CN109303922B

CN109303922B - 一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物及其制备方法与在降糖药物中的应用

Info

Publication number: CN109303922B
Application number: CN201811377322.2A
Authority: CN
Inventors: 扶雄; 汪磊; 李超; 黄强
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109303922A

Abstract

本发明公开了一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物及其制备方法与在降糖药物中的应用，属于纳米硒制备技术领域。该制备方法包括以下步骤：(1)将亚硒酸钠溶液与刺梨多糖溶液混合均匀，然后加入维生素C溶液，搅拌均匀后振荡反应；(2)将步骤（1）所得反应液透析，干燥，即得到刺梨多糖功能化纳米硒复合物。本发明以亚硒酸钠为硒源，维生素C为还原剂，刺梨多糖（RTFP‑3）为表面修饰剂，绿色制备表面功能化的纳米硒复合物（RP3‑SeNPs），制备出稳定性好、粒径分布窄、分散性好的纳米硒多糖复合物，以及刺梨多糖纳米硒复合物在制备抑制胰岛β细胞受损的药物中的用途。

Description

一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物及其制备方法与在降糖药物中的应用

技术领域

本发明属于纳米硒制备技术领域，特别涉及一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物及其制备方法与在降糖药物中的应用。

背景技术

随着社会经济发展和人们生活水平的提高，糖尿病发病率日趋增高，其发病率和死亡率已位于非传染疾病的第3位，特别是2型糖尿病人群数量增加更加迅速。2型糖尿病的诱因之一，就是人体胰岛细胞数量减少或者功能缺失导致胰岛素分泌量减少，从而导致人的血糖平衡状态被打乱。目前发现，自由基是导致胰岛β-细胞损伤和凋亡的重要诱因之一，在正常人体内，自由基处于动态平衡状态，但由于在外界不良环境以及自身炎症等刺激下，体内过量的自由基（ROS、RNS等）会对正常细胞发生攻击。在氧化应激状态下，正常细胞的组成会发生变化，例如胞内物质的DNA、蛋白质以及脂类等成分发生变化，诱导细胞发生损伤和凋亡。基于氧化应激、β-细胞凋亡和糖尿病之间的关系，研究发现抑制胰岛β-细胞的氧化应激状态是治疗糖尿病的有效方法之一。同时多项研究也表明，补充抗氧化剂可以清除自由基，可以控制β-细胞的氧化应激状态，达到保护胰岛β-细胞的作用。

硒是人体必需的微量元素之一，硒具有提高人体免疫力、抗氧化、延缓衰老和防癌、抗癌的作用，与人类和动物的生长、发育及疾病的发生密切相关。研究表明，缺硒会引发比如癌症、心脏病、关节炎和免疫系统功能紊乱等多种病症，适量补硒可以预防糖尿病等代谢类疾病，降低糖尿病的发病率和并发症。研究表明硒作为抗氧化剂，进入人体可以参与体内抗氧化酶体系的合成（例如谷胱甘肽过氧化氢酶），可迅速清除体内的自由基，从而可有效防御自由基对细胞的损害，有抗衰老的功能。目前，硒的补充常以亚硒酸钠、硒酸钠、硒代蛋氨酸的形式添加于许多食品补充剂中。硒纳米粒子(SeNPs)因其生物利用度高，毒性低和生物活性显著的特性而成为新的研究热点。中国发明专利CN104310319B公开了一种纳米硒的制备方法，将亚硒酸盐与还原剂在稳定剂的作用下反应，通过改变亚硒酸盐与还原剂的配比，其中亚硒酸盐溶液的摩尔浓度为 15～25 mM，在此浓度范围内，可精确控制纳米硒粒径。中国发明专利CN104825484B公开了一种纳米硒的制备方法，该方法以亚硒酸钠为硒源，碘化钾为稳定剂，抗坏血酸为还原剂，壳聚糖或羧甲基壳聚糖为表面修饰剂，成功制备表面功能化的纳米硒复合物，其粒径范围在50 nm左右。研究表明硒的生物利用度、生物活性随其纳米粒径的改变而相差很大，通常合成的表面没有功能化的SeNPs极易聚集沉淀，这已成为限制SeNPs应用的瓶颈。因此，制备粒径小、分布窄的SeNPs，并利用多糖对其表面进行功能化修饰，以期获得稳定性好的硒纳米粒子，成为当下研究的热点。

