CN1091291A

CN1091291A - 处置病毒感染的方法

Info

Publication number: CN1091291A
Application number: CN93119070A
Authority: CN
Inventors: R·W·里宾堡; P·B·克鲁格; P·J·D·布易克; C·F·迪沃斯阿尔布雷特
Original assignee: VIROSTAT (NA) NV
Current assignee: VIROSTAT (NA) NV
Priority date: 1992-09-07
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 1994-08-31
Also published as: AU4611093A; AU667564B2; KR940006591A; JPH06219974A; IL106939A0; BR9303733A; EP0587396A1; CA2105630A1; MX9305453A; ZW11693A1

Abstract

本发明提供处置人或动物治疗体病毒感染的化合物、物质和组合物，以及含有它们的药品及药剂。公开了处置这种病毒感染及用于制备处置病毒感染 (特别是HIV感染)的物质和组合物的这种化合物、物质和组合物的用途。公开了新化合物，即1，5-双取代的戊-4-烯-1-炔，其制备方法和用于处置人或动物治疗体病毒感染的方法。该化合物可用通式(1) 代表。

Description

本发明涉及病毒感染的处置。因此，本发明涉及在制备处置病毒感染的物质或组合物方面的一种化合物、物质或组合物的用途;涉及用于病毒感染处置的化合物、物质或组合物;涉及用作病毒感染处置的药品或药剂的化合物、物质或组合物;涉及用作病毒感染处置的活性治疗剂的化合物、物质或组合物;涉及用来制备处置病毒感染的组合物、药品或药剂而使用的化合物、物质或组合物;涉及适宜用在病毒感染处置方面的新化合物、涉及病毒感染处置的药品或药剂;涉及制备化合物的新方法和该方法制备的化合物。本发明尤其涉及适合处置人体免疫缺乏病毒感染（HIV），呼吸道融合病毒感染（RSV）和细胞巨化病毒感染（CMV）的所说的用途，所说的化合物、物质或组合物;所说药品或药剂;所说的制备方法。

按照本发明，在制备处置人或动物治疗体内病毒感染，尤其是人体治疗体内HIV;RSV或CMV感染的物质或组合物方面提供化合物、物质或组合物的用途，该物质或组合物包括含至少一种通式（1）的化合物：

其中R₁、R₂、R₃和R₄可相同或不同并选自-H，-OH，A，B，C和D，而其中

A ＝

B ＝

（其中-OSO

基团的任意1-3个可选地用-OH取代）

C ＝

;及

D ＝ -OSO

尤其是，每个式（1）化合物中，R₂和R₃选自-OH，-H和D;且每个式（1）化合物中，R₁和R₄选自-OH，A，B，C和D。

更具体的，每个所说的式（1）化合物可选自R₁，R₂，R₃和R₄是列于下面表1的化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ），这些化合物是按所说式（Ⅰ）的优选化合物。表1中某些化合物存在于下文详述的植物提取物中（化合物Ⅴ-Ⅷ），而另一些是其代谢物（化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-ⅩⅩⅧ）。代谢物Ⅰ-Ⅳ是在人体肠中生成的，而代谢物Ⅸ-ⅩⅩⅧ是在人体内通过Ⅱ阶段生体转化来生成。Ⅱ阶段生体转化意指生物合成反应，从而使一种取代基加到前体分子中，一般使前体分子增大水溶性和/或减少生物反应性。

（表1化合物Ⅸ，Ⅺ和Ⅻ内R₂和R₃位置的任何羟基可用D取代）。

至少一种所说的通式（1）的化合物可以形成取自为仙茅科（Hypoxidaceae）植物成员的至少一种植物种的部分提取物，优选形成自至少一种为选自如下植物属的一种植物属成员的植物种的部分提取物：Hypoxis、Spiloxene、Curculigo和Campynema。

本发明使得处置人或动物治疗体内病毒感染，尤其是处置人体治疗体内的HIV、RSV或CMV感染的方法成为可能，该方法包括向治疗体投用一种物质或组合物，该物质或组合物包括一种来自为仙茅科植物成员的至少一种植物种的提取物，或者该方法包括向治疗体给用一种物质或组合物，它们具有包括至少一种上述式（1）化合物的一种活性成分。

该提取物可是干燥提取物。该提取物可为选自如下的至少一种植物种的提取物：Hypoxis nitida，H.obtusa，H.rigidula，H.villosa，H.interjecta，H.multiceps，H.nyasica且特别是H.rooperi（也叫作H.hemerocallidea），H.acuminata及H.latifolia（也叫作H.colchicifolia或H.oligotricha），Spiloxene schlechteri及其杂交物。

由于化合物Ⅴ-Ⅷ产生在上述植物提取物中，那么，在按照本发明的上述用途中，每个通式（1）的化合物（形成部分所说植物提取物）可选自化合物Ⅴ-Ⅷ，所具有的R₁、R₂、R₃和R₄列于前面的表1中。自然，作为替代，每个所述的通式（1）的化合物（当它不形成部分植物提取物时）可选自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ，所具有的R₁、R₂、R₃和R₄列于前面的表1。因此，每个式（1）化合物可选自化合物Ⅰ-Ⅴ，或者作为替代，每个化合物可选自化合物Ⅸ-XXⅧ。

上述用途可用于的病毒感染选自人体的免疫缺乏病毒（HIV）感染，呼吸道融合病毒（RSV）感染和细胞巨化病毒（CMV）感染，特别是HIV感染。

化合物E-1，5-双（3′-羟基-4′-O-β-D-吡喃葡糖苯基）戊-4-烯-1-炔（也叫作hypoxoside）是R₂及R₃为-OH而R₁及R₄为A的式（1）化合物之中的化合物Ⅴ。上述自仙茅科植物的提取物含有一种或多种化合物Ⅰ-Ⅷ，特别是Ⅴ-Ⅶ。Hypoxoside和有关的自仙茅科植物的1，5-二取代戊-4-烯-1-炔化合物的分离公开在Marini-Bettolo等人的文章Tetrahedron，1982，38，1683-1687，而其合成则公开在南非专利86/4482中。

按照上面所示，应当注意，在B中任何1-3个硫酸根基团可任选地用-OH取代;而在化合物Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ中的任何羟基可用D取代。

化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的制备详述如下。

植物提取物，或所说的式（1）化合物，尤其是化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可口服或肠胃外给药。

在肠胃外给药的情况下，植物提取物或化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可溶在合适的如盐水的水溶液中静脉注射给药。静脉给药可连续或间歇地进行，并可以使血浆中的化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ和/或其代谢物（如其Ⅱ阶段生体转化产物）的平均含量达到0.1-400μg/ml（如25-200μg/ml）且优选达到50-150μg/ml（如100μg/ml）的方式进行。

对静脉给药而言，期望化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ以浓度为1-100mg/ml（典型为50-100mg/ml）的灭菌溶液形式和一定速率给药，使得上面所说的血浆中化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的含量达到最高达400μg/ml血浆的稳定状态。

在口服给药的情况下，植物提取物或化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可呈片剂，或粉剂或溶液形式，也可包在胶囊中。溶液可为水溶液，且这种溶液可为一种或多种化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的纯态混和物溶液，或者是植物提取物的溶液。同样，片剂、粉剂或胶囊可包含植物提取物或者一种或多种化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ。每个片剂或胶囊可含有作为混和物的一种或多种所说化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ 20-500mg，优选50-300mg，例如200mg。

