可变区序列和变体的设计

使用Swiss PDB产生鼠抗CLEVER-1抗体V区的结构模型并分析以鉴定对抗体的结合性质而言可能为必需的V区中的重要的“限制性”氨基酸。包含在CDR中的残基(使用Kabat和Chothia两种定义)连同许多框架残基被认为是重要的。抗Clever 1的VH和Vκ序列二者均含有典型的框架残基，且CDR 1、2和3基序与许多鼠抗体相当。然而，我们鉴定了VH序列中用于N连接糖基化的可能位点(30N)，和Vκ序列中的未成对半胱氨酸(47C)。

从上述分析中，认为可使用CDR之外的宽泛范围的备选残基但仅可使用CDR序列之内的狭窄范围的可能备选残基来产生抗CLEVER-1的复合人类序列。初步分析表明，可将来自数个人类抗体的相应序列区段组合以产生与鼠序列中的CDR相似或相同的CDR。对于CDR之外和侧翼的区域，鉴定了宽泛选择的人类序列区段，作为新型复合人类抗体^TMV区的可能组分。

基于上述分析，选出可用于产生抗CLEVER-1复合人类抗体^TM变体的序列区段的初始大组，并使用用于计算机分析与人MHC II类等位基因结合的肽的iTope^TM技术(Perry等2008)和使用已知抗体序列相关的T细胞表位的TCED^TM (T细胞表位数据库) (Bryson等2010)进行分析。弃去这样的序列区段，其鉴定为对于人MHC II类而言重要的非人类种系结合物或者经评分为针对TCED^TM显著击中。其得到一组缩减的区段，并如上再次对这些区段的组合进行分析，以确保区段之间的连接不含潜在的T细胞表位。然后将所选区段合并以产生用于合成的重链和轻链V区序列。对于抗CLEVER-1，设计了四个VH链(VH1、VH2；VH3和VH4[分别为SEQ ID NO: 13、15、17和19 (碱基序列)以及NO: 14、16、18和20 (氨基酸序列)])和五个Vκ链(Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4和Vκ5 [分别为SEQ ID NO: 21、23、25、27和29 (碱基序列)以及NO: 22、24、26、28和30 (氨基酸序列))。重链CDR VH1、VH2、VH3和VH4从第91位碱基延伸至第111位碱基、从第154位碱基延伸至第201位碱基和从第298位碱基延伸至第333位碱基；和轻链CDR Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4和Vκ5从第70位碱基延伸至第105位碱基、从第151位碱基延伸至第171位碱基和从第268位碱基延伸至第294位碱基。CDR定义和蛋白质序列编号是根据Kabat。注意的是，VH链中的三个去除了潜在的N连接糖基化位点(VH2、VH3和VH4)，和Vκ链中的两个去除了未成对半胱氨酸(Vκ4和Vκ5)。

实施例8

复合人类抗体 ^TM 变体的构建

使用一系列重叠寡核苷酸，将其退火、连接和PCR扩增以得到全长合成V区，合成用于抗Clever 1的所有变体复合人类抗体^TMVH和Vκ区基因。然后将组装的变体直接克隆到用于IgG4(S241P) VH链和Vκ链的Antitope pANT表达载体系统中(图7)。使用MluI和HindIII位点克隆VH区，和使用BssHII和BamHI限制位点克隆Vκ区。通过测序来证实所有构建体。

图7显示Antitope pANT载体图。Vh和Vκ载体二者均含有掺入内含子和多聚腺苷酸序列的基因组DNA片段。两条链的表达均通过CMV启动子来驱动，且经由DHFR小基因来选择(在重链载体上)。

实施例9

抗体的构建、表达和纯化

经由电穿孔将复合IgG4(S241P) VH和Vκ链的所有组合(即总共20对)稳定转染到NS0细胞中。使用200nM甲氨蝶呤(MTX) (Sigma目录号M8407)挑选稳定转染，使用IgG4 ELISA对各构建体的抗甲氨蝶呤菌落检测IgG表达水平，以及挑选最佳表达系、扩增并在液氮下冷冻。除VH3/Vκ3和VH4/Vκ3之外，对所有变体均实现了成功转染和稳定克隆挑选。

在蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare目录号110034-93)上从细胞培养上清液中纯化抗CLEVER-1的复合变体，将缓冲液更换成PBS并基于预测氨基酸序列使用消光系数(Ec(0.1%) = 1.55)通过OD280nm来进行定量。通过还原SDS-PAGE分析先导的复合人类抗体^TM变体。观察到对应于VH和Vκ链的预测大小的条带，未见任何污染迹象(图8)。

图8说明所选蛋白A纯化抗体的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。将2 μg各样品上样至NuPage 4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen目录号NP0322BOX)并于200 V运行35 min。大小标志物为预染蛋白标准品Fermentas PageRuler (目录号SM1811)。

实施例10

复合人类抗体 ^TM 与CLEVER-1的结合

通过竞争ELISA评价NS0来源的复合3-372抗体与CLEVER-1的结合。嵌合3-372抗体和复合3-372抗体的稀释系列(5-0.078 µg/ml)与恒定浓度(0.6 μg/ml)的生物素化小鼠3-372抗体预混合。在用1 μg/ml CLEVER-1预包被的96孔Immulon maxisorp板(Fisher目录号DIS-971-030J)上，将这些抗体于室温孵育1小时。使用链霉抗生物素-HRP (Sigma目录号S5512)和TMB单底物溶液(Invitrogen目录号00-2023)检测生物素化小鼠3-372与CLEVER-1的结合。使用3M HCl终止反应，用Dynex Technologies MRX TC II酶标仪在450nm读取吸光度并绘制结合曲线。计算各抗体的IC50值并针对包含在各相应ELISA板上的嵌合体的IC50将这些值标准化。

获得的IC50显示，与嵌合3-372相比，许多复合人类抗CLEVER-1抗体^TM具有更佳的与CLEVER-1的结合。先导变体的竞争数据在图9中显示。

表5 复合人类抗CLEVER-1抗体^TM的结合表征

相对IC₅₀通过在相同板上测定的试验抗体的值除以嵌合体的值来计算。

实施例11：体外抗体结合

收集来自健康供者的人外周血单核细胞并通过蔗聚糖梯度离心从约9 ml的外周血中将其富集。然后以1.2 × 10⁶个细胞/孔的密度，将其接种到低粘附96孔板中的补充以1%人AB血清的IMDM培养基中。使用1 μg/ml或10 μg/ml的抗CLEVER-1抗体3-372 (DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)或VH3/Vκ5 (识别所述特异性CLEVER-1表位的根据本发明的人源化抗CLEVER-1抗体)将细胞处理48小时。通过使用LSRFortessa流式细胞术在48小时之后从CD14阳性细胞中确定HLA-DR表达。基于对7-AAD细胞活力染料的阳性信号，从分析中剔除死细胞。

使用人IgG作为参照。

图10A显示从CD14阳性细胞测定HLA-DR表达的结果。与人IgG参照相比，CD14阳性细胞上的HLA-DR表达随着人源化抗CLEVER-1抗体VH3/Vκ5的处理而增加。

在处理之间未观察到在细胞活力上的差异。因此，可推断的是，靶向CLEVER-1的抗体不影响单核细胞存活。

实施例12：TNF-α的测定

如在实施例11中所述，收集来自健康供者的人外周血单核细胞并进行富集。使来自3ml红细胞裂解缓冲液处理血液的单核细胞过夜粘附于6孔板上，用PBS洗涤一次并使用10 μg/ml抗CLEVER-1抗体3-372或AK-1培养3天。

使用市售TNF-α ELISA试剂盒(Invitrogen)从培养基中测定可溶性TNF-α。测定的结果在图10B中显示。与未处理样品或者使用AK-1的对照处理样品相比，使用抗CLEVER-1处理的样品中注意到增加的TNF-α分泌。

实施例13：小鼠同基因癌症模型

每3-4天使用5 mg/kg抗CLEVER-1 (mStab1)或同种型对照治疗已建立的E0771小鼠乳腺癌直至肿瘤达到1 mm³的大小。使用流式细胞术评价抗CLEVER-1治疗对TAM、不同单核细胞亚组和肿瘤浸润性白细胞的募集和表型的影响。