刺梨作为具有地域特色的药食两用植物，也被人们当作中药食用。传统医学主要以刺梨根、叶以及果实等入药，具有消食健脾、止泻、解暑等功效，对于治疗积食腹胀、高血脂、肠炎、高血压、夜盲症、维生素C缺乏症等疾病都有一定的效果。多糖作为刺梨果实中的重要成分之一，通过采用热水浸提法，经过脱色、脱蛋白以及DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析分离出一种均一组分RTFP-3，分子量均一，结构明确。得到的刺梨多糖RTFP-3其分子量为67.2 kDa，该多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖等组成，主要糖苷键分别有33.21%的(1→5)-阿拉伯糖，35.72%的(1→6)-半乳糖，4.27%的(1→4)-葡萄糖，17.22%的(1→3,4)-岩藻糖。同时，还包括少部分端基木糖和(1→3,6)-甘露糖。目前关于刺梨多糖调控制备具有保护胰岛β-细胞作用的纳米硒的报道尚未见报道。本发明人以刺梨多糖作为功能修饰材料，以亚硒酸钠和维生素C为原料，用氧化还原法制备具有保护胰岛β-细胞的功能化纳米硒。该法制得的产品安全性高，方法简便可大量生产，在作为补硒剂的同时还具有极高的生物活性，可发展成为治疗和预防糖尿病的高效低毒药剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物及其制备方法与在降糖药物中的应用。

本发明以亚硒酸钠为硒源，抗坏血酸（维生素C）为还原剂，刺梨多糖（RTFP-3）为表面修饰剂，绿色制备表面功能化的纳米硒复合物（RP3-SeNPs）。制备出稳定性好、粒径分布窄、分散性好的纳米硒多糖复合物，以及刺梨多糖纳米硒复合物在制备抑制胰岛β细胞受损的药物中的用途。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1) 将亚硒酸钠溶液与刺梨多糖溶液混合均匀，然后加入维生素C溶液，搅拌均匀后振荡反应；

(2) 将步骤（1）所得反应液透析，干燥，即得到刺梨多糖功能化纳米硒复合物。

优选的，步骤（1）所述亚硒酸钠溶液的浓度为1～3 mM，所述刺梨多糖溶液的浓度为0.25-4 mg/L；所述维生素C溶液的浓度为6～10 mM。

进一步优选的，所述刺梨多糖溶液的浓度为0.25，0.5，1，2，3或4 mg/L。

优选的，步骤（1）所述维生素C溶液的体积为亚硒酸钠溶液体积的6～10倍。

优选的，步骤（1）所述反应的温度为37 °C。

优选的，步骤（1）所述反应是在100～300转每分钟条件下反应12～36 h。

优选的，步骤（2）所述透析是将步骤（1）所得反应液转移到3000 Da的透析袋中，在4 °C水中透析，透析液经过ICP-AES检测无硒离子后停止透析；透析的时间为36～96 h。

由以上所述的制备方法制得的一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物。

以上所述的一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物在制备降糖药物中的应用。

本发明制备的功能化纳米硒可应用于抑制胰岛β细胞的氧化损伤，其中功能化纳米硒为活性成分，具有抗氧化和保护胰岛细胞的活性。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明制备的刺梨多糖修饰的功能化纳米硒，直接以亚硒酸钠和维生素C为反应原料，刺梨多糖为表面修饰剂，其制备过程简单易行，产物体系简单，制备的纳米硒颗粒粒径范围窄，储存稳定性好，储存一个月内其粒径无明显的变化。能谱分析显示制备的刺梨多糖纳米硒复合物中硒原子的含量大约为27.01%，硒原子含量较高。

