CN109207407B - 一株海研站菌k4-1及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株海研站菌Mesonia sp.K4‑1及其应用。所述Mesoniasp.K4‑1菌株已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2018482。本发明的海研站菌Mesonia sp.K4‑1是一株具有耐盐特性的菌株，能够产耐盐胞外蛋白酶，经测定，该菌培养96h后，胞外蛋白酶活性达527.42U/mL，且该菌株高产胞外多糖，其胞外多糖在维持蛋白酶热稳定性中具有广泛应用前景。

Description

一株海研站菌K4-1及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株海洋来源的海研站菌Mesonia sp.K4-1及应用。

背景技术

海洋占地球表面积的71％，其区域环境复杂多变，高盐、高压、低温等特殊区域生态环境使海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上具有多样性。海洋微生物作为其中的重要的生物资源，种类丰富，数量庞大，在长期适应特殊的生活环境过程中具备独特生理生化功能或遗传体系，并可产生新的功能活性物质，如多肽、胞外多糖、蒽醌类衍生物。目前已经鉴定和研究出的海洋微生物尚不足其生物总量的5％，已发现的活性物质就更少，仅占总数的1％左右。海洋微生物与陆生生物存在着一定的差异，是发现新材料，新机制，新功能的重要来源，为进一步微生物资源的开发利用奠定基础。

微生物蛋白酶以其易于大规模发酵和纯化等特点被人们视为工业蛋白酶的重要来源。在酱油发酵、泡菜腌制、鱼露风味形成等食品加工领域或污水处理、生物降解、皮革脱毛等工业领域都发挥着重要作用，但上述生产中的高盐环境成为限制蛋白酶应用的关键因素。比如我国制革所用原料在投产前需要用盐腌渍做预处理，蛋白酶活力的高低与在高盐环境下的稳定性直接影响并决定成品制革的质量。再如，鱼类加工工业生产中60％以上的副产品，如头部，皮肤，饰边，鳍，框架，内脏和粪便作为废物，而只有40％的产品部分适合人类食用。这种剩余的鱼类废物在全世界范围内造成环境污染威胁。然而，这些鱼类废弃物含有大量的蛋白质物质，可以转化为动物饲料，鱼粉和肥料等增值产品。此外，在豆制品发酵产生豆豉以及酱油的酿造过程中，其盐浓度通常极高。因此选育耐盐且高产蛋白酶的菌株显得尤为重要。利用海洋的高盐环境，选育噬盐性或耐盐性的菌株，利用其高产蛋白酶和在高盐环境下酶活较稳定的特点，满足工业化生产要求，提高经济效益。

细菌胞外多糖是细菌的次级代谢产物，其种类繁多。作为一种新型发酵产品，已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、悬浮剂和润滑剂等应用于石油、化工、食品、制药、环保和化妆品等多个领域。对于海洋微生物分泌的胞外多糖国内外已经有一些研究，但总体来看开发利用程度仍然很低，因此筛选营养要求低，多糖产量高，具独特性质的又适合工业化大规模发酵生产多糖具有十分重要的意义。制备并研究深海来源细菌所产胞外多糖的特征及性质，能进一步挖掘深海微生物胞外多糖的应用潜能，满足对海洋自然资源开发的迫切需要。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株海洋来源的海研站菌。该菌株营养要求低，耐盐且高产蛋白酶和多糖，应用前景非常广阔。

本发明的海研站菌(Mesoniasp.K4-1)，保藏编号为CCTCC No.M 2018482。该菌株分离自北极深海。该菌在2216E平板上培养96h后的菌落呈的菌落呈黄色，圆形，表面光滑半透明，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，无芽孢。海研站菌K4-1经生理生化测定，氧化酶试验为阴性，接触酶试验为阳性，卵磷脂酶实验为阴性，能水解明胶、酪蛋白，甲基红试验为阴性，V-P试验为阴性，H₂S实验为阳性，硝酸盐还原测定为阴性。

综合16S rDNA序列分析、生理生化特性分析，表明本发明属于海研站菌，命名为海研站菌Mesonia sp.K4-1，所述Mesonia sp.K4-1菌株已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2018482。