对志愿人员的试验显现出，将无水甲醇的植物提取物以3200mg/天的速率口服给药可很好地容许治疗体内血浆中含药浓度达到200μg/ml的程度。仅有的付作用只限于小部分治疗体（25人中有3人）的某些程度的恶心、呕吐及腹泻。

另个试验中所述无水甲醇的植物提取物以静脉给药，溶于盐水溶液后给药于羊，其剂量速率是200mg hypoxoside/Kg/天，至少给药30天且至多60天，除增重下降和在给药部位结缔组织有些变色外，没有明显的与药物相关的作用。因而将该方法扩展到植物提取物特别是高压液色谱纯化馏分的肠胃外用药，且尤其是静脉给药;所述馏分含有甲醇植物馏分的化合物Ⅴ-Ⅷ，将其溶在水溶液（优选盐水溶液）中。此外，当发现经人体口服摄入化合物Ⅴ-Ⅷ后，化合物Ⅸ-XXⅧ在血浆中的加合浓度或总的浓度水平已达400μg/ml血浆时化合物Ⅸ-XXⅧ特别适宜溶在盐水溶液内直接静脉输注。

本发明的另个方面是提供一种化合物、物质或组合物，它可用来处置人或动物治疗体内病毒感染，特别是处置人体治疗体内的HIV、RSV或CMV感染，该化合物、物质或组合物包括至少一种上面限定的通式（1）的化合物。

本发明的另个方面是提供用途药品或药剂的化合物、物质或组合物，用来处置人或动物治疗体病毒感染，特别是人体治疗体内HIV、RSV或CMV感染，该化合物、物质或组合物包含至少一种如上限定的通式（1）的化合物。

本发明的另个方面是提供用作活性治疗剂的化合物、物质或组合物，用来处置人或动物治疗体内的病毒感染，尤其是人体治疗体内的HIV、RSV或CMV感染，该化合物、物质或组合物包含如上限定的通式（1）的化合物。

本发明的另个方面是提供一种化合物、物质或组合物，用来制备一种组合物、药品或药剂来处置人或动物治疗体内的病毒感染，特别是人体治疗体内的HIV、RSV或CMV感染，该化合物、物质或组合物包含至少一种如上限定的通式（1）的化合物。

本发明进而扩展到如上限定的通式（1）的化合物的新化合物，其附加条件是当R₂和R₃两者选自-OH和-H时，那么，R₁和R₄不是两个-OH并且R₁和R₄不是两个A。

本发明又一个方面是提供一种药品或药剂来处置人或动物治疗体内的病毒感染，特别是人体治疗体内的HIV、RSV和CMV感染，该药品或药剂包含作为活性治疗剂的至少一种如上限定的通式（1）的化合物，同时受到上面附加条件限制。

药品或药剂的形式可选自含活性治疗剂的片剂，胶囊，粉剂和液体，片剂和胶囊每个含活性治疗剂20-50mg，而粉剂和液体每种含活性治疗剂4-10mg/ml。

本发明还扩展到本文所述化合物Ⅸ-ⅩⅩⅧ的制备的新方法，特别是采用将其从化合物Ⅰ-Ⅷ或从化合物Ⅰ-Ⅷ的衍生物的局部合成的方法。

R₁、R₂、R₃和R₄如上文表1所示的，选自化合物Ⅰ-Ⅳ的通式（1）的化合物其制备方式可为：将选自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式（1）的化合物从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取，将所说的提取的化合物进行酶水解，从而得到作为产物的选自化合物Ⅰ-Ⅴ的所述化合物。

本发明进而扩展到制备通式（1）化合物的方法，该化合物选自化合物Ⅸ-Ⅻ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄如上文表1所示，该方法包括将选自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式（1）的化合物从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取，将该提取的化合物过硫酸化，得到选自化合物Ⅸ-Ⅻ的作为产物的所述化合物。

本发明还扩展到R₁、R₂、R₃和R₄如上表1所示，选自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的通式（1）的化合物的制备方法，包括将选自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式（1）的化合物从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取，将所述提取的化合物进行酶水解来得到选自化合物Ⅰ-Ⅴ的化合物，该方法还包括将选自化合物Ⅰ-Ⅳ的所述化合物硫酸化来得到作为产物的选自化合物ⅩⅦ-XX的所述化合物。

本发明还扩展到制备通式（1）化合物中化合物ⅩⅢ的方法，其中R₁、R₂、R₃和R₄如上表1所示，该方法包括将通式（1）化合物中化合物Ⅴ从为仙茅科植物成员的一种植物种中提取，对化合物Ⅴ进行酶水解得到化合物Ⅰ，将所述化合物Ⅰ进行葡糖苷酸化，从而得到作为产物的所述化合物ⅩⅢ。

本发明还扩展到为选自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ的通式（1）的化合物的制备方法，其中的R₁、R₂、R₃和R₄如上文表1所示，该方法包括将选自化合物Ⅴ-Ⅷ的至少一种通式（1）的化合物从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取，使人或动物治疗体摄入提取的化合物，收集摄入之后的治疗体的尿，该尿中含有作为选自化合物Ⅴ-Ⅷ的化合物代谢物的选自化合物Ⅰ-Ⅴ和ⅩⅢ-XXⅧ的所述化合物，并从尿中提取作为产物化合物的所述代谢物。

当然，该方法包括每种化合物产物的分离及提纯步骤。

当利用如上限定的本发明方法制备时，本发明还扩展到所获得的选自化合物Ⅰ-Ⅳ及Ⅸ-XXⅧ的通式（1）化合物，其中R₁、R₂、R₃和R₄如上文表1中所列。

试验时出乎意料地发现，植物提取物特别是自植物提取物得的化合物Ⅴ，尤其在过硫酸化时表现了HIV的体外活性。而且还出乎意料地发现，当这些以纯体形式或作为植物提取物的一部分的化合物生体转化时（Ⅱ阶段生体转化），在体外和体内都显示抗HIV的活性。化合物Ⅸ-XXⅧ的实用性尤其不可预料且另人惊奇，因为化合物的Ⅱ阶段生体转化（肝的和/或肝外的）通常导至其生物失活。这些代谢物的抗病原或抗病毒作用因而完全不能予料。在这些试验中，被处置的治疗体与未被处置的治疗体在HIV感染的特性平均值方面相比较时，P24HIV核蛋白含量表现为平均降低而特定淋巴细胞亚群的含量表现为平均增加。

现在详述本发明，利用实施例，结合参照所进行的说明活体外的抗病毒活性，抗HIV活性的试验，结合参照临床试验，结合参照制备新化合物Ⅸ-XXⅧ的实施例，并结合参照附图来详述，其中：

图1表明标示Hypoxis rooperi球茎中化合物Ⅴ-Ⅷ的甲醇提取物的mAU（毫吸收单位）对时间（分）的色谱图，说明提取物中化合物Ⅴ、化合物Ⅵ和化合物（Ⅶ+Ⅷ）的相对量，使用的信号波长是260nm，带宽20nm，而参照波长是550nm，带宽50nm;

图2表示类似于图1的H.latifolia球茎中化合物Ⅴ-Ⅷ的甲醇提取物的色谱图，说明提取物中化合物Ⅴ、化合物Ⅳ和化合物（Ⅶ+Ⅷ）的相对量，通过化合物Ⅴ-Ⅷ的酶去糖苷作用分别得到的（非糖部）配基，即分别是化合物Ⅰ-Ⅳ，为对比目的而将其共同色谱分析，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅰ 12.18

Ⅱ 14.84

（Ⅲ+Ⅳ） 13.55

Ⅴ 8.25

Ⅵ 8.76

（Ⅶ+Ⅷ） 8.50

图3表示类似于图1的以HPLC法将H.rooperi甲醇提取物纯化的化合物Ⅴ-Ⅷ的色谱图，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅴ 8.28

