CN109207522B

CN109207522B - 表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物

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Publication number: CN109207522B
Application number: CN201810912585.2A
Authority: CN
Inventors: 高崧; 程清如; 高清清; 王小波; 郇长超; 刘秀梵
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2018-08-12
Filing date: 2018-08-12
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2038-08-12
Also published as: CN109207522A

Abstract

本发明属于疫苗制造技术领域。本发明公开了一种表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap，保藏号为CGMCC No.15691。本发明还公开了一种用于构建表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap的引物。本发明又公开了表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap的构建方法，包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK‑sPCV3；2、转移载体的构建；3、穿梭质粒的构建；4、重组杆状病毒的获得：将阳性穿梭质粒Bacmid‑ΔCap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap。本发明可以方便快捷的构建出表达PCV3截短Cap蛋白的重组杆状病毒，而且可以确定表达的截短Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。

Description

表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物

技术领域

本发明涉及表达猪圆环病毒3型(PCV3)截短Cap基因的重组杆状病毒的构建方法，用于制造疫苗。

背景技术

猪圆环病毒病(PCVD)是当前危害养猪业的重要疾病之一，其中PCV2是导致该类疾病的主要致病因子。2016年，Phan等学者又报道了新型猪圆环病毒PCV3，该病毒可造成猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪繁殖障碍呼吸系统疾病及消化系统炎症等疾病[Phan TG,Giannitti F,Rossow S,et al.Detection of a novel circovirus PCV3in pigs withcardiac and multi-systemic inflammation[J].Virology Journal,2016,13(1):184.]。通过PCV3全基因组遗传进化分析发现，PCV3与另外PCV1和PCV2两个基因型的病毒处于不同的进化分支，且PCV3各分离株之间也存在进化差异，是新型猪圆环病毒。自PCV3被报道以来，国内外多个地区均检测出该病毒，其危害正逐步受到重视。2017年初，何启盖等在我国首次检出PCV3。目前国内的PCV3毒株主要分为3a、3b和3c三种基因型，其中3a和美国PCV3参考毒株处于相同的进化分支[Fu X,Fang B,Ma J,et al.Insights into the epidemiccharacteristics and evolutionary history of the novel porcine circovirus type3in southern China[J].Transboundary and Emerging Diseases,2018,65(2):e296-e303.]。Stadejek等对波兰境内14个商品化猪场母猪、仔猪和育成猪的血清进行PCV3检测，首次证实PCV3感染在欧洲地区同样存在[Stadejek T,

niak A,

ek D,et al.Firstdetection of porcine circovirus type 3on commercial pig farms in Poland[J].Transboundary and Emerging Diseases,2017,64(5):1350-1353.]。为控制PCV3的进一步流行，亟需研究开发针对该病毒的商品化疫苗。

PCV3与PCV1、PCV2一样为无囊膜病毒，病毒粒子也呈二十面体结构，具有2kb的单链闭合环状负链DNA基因组，包含三个最主要的开放阅读框。ORF1编码参与病毒基因组复制的相关蛋白，而ORF2编码主导免疫原性的Cap核衣壳结构蛋白，是研制PCV3亚单位基因工程疫苗的理想靶基因[Nawagitgul P,Morozov I,Bolin S R,et al.Open reading frame 2of porcine circovirus type 2encodes a major capsid protein[J].Journal ofGeneral Virology,2000,81(Pt 9):2281-2287.]。PCV3ORF3编码由231个氨基酸组成的功能未知蛋白质。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性较低，仅为30％，此外，二者Cap蛋白的抗原表位也无任何相似性，暗示PCV3和PCV2毒株间的抗原交叉保护性可能很低，现有的PCV2疫苗已无法有效预防PCV3感染[湛洋,王东亮,王乃东,等.猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(6):1076-1084.]。研究发现，Cap蛋白N端富含精氨酸组成的核定位信号(NLS)，不含主要的抗原位点，容易使得表达的蛋白向细胞核转移，难以获得大量具有活性的Cap蛋白[Lou GG,Li XR,Li ZY,etal.Expression and antigenicity characterization for truncated capsid proteinof porcine circovirus type 2[J].The Canadian Journal of Veterinary Research,2011,75(1):61-64.]。然而全部缺失NLS则可能会影响外源蛋白的免疫原性，但缺失N端的NLS并不影响Cap在体外包装成病毒样颗粒[Zhang H,Qian P,Liu L,et al.Virus-likeparticles of chimeric recombinant Porcine circovirus type 2as antigen vehiclecarrying foreign epitopes[J].Viruses,2014,6(12):4839-4855.]。考虑到以上几点，在不影响其免疫原性基础上，为提高活性蛋白表达量，本研究通过设计一对引物用来扩增缺失NLS中34个氨基酸的截短Cap(ΔCap)，并引入Kozak序列，以期望进一步提高蛋白表达。

