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CN109182491B - 一种人类白细胞hla-b*27基因分型引物组及应用 - Google Patents

一种人类白细胞hla-b*27基因分型引物组及应用 Download PDF

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CN109182491B
CN109182491B CN201811025330.0A CN201811025330A CN109182491B CN 109182491 B CN109182491 B CN 109182491B CN 201811025330 A CN201811025330 A CN 201811025330A CN 109182491 B CN109182491 B CN 109182491B
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hla
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吴明磊
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Jiangsu Zojiwat Biomedical Co ltd
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Jiangsu Zojiwat Biomedical Co ltd
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种人类白细胞HLA‑B*27基因分型引物组，包括分别检测血型A,A205，B和O(261G缺失)，O1，O2的等位基因引物对AR和AF；A2R和A2F；BR和BF；0TR和OTF；O1R和O1F；O2R和O2F及内参引物对；本发明设计的等位基因引物组动力高，特异性强，同时根据人类白蛋白基因的保守片段设计内参引物对内参1R和内参1F与内参2R和内参2F，每个检测孔内等位基因引物对的对数为2～4对，并同时含有2对内参，确保PCR扩增质量与正确性，进而确保了试验结果的可靠性。

Description

一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组及应用
技术领域
本发明涉及基因诊断制品技术领域，具体为一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组及应用。
背景技术
HLA(human leukocyte antigen)，即人类白细胞抗原是人体重要的免疫遗传体系，也是目前所知人体最复杂的多态系统。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，这是器官移植产生排异反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。HLA有I类、II类、III类基因，HLA-B*是I 类HLA基因的三个位点(HLA-A*,HLA-B*,HLA-C*)之一。而HLA-B27基因即人类HLA-I类分子B位点上的等位基因，位于第6号染色体短竹上，由8个外显子和7个内含子组织，编码分子质量为43KD的糖蛋白。该基因主要表达在机体所有的有核细胞表面，尤其是淋巴细胞表面有丰富的含量。
强直性脊椎炎(Ankylosing Spondylitis AS)是以散韶关节和脊柱附着点炎症为主要症状的疾病。该病以脊柱为主要病变部位的慢性病，累及K关节，引起脊柱强直和纤维化，造成不同程度眼、肺、肌肉、骨骼病变，属自身免疫性疾病。据资料统计，我国约有400余万强直性脊柱炎病人。它最为显著的变化为关节的纤维化和骨性强直。若不及时诊治，很容易导致患者关节畸形，终身痛苦，故有“不死的癌症’之称。
AS具有家族遗传现象，HLA-B*27诊断能够提示高危人群，及早进行筛查、诊治。根据中华骨髓库公布HLA-B等位基因4码中分辨频率共记录244种亚型，其中B27亚型共15种,占人群频率1.98％，以HLA-B27:04最高，占B27 等位基因47.8％；其次为HLA-B27:05，占B27等位基因38.7％。在泰国与中国台湾地区研究中，强直性脊柱炎(AS)患者高达91％为HLA-B*27:04等位基因，在高加索人的研究则以HLA-B*27:05为主。目前中国的文献中指出 HLA-B*27:04与HLA-B*27:05为强直性脊柱炎主要型别(占90％以上)， HLA-B*27:04较多于HLA-B*27:05。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的HLA-B*27的检测技术的正确性需要进一步提高的缺陷，提供一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组，其特征在于，包括分别检测血型B27T,B2705，B2704和B2706的等位基因引物对LB27TF和LB27TR； LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2和LB2706R2和内参引物对；
所述LB27TF和LB27TR的序列分别为GTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTC和GTCAGTCTGTGCCTTGGCCTTGCAGATC；
所述LB2705F和LB2705R的序列分别为GGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCCA和CGGAGCAGGGTCCGCAGGTCCTC；
所述LB2706F1和LB2706R1的序列分别为 CCAGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGT和TAGGCTCTCAGCTGCTCCGCCACA；
所述LB2706F2和LB2706R2的序列分别为 CAGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGTA和TTGCCGTCGTAGGCGTCCTGGTCATAC。
进一步的，所述内参引物对的序列分别为GTCCTGGAGGAGAAGAGGA和ATTGAGGACCTCTGTGTAT。
上述的引物可在制备检测人类白细胞HLA-B*27基因分型的制品中应用。
一种检测人类白细胞HLA-B*27基因分型的试剂盒，包括权利要求1所述的等位基因引物对检测血型B27T,B2705，B2704和B2706的等位基因引物对 LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2 和LB2706R2和内参引物对；dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和MgCl2。
每人份的检测包括4个检测孔，检测孔内分别放置等位基因引物对 LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2 和LB2706R2，且每个检测孔内均设置内参引物对。
试剂盒通常可以做成24人份/盒。
本试剂盒针对白细胞抗原B27基因设计专一性引物，结合SYBR Green I 进行实时荧光PCR扩增及熔解曲线反应，当引物序列与待测序列互补时，通过PCR反应将目的片段复制与放大，再通过熔解曲线的荧光信号与温度变化，检测特异性产物在双链解离50％时的温度(Tm)。PCR体系中加入内参(IC)，用于评估样本质量及PCR抑制因素。本发明设计的等位基因引物组动力高，特异性强，确保PCR扩增质量与正确性，进而确保了试验结果的可靠性。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组，包括分别检测血型 B27T,B2705，B2704和B2706的等位基因引物对LB27TF和LB27TR；LB2705F 和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2和LB2706R2和内参引物对；
所述LB27TF和LB27TR的序列分别为GTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTC和GTCAGTCTGTGCCTTGGCCTTGCAGATC；
