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CN109280709A - 一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用 Download PDF

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CN109280709A CN201710598893.8A CN201710598893A CN109280709A CN 109280709 A CN109280709 A CN 109280709A CN 201710598893 A CN201710598893 A CN 201710598893A CN 109280709 A CN109280709 A CN 109280709A
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Abstract

本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体公开了一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用，该标记从猪DLST基因中筛选得到，在SEQ ID NO.1所示序列的677位碱基处发生一个A/G碱基突变，导致DraI‑RFLP多态性，利用该SNP位点设计引物，分析该SNP标记与繁殖性状间相关性，发现了猪DLST基因内含子区内的SNP突变位点与左乳头数与总乳头数等繁殖性状显著相关；与体长等生长性状极显著相关。本发明为猪标记辅助选择提供了新的标记资源。

Description

一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用
技术领域
本发明涉及猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用。所述的遗传标记分离自DLST基因片段，本发明还包括所述的遗传标记在猪辅助选择关联分析中的应用。
背景技术
猪的育种工作指的是凡是能够从遗传结构上改进种猪和商品猪的品质、提高产品数量和质量的工作，其目的是不断改善和扩大现有良种、培育新品种、是猪群的重要经济性状得到遗传改良。而传统的育种主要依赖于表现型选择，无法了解其遗传背景。二十世纪后期，育种学家把对目标性状的改良逐步从表型选择理论转变到基因型选择理论，充分利用分子育种方法开展选育工作。如今，应用最为广泛的是分子标记辅助选择(molecularmarker-assisted selection，MAS)，在育种工作中越来越受到人们的重视。它是通过与重要生产性状座位连锁的DNA标记来评估动物个体的生产潜力，可以通过分子标记对基因型做直接选择，从而进行分子育种。分子标记辅助选择具有高准确性，可用于早期选种，缩短世代间隔，与常规育种相结合，可大大加快育种进程。
分子标记是指能反映动物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，目前已经出现的分子标记有十几种，例如RLFP、SSR、RAPD、SNPs等等。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)是第一代分子标记，将PCR与RFLP结合就形成PCR-RFLP技术，利用该技术方法可以实现对单核苷酸多态性进行基因型分析。其原理是在扩增不同个体同一段DNA序列时，由于单个碱基的突变从而引起限制性内切酶识别位点的得失，经电泳分离产生大小不同的条带，从而实现对基因型的分析。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指同一物种不同个体基因组DNA上的某个位点存在单个碱基的变化，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等现象。SNP是基因组中最普遍、频率最高的遗传标记，某些位于基因表达序列内的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，对于复杂表型性状与基因变异之间的关联分析具有重要意义。SNP易于实现自动化分析，被认为是继RFLP、微卫星标记之后的第三代分子标记，在遗传育种学研究中的应用前景十分广阔。
二氢硫代酰胺S-琥珀酰转移酶(dihydrolipoamide S-succinyltransferase，DLST)是α-酮戊二酸脱氢酶的结构核心蛋白，是其一个亚单位酶，参与复杂的柠檬酸循环。有研究发现DLST作为α-酮戊二酸脱氢酶复合物(KGDHC)中的转移酶，其在TCA循环中对能量产生和大分子合成至关重要。在本研究中，我们克隆了大白猪DLST基因序列，发现该基因在大白猪群体中存在一个SNP位点，首次发现该SNP位点与大白猪的乳头数和体长这两个性状差异显著。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种与猪生长和/或繁殖性状关联的SNP分子标记，该分子标记位于猪的基因组数据库Sscrofa11.1中的DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基，对应SEQ ID NO.1所示序列的第677个碱基，SEQ ID NO.1中的R为A或G，利用本领域的常规方式对该突变进行检测，可用于对猪的生长和/或繁殖性状进行关联分析。
本发明的另一个目的在于提供针对DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基设计的引物，引物为：正向引物F：5’-TCAAACATTTCCACTG-3’，反向引物R：5’-ATCCTCTTAGCACCAC-3’。