疫苗仍是目前防控PCVD的主要手段，因此，针对新型PCV3感染的疫苗自然会成为全世界研究的热点。不同于原核表达系统、酵母及哺乳动物细胞真核表达系统，杆状病毒表达系统作为真核表达系统之一拥有外源插入基因容量大、蛋白表达水平高、操作简便及翻译后加工修饰等诸多优点而广泛使用[Lin SY,Chen GY,Hu YC.Recent patents on thebaculovirus systems[J].Recent Patents on Biotechnology,2011,5(1):1-11.]。目前，关于PCV2亚单位疫苗的生产主要基于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，如英特威公司研制的Circumvent亚单位疫苗[Baech NM,Meng XJ.Efficacy and future prospects ofcommercially available and experimental vaccines against porcine circovirustype2(PCV2).Virus Res,2012(164):33-42.]。目前关于PCV3疫苗的报道较少，通过构建重组杆状病毒进行PCV3Cap蛋白的表达，可为开发PCV3亚单位疫苗奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白及其构建方法与引物，本研究通过筛选PCV3毒株，设计了扩增PCV3全长的引物；针对PCV3截短Cap基因设计特异引物，基于Bac-to-Bac系统，获得了表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白的重组杆状病毒。该方法可以方便快捷的构建出表达PCV3截短Cap蛋白的重组杆状病毒，而且可以确定表达的截短Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。

本发明的第一个目的是提供表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，该重组杆状病毒rBac-ΔCap于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，建议的分类命名为：表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，保藏号为CGMCC No.15691。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，参照GenBank上公布的PCV3序列与Cap基因全长序列独立自主设计，用于构建表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的引物，见表1；

表1引物及酶切位点

引物XhoI-3F的酶切位点为CTCGAG；

引物EcoR I-3R的酶切位点为GAATTC

引物ΔCap-F的酶切位点为GGATCC

引物ΔCap-R的酶切位点为AAGCTT。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案实现的，表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，PCV3毒株的筛选；扩增PCV3全长，用以保存PCV3基因组；表达PCV3型缺失NLS的截短Cap基因引物的设计；转移载体pFastBac^TMHT A-ΔCap的构建；穿梭质粒Bacmid-ΔCap的获得；重组杆状病毒rBac-ΔCap的获得；PCV3截短Cap蛋白的表达鉴定；电镜观察病毒样颗粒；小鼠免疫试验。最终得到可用于工业化生产的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap；

具体包括以下步骤：

1、构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：

以提取的PCV3DNA为模板，用权利要求1所述的引物Xho I-3F和引物EcoR I-3R扩增出PCV3全基因组，扩增参数：98℃预变性2min；98℃变性10s，59℃退火15s，72℃延伸2min30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min。将PCV3全基因组胶回收后与pBluescriptSK+载体同时用Xho I和EcoR I双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3；通过Xho I和EcoR I双酶切鉴定重组质粒，酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为2958bp和2000bp的条带；