(2)由于刺梨多糖本身具有抗氧化活性，通过刺梨多糖与纳米硒颗粒的结合，与原纳米硒颗粒相比，复合后可以极大的提高纳米硒颗粒的抗氧化活性，复合物的抗氧化活性与刺梨多糖的抗氧化活性几乎相当。

(3)本发明制备的刺梨多糖纳米硒颗粒具有较好的细胞膜穿透性，经离子色谱测定培养24 h胰岛细胞INS-1的吸收量为12.53 μg/10⁸个细胞，同时可以抑制H₂O₂诱导的胰岛瘤细胞INS-1的凋亡，提高细胞的存活率，同时也可以提高H₂O₂诱导的胰岛瘤损伤细胞的胰岛素分泌量。

附图说明

图1a为不同浓度刺梨多糖修饰纳米硒溶液的粒径图。

图1b为1 mg/mL和2 mg/mL刺梨多糖修饰纳米硒溶液的储存稳定性比较图。

图2a为纳米硒溶液的透射电镜图。

图2b为刺梨多糖纳米硒溶液的透射电镜图。

图2c为纳米硒溶液的扫描电镜图。

图2d为刺梨多糖纳米硒溶液的扫描电镜图。

图3a为纳米硒和刺梨多糖纳米硒复合物红外光谱(FT-IR)图。

图3b为纳米硒和刺梨多糖纳米硒溶液的紫外-可见光谱图。

图3c为纳米硒的能谱分析图(EDX)。

图3d为刺梨多糖纳米硒复合物的能谱分析图(EDX)。

图4a为不同浓度纳米硒、刺梨多糖和刺梨多糖纳米硒复合物溶液的DPPH自由基清除能力比较图。

图4b为不同浓度纳米硒、刺梨多糖和刺梨多糖纳米硒复合物溶液的ABTS自由基清除能力比较图。

图4c为不同浓度纳米硒、刺梨多糖和刺梨多糖纳米硒复合物溶液的氧自由基吸收能力比较图。

图5a为刺梨多糖纳米硒复合物的细胞毒性实验图。

图5b为刺梨多糖纳米硒复合物的H₂O₂建立INS-1细胞氧化损伤模型图。

图5c为刺梨多糖和纳米硒对氧化损伤INS-1细胞的保护作用图。

图5d为刺梨多糖纳米硒复合物对氧化损伤INS-1细胞的保护作用图。

图6为刺梨多糖纳米硒复合物对氧化损伤INS-1细胞胰岛素分泌作用的影响图。

具体实施方式

下面通过实例和附图进一步说明本发明的技术内容和效果，但本发明的实施方式不限于此。

本发明以亚硒酸钠为硒来源，维生素C为还原剂，刺梨多糖为表面修饰剂制备纳米硒多糖复合物。

实施例1 刺梨多糖RTFP-3的制备

将刺梨鲜果清洗后在60 °C鼓风干燥箱中干燥、粉碎、过60目筛，按照刺梨干粉和95%乙醇（v/v）配成固液比为1:6 g/mL的混合液，在70 °C条件下加热回流4 h，过滤得到残留物，加热回流和过滤重复3次。将脱脂后的刺梨粉放入45 °C的鼓风干燥箱中干燥48 h。将处理后的刺梨干粉150 g，加入蒸馏水进行热水浸提，浸提温度95°C，时间3 h，料液比1:30（质量和体积的单位分别为g和mL），提取次数为2次；离心力5000 g，离心10 min，收集上清液于55°C下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，得到刺梨多糖的浓缩液。在刺梨多糖的浓缩液中加入Sevag试剂（氯仿：正丁醇=4:1），刺梨多糖的浓缩液与Sevag试剂的体积比为3:1，振荡30 min，离心分离上层糖液，离心力5000 g，离心时间为10 min，振荡和离心过程重复操作12次以上，直至肉眼观察无蛋白残留，减压浓缩至原体积的1/3。脱蛋白后的浓缩液中加入大孔树脂AB-8，进行脱色处理，使多糖浓缩液与大孔树脂的体积比为6:1，温度37 °C，在摇床上振荡处理10 h，过滤得到滤液。脱色后的滤液中加入无水乙醇，使乙醇的体积浓度达到70%，4 °C下静置24 h，离心力5000 g，离心10 min得到下层的多糖沉淀，冷冻干燥48 h，得到水溶性刺梨粗多糖。将水溶性刺梨粗多糖用蒸馏水溶解，配制成终浓度为20 mg/mL的多糖溶液，上样于DEAE-Sepharose fast flow柱，上样量体积与柱体积比为1:4，分别用蒸馏水、0.1 mol/L、0.2 mol/L和0.3 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min，每管收集5 mL。其中用蒸馏水、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，分别收集各组分，分别命名为RTFP-1、RTFP-2、RTFP-3和RTFP-4。本发明主要报道RTFP-3组分，将RTFP-3组分收集后浓缩透析48 h，然后对RTFP-3组分进行真空冷冻干燥，得到纯化后的刺梨多糖样品。