图11A显示在给予与CLEVER-1结合的抗体之后在同基因E0771乳腺癌中的TAM复极化。通过流式细胞术，经由表达MHC II (在人HLA-DR中)的巨噬细胞群体增加来测定TAM复极化。各点代表一只小鼠中MHCII^高CD11b⁺F4/80⁺TAM的百分数。与对照治疗的肿瘤相比，抗CLEVER-1治疗的肿瘤显示类似的TAM (CD11b+F4/80+)水平。然而，抗CLEVER-1肿瘤中的TAM群体由更多的具有较低II型标志物CD206表达的促炎巨噬细胞(Ly6CloMHCIIhi)组成。

与IgG治疗的TAM相比，抗CLEVER-1治疗的TAM分泌显著更多的TNF-α，如在图11B中所示。各点代表从一只小鼠中分离的TAM。与此相符合的是，亦观察到FoxP3+肿瘤浸润性白细胞的减少。

结果表明，CLEVER-1为用于巨噬细胞导向免疫疗法的潜在靶标。

实施例14

如在实施例1中已指示，抗体9-11和3-372与人CLEVER-1中的不同表位结合，且目前已研究了该差异对人外周血单核细胞中的信号传导的影响。图12说明CLEVER-1与9-11和3-372抗体的连接促进对人外周血单核细胞中的mTOR (雷帕霉素的机械靶标)和c-Jun信号传导的反向作用。

图12A显示CD14阳性人单核细胞上的9-11和3-372结合的流式细胞术分析(n = 2个供者，D1和D2)。

图12B显示当使用20 μg/mL的9-11和3-372的10分钟处理之后用人磷酸激酶阵列(Human Phospho-Kinase Array，R&D)测定CD14阳性细胞(通过负选择富集)上磷酸化蛋白(phospho protein)激活的结果。针对相关的同种型对照处理的细胞(对于9-11为ratIgG2a和对于3-372为小鼠IgG1)将磷酸信号标准化。如在图12B中所示，抗体9-11和3-372促进对人外周血单核细胞中的mTOR和c-Jun信号传导的反向作用。已知的是，mTOR途径调节巨噬细胞极化和免疫抑制性巨噬细胞表型取决于c-Jun磷酸化，其中结果表明，3-372抗体激活巨噬细胞以将其表型从M2巨噬细胞转换为M1巨噬细胞。

其它优选实施方案

要理解的是，本发明的能够与人CLEVER-1结合的试剂，例如抗体、单链Fv或Fab片段、肽、大分子以及人源化抗体或者人源化单链Fv或Fab片段和药物组合物可以各种实施方案的形式结合，在本文中仅公开了其中的少数实施方案。对于本领域熟练技术人员而言显而易见的是，存在其它实施方案且不会背离本发明的精神。因此，所述实施方案为说明性的且不应理解为限制性的。

Claims

1. 一种能够与人CLEVER-1的表位结合的试剂，其中所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2) ，

TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，

HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，

HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)，

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，

RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和

HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

2.根据权利要求1的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述不连续表位进一步包含选自以下的一个或多个序列：

ATQTGRVFLQ (SEQ ID NO: 3)，

DSLRDGRLIYLF (SEQ ID NO: 4)，

SKGRILTMANQVL (SEQ ID NO: 5)，和

LCVYQKPGQAFCTCR (SEQ ID NO: 6)。

3.根据权利要求1或2的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述试剂包含在权利要求1中定义的互补决定区(CDR)的至少两个、优选三个、更优选四个、还更优选五个以及最优选全部六个氨基酸序列。

4.根据前述权利要求中任一项的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述试剂选自抗体、单链Fv或Fab片段、肽或具有足以与所述表位结合的亲和力的大分子。

5. 一种能够与人CLEVER-1的表位结合的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)，

所述抗体或者单链Fv或Fab片段包含

a)人IgG4重链和κ轻链的恒定区，和

b)一个或多个下列互补决定区(CDR)的序列

i)重链的CDR

CDR 1：TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，和/或

CDR 2：HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，和/或

CDR 3：HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)；和

ii)轻链的CDR

CDR 1：TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，和/或

CDR 2：RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和/或

CDR 3：HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

6.能够与人CLEVER-1结合的根据权利要求5的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中所述不连续表位进一步包含选自以下的一个或多个序列：