Ⅵ 8.79

（Ⅶ+Ⅷ） 8.54

图4是类似于图1的色谱图，表示摄入1g纯化的化合物Ⅴ-Ⅷ（其色谱在图3中显示）之前人体血清分析色谱，且在其中叠加有同样治疗体在摄入所述化合物90分钟后的血清色谱图，化合物Ⅴ-Ⅷ的代谢物在摄入后色谱图上具有三个主峰，分别相似于下文图5和图6中的馏分A、B和C;

图5为类似于图1的色谱图，是摄入纯化的化合物Ⅴ-Ⅷ（其色谱在图3中显示）三小时之后人尿的色谱图，其说明在图6中被说明的三种尿馏分A、B和C;

图6示出类似于图1的三个色谱图，叠加部分说明用HPLC法从尿（其色谱示于图5）中制备分离的纯化代谢物的三种馏分（即馏分A、B和C），它们的保留时间是：

馏分保留时间（分钟）

A 7.19

B 7.90

C 9.03;

图7表示二极管系统检测器紫外吸收光谱图，说明图6纯化尿代谢物馏分A的吸收光谱，其为mAU对波长（nm）的绘制图，该光谱图的吸收波长最大分别是在206.5-210.5nm和258.5-262.5nm，而吸收波长最小处在230.5-234.5nm;

图8表示类似于图7的光谱图，为图6馏分B的吸收光谱，该光谱图的吸收波长最大处分别在206.5-210.5nm和258.5-262.5nm，最小处在228.5-232.5nm;

图9表示类似于图7的光谱图，为图6馏分C的吸收光谱，该吸收光谱的吸收波长最大处分别在204.5-208.5nm和256.5-260.5nm，吸收波长最小处在228.5-232.5nm;

图10表示类似于图1的纯化的尿馏分A的一种结合体的HPLC色谱图，该结合体是馏分A用β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶在pH＝5.5时水解衍生的，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅰ 12.35

Ⅱ 14.91

（Ⅲ+Ⅳ） 13.58

在这些保留时间数据与化合物Ⅰ，化合物Ⅱ和化合物（Ⅲ+Ⅳ）（由β-葡糖苷酶对H.latifolia的乙醇提取物（如图2所示）的作用而衍生）的那些相应数据间发现对应性，尿和植物衍生的结合体的吸收光谱也可叠合;

图11表示类似于图10的由纯化尿馏分B以类似形式衍生的所述结合体的色谱图;

图12表示类似于图10的由纯化尿馏分C以类似方式衍生的所述结合体的色谱图;

图13表示类似于图1的化合物Ⅰ的葡糖苷酸化产物的色谱图，该产物即为以改型的Koenigs-Knorr合成方法得到化学合成的化合物Ⅰ的β-D-吡喃葡糖苷酸酯，该产物可用选择溶剂分配法纯化，化合物Ⅰ的化学β-D-葡糖苷酸化产生两种产物，其保留时间和光谱和图5的尿代谢物馏分A的相一致，所讨论的光谱图叠加在图13中;

图14表示类似于图7的化合物Ⅰ的光谱图，但将mAU轴标度（标准化），吸收波长最大处分别在210.5-214.5nm，258.5-262.5nm和290.5-294.5nm，吸收波长最小处分别在234.5-238.5nm和282.5-286.5nm;

图15表示类似图14但对化合物Ⅱ的光谱图，吸收波长最大处分别在200.5-204.5nm和258.5-262.5nm，吸收波长最小处在222.5-226.5nm;

图16表示类似图14但对化合物（Ⅲ+Ⅴ）的光谱图，吸收波长最大处分别在202.5-206.5nm和258.5-262.5nm，而吸收波长最小处在228.5-232.5nm;

图17表示类似图14但对化合物Ⅴ的光谱图，吸收波长最大处分别在210.5-212.5nm，254.5-258.5nm以及288.5-292.5nm，而吸收波长最小处分别在232.5-234.5nm和278.5-282.5nm;

图18表示类似图14的对化合物Ⅵ的光谱图，吸收波长最大处分别在200.5-204.5nm和256.5-260.5nm，而吸收波长最小处在220.5-224.5nm处;

图19表示类似图14的化合物（Ⅵ+Ⅷ）的光谱图，吸收波长最大处分别在204.5-208.5nm和256.5-260.5nm，而吸收波长最小处在226.5-230.5nm;

图20表示类似图14但显示化合物Ⅰ和Ⅴ的叠合吸收光谱的光谱图;

图21表示类似图14但显示化合物Ⅱ和Ⅵ的叠合吸收光谱的光谱图;

图22表示类似图14但显示化合物（Ⅲ+Ⅳ）和（Ⅶ+Ⅷ）的叠合吸收光谱的光谱图;

图23表示类似图1的叠合的色谱图，是分别从天然和合成来源得到的化合物Ⅱ的色谱，天然化合物是将得自H.rooeri的HPLC纯化的化合物Ⅴ进行酶去糖苷化而得到，而合成的化合物是照Drewes等人的Synthetic Communications，1990，20，1671-1679所述方法合成的;

图24表示类似图14的光谱图，为合成和天然型化合物Ⅱ（其中色谱图示于图23）的叠合的吸收光谱;

图25表示类似图1的色谱图，其为通过化合物Ⅴ-Ⅷ的混和物过硫酸化获得的化合物Ⅸ-Ⅻ的混和物的色谱;

图26的表示类似图7的光谱图，其为化合物Ⅸ-Ⅻ（其色谱示于图25）的混合物的光谱图;

图27表示类似图1的色谱图，其为由H.rooperi衍生的化合物Ⅰ-Ⅳ的色谱，该化合物是化合物Ⅴ-Ⅷ（其色谱见图3）通过β-D-葡糖苷酶在PH＝5.5时水解的产物，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅰ 12.31

Ⅱ 14.88

（Ⅲ+Ⅳ） 13.53

图28表示类似图1的色谱图，其为化合物Ⅰ和它的半合成二硫酸化产物化合物ⅩⅦ的混和物的色谱，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅰ 12.29

ⅩⅦ 8.95

图29表示类似图14光谱图，其为化合物Ⅰ和ⅩⅦ的（其色谱见图28）的光谱，化合物Ⅰ吸收波长最大处分别在210.5-214.5nm，258.5-262.5nm和290.5-294.5nm，而吸收波长最小在234.5-238.5nm和282.5-286.5nm，而化合物ⅩⅦ吸收波长最大在204.5-208.5nm和254.5-258.5nm，且吸收波长最小在226.5-230.5nm;

图30表示类似图1色谱图，其为化合物Ⅱ与半合成的化合物ⅩⅧ（为化合物Ⅱ的二硫酸化结合产物）的混和物的色谱，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅱ 14.86

ⅩⅧ 9.07

图31表示类似图14光谱图，其为化合物Ⅱ和ⅩⅧ（其色谱见图30）的光谱，化合物Ⅱ的吸收波长最大分别在200.5-204.5nm和258.5-262.5nm，吸收波长最小在222.5-226.5nm，而化合物ⅩⅧ吸收波长最大在198.5-202.5nm和254.5-258.5nm，吸收波长最小在220.5-224.5nm，与化合物Ⅱ相比较，二硫酸化产物-化合物ⅩⅧ的吸收光谱呈现出较短波长方面位移;