本发明的最后一个目的在于提供了DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基在猪生长和/或繁殖性状关联分析中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一个与猪生长和/或繁殖性状关联的SNP分子标记的获得：
申请人克隆获得了大白猪DLST基因包括第三、四内含子和第三外显子在内片段，所述片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO.1中的R为A或G，通过对上述序列在NCBI网站上进行blast比对，在该扩增片段内部发现一处核苷酸多态性(SNP)位点，所述位点为SEQ ID NO.1所示序列的第677碱基处的碱基发生的一个等位基因的A/G突变，SEQ IDNO.1中的R为A或G，该突变导致DraI-RFLP多态性，申请人将该突变位点命名为A677G。针对该位点利用本领域的常规方式进行检测，发现该位点与猪乳头数、体长性状的关系显著相关，为猪乳头数和体长性状的标记辅助选择提供有用的标记。
DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基在猪生长和/或繁殖性状关联分析中的应用，包括利用该位点筛选不同乳头数的猪和/或筛选不同体长的猪。
以上所述方案中，优选的，基于该位点设计引物为，正向引物F：5’-TCAAACATTTCCACTG-3’，反向引物R：5’-ATCCTCTTAGCACCAC-3’。
只要现有技术中，针对上述A677G位点突变设计的检测引物或是检测方法用于猪生长和/或繁殖性状关联分析的，均属于本发明的保护范围。
更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人首次在大白猪DLST基因序列中发现一个SNP位点与大白猪的乳头数和/或体长这两个性状显著相关，为大白猪的生长性相关的筛选工作提供了新方法。
附图说明
图1本发明对DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基突变DraI-RFLP的检测结果。
其中泳道：M为DL2000Maker；泳道3和泳道6为GG基因型，817bp，163bp；泳道3和泳道5为AA基因型，676bp，163bp，161bp；泳道1、泳道4和泳道6为AG基因型，817bp，676bp，163bp，161bp。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
猪DLST基因DNA片段的获得及SNP检测方法的建立
试验选择外国血缘猪种“大白猪”，根据猪的基因组数据库Sscrofa11.1中的DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基设计如下引物对，具体序列如下：
正向引物F：5’-TCAAACATTTCCACTG-3’，
反向引物R：5’-ATCCTCTTAGCACCAC-3’；
用上述引物对在“大白猪”基因组DNA中进行PCR扩增，扩增得到SEQ ID NO.1所示序列，该序列中的R为A或G。
PCR反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
PCR反应条件见表2所示。
表2 PCR反应条件
将所得的上述基因型猪种的PCR产物进行纯化和克隆后，进行序列测定，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经blast比对分析，发现在该序列中第677位碱基处存在一个A/G突变(转换)，该突变引起DraI酶切位点多态性。
取10ul PCR产物加入0.5ul限制性内切酶DraI(20U/ul)、2ul 10×buffer和7.5ulddH2O，37℃酶切1小时，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并记录酶切结果。当此突变处碱基都为A时存在酶切位点，酶切结果检测到三条带计为AA型(676bp+163bp+161bp)，当此突变处碱基都为G时不识别该位点，酶切结果检测到两条带计为GG型(817bp+163bp)，当A和G都存在时，酶切结果为四条带计为AG型(817bp+676bp+163bp+161bp)，具体如图1所示。
实施例2：
DLST基因(NC_010449.5)的第3509个碱基在猪生长和/或繁殖性状关联分析中的应用：
为了确定猪DLST基因内含子区域内的SNP与猪表型差异是否相关，选择大白猪(899头)为试验材料，样本采集及其数据收集于浙江开盛生态农业发展有限公司，采用常规DraI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪DLST基因内含子区内不同基因型与猪乳头数和体长性状的相关关系。采用SAS统计软件GLM程序进行单标记方差分析，模型如下：
Tijkl＝μ+Gi+Fj+Sk+Bl+eijkl
在上述模型公式中：Tijkl为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AG和GG基因型，显性效应用1代表GG和AA基因型，用-1代表AG基因型)；Fj、Sk、Bl为固定效应，分别为家系、性别、批次效应,eijkl为残差效应。
对大白猪DLST基因内含子区域A677G位点的多态性检测，在这两个群体中均检测到三种基因型，基因型频率及分布情况如表3所示。