实施例2 刺梨多糖纳米硒溶液(SeNPs)的制备

浓度为1 mM的亚硒酸钠溶液10 mL分别与相同体积一定浓度的刺梨多糖溶液（0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）或蒸馏水相互混合，然后加入60 mL的6 mM的维生素C溶液，搅拌均匀，在37 °C条件下100 r/min摇床上振荡反应12 h，然后将反应液转移到透析袋中在4°C条件下透析48 h。最后将经过透析后的纳米硒溶液，冷冻干燥分别得到刺梨多糖纳米硒颗粒（RP3-SeNPs）、纳米硒颗粒（SeNPs）。分别采用透射电镜(TEM)图、高分辨扫描电镜(SEM)、激光粒度分析仪、能谱分析图(EDS)和红外光谱（FT-IR）等对纳米硒的结构进行表征。

实施例3 刺梨多糖纳米硒溶液(SeNPs)的制备

浓度为2 mM的亚硒酸钠溶液10 mL与相同体积一定浓度的刺梨多糖溶液（0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）或蒸馏水相互混合，然后加入80 mL的8 mM的维生素C溶液，搅拌均匀，在37 °C条件下200 r/min摇床上振荡反应24 h，然后将反应液转移到透析袋中在4 °C条件下透析72 h。最后将经过透析后的纳米硒溶液，冷冻干燥分别得到刺梨多糖纳米硒颗粒（RP3-SeNPs）、纳米硒颗粒（SeNPs）。分别采用透射电镜(TEM)图、高分辨扫描电镜(SEM)、激光粒度分析仪、能谱分析图(EDS)和红外光谱（FT-IR）等对纳米硒的结构进行表征。

实施例4 刺梨多糖纳米硒溶液(SeNPs)的制备

浓度为3 mM的亚硒酸钠溶液10 mL与相同体积一定浓度的刺梨多糖溶液（0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）或蒸馏水相互混合，然后加入100 mL的10 mM的维生素C溶液，搅拌均匀，在37 °C条件下300 r/min摇床上振荡反应36 h，然后将反应液转移到透析袋中在4 °C条件下透析96 h。最后将经过透析后的纳米硒溶液，冷冻干燥分别得到刺梨多糖纳米硒颗粒（RP3-SeNPs）、纳米硒颗粒（SeNPs）。分别采用透射电镜(TEM)图、高分辨扫描电镜(SEM)、激光粒度分析仪、能谱分析图(EDS)和红外光谱（FT-IR）等对纳米硒的结构进行表征。

按以上实施例3制得的刺梨多糖通过以下方法进行结构鉴定和活性分析，实施例2和4的结果与实施例3相似。

本实施例考察了反应体系中不同浓度的刺梨多糖对反应体系中纳米硒颗粒粒径的影响。结果如图1a所示，本发明分别选用0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL的刺梨多糖溶液对纳米硒颗粒进行修饰。当刺梨多糖RTFP-3的浓度为0.25~2 mg/mL时，纳米硒的粒径逐渐降低；当刺梨多糖RTFP-3的浓度大于2 mg/mL时，纳米硒颗粒几乎不变。因此可以确定刺梨多糖修饰纳米硒颗粒的最佳浓度为2 mg/mL，此时纳米硒颗粒的平均粒径为104.5 nm。