所述LB2705F和LB2705R的序列分别为GGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCCA和CGGAGCAGGGTCCGCAGGTCCTC；
所述LB2706F1和LB2706R1的序列分别为 CCAGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGT和TAGGCTCTCAGCTGCTCCGCCACA；
所述LB2706F2和LB2706R2的序列分别为 CAGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGTA和TTGCCGTCGTAGGCGTCCTGGTCATAC。
进一步的，所述内参引物对的序列分别为GTCCTGGAGGAGAAGAGGA和ATTGAGGACCTCTGTGTAT。
上述的引物可在制备检测人类白细胞HLA-B*27基因分型的制品中应用。
一种检测人类白细胞HLA-B*27基因分型的试剂盒，包括等位基因引物对检测血型B27T,B2705，B2704和B2706的等位基因引物对LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2和LB2706R2和内参引物对；dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和MgCl2。
每人份的检测包括4个检测孔，检测孔内分别放置等位基因引物对 LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2 和LB2706R2，且每个检测孔内均设置内参引物对。
储存条件及有效期
试剂盒所有组份在-18℃以下保存，有效期为12个月。
【适用仪器】
Applied
Figure BDA0001788376130000041
7500，
Figure BDA0001788376130000042
Q6000
杭州博日科技有限公司荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测系统FQD-96A
样本要求：
1、本试剂盒所需DNA样本需进行全血DNA提取，并需要测定其DNA样本浓度。不可使用肝素抗凝的全血标本，推荐使用枸橼酸钠抗凝剂。
2、DNA样本浓度应符合40-70ng/μl，纯度A260/A280值为1.6-2.0。
3、已完成提取的DNA样本建议-18℃以下储存不要超过一年。
检验方法
1、PCR工作液配制(在试剂配制区进行)
1.去离子水500ul加入PCR浓缩液管中，加入rTaq 10ul。
2.混匀器10秒间隔8次或(缓慢上下颠倒10次),800rpm离心数秒。
※4℃冷藏1天，冷冻3个月。反覆冻融不超过3次。请按检测的频密度将其以适当体积分管保存，避免反复冻融。
2、加样(在样本处理区进行)
1.每人份(4孔)用量：取PCR工作液40ul与样本DNA 4ul(浓度:60 ±20ng/ul)混合
2.加样前混合反覆抽吸20次
3.每孔加样10ul，封膜(或石蜡油)
4.建议封膜后96孔板式离心1分钟7500RPM
3、PCR扩增(在扩增区进行)
FluoVia Line 9600plus(fq-96)
程序选择SYBER GREEN I(不含ROX)
反应体积设定：10μL
程序设定:扩增曲线采集
96℃3min 1个循环；96℃20秒，68℃1min 5个循环；96℃20秒，65℃45 秒，72℃30秒10个循环；96℃20秒，62℃45秒，72℃30秒15个循环； 72℃2min 1个循环。
熔解曲线采集，每秒升温0.4℃，每0.5℃采集1次荧光值，采集温度范围60-95℃。
质量控制
内参引物作为成功扩增的质控手段，在对应温度区间出现良好的扩增曲线和溶解曲线，否则该孔反应失败。
阳性/阴性判断值
1、阳性:使用智能分析软件时，当该孔具有阳性判断值的Tm(可能同時具有阴性判断值)，則判定为阳性。采取人工分析时，当该孔具有阳性判断值范围的Tm(可能同時具有阴性判断值)，且波峰的相对高度(Derivative reporter,-Rn’)大于等于1时，判定为阳性。
2.阴性:当该孔具有阴性判断值(内控)的Tm，且不具有阳性判断值时，判定为阴性。
【检验结果的分析】
1.将荧光PCR的原始数据依不同机型转存成不同文件格式。Applied
Figure BDA0001788376130000061
7500选择转存为TXT文件；
Figure BDA0001788376130000062
Q6000选择转存为CSV文件。
2.将转存的文件汇入配套的智能分析软件分析，软件可直接提供基因分型結果。
人工分析
1.以荧光PCR原厂软件开启原始数据，利用阳性、阴性的Tm判断值范围找出阳性的孔(见下表)。
2.直接判读阳性阴性结果。
孔位、基因分型、内参Tm与阳性Tm对照表
孔号 基因分型 内参Tm 阳性Tm
A1-H1 B27T 76-78 88-90
A2-H2 B2705 76-78 89-92
A3-H3 B2704 76-78 90-91
A4-H4 B2706 76-78 86-88
A5-H5 B27T 76-78 88-90
A6-H6 B2705 76-78 89-92
A7-H7 B2704 76-78 90-91
A8-H8 B2706 76-78 86-88
A9-H9 B27T 76-78 88-90
A10-H10 B2705 76-78 89-92
A11-H11 B2704 76-78 90-91
A12-H12 B2706 76-78 86-88
2、使用下表的型别判读表，直接判读ABO等位基因结果。
B27 B2705 B2704 B2706 基因分型
+ - - - HLA-B*27
+ - + - HLA-B*27:04
+ + - - HLA-B*27:05
+ - + + HLA-B*27:06
- - - - 非B27
【产品性能指标】
1.阳性/阴性参考品符合率：对3种企业阳性参考品进行检测，分型结果均与已知基因分型相符。罕见型别进行质粒检测，检测结果均相符。
2.阴性参考品符合率
3.重复性：对1种已知基因分型的样品重复检测5次，其基因分型结果完全一致。
4.有效检测范围：用1种已知基因分型的样品，将其浓度配制成40 ng/μL与70ng/μL进行检测，确定同一样品的高低浓度均与已知基因分型相符。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏中济万泰生物医药有限公司
<120> 一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组及应用
<130> D201810186
<141> 2018-09-04
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgggctacg tggacgacac gctgttc 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcagtctgt gccttggcct tgcagatc 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctcccact ccatgaggta tttcca 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggagcaggg tccgcaggtc ctc 23
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagggtctc acaccctcca gaatatgt 28
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggctctca gctgctccgc caca 24
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagggtctca caccctccag aatatgta 28
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgccgtcgt aggcgtcctg gtcatac 27