表3大白猪DLST基因DraI-RFLP基因型频率和等位基因频率
注：表3括号外的为个体数，括号内的为基因型频率。
从表3中可以看出，A等位基因频率要明显大于G等位基因频率。
表4大白猪DLST基因A677G位点的多态性与生长、繁殖性状间的关联分析
数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著；上标﹡﹡表示P<0.01，﹡表示P<0.05。
注：上表中“±”前的数值表示平均数；“±”后的数值表示标准误。
从表4中可以看出DLST基因A677G位点多态性与法系大白猪的初生重、体长、左乳头数以及总乳头数存在显著的关联性，且具有明显的加性效应。其中GG基因型的总乳头数显著(P<0.05)高于AA基因型，而GG基因型的左乳头数和体长都极显著(P<0.01)高于AA基因型；AG基因型的初生重显著(P<0.05)高于GG基因型，AA基因型则高于AG和GG基因型，但没有达到显著水平；而背膘厚虽然并没有达到显著水平，但是G等位基因要优于A等位基因。从遗传稳定性和遗传进展方面来讲，GG基因型对于增加体长、乳头数性状具有明显优势。综合以上结果，该位点可作为增加大白猪体长及乳头数性状的潜在遗传标记。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用
<130> 一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaaacattt ccactgctcc tctgattagg ctgtgtcttc acaagataag ccatcatgtg 60
tttttcttaa gcttcagttg tatttgaaga cttgcagagt agaggcactt tattatgaaa 120
acatgtaggg ataatgagag tttatgaatt ttaaggtaaa taagatgata gaattctccc 180
ctttcttcct caaacacctt cccacccaca gtcccacata cctgttctct gccataacag 240
ttactttggt ggaaaagttt taagaagcag gactttctga taaagatgat attattgctt 300
gctgttgatc ctgctctatc tcagttaggg ggtgaacaga cgtcttttcc attcccagca 360
ggtatcctgt gtaagataaa gagttgttgg ttaagagttg ttttgtttct tgcagggatc 420
tccttatgtc agggaccagg ttaccctgac agcaggaaga ttgtgtaagt atcactgggg 480
agcatagata tgtggacacg gggtatttaa gacatcagtt tgactgtctg ctttcttcat 540
tgactttcaa acctagaaat cagactgttt gtgttgagtc cctagatcta accttgatgt 600
taattcatga catgtgcttg agctttagct ccatgttaag tgctggacca ggagtgtgcc 660
tgtcctcagg tgtttaRatt ataatgaagg tgaagctgga accctctttt tatgagaata 720
gatgtagtgg ggtgctccta aatattctgg ttggatacaa gtgaagctga aaagctggag 780
gttacattta ttgcggcgat taagagcatc tttttggttg catagttact ccctttaaaa 840
acagtaaaag caaagagtct tgctaattat aattctatta ttgcataatg caaggtttgg 900
agaaaggcca cccatgcgcg tttgaggtta acttctgctt atgagtgttg cttaatgcta 960
ctttgcattc caagtgtttt cagggtggtg ctaagaggat 1000
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcaaacattt ccactg 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcctcttag caccac 16

Claims (6)

1.猪的基因组数据库Sscrofa11.1中的DLST基因，NC_010449.5的第3509个碱基在猪生长和/或繁殖性状关联分析中的应用。
2.针对猪的基因组数据库Sscrofa11.1中的DLST基因，NC_010449.5的第3509个碱基设计的引物在猪生长和/或繁殖性状关联分析中的应用。
3.针对猪的基因组数据库Sscrofa11.1中的DLST基因，NC_010449.5的第3509个碱基的检测方法在猪生长和/或繁殖性状关联分析中的应用。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，所述的猪生长性状为体长。
5.根据权利要求1或2或3所述的应用，所述的繁殖性状为乳头数。
6.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为：正向引物F：5’-TCAAACATTTCCACTG-3’，反向引物R：5’-ATCCTCTTAGCACCAC-3’。
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