如图1b所示，本实施例考察了不同浓度的刺梨多糖溶液制备的纳米硒溶液的储存稳定性，随着储存时间的增加，1 mg/mL刺梨多糖溶液制备的纳米硒溶液的粒径逐渐增加，然而2 mg/mL刺梨多糖溶液制备的纳米硒溶液的粒径基本不变，表明高浓度刺梨多糖溶液制备的纳米硒溶液的稳定性较好，可以长时间储存，有利于开发成药物长期保存。

图2a为纳米硒溶胶的透射电镜(TEM)图，表明无刺梨多糖溶液修饰的纳米硒容易团聚成堆状结构，存在刺梨多糖溶液修饰的纳米硒(见图2b)可以制成粒径均一，均匀分散的纳米硒颗粒。图2c的扫描电镜(SEM)图表明无多糖修饰的纳米硒颗粒聚集成蜂窝状结构，图2d表明经多糖修饰的纳米硒颗粒均匀分散在刺梨多糖的网络框架中。

如图3a所示，与原刺梨多糖相比，刺梨多糖纳米硒复合物的红外光谱图显示，-OH基团峰从3442 cm^-1红移到3456 cm^-1，C=O基团峰从1610 cm^-1红移到1635 cm^-1，C-O-C基团峰从1239 cm^-1红移到 1242 cm^-1，这些特征峰的红移表明Se原子与多糖之间形成了Se-O化学键。此外，紫外光谱(见图3b)显示刺梨多糖与刺梨多糖纳米硒复合物在198和278 cm^-1 处有相同的吸收峰，这些特征峰的存在表明刺梨多糖和纳米硒之间形成了共价结合。能谱分析结果表明，刺梨多糖（见图3c）结构中无硒元素，刺梨多糖纳米硒复合物（见图3d）中硒原子含量约为27.01%。

实施例3不同样品对DPPH自由基的抑制作用

精确称取一定量的刺梨多糖，纳米硒颗粒和刺梨多糖纳米硒颗粒，溶于蒸馏水中配成不同浓度的溶液（0.25-2.0 mg/m L）备用。取2 mL样品溶液加入2 mL DPPH工作液中（75 μM，50%的甲醇溶液配制），漩涡混合均匀，室温下避光反应30 min后于517 nm波长处测定吸光值，用蒸馏水代替样品作为空白对照，甲醇溶液代替DPPH溶液用作本底对照，以维生素C（VC）为阳性对照。DPPH自由基清除率按照如下公式计算：

DPPH自由基清除率（%）=[1-(A_样品-A_本底对照)/A_空白]× 100

图4a为RTFP-3、RP3-SeNPs和SeNPs对DPPH自由基抑制率的曲线图。结果所示在0.25-2.0 mg/mL浓度范围内RTFP-3和RP3-SeNPs对DPPH有较好的清除作用，且三种物质的抗氧化活性，随着浓度的升高而增强。在浓度为2 mg/mL时，RTFP-3、RP3-SeNPs和SeNPs对DPPH自由基的最大清除率分别为66.01 %， 56.29%和13.92%。其中RTFP-3对DPPH自由基有最强的清除作用，RP3-SeNPs次之，SeNPs展示最弱的清除DPPH活性。

实施例4 不同样品对ABTS自由基的抑制作用

ABTS 工作液由 5 mL ABTS 溶液（7 mM ）和 5 mL K₂S₂O₈溶液（2.45 mM）于室温下避光反应 12 h 后配制。使用前用磷酸缓冲钠盐溶液稀释到在 734 nm 处吸光值为 0.70± 0.02。然后，取 0.4 mL 不同浓度的样品溶液（0.25-2.0 mg/mL）加入到 4 mL 稀释的ABTS 工作液中，振荡 30 s 后避光反应 6 min，于 734 nm波长下检测吸光度值，以相同体积的蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，以相同体积的蒸馏水代替ABTS 工作液作为本底对照，以维生素 C（V_C）为阳性对照，ABTS 自由基清除率计算公式如下：