Claims (5)

1.一种人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组，其特征在于，包括分别检测血型B27T，B2705，B2704和B2706的等位基因引物对LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2和LB2706R2和内参引物对；
所述LB27TF和LB27TR的序列分别为GTGGGCTACGTGGACGACACGCTGTTC和GTCAGTCTGTGCCTTGGCCTTGCAGATC；
所述LB2705F和LB2705R的序列分别为GGCTCCCACTCCATGAGGTATTTCCA和CGGAGCAGGGTCCGCAGGTCCTC；
所述LB2706F1和LB2706R1的序列分别为CCAGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGT和TAGGCTCTCAGCTGCTCCGCCACA；
所述LB2706F2和LB2706R2的序列分别为CAGGGTCTCACACCCTCCAGAATATGTA和TTGCCGTCGTAGGCGTCCTGGTCATAC。
2.如权利要求1所述的人类白细胞HLA-B*27基因分型引物组，其特征在于，所述内参引物对的序列分别为GTCCTGGAGGAGAAGAGGA和ATTGAGGACCTCTGTGTAT。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测人类白细胞HLA-B*27基因分型的制品中的应用。
4.一种检测人类白细胞HLA-B*27基因分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的等位基因引物对检测血型B27T,B2705，B2704和B2706的等位基因引物对LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2和LB2706R2和内参引物对；dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和MgCl2。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，每人份的检测包括4个检测孔，检测孔内分别放置等位基因引物对LB27TF和LB27TR；LB2705F和LB2705R；LB2706F1和LB2706R1；LB2706F2和LB2706R2，且每个检测孔内均设置有权利要求2所述的内参引物对。
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