图32表示类似图1色谱图，其为化合物Ⅰ-Ⅳ和它们半合成二硫酸化结合物化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的混和物的色谱，将化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物二硫酸化即得其结合物，该图说明化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸酯即化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ共洗脱，保留时间是：

化合物保留时间（分钟）

Ⅰ 12.14

Ⅱ 14.80

（Ⅲ+Ⅳ） 13.51

（ⅩⅦ+ⅩⅩ） 9.00

图33表示HIV试验研究结果的条形图表，显示经处置的治疗体（本发明）和未经处置的治疗体（对比）组内以Pg/ml表示的P24核蛋白含量的平均绝对变化情况;

图34表示如图33试验性研究的条形图表，但其为以细胞/μl表示的所述的处置及未处置组内选择性淋巴细胞亚群的绝对平均变化状况;及

图35表示如图33试验性研究的条形图表，但其为所述组内所述细胞亚群的平均改变百分比。

实施例1

化合物Ⅰ-XXⅧ的分析、定性及制备分离方法概要

化合物的制备分离

进行化合物的制备分离是采用制备性高效液体色谱法。

装置

使用Shimadzu仪器（Kyoto，Jopan）。它含有下列部件：SCL-8A系统控制器，2XLC-8A流动相输送泵，SPD-6AVUV-Vis分光光度检测器，FCV-130AL容器注入控制器和FCV-100B馏分收集器。

用C8键合硅石（Partisil Bioprep 20μm C8 75A）填充制备色谱柱（50×300mm），该硅石由Whatman购得（Fairfield，New Jorsey，U.S.A）。

操作条件包括流动相（水中15%的乙腈，V/V）的ioscratic输送，其流速溶为100ml/min。检测器设定在260nm波长，馏分收集设定为收集250ml等分试样。进行样品装载时将样品（5g）溶在水（50ml）中直接泵送到柱上，色谱柱已予装载有水。Hypoxoside（化合物Ⅴ）和Hypoxoside的同种物[化合物（Ⅶ+Ⅷ）和Ⅵ]被依次洗脱，其起始是在8.5L的保留体积，获得的馏分富集各自化合物达80-100%的质量纯度。

半制备性分离和定性分析

将标准的高效液体色谱（HPLC）技术（Kruger等人，J.Chromatography，1993，612，191-198）用于所有化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的分析、定性和半制备性分离。

装置

使用Hewlett Packard仪器（Waldbron，德国）。它含有下列部件：HP1090M液色谱仪，它带有二元DR5溶剂输送系统和手动阀门注入器;HP1040二极管系统检测器;HP79994A工作台;HP310SPU带彩色监视的程序处理仪器;HP9153C20MB温彻斯特磁盘驱动器;AP2225A thinkjet打印机和HP7440A X-Y绘图仪。

分析（色谱）柱（4.6×250mm）用5μm规则颗粒尺寸的尾端加盖的C8键合二氧化硅（Whatman，Maidstone，英国）来填充，同时用薄膜的C18键合二氧化硅（Whatman）填充保护柱（2.1×75mm）。在线使用的提取前置柱（2.1×30mm）则用40μm颗粒尺寸的制备级C18键合二氧化硅来填充（Analytichem International，Harbor City，CA）。

操作条件包括流速程控在1.5ml/min的线性溶剂梯度，起始时用的流动相A（0.05M KH₂PO₄）中加入10%V/V的流动相B（乙腈-异丙醇80∶20V/V）。将这种混和物保持1分钟后形成流动相A和B的线性梯度，16分钟后以70%V/V的B结束。柱温度维持在50℃。

在线提取前置柱用样品混合物（溶于50μl乙醇或至多200μl的水相）装载并用含硫酸鈲盐（8.05M）和硫酸铵（1.02M）的水溶液充至500μl。样品引入前后用500μl的硫酸铵水液（0.5M）冲洗提取柱。然后将在线提取柱上截留的溶质在分析柱上以基于起始分析的流动相来洗脱。

程控二极管系统检测器参数以监视260nm的信号并且也给出200-400nm的吸收光谱。

实施例2

制备Hypoxis物种的无水甲醇提取物

将洗涤后的Hypoxis种球茎切碎，切碎物置于干燥托盘并于70℃经3.5小时在对流烘箱中脱水。将切碎物磨成200目细粉，得棕色细粉末（12.5Kg球茎得大约5.0Kg干粉）。干磨粉（5.0Kg）用甲醇（25L）于室温经30分钟搅拌来提取。过滤淤浆，真空蒸发棕色清液得1.25Kg浅棕色Hypoxis种球茎提取物，其始终含有45-50%m/m的Hypoxoside和其同种物[化合物（Ⅴ-Ⅷ）]，而其中Hypoxoside（化合物Ⅴ）是主要成分（90-95%m/m），其含量依所用的具体Hypoxis物种而定。

实施例3

化合物Ⅴ-Ⅷ的制备分离（见图1-2）

化合物Ⅴ由Hypoxis rooperi的甲醇提取物中分离，然后用实施例1所述的制备性HPLC纯化（见图1）。

化合物Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）由Hypoxis latifolia的乙醇提取物中分离，然后，用实施例1所述制备性的HPLC技术提纯。若必须进行这些化合物的进一步提纯则采用使用实施例1所述标准化分析性HPLC系统（见图2）的半制备性HPLC法进行。

实施例4

化合物Ⅰ-Ⅳ的分离（见图2）

化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）分别作为化合物Ⅴ、Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）的酶水解产物的分离如下：化合物Ⅴ、Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）（每种100mg）分别溶于乙酸盐缓冲水液（10ml，0.1M，PH＝5.5），且各加入β-葡糖苷酶（100mg）。该混和物于37℃培育4小时，之后将水解产物用乙醚（5ml）提取。用碳酸氢钠水液（5ml，0.5M）洗涤乙醚提取液而后用无水硫酸钠干燥。氮气流保护蒸发乙醚相分别得到5-10mg的化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）。每种产物用实施例2所述校准的分析HPLC系统以半制备性HPLC方法来提纯。通过标准反相吸着技术从HPLC馏分中去除HPLC溶剂缓冲盐并以低压升华干燥法获得各种最终粉末产物。

实施例5

化合物ⅩⅢ-XXⅧ的分离（见图3-12）

用制备性HPLC（见实施例1）技术纯化Hypoxis rooperi球茎的甲醇提取物得一混和物，该混和物含有主要成分的化合物Ⅴ（90-95%m/m），还得到少量的化合物Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）（见图3）。将这种产物（1g）溶在于（200ml）中，并让成年男性治疗对象以单一剂量口服。随后收集尿液并处置如下：经柱床用甲醇和水对C18键合二氧化硅吸着剂材料（200g，40μm）进行予处理。使过滤的尿液（5L）流经吸着剂床，随后依次用下列物洗脱：水（400ml），甲醇水液（10%V/V，400ml），甲醇水液（30%V/V，800ml），最后用甲醇（400ml）随后用水（400ml）。

将甲醇水液馏分（30%V/V，800ml）用水（1600ml）稀释，使其再次流经吸着剂床，该床随后用水（400ml）最后用甲醇（400ml）洗脱。

真空下于50℃蒸发最终的甲醇溶液至含水剩余物，将其低压升华干燥得代谢物ⅩⅢ-XXⅧ和内生的尿成分的混和物（1g）。取合适体积的这种剩余物的过滤水溶液（10ml/ml）注入校准HPLC系统（见实施例1）的在线前置柱上，这样便在柱的输出端收集馏分A、B和C（见图5-6）。采用标准反相吸着技术使这些馏分去除流动相缓冲盐，再将其低压升华干燥为干燥产物，即化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ混和物样品。