本发明的菌株是一株耐盐菌株。能够适应工业化生产时的高盐环境，应用潜力非常大。

本发明的目的之二是提供所述的海研站菌在产胞外蛋白酶上的应用。

进一步的，所述的海研站菌用于产耐盐胞外蛋白酶。

进一步的，所述的所述的胞外蛋白酶用于催化酪蛋白水解。

本发明的目的之三是提供所述的海研站菌在产胞外多糖上的应用。

进一步的，所述的胞外多糖用于维持酶热稳定性，特别是蛋白酶热稳定性。

进一步的，所述的胞外多糖用于维持胰蛋白酶热稳定性。

进一步的，所述的胞外多糖在不超过50℃的条件下，用于维持胰蛋白酶稳定性。

本发明的海研站菌，分类命名为Mesoniasp.K4-1，所述Mesonia sp.K4-1菌株已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2018482。

本发明菌株能够产胞外蛋白酶，具有水解蛋白的功能。经测定，该菌培养96h后，蛋白酶活性达527.42U/mL，其蛋白酶在高盐和低盐环境中均有较高活性，对海洋来源蛋白酶的研究和在工业化生产中的应用具有重要价值。而且该菌株能够高产胞外多糖，且在保护蛋白酶热稳定性中具有明显作用。

附图说明

图1.海研站菌Mesonia sp.K4-1的扫描电镜照片(100000倍)；

图2.海研站菌Mesonia sp.K4-1及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树；

图3.在不同盐度下海研站菌Mesonia sp.K4-1的生长曲线；

图4.发酵培养不同时间的海研站菌Mesonia sp.K4-1产胞外蛋白酶活性；

图5.不同盐浓度条件下海研站菌Mesonia sp.K4-1蛋白酶的酶活力；

图6.海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外蛋白酶的耐盐稳定性；

图7.发酵培养不同时间的海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外多糖产量；

图8.海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外多糖对K4-1胞外蛋白酶在50℃孵育的热稳定性保护；

图9.海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外多糖对胰蛋白酶在40℃孵育的热稳定性保护；

图10.海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外多糖对胰蛋白酶在50℃孵育的热稳定性保护。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1海洋细菌K4-1的分离样品的处理：称取保存于4℃的沉积物样品10g，置于100ml灭过菌的人工海水锥形瓶中，制备成质量分数为10％的样品悬液，在180rpm转速下振荡30min静置30s，将悬浮液进行梯度稀释，稀释倍数分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，从稀释倍数10^-5，10^-6，10^-7的液体中分别取200μl在2216E固体培养基平板上涂布，每个稀释倍数设置三个重复，然后置于16℃恒温箱中静置培养。待各个菌落长好后，反复平板划线，分离纯化，最终得到菌株K4-1。

实施例2菌株K4-1生物学性状及生理生化和分子鉴定

S1.形态特征：菌株K4-1在扫描电镜下的形态见图1，该菌株在2216E固体培养基平板培养96h菌落形态为：菌落呈黄色，圆形，表面光滑半透明，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，无芽孢。

S2.生理生化特征：本发明的菌株K4-1经生理生化测定，氧化酶试验为阴性，接触酶试验为阳性，卵磷脂酶实验为阴性，能水解明胶、酪蛋白，甲基红试验为阴性，V-P试验为阴性，H₂S实验为阳性，硝酸盐还原测定为阴性。

见表1。

表1海研站菌K4-1生理生化特征

注：+，阳性；－，阴性；Y，黄色；R，杆状

S3.菌株K4-1的16S rDNA的序列测定与分析

S31.PCR模板DNA的快速制备：将菌株K4-1划线接种在2216E培养基的平板上，16℃培养过夜。取单一菌落悬浮于10mL ddH₂O中，沸水浴加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA。

S32.16S rDNA基因PCR扩增

PCR引物由华大基因合成。

Primer A：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，其序列如SEQ ID NO:1所示，

Primer B：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，其序列如SEQ ID NO:2所示。

PCR反应体系如下：

10×PCR buffer 2mmol/L d NTP	5μL
		Primer A	5μL
Primer B	1μM
		5U/μLTaq DNA Polymerase	1μM
25mM MgCl<sub>2</sub>	1.25U
		Template DNA	4mM
Water，nuclease-free to	0.5μg
		10×PCR buffer 2mmol/L d NTP	50μL

PCR扩增条件：95℃ 3min，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 90s，30个循环；72℃10min。