ABTS自由基清除率（%）=[1-(A_样品-A_本底对照)/A_空白]× 100

测试结果如图4b所示，RTFP-3、RP3-SeNPs和SeNPs对ABTS自由基的半数清除率（IC₅₀）分别为0.93 mg/mL，1.05 mg/mL和 >10 mg/mL。由此可知，纳米硒颗粒SeNPs显示极弱的清除ABTS自由基的能力，经刺梨多糖RTFP-3修饰后，刺梨多糖纳米硒复合物清除ABTS自由基的能力显著的提升。

实施例5 刺梨多糖氧化自由基吸收能力（ORAC）评价

所有样品溶液均由磷酸盐缓冲液（75 mM, pH 7.4）配制。于96孔酶标板中依次加入20 μL不同浓度（0.5-4.0 mg/mL）的RTFP-3, SeNPs和RP3-SeNPs溶液和200 μL荧光素钠盐溶液（95.6 nM），同时用磷酸盐缓冲液代替荧光素钠盐溶液作为对照组，用蒸馏水代替样品作为空白对照组。设定荧光/化学分析仪程序，37 °C避光孵育15 min，每孔迅速加入20 μL ABAP溶液（119.4 m M），自动混匀后，于激发波长485 nm和吸收波长535 nm，毎隔2 min记录一次，共循环70次，分别记录荧光强度f₁、f₂、f₃、······f₇₀，计算荧光淬灭的面积（AUC）值，公式如下：AUC = 2 × [1/2×(f₁ + f₃₅) + f₂+ f₃ + f₄+······+ f₇₀]。同时以不同浓度的Trolox标准溶液（6.25-100 μM）绘制标准曲线，样品的ORAC值表示毎克样品相当于Trolox当量（Trolox equivalent，TE）值，单位为µmol TE/g。

结果如4c所示，RTFP-3、RP3-SeNPs和SeNPs的ORAC值分别为105.65、79.94和5.33μmol TE/g。由ORAC值可知，与纯纳米硒颗粒相比，刺梨多糖纳米硒复合物的抗氧化性提高了14倍。

实施例6 刺梨多糖纳米硒颗粒对INS-1细胞的毒性

实验细胞：大鼠胰岛瘤细胞INS-1常规培养。培养细胞的培养基包括有10%的胎牛血清，2 mM的L-谷氨酰胺，1 mM的丙酮酸钠，50 μM的β-巯基乙醇， 100 units/mL的青霉素和100 units/mL的链霉素。细胞存活率的测定采用MTT方法。

细胞毒性测定:取对数生长期的INS-1细胞，用胰酶消化吹打细胞成单细胞悬液，750 r/min，离心5 min去除上清，培养基重悬细胞，用血细胞计数板计数后，调整细胞浓度按照6× 10⁴个的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养12 h，然后弃去培养液。每孔加入100 µL的含有不同浓度的RP3-SeNPs的细胞培养基，置于培养箱中继续培养24 h 后，往每孔中加入20 µL的MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h，然后吸去培养液，并用100 µL PBS洗涤1次，最后向每孔中加入100 µL的DMSO，振荡10 min后于570 nm波长下测定各孔的吸光值，按照下列公式计算细胞的存活率。实验设置空白组、实验组和对照组。空白组为不加细胞，加入100 µL培养基，实验组和对照组，每孔加入100 µL的细胞悬浮液，其中对照组未加样品。其中A_S为实验组的吸光度值，A_C是对照组的吸光度值，A₀是空白组的吸光度值。

细胞存活率（%）=(A_S-A₀)/(A_C-A₀)

按照逐渐递增的浓度梯度（0、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL）检测 RP3-SeNPs 对 INS-1细胞的毒性，结果（图 5a）显示在浓度达到4 μg/mL时，RP3-SeNPs的毒性发挥主要作用，开始促进细胞凋亡，细胞的存活率为79.1%，显著小于空白对照组；而 RP3-SeNPs 在0~2 µg/mL的浓度范围内，RP3-SeNPs几乎无细胞毒性。低浓度的RP3-SeNPs具有显著的促进细胞增殖活性，高浓度的RP3-SeNPs能够抑制细胞增殖，对细胞有毒性，故选择 RP3-SeNPs 浓度低于 2 µg/mL 进行后续实验。