实施例6

化学合成硫酸盐结合物

硫酸吡啶鎓作为硫酸化试剂用于部分合成化合物Ⅸ-Ⅻ和化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ。

制备硫酸吡啶鎓试剂

向无水乙酸乙酯（1L）和浓硫酸（25L，0.469mol）的混和物伴随搅拌缓慢加入无水吡啶（50ml，0.620mol）。冷却混和物，通过滗析从乙酸乙酯中分离生成的硫酸吡啶鎓沉淀，将其用部分无水乙酸乙酯漂洗并于60℃真空干燥得85g产物（产率100%）。使该产物（85g，0.480mol）溶于无水二甲基甲酰胺（250ml）中得1.921M的硫酸吡啶鎓溶液，本文称做硫酸吡啶鎓试剂。该试剂置于无水硫酸钙（25g）上贮存在气密的琥珀瓶内。Hypoxoside（化合物Ⅴ）和Hypoxoside同种物[化合物Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）]的过二硫酸化来分别制备化合物Ⅸ、Ⅹ和（Ⅺ+Ⅻ）

向Hypoxoside（2g，0.0033mol）（见实施例3及图1）的无水二甲基甲酰胺（130ml）溶液加入硫酸吡啶鎓试剂（70ml，0.135mol），无水硫酸钙（4g）和乙酐（13.2ml，0.14mol），在氮气氛下于25℃搅拌该混和物24小时。将反应混和物过滤得清液，搅拌清液并加入甲醇和异丙醇的混和物（600ml，1∶2V/V），随后加异丙醇（250ml）。连续搅拌使所形成的沉淀凝固并洗析除去溶剂混和物。将凝固的沉淀用异丙醇淋洗，然后溶于水（40ml）。向这个溶液搅拌加入甲醇（100ml），随后加氢氧化钠的甲醇溶液（50ml，1M）使PH为7-11。所得沉淀通过过滤分离，用甲醇洗涤后溶于水（200ml）。将此溶液流经C18键合二氧化硅吸着剂颗粒床（颗粒尺寸40μm，床尺寸为内径50mm长50mm），该床已用甲醇和水作予调理。将另一份200ml水流经吸着剂床并与前面的洗脱液合并，得400ml硫酸化Hypoxoside的清澈的钠盐溶液。发现这一溶液能够被低压升华干燥成白色产物（2g）。还发现通过添加乙醇（400ml）和乙酸乙酯（1200ml）可从洗脱液中沉淀出硫酸化Hypoxoside的钠盐。经过滤收集该沉淀，真空干燥得白色干燥产物。硫酸化Hypoxoside的钠盐易溶于水，与Hypoxoside（即化合物Ⅴ）不一样，其对诸如C18键合二氧化硅颗粒的反相色谱介质几乎或根本没有亲合力，甚至有水存在时亦是如此。以类似方式将化合物Ⅵ及（Ⅶ+Ⅷ）过硫酸化。

化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）硫酸化来分别制备化合物ⅩⅦ、ⅩⅧ和（XIX+XX）

向化合物Ⅰ（100mg，0.00355mol）（见实施例4及图2）的无水二甲基甲酰胺（2.2ml）溶液加入硫酸吡啶鎓试剂（1.5ml，0.00288mol）和乙酐（0.3ml，0.00318mol）。令该混和物于无水条件下在90-100℃保持30分钟，冷却，之后将其倾入冷水（40ml）并同时搅拌。随后使该溶液流经C18-键合硅石吸着剂床（颗粒尺寸40μm），该床已用甲醇和水依次进行予处理。

依次分别用下列物流经吸着剂床：水（40ml），碳酸氢钠水液（40ml，0.1M），水（40ml）和甲醇（10ml），个别地收集甲醇馏分。真空下于50℃蒸发甲醇洗脱液得到含水剩余物，将其低压升华干燥得0.07g的化合物ⅩⅦ。以同样步骤从化合物Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）分别制备化合物ⅩⅧ和（XIX+XX）。

实施例7

化学合成化合物ⅩⅢ（见图13）

将化合物Ⅰ经葡糖苷酸化而衍生化合物ⅩⅢ。化合物Ⅰ的二-β-葡糖苷酸通过传统的Koenigs-Knorr反应而衍生，该反应包括在碳酸银存在下将保护的溴代葡糖苷酸偶联于糖苷配基。该保护的溴代葡糖苷酸，即（2，3，4-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡糖基-1-溴化物）糖醛酸甲酯，是按Bollenback等人所述方法制备的，见J.Amer.Chem.Soc.1955，77，3310-3315。

考虑到微量产量，产物不必制备性分离，但可按下文实施例8所示进行定性。

实施例8

标准化HPLC工艺和酶水解（见实施例1）将化合物定性的一般工艺

化合物的定性基于它们的绝对色谱保留时间，它们的保留时间彼此相关，还基于标准分析参数下所得到它们的二极管系统检测器吸收光谱。发现在同一制造商的系列分析（色谱）柱上的大约30秒以内的保留时间可重复再现。二极管系统检测器吸收光谱在检测器分辨限度范围内表面，且最大和最小吸收以波长范围来表示，该范围为4-6nm。

苯被用作参照化合物。甲醇内苯的分析以如下的关于标准化HPLC法来定性。

保留时间＝13.84分钟

最大吸收＝198.5-202.5nm和252.5-256.5nm

最小吸收＝220.5-224.5nm

化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的另一定性基于用β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的选择性酶水解来推断。D-葡糖二酸-1，4-内酯（σ50375）（1mg/mg）和硫酸钠（0.01M）用来分别选择性抑制β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性，其中在大规模的酶制备中发现交叉反应。水解在乙酸盐缓冲液（0.1M，PH5.5）中进行。

化合物Ⅰ-Ⅷ的定性（见图1-2和图14-22）

由Hypoxis roopri甲醇提取物（见实施例2）制备的化合物Ⅴ（见实施例3）水溶液用标准HPLC方法（见实施例1）进行分析。化合物Ⅴ（见图1）作为主要成分被分离，其保留时间是8.25分钟，具有UV最大处分别在210.5-212.5;254.5-258.5和288.5-292.5nm（见图17）。Marini-Bettolo等人在Tetrahedron，1982，38，1683-1687中援引的值是：UV最大分别在258、291、298和310nm，这是在甲醇中测得的。化合物Ⅴ与碱经历不可逆反应，而酚基与铁氰化铁则进行正向反应。化合物Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）在Hypoxio latifolia的乙醇提取物中更普遍存在，因此在由Hypoxio latifolia得到的分离物中被较好地定性（见图2）。

化合物Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）的UV光谱与化合物Ⅴ的光谱（见图17-19）的类似性暗示出它们在结构上与化合物Ⅴ相关。

化合物Ⅴ、Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）通过PH＝5.5时被β-D-葡糖苷酸酶水解分别产生化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ），见图2说明。

化合物Ⅴ、Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）及其同种物化合物Ⅰ，Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）的洗脱次序仍是分别相同的（见图2）。从这点可推断，就它们同种物上取代基而论，化合物Ⅴ、Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）彼此并不相同。因而从化合物Ⅴ到化合物（Ⅶ+Ⅷ），然后到化合物Ⅵ保留时间的增加，以及分别从化合物Ⅰ到化合物（Ⅲ+Ⅳ）然后到化合物Ⅱ保留时间的增加，都与同种物上羟基数目减少是一致的。