ATQTGRVFLQ (SEQ ID NO: 3)，

DSLRDGRLIYLF (SEQ ID NO: 4)，

SKGRILTMANQVL (SEQ ID NO: 5)，和

LCVYQKPGQAFCTCR (SEQ ID NO: 6)。

7.能够与人CLEVER-1结合的根据权利要求5或6的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中至少两个、优选三个、更优选四个、还更优选五个以及最优选全部六个在权利要求5中定义的CDR包含在所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段中。

8. 能够与人CLEVER-1结合的根据前述权利要求5-7中任一项的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中人IgG重链可变区序列选自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO: 20，优选SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 20。

9. 能够与人CLEVER-1结合的根据前述权利要求5-8中任一项的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中人IgG轻链可变区序列选自SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO: 28和SEQ ID NO: 30，优选SEQ ID NO: 30。

10. 根据前述权利要求5-9中任一项的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，与单克隆抗体3-372 (DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)的IC50相比，其能够以相对IC50 < 1.0、优选< 0.8、更优选< 0.6和最优选< 0.5与人CLEVER-1结合。

11. 根据前述权利要求8-10中任一项的能够与人CLEVER-1结合的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段，其中所述人IgG重链和轻链可变区的组合选自表5中所示的组合，与单克隆抗体3-372 (DSM ACC2520，2001年8月21日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心)的IC50相比，所述人源化抗体或者单链Fv或Fab片段能够以相对IC50 < 1.0与人CLEVER-1结合。

12. 一种能够与个体中的人CLEVER-1结合的试剂，用于通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除肿瘤或抗原诱导的免疫抑制，其中所述试剂与人CLEVER-1的表位结合，所述表位为不连续的且包含序列：

PFTVLVPSVSSFSSR (SEQ ID NO: 1)，和

QEITVTFNQFTK (SEQ ID NO: 2)。

13.根据权利要求12的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述不连续表位进一步包含选自以下的一个或多个序列：

ATQTGRVFLQ (SEQ ID NO: 3)，

DSLRDGRLIYLF (SEQ ID NO: 4)，

SKGRILTMANQVL (SEQ ID NO: 5)，和

LCVYQKPGQAFCTCR (SEQ ID NO: 6)。

14.根据权利要求12或13的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述试剂包含与选自以下的所述表位序列结合的互补决定区(CDR)的序列：

TSGMGIG (SEQ ID NO: 7)，

HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 8)，

HYGYDPYYAMDY (SEQ ID NO: 9)，

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 10)，

RTSNLAS (SEQ ID NO: 11)，和

HQYHRSPPT (SEQ ID NO: 12)。

15.根据前述权利要求12-14中任一项的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述试剂选自抗体、单链Fv或Fab片段、肽或具有足以与所述表位结合的亲和力的大分子。

16.根据前述权利要求12-14中任一项的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其中所述试剂为根据权利要求5-11中任一项的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段。

17.根据前述权利要求12-16中任一项的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其特征在于用于通过减小恶性肿瘤大小；通过减少个体中的恶性肿瘤生长；和/或通过抑制癌细胞迁移和转移形成来治疗或预防癌症，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除所述恶性生长周围的免疫抑制。

18.根据前述权利要求12-16中任一项的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其特征在于用于治疗慢性感染，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除对感染性抗原的免疫抑制。

19.根据前述权利要求12-16中任一项的用于消除免疫抑制的能够与人CLEVER-1结合的试剂，其特征在于用作疫苗的佐剂，其中通过将M2巨噬细胞调变为M1巨噬细胞来消除对疫苗抗原的免疫抑制。

20.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求1-4中任一项的能够与人CLEVER-1结合的试剂或者根据权利要求5-11中任一项的人源化抗体或者单链Fv或Fab片段以及适当的赋形剂。

21.根据权利要求20的药物组合物，其用于消除肿瘤或抗原诱导的免疫抑制。

22.根据权利要求21的用于消除免疫抑制的药物组合物，其特征在于用于治疗或预防癌症、用于治疗慢性感染或用作疫苗的佐剂。