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CN109280647A - 一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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CN109280647A CN201811363303.4A CN201811363303A CN109280647A CN 109280647 A CN109280647 A CN 109280647A CN 201811363303 A CN201811363303 A CN 201811363303A CN 109280647 A CN109280647 A CN 109280647A
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Abstract

一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。由SS0713分泌产生的尼卡巴嗪单克隆抗体，用于食品安全检测中尼卡巴嗪残留的分析检测。此细胞株分泌的单克隆抗体，对尼卡巴嗪具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.05 ng/mL），可实现对鸡肉、鸡的肝脏和饲料中尼卡巴嗪残留量的检测，为食品中尼卡巴嗪残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
尼卡巴嗪（Nicarbazin，DNC）是一种饲料添加剂，驱虫保健剂，对各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，不易产生耐药性和交叉抗药性，排泄迅速，残留量极低。尼卡巴嗪对鸡盲肠球虫和堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、波氏艾美尔球虫均有良好的预防效果，具有高效、低毒、性能稳定、抗药性小等优点，与球虫酯联合用药效果更佳。尼卡巴嗪对球虫第二代裂殖体有效，推荐量不影响鸡对球虫产生免疫力，且安全性较高，高温季节慎用，产蛋期禁用。尼卡巴嗪的两种成分能分别由家禽消化道吸收，并广泛分布于组织及体液中。
尼卡巴嗪已被广泛应用于农业、畜禽和饲料等领域。因此尼卡巴嗪在动物组织、肌肉和饲料中一般都有一定的残留，而人体摄入尼卡巴嗪过多会对人类的肝肾等器官造成代谢负担，若在动物蛋白（鸡肉、鸡蛋、奶）中，有尼卡巴嗪残留，则有害于人体健康。
国家标准 GB/T 29691-2013 将尼卡巴嗪(DNC)作为允许使用的饲料添加剂，同时也规定了其最高允许使用限量（0.02mg/kg）和最高允许残留量（0.1mg/kg）。中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN0216-1993中也规定了出口禽肉中尼卡巴嗪的残留量标准，规定其允许残留量（0.03 mg/kg-1.20 mg/kg）。
但是这些标准都采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对DNC的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对尼卡巴嗪的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713及其应用，由该细胞株制备的抗体对尼卡巴嗪具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立尼卡巴嗪的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。
尼卡巴嗪单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.14691的尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713分泌产生。
所述尼卡巴嗪单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中尼卡巴嗪残留的分析检测。
本发明提供的尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713的制备基本步骤为：
（1）半抗原的衍生：
尼卡巴嗪原药为：
半抗原：用尼卡巴嗪原药衍生出氨基。
（2）完全抗原DNC-BSA的制备：称取4.38mg DNC衍生物，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL 1mol/L d的HCL进行酸化0.5h；再称取150mg 亚硝酸钠(DIA)，用500μL 纯水充分溶解后，加入5.56μL亚硝酸钠溶液到DNC衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1 h(称为A液)。取6mg BSA（DNC与牛血清白蛋白BSA摩尔比为60：1），用2mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液（CB, pH=9.0）溶解（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DNC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（3）小鼠的免疫：将完全抗原DNC-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg /只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713；
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
完全抗原DNC-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫用DNC完全抗原（25μg/只，不含佐剂）进行小鼠腹腔注射。取特异性高，IC50低的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆，得到一株高分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株SS0713分泌的单克隆抗体，对DNC具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.05ng/mL），可实现对鸡肉和鸡的肝脏、饲料中DNC残留量的检测，为食品中DNC残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。
附图说明
图1是尼卡巴嗪单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将尼卡巴嗪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对尼卡巴嗪具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株SS0713的制备
（1）完全抗原的合成 ：称取4.38mg DNC衍生物，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL 1mol/L HCL进行酸化0.5h；再称取150mg 亚硝酸钠(DIA)，用500μL 纯水充分溶解后，加入5.56μL亚硝酸钠溶液到DNC衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1 h(称为A液)。取6mg BSA（DNC与牛血清白蛋白（BSA）摩尔比为60：1），用2mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液（CB, pH=9.0）溶解（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DNC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（2）动物免疫：将完全抗原DNC-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 （1-4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800rpm，10min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/ 孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用尼卡巴嗪为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对尼卡巴嗪标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得尼卡巴嗪单克隆抗体细胞株SS0713。
实施例2 单克隆抗体的制备与鉴定
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 尼卡巴嗪杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
（1）包被：将包被原DNC-BSA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体尼卡巴嗪的IC50为：0.05ng/mL，说明对尼卡巴嗪有很好的灵敏度，可用于尼卡巴嗪免疫分析检测。
用ic-ELISA测定选取单克隆抗体尼卡巴嗪的工作点，根据工作点的抗原抗体浓度按梯度加标，然后用Origin软件作图得到尼卡巴嗪单克隆抗体的抑制标准曲线，具体如图1所示。

Claims (4)

1.一株尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.14691，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，分类命名单克隆细胞株。
2.尼卡巴嗪单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.14691的尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0713分泌产生。
3.权利要求2所述尼卡巴嗪单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中尼卡巴嗪残留的分析检测。
4.制备权利要求1所述细胞株SS0713采用的完全抗原的制备方法，其特征是步骤如下：
（1）半抗原的衍生：
尼卡巴嗪原药为：
半抗原：用尼卡巴嗪原药衍生出氨基；
（2）完全抗原DNC-BSA的制备：称取4.38mg DNC衍生物，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺DMF中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL HCL进行酸化0.5h；再称取150mg 亚硝酸钠，用500μL 纯水充分溶解后，加入5.56μL亚硝酸钠溶液到DNC衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1 h，称为A液；取6mg BSA，DNC与牛血清白蛋白BSA摩尔比为60：1，用2mL 0.01M、pH=9.0碳酸盐缓冲溶液溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DNC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
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