由Hypoxis latifolia衍生的化合物Ⅱ与按照Drewes等人（Phytochemistry，1989，28，153-156）所述合成的E-1，5-双（4′-羟苯基）戊-4-烯-1-炔相比较，考虑到保留时间和光谱特性的一致性（见图23-24），证实化合物Ⅱ中二对位羟基的存在。

化合物（Ⅲ+Ⅳ）的保留时间居于化合物Ⅰ和Ⅱ的中间意味着有三个羟基，可能的结构可由化合物Ⅲ和Ⅳ来代表，但还未在色谱上辨别（见图2）。这种由Hypoxis rooperi衍生的三羟基化合物最可能的构型会是化合物Ⅲ的那一种构型，因Drewes等人在Phytochemistry，1989，28，153-156中给出了很好的证据，即当化合物由Hypoxis rooperi衍生时烯烃一侧的酚环是个儿茶酚。

在图14-22中分别说明的化合物Ⅰ-Ⅷ的光谱特性与一般的中央部位戊-4-烯-1-炔结构相一致。

比较光谱表明（见图20-22），通常的分析条件去糖苷会导至谱线向较短波长位移。

由水解带来的保留位移和这些化学衍生物的羟基化程度可依据反相色谱保留机理来推断。

化合物Ⅸ、Ⅹ和（Ⅺ+Ⅻ）的定性（见图25-26）

化合物Ⅴ-Ⅷ的部分硫酸化会导致大量的羟基硫酸化物，给出复杂的洗脱图。然而在全部硫酸化的情况下，可以期待每种化合物具有充分确定三个洗脱峰。明显的三峰图样确实在图25中显而易见，因此化合物Ⅸ、Ⅹ和（Ⅺ+Ⅻ）可认为分别是化合物Ⅴ、Ⅵ和（Ⅶ+Ⅷ）的十-、八-和九-硫酸化物。然而部分硫酸化产物通过降低关于被硫酸化的化合物的硫酸化试剂的摩尔比制备，可观察到如所予料的复杂洗脱图样。

化合物Ⅸ、Ⅹ和（Ⅺ+Ⅻ）不易根据它们的色谱或光谱性质区分，这些化合物的混和物的定性反映在图25和26中。这些化合物的初期洗脱与其增强的水溶性相关，同时它们保留了化合物Ⅴ-Ⅷ的光谱特性。可以预料，按实施例6方法制备的化合物Ⅹ和（Ⅺ+Ⅻ）将具有类似于化合物Ⅸ的硫酸化程度。

化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的定性（见图3-12和27-32）

化合物Ⅷ-ⅩⅩⅧ表示化合物Ⅴ-Ⅷ的生体转化产物。它们被发现于摄入了化合物Ⅴ-Ⅷ后人体治疗体的血清和尿中（见图4-6）。能够从下列观察中注意到一定质量和数量的生化作用和活体内形成的结合化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ有关。这与通过合成和特定的酶水解证实结合物类型的方式合在一起，将有助于鉴别和定性这些化合物。

化合物Ⅴ-Ⅷ已表明在人体治疗体肠道内被水解成化合物Ⅰ-Ⅳ，因为这些糖苷配基可在人的面容上检测出来。因此化合物Ⅰ-Ⅳ自肠道吸收后可能是化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的代谢前体。

从图3和27中应注意到化合物Ⅴ-Ⅷ的相对量代表了它们水解产物即化合物Ⅰ-Ⅳ的相对量。示于图27中化合物Ⅰ-Ⅳ的相对量则代表这些对肠吸收有用的糖苷配基的相对量。

以HPLC法将尿代谢物分离成馏分A、B和C已在图6中说明，化合物Ⅰ-Ⅷ的吸收光谱特征保留在代谢物的馏分中（图7-9）。这就证明尿代谢物的馏分A、B和C有个共同的来源，即化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）。

代谢物馏分A、B和C在PH＝5.5时用β-D-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶完全水解产生了它们的结合物的图形（见图10-12）。化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）的保留时间和吸收光谱依然不变，不管其是植物提取物的水解产物还是代谢物提取物的水解产物。这可再次确定结合物基团的类型：植物配基的β-D-葡糖醛酸和硫酸化物，即化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）。

馏分A、B和C的选择性酶水解（见图6）意示：

（ⅰ）馏分A主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二-β-D-葡糖苷酸，即分别是化合物ⅩⅢ-ⅩⅥ。

（ⅱ）馏分B主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ单硫酸化物-单-β-D-葡糖苷酸，即分别是化合物ⅩⅪ-ⅩⅩⅣ。

（ⅲ）馏分C主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸化物，即分别是化合物XⅦ-XX。

因此，结合物基团的类型似乎在反相色谱中是代谢物保留时间的主要决定因素。因而馏分B，化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）的混和结合物（为单-β-D-葡糖醛酸单硫酸化物）在保留时间方面居于它们的二-β-D-葡糖醛酸（馏分A）和它们的二硫酸化物（馏分C）的中间是合适的。

尿馏分A、B和C（见图10-12）的结合物图形并不含有作为摄入物质的相同相对量的化合物Ⅰ-Ⅴ（见图3和27），这就意示化合物Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）的选择性吸收超过化合物Ⅰ，和/或意示化合物Ⅰ生体转化成化合物（Ⅲ+Ⅳ），然后随着后来的结合作用生体转化成化合物Ⅱ。

化合物Ⅰ（见图28-29）、化合物Ⅱ（见图30-31）和二硫酸化的化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物（见图32）的化学硫酸化作用产物产物的保留时间在尿代谢物馏分C（见图6）的保留时间区域内，这一点由芳基硫酸酯酶使得主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸化物的作用来表明。

芳基硫酸酯酶的化学合成二硫酸化物的水解产生它们各自的结合物，化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）。

化合物Ⅰ的化学葡糖苷酸作用（见图13）产生两种产物，其保留时间和吸收光谱相应于馏分A的两个尿代谢物（吸收）峰（见图5-6）。化合物Ⅰ的半合成葡糖苷酸可被β-D-葡糖苷酸水解。两个化合物Ⅰ的葡糖醛酸产物可以代表或者间位或者对位的葡糖苷酸化作用，这点未经检验。

化合物Ⅰ、Ⅱ和（Ⅲ+Ⅳ）的所有结合物在它们的吸收光谱上与它们的结合物在通常分析参数条件下相比较显示出向较低波长的位移。这一点，与它们是否是葡糖苷，葡糖苷酸或硫酸化物无关，也与是否为半合成或生物衍生无关。这些对照光谱可见于图20-22，29和31。

化合物Ⅰ和（Ⅲ+Ⅳ）的代谢的和/或合成的结合作用发生在苯环间位的羟基上，导至更加多的结合产物的结合。然而可以确信，由于化学缩合作用，对位取代是优选的。

实施例9

使化合物Ⅰ-XXⅧ经受体外试验，用来抑制人体免疫缺乏1型病毒（HIV-1）增生，具体如下：取血库中健康志愿者的血液经密度梯度离心沉淀得到人体外周血液淋巴细胞（PBL′s），将它积存并用来体外繁殖HIV-1。

用植物凝血素（PHA）将PBL′s多克隆激活并使其经受质量控制，从而可用锥虫兰排除法和活化抗原的表达来检验它们的生存性，CD4⁺和CD25⁺用免疫荧光来测量。加入试验物质之前，活化的PBL′s要接触校准滴定度的HIV-1病毒液，培育60分钟后洗涤细胞两次并以2×10⁶细胞/井的浓度铺入微量滴定板。第4天介质含有中间白细胞-2并且在对比井内产生的病毒在50-100ng/ml的P24核心蛋白之间。将试验物质根据其溶解特性或在水中或在二甲亚砜（DMSO）中加到这些培养体内。如用DMSO其最终的浓度总是1%V/V。