2、转移载体的构建：

以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用权利要求1所述的引物ΔCap-F和引物ΔCap-R扩增PCV3Cap缺失NLS的截短Cap(ΔCap)，反应参数：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸55s，共30个循环；最后72℃再延伸3min。将PCR产物纯化后与转移载体pFastBac^TMHT A共同进行BamH I和Hind III的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应；Axygen质粒小量DNA提取试剂盒提取重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap，分别利用限制性内切酶BamH I和HindⅢ单酶切鉴定，以及BamH I-HindⅢ的双酶切鉴定；将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，BamH I和HindⅢ分别单酶切pFastBac^TMHT A-ΔCap质粒，得到5399bp单一条带；BamH I-HindⅢ双酶切重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap，得到4856bp和543bp两个条带；

3、穿梭质粒的构建：

将BamH I-HindⅢ双酶切得到4856bp和543bp两个条带的正确重组载体pFastBac^TMHTA-ΔCap转化进入DH10αBac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，参考Invirtogen公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书进行相应PCR鉴定，鉴定正确后抽提重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap；用引物pUC/M13扩增出2973bp条带；用引物pUC/M13F+ΔCapR扩增出2500bp目的条带；用引物ΔCap F+pUC/M13R扩增出1000bp目的条带；用引物ΔCap F/R扩增出543bp目的条带；

4、重组杆状病毒的获得：

将阳性穿梭质粒Bacmid-ΔCap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:

本发明通过PCR实现猪圆环病毒3型全基因组的扩增，然后进行常规的连接反应实现PCV3单拷贝的构建。同时，体用特异性引物获得PCV3去除核定位信号的截短Cap基因，使用杆状病毒表达系统成功实现并提高了表达，使得增殖后重组杆状病毒滴度可达10^8.3TCID₅₀/mL以上，反转录、SDS-PAGE及以Western Blot鉴定，证实表达效果良好，免疫小鼠试验发现可以刺激小鼠产生针对PCV3的特异性抗体，最终获得了完全适用于工厂化生产的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap。可作为基因工程亚单位疫苗使用，同时为深入研究PCV3病毒相关基因的功能与免疫机理奠定了物质基础。

附图说明

图1为包含PCV3全基因组单拷贝重组质粒pSK-sPCV3双酶切的电泳图。

图2为转移载体pFastBac^TMHT A-ΔCap酶切电泳图。

图3为穿梭载体Bacmid-ΔCap的PCR鉴定电泳图。

图4为提取重组杆状病毒rBac-ΔCap的PCR电泳图。

图5为提取重组杆状病毒rBac-ΔCap的总RNA电泳图。

图6为RT-PCR后PCR鉴定的电泳图。

图7-1为接种重组杆状病毒rBac-ΔCap的Sf9细胞的IFA图。

图7-2为接种野生型杆状病毒的Sf9细胞的IFA对照图。

图7-3为健康Sf9细胞的IFA对照图。

图8为表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白的SDS-PAGE鉴定图。

图9为表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白的Western Blot鉴定图(以His-tag小鼠单抗作为一抗)。

图10为表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白的Western Blot鉴定图(以小鼠抗PCV3阳性血清作为一抗)。

图11PCV3截短Cap VLPs观察透射电镜图。

图12试验小鼠抗体水平图。

具体实施方式

一、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建：

设计用于扩增的引物序列如下：

表2所需引物及酶切位点

注：下划线部分为各酶切位点

1、构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：

以提取的PCV3DNA为模板，用引物Xho I-3F和引物EcoR I-3R扩增出PCV3全基因组；将PCV3全基因组胶回收后与pBluescript SK(+)载体同时用Xho I和EcoR I双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3。通过XhoI和EcoR I双酶切鉴定重组质粒，酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为2958bp和2000bp左右的条带，如图1所示。图1中，M：DL5000 DNA Marker；1：Xho I酶和EcoR I酶双酶切pSK-sPCV3质粒获得2958bp与2000bp左右片段。