序列测定：PCR产物纯化后，送华大基因测序。该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA序列，构建系统发育树，见图2。经比较分析发现，本发明的海研站菌K4-1与菌株Mesonia algae KMM 3909(NR025263.1)近，菌株K4-1的16S rDNA序列与Mesonia algae KMM 3909(NR 025263.1)有99％的同源性。

综合16S rDNA序列分析、生理生化特性分析，表明本发明属于海研站菌，命名为海研站菌Mesonia sp.K4-1，所述Mesonia sp.K4-1菌株已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2018482。

实施例3在不同盐度下海研站菌Mesonia sp.K4-1的生长曲线

从平板上挑取单菌落接入2216E培养基中，于16℃，200rpm摇床中培养过夜后，配制含有不同NaCl盐度的2216E培养基，使培养基中的NaCl的终浓度为3％，7％，12％，13％，14％，15％。按1％接种量将菌液接种于100mL含不同NaCl盐度的2216E培养基中，在不同时间取样，测定OD₆₀₀的数值，绘制生长曲线(见图3)。根据海研站菌K4-1生长曲线显示其在0％～14％的盐浓度下均可生长，具有一定的耐盐特征。

2216E液体培养基(g/100mL)：蛋白胨0.5g，酵母0.1g，Fe₂(PO₄)₃ 0.001g，人工海水100mL，pH 7.8。

实施例4海研站菌Mesonia sp.K4-1产胞外蛋白酶活力测定

将菌株海研站菌K4-1接种于2216E液体培养基，16℃，200rpm培养24h，按2％接种量接种发酵培养基，16℃，200rpm振荡培养120h，每隔24h取发酵液，8000rpm离心除菌体，上清即为粗酶液，Folin-酚法测定发酵培养不同时间的海研站菌K4-1蛋白酶活力(张树政，1998)：用20mM Tris-HCl pH 8.5将酶液稀释合适的倍数，取200μL稀释好的酶液，在40℃下保温2min，加入同样温度的200μL2％酪蛋白，40℃反应10min，加入400μL 0.4M的三氯乙酸终止反应，9000×g离心10min，取30μL上清液加入150μL0.4 M的碳酸钠，混匀后加入30μLFolin-酚试剂，混匀后反应20min，在660nm波长下测定吸光度，标准曲线用不同浓度的酪氨酸来制定。

酶活力单位定义：

在40℃，每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的所需酶量定义为1个活性单位(U)。测试结果发现，海研站菌K4-1培养96h后蛋白酶活力可以达到527.42U/mL，见图4。

发酵培养基(g/100mL)：豆粕2g，蔗糖2g，Na₂HPO₄ 0.1g，KH₂PO₄ 0.03g，CaCl₂ 0.1g，Na₂CO₃ 0.1g，人工海水100mL，pH 7.8。

实施例5海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外蛋白酶的最适反应NaCl浓度以及耐盐稳定性

S1.海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外蛋白酶的最适反应NaCl浓度

向K4-1粗酶液中慢慢加入(NH₄)₂SO₄粉末至浓度达到40％，4℃过夜沉淀。10000rpm离心30min，收集沉淀，向所得沉淀加入适量20mM、pH 8.5的Tris-HCl溶液进行重溶，所得溶液注入透析袋内，用上述缓冲液过夜透析。

将菌株K4-1的胞外蛋白酶液分别置于NaCl浓度为0.25M、0.5M、0.75M、1.5M、2.5M、3.75M、4M、4.5M的Tris-HCl缓冲液中，在最适pH值，最适温度下进行反应。Folin-酚法测定不同盐浓度条件下蛋白酶的酶活力，以未处理酶液作为对照，计算其酶活的相对值，见图5。K4-1胞外蛋白酶在含有0.75M的NaCl缓冲液中具有较高酶活性。在2.5M的NaCl缓冲液中仍能具有100％酶活力，表明K4-1在高盐和低盐反应条件下均有其酶活性。

S2.海研站菌Mesonia sp.K4-1胞外蛋白酶的耐盐稳定性

将菌株K4-1胞外蛋白酶液，分别置于NaCl浓度为1M、2M、3M、4M的Tris-HCl缓冲液中，4℃冰箱中放置20min、40min、60min、120min、180min，用Folin-酚法测定不同盐浓度条件下蛋白酶的酶活力，分别以未处理酶液作为对照，计算其酶活的相对值，见图6。测定结果显示，随着温育时间增加，酶活性缓慢降低，表明K4-1胞外蛋白酶具有一定的耐盐特征。