HIV复制的测量在第2、3和4天或第3、4、5和6天P24核心蛋白和HIV RNA的产生时进行。核心蛋白P24的测量用Sandwich ELISA技术，其中尤其使用抗P24核心蛋白的单克隆抗体。HIV RNA的测量使用特性标记的抗HIV RNA的DNA探针和杂交工艺。

结果以第3、4或第6天抑制HIV-1 P24核心蛋白生成或RNA生成的百分数来表达。

试验物质可能的毒性作用在实验开始后第4天或第6天以用锥虫兰的生存性测试或用3-（4，5-二甲噻唑-2-基）-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物（MTT）的增生试验来测量（Borenfreund等人：Toxicol.ln Vitro，1988，2，1-6）。

应当注意，以1%V/V的DMSO的剂量不能抑制HIV-1的复制。

药物的毒性通过以MTT测量并与接受病毒但无药物的对照组进行比较而表达为抑制淋巴细胞增生的百分数。

在每个试验里，细胞也要接触HIV-1和3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷（也叫作Zidovudine或AZT），其浓度为100、10、1和0.1ng/ml。这是个阳性对照物并且试验的化合物要和10ng/ml AZT的抑制作用相比较。

下列所有表格中，抑制百分数指的是相比于感染的对照物时对P24核心蛋白生成和HIV RNA生成的抑制。AZT抑制百分数指的是在实验结束时即大约4或6天后以10ng/ml AZT所造成的抑制。

粗提取物

将Hypoxis rooperi的无水甲醇提取物（见图1）溶于二甲亚砜并加到试验细胞中，其最终浓度为70μg/ml（DMSO的最终浓度是1%V/V）。培育4天后，P24核心蛋白的生成被100%的抑制而HIV RNA的生成则抑制85%。细胞增生在对比物的76%。10ng/ml的AZT使得P24核心蛋白的生成100%地抑制，而HIV RNA的生成则96%地抑制。

纯化的化合物Ⅴ

为了证实粗甲醇提取物的哪一成分参与了HIV-1增生的抑制，将HPLC提纯的hypoxoside（见图3）自身溶在水中进行试验。下列结果是6天后用标准的HIV-1滴定度所获得的：

表2

10ng/ml AZT对P24核心蛋白的生成抑制20%而对HIV-RNA的生成抑制68%。

使用同样化合物Ⅴ样品但将病毒滴定度降低十倍得到下列结果：

表3

10ng/ml AZT对P24核心蛋白和HIV-RNA的生成抑制99%。

化合物Ⅴ-Ⅷ

在另个试验中，使由Hypoxis latifolia分离的化合物Ⅴ-Ⅷ（见图2）溶于水后进行试验，培育3天和6天后所得结果如下：

表4（三天后）

10ng/ml AZT使P24核心蛋白的生成抑制50%而使HIV-RNA的生成抑制46%。

表5（6天后）

10ng/ml AZT对P24核心蛋白的生成抑制50%而对HIV-RNA的生成抑制46%。

化合物Ⅸ-Ⅻ

Hypoxoside（化合物Ⅴ）和它的结构相关化合物经硫酸化得化合物Ⅸ-Ⅻ，（见图25），试验其抑制HIV-1的增生，6天后得结果如下：

表6（标准病毒滴定度）

10ng/ml AZT造成20%地抑制P24核心蛋白的生成且68%地抑制HIV-RNA的生成。

表7（稀释10倍的标准病毒滴定度）

10ng/ml AZT造成99%地抑制P24核心蛋白和HIV-RNA的生成。

化合物ⅩⅦ

化合物Ⅰ经硫酸化得化合物ⅩⅦ（见图28-29），试验其对HIV-1体外增生的抑制，得如下结果：

表8（培育3天）

10ng/ml AZT造成5%地抑制P24核心蛋白生成且46%地抑制HIV-RNA生成。

续表8（培育6天）

10ng/ml AZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且96%地抑制HIV-RNA生成。

化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物经硫酸化分别得化合物XⅦ-ⅩⅩ（见图32）并将其培育6天得如下结果。

表9

10ng/ml AZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且92%地抑制HIV-RNA生成。

化合物ⅩⅧ

化合物Ⅱ硫酸化得出化合物ⅩⅧ（见图30-31）6天后得出如下结果。

表10

活体内产生的化合物Ⅴ-Ⅷ的代谢产物

口服摄入的Hypoxide（化合物Ⅴ）在大肠内被细菌的β-葡糖苷酶转换成化合物Ⅰ。化合物Ⅰ排泄在粪便里并也被吸收及由Ⅱ相型生体转化成为硫酸化物和葡糖醛酸结合物（图6中的馏分A、B和C）。馏分A主要含化合物Ⅰ-Ⅳ的二葡苷酸化物，即化合物Ⅷ-XVI，得出如下结果：

表11

10ng/ml AZT造成100%地抑制P24核心蛋白生成且97%地抑制HIV-RNA生成。

馏分A-C

对化合物Ⅴ-Ⅷ的尿代谢物的馏分A，B和C（即化合物ⅩⅢ-ⅩⅥ（馏分A）;化合物ⅩⅪ-ⅩⅩⅧ（馏分B）和化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ（馏分C）（见图5-6）进行试验，得到培育三天后的如下结果。

表12

10%ng/ml AZT造成50%地抑制P24核心蛋白的生成且46%地抑制HIV-RNA生成。

化合物Ⅴ-Ⅷ的尿代谢物馏分B（见图6）被细分馏成两个馏分。馏分V1是馏分B的上行半部而馏分V2是馏分B的下行半部。对这些馏分分别进行抑制HIV复制的测试，得到经4天和6天培育的如下结果。

表13

（ND＝未测定）

10%ng/ml AZT抑制P24核心蛋白生成和HIV-RNA生成在4天和6天后为100%。

实施例10

物料和方法：

治疗体：

加入此项研究的所有治疗体都呈HIV阳性，这是以通用的酶连接免疫吸附剂试验（ELISA）所测定的，且其ELISA阳性结果已经过Western印迹技术证实。

被研究的人员包括18名两种性别的治疗体，其中7名志愿者作为处置组（Hypoxis物种提取物处置，见实施例2），而其余11名治疗体作为对比的非处置组。研究中的任何治疗体皆不使用其他的抗反转病毒试剂。在（为基准的）初诊时抽取静脉血样（凝块和全血EDTA）并以一个月的间隔再次抽取。

胶囊：

每个胶囊含200mg的Hypoxis种提取物（大约100mg的化合物Ⅴ-Ⅷ）并告知患者吞服这种胶囊每天三次每次两个，即吞服总量为1200mg/天的提取物。

血液分析：

凝血：

用这种血样借助通常的捕获ELISA药具来定量血清HIV抗原血症。所用培育条件包括用甘氨酸-盐酸缓冲液对每种血清样品进行予处理，以便分离免疫复体。这就保证了所谓的总P24核心蛋白的测量。且使不仅是留在循环中的该核心蛋白因抗P24核心蛋白抗体而不呈复合态。结果以按照校准曲线确定的绝对值Pg/ml血清来表达。EDTA全血