2、转移载体的构建：

以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用引物ΔCap-F和引物ΔCap-R扩增PCV3Cap缺失NLS的截短Cap(ΔCap)，将PCR产物纯化后与转移载体pFastBac^TMHT A共同进行BamH I和HindIII的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应。小量提取重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap，分别利用限制性内切酶BamH I和HindⅢ单酶切鉴定，以及BamH I-HindⅢ的双酶切鉴定。将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，BamH I和HindⅢ分别单酶切pFastBac^TMHTA-ΔCap质粒，可得到约5399bp单一条带。BamH I-HindⅢ双酶切重组质粒pFastBac^TMHTA-ΔCap，可得到4856bp和543bp两个条带，如图2所示。图2中，M：DL5000DNAMarker；1：BamH I酶酶切pFastBac^TMHT A-ΔCap质粒获得5399bp左右片段；2：HindⅢ酶酶切pFastBac^TM HT A-ΔCap质粒获得5399bp左右片段；3：BamH I酶与HindⅢ酶双酶切pFastBac^TMHT A-ΔCap质粒获得4856bp与543bp左右片段；

4、穿梭质粒的构建：

将BamH I-HindⅢ双酶切得到4856bp和543bp两个条带的正确重组载体pFastBac^TMHTA-ΔCap转化进入DH10αBac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，PCR鉴定正确后抽提重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap。用引物pUC/M13可以扩增出3000bp左右条带；用引物pUC/M13F+ΔCapR可以扩增出2500bp左右目的条带；用引物ΔCap F+pUC/M13R可以扩增出1000bp左右目的条带；用引物ΔCap F/R可以扩增出543bp左右目的条带。如图3所示。图3中，M：1kb DNA Marker；1：pUC/M13扩增野生型穿梭质粒Bacmid约300bp的产物；2：pUC/M13扩增重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap约2973bp的产物；3：M13F+ΔCapR扩增重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap约2500bp的产物；4：ΔCapF+M13R扩增重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap约1000bp的产物；5：ΔCapF+ΔCapR扩增重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap约543bp的产物；6:Negative control。

4、重组杆状病毒的获得：

鉴定：提取重组杆状病毒rBac-ΔCap的DNA，利用引物ΔCap F/R进行PCR鉴定，用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，如图4所示：M：DL5000DNA Marker；1：ΔCap F/R扩增rBac-ΔCap约543bp左右目的片段。

从图4可见：以DNA作为模板进行电泳鉴定PCR产物中有543bp左右大小的截短Cap目的条带，说明获得了重组杆状病毒rBac-ΔCap。

该重组杆状病毒rBac-ΔCap于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，建议的分类命名为：表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，保藏号为CGMCC No.15691。

二、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的生物学特性鉴定：

材料：重组杆状病毒rBac-ΔCap、健康Sf9细胞。

猪源抗PCV3阳性血清(自制血清)、鼠源抗PCV3阳性血清(自制血清)、商品化His-tag单克隆抗体。

1、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的cDNA检测

将F₂代的重组杆状病毒rBac-ΔCap分别接种健康Sf9细胞，72h后TRIzol裂解提取总RNA，如图5所示。去除基因组DNA后进行RT-PCR，再通过PCR检测目的基因转录情况，PCR方法检测到PCV3截短Cap基因特异性条带，如图6所示。

图5中，M：200bp DNA Marker；1：rBac-ΔCap总RNA。

图6中，M：200bp DNA Marker；1：rBac-ΔCap总RNA反转录后鉴定543bp条带。

2、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的间接免疫荧光(IFA)检测

以猪源抗PCV3阳性血清作为一抗，FITC荧光标记的羊抗猪IgG为二抗，在荧光显微镜下观察到，经接种表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的Sf9细胞中出现了明显的特异荧光(如图7-1所示)；而接种野生型杆状病毒(如图7-2所示)与正常对照细胞(如图7-3所示)中则未出现荧光，可见感染表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的细胞能够高效表达PCV3截短Cap蛋白。