实施例6海研站菌Mesoniasp.K4-1胞外多糖产量的测定

将菌株海研站菌K4-1接种于2216E液体培养基，15℃，200rpm培养24h，按2％接种量接种发酵培养基，15℃，200rpm振荡培养120h，每隔24h取发酵液，8000rpm离心除菌体，上清液与两倍体积的预冷无水乙醇的混匀，玻璃棒搅动至出现絮状沉淀，在4℃静置8-10h后10000rpm，离心10min去除上清液，为了去除低分子量的杂质，用无水乙醇反复洗两次并离心，沉淀以蒸馏水复溶，透析2-3天后烘干，制得胞外多糖。苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量，见图7。

实施例7海研站菌Mesoniasp.K4-1胞外多糖对胰蛋白酶热稳定性的影响

将海研站菌Mesoniasp.K4-1胞外蛋白酶与浓度为3mg/ml海研站菌K4-1胞外多糖等比例混合，将酶液分别在40℃保温10min、20min、40min、60min、90min、120min，以未处理酶液作为对照，Folin-酚法检测残余酶活力，以分析K4-1胞外多糖对K4-1胞外蛋白酶的热稳定性的影响，见图8。

测试结果发现，海研站菌K4-1胞外多糖可以提高K4-1胞外蛋白酶的热稳定性。没有加入多糖的蛋白酶溶液酶活损失很快，60min酶活降低到50％，加入胞外多糖的蛋白酶在温育120min后仍能保持50％的酶活力，海研站菌K4-1所分泌的胞外多糖对自身所分泌的具有耐盐性的胞外蛋白酶活性存在一定的保护作用。

实施例8海研站菌Mesoniasp.K4-1胞外多糖对胰蛋白酶热稳定性的影响

将5mg/ml胰蛋白酶液与3mg/ml胞外多糖等比例混合，将酶液分别在40℃、50℃保温10min、20min、40min、60min、90min、120min，以未处理酶液作为对照，Folin-酚法检测残余酶活力，以分析不同处理对胰蛋白酶的热稳定性的影响，见图9，图10。

测试结果发现，在40℃120 min作用时间内，加入胞外多糖后胰蛋白酶酶活没有明显的下降，而没有加入多糖的蛋白酶溶液酶活损失很快，60min酶活降低到50％，120min后酶活已经损失80％。在50℃ 120min作用时间内，没有加入多糖的蛋白酶约120min后酶活基本已经完全丧失，但是加入胞外多糖后的蛋白酶其酶活力损失速度明显要低于没有加入多糖的蛋白酶液。由此结果说明，胞外多糖确实可以在一定温度下保持一定时间的蛋白酶活力，从而降低胰蛋白酶的热不稳定性，为热不稳定性蛋白酶的应用提供了很好的保护作用。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一株海研站菌K4-1及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

acggctacct tgttacgact t 21

Claims (11)

1.一株海研站菌(Mesonia sp.)K4-1，保藏编号为CCTCC No.M 2018482。

2.根据权利要求1所述的海研站菌，其特征在于，氧化酶试验为阴性，接触酶试验为阳性，卵磷脂酶实验为阴性，能水解明胶、酪蛋白，甲基红试验为阴性，V-P试验为阴性，H₂S实验为阳性，硝酸盐还原测定为阴性。

3.根据权利要求1所述的海研站菌，其特征在于，是一株耐盐菌株。

4.权利要求1或2或3所述的海研站菌的应用，其特征在于，用于产胞外蛋白酶。

5.根据权利要求4所述的海研站菌的应用，其特征在于，用于产耐盐胞外蛋白酶。

6.根据权利要求4所述的海研站菌的应用，其特征在于，所述的胞外蛋白酶用于催化酪蛋白水解。

7.权利要求1或2或3所述的海研站菌的应用，其特征在于，用于产胞外多糖。

8.根据权利要求7所述的海研站菌的应用，其特征在于，所述的胞外多糖用于维持酶热稳定性。

9.根据权利要求8所述的海研站菌的应用，其特征在于，所述的胞外多糖用于维持蛋白酶热稳定性。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的胞外多糖用于维持胰蛋白酶热稳定性。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的胞外多糖在不超过50℃的条件下，用于维持胰蛋白酶稳定性。

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