实施例7 确定H₂O₂诱导INS-1细胞氧化损伤模型的最佳浓度

按照6×10⁴个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养12 h，然后弃去培养液。每孔加入100 µL的含有不同浓度的H₂O₂的细胞培养基，置于培养箱中继续培养12 h后，按照MTT方法计算细胞的存活率。

结果所示如图5b，随着H₂O₂浓度的升高，H₂O₂的细胞毒性越来越强，能显著抑制INS-1细胞的增殖。当H₂O₂的浓度为250 μM时，细胞的存活率为67.54%，可以作为合适的造模浓度。

实施例8 测定RP3-SeNPs对氧化损伤INS-1细胞的保护作用

测定RP3-SeNPs对INS-1细胞的保护作用。按照6×10⁴个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养12 h，然后弃去培养液。每孔加入100 µL的含有不同浓度的RP3-SeNPs细胞培养基，置于培养箱中继续培养24 h 后，然后弃去培养基。每孔加入100 µL的含有H₂O₂的细胞培养基，置于培养箱中继续培养12 h后，按照MTT方法计算细胞的存活率。

结果所示如图5c，将INS-1细胞先用RP3-SeNPs预处理24 h后，可以抑制H₂O₂诱导的细胞损伤。当RP3-SeNPs的浓度为2 µg/mL时，细胞的存活率为89.34%，是H₂O₂模型组细胞存活率的1.36倍，表明RP3-SeNPs可以保护胰岛细胞免受氧化损伤。

实施例9 测定INS-1细胞对刺梨多糖纳米硒的摄入情况

调整细胞浓度按照5× 10⁵个的密度接种于6孔细胞培养板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养12 h，然后弃去培养液。每孔中加入2 mL的含有不同浓度的RP3-SeNPs(0.5、 1和2 mg/mL) 的细胞培养基孵育24 h。分别在8、24 h时间点处收集细胞，用PBS缓冲液洗细胞3次，用ICP-AES测量细胞内硒的含量。

结果所示如图5d，INS-1细胞对刺梨多糖纳米硒的摄入量，随着孵育时间和多糖纳米硒浓度的升高，摄入量逐渐增加。当RP3-SeNPs浓度为0.5 µg/mL，孵育时间为24 h时，INS-1细胞内的硒浓度为5.68 mg/ 10⁸个细胞。当RP3-SeNPs浓度升高为2 µg/mL时，INS-1细胞摄入硒量提高了2.21倍。

实施例10 葡萄糖刺激胰岛瘤细胞INS-1的胰岛素分泌情况

调整细胞浓度按照6× 10⁵个的密度接种于6孔细胞培养板中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养12 h，然后弃去培养液。每孔加入2 mL不同浓度的RP3-SeNPs (0.5、1和2 µg/mL)的细胞培养基孵育24 h后，弃去培养基。除正常组外，每孔加入含有250 µM H₂O₂的细胞培养基孵育12 h后，然后分别用浓度为5.6 mmol/L和16.7 mmol/L的葡萄糖溶液（Hanks平衡盐溶液配制）孵育INS-1细胞30 min，用胰岛素酶联免疫试剂盒测定培养基中胰岛素的含量。

结果所示如图6，H₂O₂可以损伤INS-1细胞分泌胰岛素的功能，H₂O₂模型组与正常组相比，在5.6 mmol/L或者16.7 mmol/L葡萄糖刺激作用下，INS-1细胞分泌胰岛素的能力显著下降，表明H₂O₂可以诱导INS-1细胞氧化损伤，从而导致其胰岛素分泌功能受损。当INS-1细胞用不同浓度的RP3-SeNPs前处理后，结果发现RP3-SeNPs可以保护INS-1细胞的胰岛素分泌功能。其中用浓度为2 μM RP3-SeNP前处理INS-1细胞24 h，在较高浓度的葡萄糖（16.7mmol/L）刺激作用下，INS-1细胞分泌的胰岛素量是模型组的2.23倍。然而在较低浓度的葡萄糖（5.6 mmol/L）刺激作用下，用RP3-SeNP处理INS-1细胞后，其分泌胰岛素的量与模型组相比，无明显的差异。由以上的结果可知，RP3-SeNPs可以保护胰岛瘤细胞的胰岛素分泌功能。