2、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的SDS-PAGE检测：

待F2代重组杆状病毒rBac-ΔCap接种Sf9细胞96h后，收集蛋白样品煮沸后用于SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色后进行观察。可见在预期大小位置出现目的条带(图8)，可见大小约为25kD的目的蛋白条带。

3、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的Western Blot鉴定

分别用His-tag小鼠单抗(图9)和抗PCV3小鼠阳性血清(图10)进行Western Blot鉴定，去除核定位信号的截短ΔCap蛋白同PCV3全长Cap一样，与SDS-PAGE中的目的条带位置相符，说明目的蛋白得到成功表达。

4、表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的TCID₅₀测定

将长势良好的Sf9细胞，分装96孔板，用Grace培养基将表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒液进行10倍倍比稀释(10^-1～10^-10稀释)。接种96孔板后于37℃、5％CO₂培养箱中吸附1.5小时后继续培养96h。弃去培养液，PBS清洗，拍干后冷甲醇-20固定20min，弃去固定液，PBS洗3遍，每次5min，吸水纸上拍干。加入用PBS稀释的猪源PCV3阳性血清(1:500)50μL/孔，37℃孵育1h，PBS同上洗涤，拍干。避光加入30μL的1:200稀释的FITC标记的羊抗猪荧光二抗(IgG)，避光孵育45min，PBS同上洗涤，拍干。进行间接免疫荧光(IFA)观察，病毒TCID₅₀按Reed-Muench二氏法计算。

经检测，表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒的TCID₅₀为10^8.3/mL以上，满足制备疫苗的要求。

5、透射电镜观察

将接种重组杆状病毒的Sf9细胞及培养物反复冻融3次，于4℃，4000rpm离心20min去除细胞碎片。将病毒液加于蔗糖垫上，4℃，超高速离心后，适量PBS悬浮沉淀。滴加一滴重悬液于铜网上，2％磷钨酸进行负染。吸取多余染液并烘干，透射电镜观察病毒样颗粒形成情况，如图11所示：磷钨酸负染后于透射电镜下观察到形态均一的病毒样颗粒，呈圆形，直径约20nm。

6、动物免疫试验

6周龄BALB/c小鼠20只随机分为4组，其中，组1注射灭活的rBac-ΔCap(10^6.5TCID₅₀/只)、组2注射灭活的rBac-ΔCap(10^7.5TCID₅₀/只)，组3和组4分别注射灭活的野生型杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清和PBS，各组均与等量的弗氏完全佐剂完全乳化后进行首次免疫，两周后与不完全弗氏佐剂乳化后进行二次加强免疫。免疫前和首次免疫后每周眶下窦采血，分离并保存血清。

将原核表达的PCV3去除核定位信号的Cap蛋白包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜包被，PBST洗3次，6min/次，吸水纸上拍干；每孔加入200μL封闭液，37℃封闭3h；再次洗板3次后，加入经PBS适当倍比稀释的小鼠血清，100μL/孔，37℃，孵育1h，同时用小鼠PCV3阳性血清作阳性对照；用含4％FBS的PBS按1:8000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，100μL/孔，37℃，孵育1h；每孔加入200μL TMB显色液，37℃显色15min；于各个孔中加入50μL终止液终止反应，随后用酶标仪在450nm处测定吸光度。

间接ELISA检测PCV3特异性抗体水平结果如图12所示：首免后第二周即可检测到PCV3特异性抗体产生，第三周抗体水平迅速上升，第四周抗体继续上升，高剂量免疫组效价均可达到1:4500左右。

<110>扬州大学

<120>表达猪圆环病毒3 型截短Cap 蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物

<160>6

SEQ ID NO.1

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TTTCTCGAGA TTGGCGAAGA TTCCTCTTCG GGTA 34

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CCGGAATTCG TAATCCCCCT CTTTCTTGCA ATA 33

SEQ ID NO.3

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TTTGGATCCC GCCACCATGG CTGGCACATA 30

SEQ ID NO.4

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CCCAAGCTTT TAGAGAACGG ACTTGTAACG AATCC 35