Claims

1.一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2) 将步骤（1）所得反应液透析，干燥，即得到刺梨多糖功能化纳米硒复合物；

所述刺梨多糖溶液的浓度为0.25-4 mg/L；

步骤（1）所述亚硒酸钠溶液的浓度为1~3 mM，所述维生素C溶液的浓度为6~10 mM；

步骤（1）所述亚硒酸钠溶液与刺梨多糖溶液的体积比为1:1~1:3；

步骤（1）所述反应的温度为37 °C；

步骤（1）所述刺梨多糖为RTFP-3，所述RTFP-3的制备包括以下步骤：

（a）将刺梨鲜果清洗后在60 °C鼓风干燥箱中干燥、粉碎、过60目筛得刺梨干粉，按照所述刺梨干粉和95%乙醇配成固液比为1:6 g/mL的混合液，在70 °C条件下加热回流4 h，过滤得到残留物，所述加热回流和过滤重复3次，得脱脂后的刺梨干粉；

（b）将步骤（a）所述脱脂后的刺梨干粉放入45 °C的鼓风干燥箱中干燥48 h；将干燥后的刺梨干粉150 g，加入蒸馏水进行热水浸提，浸提温度95°C，时间3 h，以干燥后的刺梨干粉的质量g和蒸馏水的体积ml计，所述干燥后的刺梨干粉的质量和蒸馏水的体积比为1:30，所述热水浸提的提取次数为2次；离心力5000 g，离心10 min，收集上清液于55°C下旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，得到刺梨多糖的浓缩液；

（c）在步骤（b）所述刺梨多糖的浓缩液中加入Sevag试剂，所述Sevag试剂为氯仿：正丁醇=4:1，所述刺梨多糖的浓缩液与Sevag试剂的体积比为3:1，振荡30min，离心分离上层糖液，离心力5000 g，离心时间为10 min，振荡和离心过程重复操作12次以上，直至肉眼观察无蛋白残留，减压浓缩至原体积的1/3，得脱蛋白后的浓缩液；

（d）将步骤（c）所述脱蛋白后的浓缩液中加入大孔树脂AB-8，进行脱色处理，所述脱蛋白后的浓缩液与大孔树脂的体积比为6:1，温度37 °C，在摇床上振荡处理10 h，过滤得到滤液；脱色后的滤液中加入无水乙醇，使乙醇的体积浓度达到70%，4 °C下静置24 h，离心力5000 g，离心10 min得到下层的多糖沉淀，冷冻干燥48 h，得到水溶性刺梨粗多糖；

（e）将步骤（d）所述水溶性刺梨粗多糖用蒸馏水溶解，配制成终浓度为20 mg/mL的多糖溶液，上样于DEAE-Sepharose fast flow柱，上样量体积与柱体积比为1:4，用0.2 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min，每管收集5 mL；将收集后溶液浓缩透析48 h，然后进行真空冷冻干燥，得到纯化后的刺梨多糖RTFP-3。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述刺梨多糖溶液的浓度为0.25、0.5、1、2、3或4 mg/L。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述维生素C溶液的体积为亚硒酸钠溶液体积的5~10倍。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反应是在100~300转每分钟条件下反应12~36 h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述透析是将步骤（1）所得反应液转移到透析袋中，在水中透析，透析液经过ICP-MS检测无硒离子后停止透析；所述透析的温度为2~8 °C；所述干燥是冷冻干燥，干燥的温度为-20~-50 °C。

6.由权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物。

7.权利要求6所述的一种刺梨多糖功能化纳米硒复合物在制备降糖药物中的应用。