SEQ ID NO.5

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GTTTTCCCAG TCACGAC 17

SEQ ID NO.6

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

CAGGAAACAG CTATGAC 17

Claims

1.表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，保藏号为CGMCCNo.15691。

2.权利要求1所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，所述构建方法包括以下步骤：

（1）构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：

以提取的PCV3 DNA为模板，用引物XhoI-3F和引物EcoR I-3R扩增出PCV3全基因组；将PCV3全基因组胶回收后与pBluescript SK+载体同时用XhoI和EcoR I双酶切，将两种酶切产物纯化回收后进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3；

（2）转移载体的构建：

以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用引物ΔCap-F和引物ΔCap-R扩增PCV3Cap缺失NLS的截短Cap，即ΔCap，将PCR产物纯化后与转移载体pFastBac^TMHT A共同进行BamH I和HindIII的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应，获得重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap；提取重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap，分别利用限制性内切酶BamH I 和HindⅢ单酶切鉴定，以及BamH I-HindⅢ的双酶切鉴定；将酶切产物用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，BamH I和HindⅢ分别单酶切pFastBac^TMHT A-ΔCap质粒，得到5399 bp单一条带；BamH I-HindⅢ双酶切重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap，得到4856 bp和543 bp两个条带；

（3）穿梭质粒的构建：

将BamH I-HindⅢ双酶切得到4856 bp和543 bp两个条带的正确重组载体pFastBac^TMHTA-ΔCap转化进入DH10αBac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，PCR鉴定正确后抽提重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap；用引物pUC/M13扩增出2430 bp加上插入目的片段大小的条带，即2973 bp条带；根据PCR鉴定重组Bacmid DNA模式图，推测计算pUC/M13上下游引物与目的片段上下游引物组合使用所扩增条带大小可知，用引物pUC/M13 F+ΔCapR扩增出2500 bp目的条带；同理，用引物ΔCap F+pUC/M13 R扩增出1000 bp目的条带；用引物ΔCapF/R扩增出543 bp目的条带；

（4）重组杆状病毒的获得：

将鉴定正确的重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap；

用于构建表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的引物如下：

引物XhoI-3F，引物序列为5’-TTTCTCGAGATTGGCGAAGATTCCTCTTCGGGTA-3’；

引物EcoR I-3R，引物序列为5’-CCGGAATTCGTAATCCCCCTCTTTCTTGCAATA-3’；

引物ΔCap-F，引物序列为5’-TTTGGATCCCGCCACCATGGCTGGCACATA-3’；

引物ΔCap-R，引物序列为5’-CCCAAGCTTTTAGAGAACGGACTTGTAACGAATCC-3’

引物pUC/ M13F，引物序列为5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；

引物pUC/ M13R引物序列为5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；

引物XhoI-3F的酶切位点为CTCGAG；

引物EcoR I-3R的酶切位点为GAATTC；

引物ΔCap-F的酶切位点为GGATCC；

引物ΔCap-R的酶切位点为AAGCTT。

3.根据权利要求2所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，所述PCV3全基因组扩增参数：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，59℃退火15 s，72℃延伸2 min 30 s，共30个循环；最后72℃再延伸10 min。

4.根据权利要求2所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，所述PCV3全基因组胶回收后与pBluescript SK+载体同时用XhoI和EcoR I双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接。

5.根据权利要求2所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，通过XhoI和EcoR I双酶切鉴定重组质粒pSK-sPCV3，酶切产物用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为2958 bp和2000 bp的条带。

6.根据权利要求2所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，扩增PCV3Cap缺失NLS的截短Cap的反应参数：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸55 s，共30个循环；最后72℃再延伸3 min。

7.根据权利要求2所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，提取重组质粒pFastBac^TMHT A-ΔCap通过Axygen质粒小量DNA提取试剂盒进行。

8.根据权利要求2所述的表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，所述PCR鉴定正确后抽提重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap中的PCR鉴定程序参考Invirtogen公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书进行。