全血被用来通过单克隆抗体识别和定量淋巴细胞亚群。简而言之，用单克隆抗体的混和物培育100μl血液，该抗体以如下所示的不同荧光染料标记：

CD3-FITC/CD4-PE

CD3-FITC/CD8-PE

CD3-FITC/CD19-PE

CD3-FITC/CD16+CD56-PE

CD8-FITC/HLA-Dr-PE

这些混和物检测下列细胞亚群名为：T-辅助细胞;T-抑制因子;B-细胞;NK-细胞和激活的抑制因子细胞。

培育20分钟后用溶胞溶液（FACS溶胞缓冲液）对血红细胞溶胞，将细胞聚成球粒并用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤一次。细胞凝固在含0.5%V/V甲醛的500μl PBS内。

使用FACS筒形血细胞计数器评定细胞荧光。用530/30nm通频滤光器测量FL1（荧光素）并且用585/42nm通频滤光器测FL2（藻红素）。使用Simulset软件程序进行分析，该程序从分析门排除粒性细胞和单核细胞而自动设定淋巴细胞门。

所有结果皆以阳性淋巴细胞（即CD3和CD4或CD3和CD8共同表达的细胞）的百分数来表示。在这种方式中，CD4阳性单核细胞被排除在CD4⁺T-细胞的计算之外。同样，CD8⁺天然杀伤（NK）细胞被排除在CD3⁺，CD8⁺T-抑制因子亚群之外。

绝对细胞数是根据用于全血的等分试样的基础血液学来进行计数的。从淋巴细胞不同计数的百分数中可计算阳性细胞的绝对值。这样进行所有亚群的分析。

对这些亚群的基准值和接续值之间观察到的变化可以如下方式分析：

患者的特殊亚群的绝对值为基线值＝X，

测量同样参数的第一个接续值＝X¹，

因此在这个参数的变化＝X¹-X。

X¹-X为正值表示所测参数增加。反之负值表示该参数在接续值和基线之间是减少。

计算两个组内所有治疗体的这个参数的平均变化，其结果或以平均绝对变化值或以相对于基线值的平均变化值百分数来表达。

结果：

血清病毒抗原血症（P24核心蛋白含量）

血清P24核心蛋白的测定揭示出：和经同样的一个月周期时其平均P24核心蛋白含量升高17.9Pg/ml的对照组即未处置群体（n＝11）相比较，处置组（n＝7）显示平均降低为-13.8Pg/ml。与之类似，分析2个月接续的P24核心蛋白含量时，处置组（n＝6）显示平均增加2.5Pg/ml，这与非处置组（n＝4）平均增加31.4Pg/ml形成了有利的对比。这些结果以绘图方式表现在图33中。

应当注意，在处置持续较长周期的四个患者中采用该方法未检测到P24核心蛋白含量，与此同时在未处置的任何治疗体中这种降低或转成负值的现象也不明显。与此相反，未处置治疗体显现P24核心蛋白含量随时间不断增长。

淋巴细胞亚群

照图1所示，处置组患者（n＝7）的所分析的所有淋巴细胞亚群显出非常有利的增加。确实，一个月后淋巴细胞总数的平均增加伴随有下列细胞的一般性增加：CD3⁺细胞（T细胞），T-辅助细胞（CD4⁺），T-抑制因子细胞（CD8⁺），B细胞和NK细胞，以及表达细胞活性标记物的CD8⁺细胞（CD8⁺Dr细胞）馏分。在细胞亚群测量中的平均增加量有利地与用其他诸如AZT（在实施例9中陈述）和Didanosine的抗反转病毒剂进行临床诊断公布的结果形成比较。确实，Fiscd等人（NewEng.J.Med.1990，323，1009-1014）报导：在他们用标准剂量（250mg/4hr）和减少剂量（100mg/4hr）的AZT处置30个月的处置组中，暂时平均增加25CD4⁺细胞/mm³血液。

另一方面，未处置组（n＝11）经同样时期显示了恶化的免疫参数（表14）。显然可见，持续一个月后显出绝大多数细胞亚群减少，这似乎是证实，这些患者的免疫状态随着如上报导的P24核心蛋白含量的明显化而衰退。

表14

持续1月后细胞亚群中平均绝对改变（对照各组）

该值以绝对细胞/μl血液来表示。

正值结果表示相对基线值是增加的，而负值表示相对基线值是减少的。

组间差别不仅明显地发生在比较平均绝对变化的时候，也反映了相对于基线值平均百分比的变化。为容易比较，这些数据列在图34中。

用2个月持续的参数可以得类似结果。如从表15中所见，未处置组（n＝4）总是显示CD4⁺、B细胞和NK细胞数的减少。其他细胞亚群稍示增加。然而在处置组，测量的所有参数在平均绝对变化以及平均百分比变化两个方面都显示恒定的显著的增大（表15）。再者，在我们的处置组观察到的平均绝对值变化可有利地与用AZT进行的其他临床诊断所公开的数据形成对比。

表15

持续2月后比较各组间细胞亚群的平均绝对变化

该值以绝对细胞/μl血液来表示。

正值表示相对于基线值的增加，而负值表示相对于起始值的减少。

从实施例10中已显出来自Hypoxis物种的提取物有抗HIV的体外活性，其可抑制HIV复制（P24核心蛋白生成）和HIV-RNA生成。

患者每日吞服1200mg的Hypoxis物种提取物，处置一个月以及两个月后显示出改进的免疫状态，这个结果是大有希望的。所测量的免疫参数包括：T-细胞（T-辅助细胞和T-抑制因子细胞两者），B-细胞和NK细胞增大的数目。与此同时，治疗体血清中测量的P24核心蛋白的生成发生迟滞以及明显减少。

另一方面，经相同时期的对照的未处置的治疗体表现出总是恶化的免疫参数和P24核心蛋白血清含量的增大。这些治疗体的CD4⁺细胞以及其他细胞亚群呈现持续减少，如同在其他抗HIV临床诊断的表现一样（Foulds等人，Drugs，1992，44，94-116和Prince等人;J.Acq.Immuno.Def.，1991，4，1227-1232）。

实施例11

化合物ⅩⅧ抑制呼吸道融合病毒（RSV）

将化合物ⅩⅧ加到在塑料管内以倾斜培养生长的Hep-2细胞中，分别获得的最终浓度是50、100和200μg/ml。然后将培养液分别用高标准病毒剂量，十分之一的所说标准剂量，以及百分之一的所说标准剂量的呼吸道融合病毒（RSV）来接种。于33℃培育4天后用反相反差显微镜视觉观测细胞，并记录合胞体生成的程度，即含有三个或多个细胞核的单个细胞，其表示如下：

a＝0-25%，b＝25-50%，c＝50-75%和d＝75-100%的细胞含有三个或多个细胞核。

所得结果列于下面的表16中：

表16

存在和不存在化合物ⅩⅦ培育4天后合胞体生成程度

实施例12

化合物ⅩⅦ对细胞巨化病毒（CMV）的作用

将化合物ⅩⅦ加到初级胎儿纤维细胞的组织培养液中，分别获得的最终浓度为50、100和200μg/ml。然后分别用高的标准病毒剂量的、十分之一所说标准剂量的和五十分之一所说标准剂量的细胞巨化病毒（CMV）接种这些培养液并培育4天。

以显微镜目视检查培养液来测定CMV的细胞发病作用，根据是细胞全膨胀的程度，其中为a＝0-25%，b＝25-50%，c＝50-75%和d＝75-100%的受全膨胀影响的细胞。结果列于下面的表17。

表17

培育4天后化合物ⅩⅦ对细胞巨化

病毒的细胞治疗效果程度的影响

在200μg/ml时8个培养液中有5个显示了因化合物引起的毒性征候。

Claims

1、在制备处置人或动物治疗体病毒感染的物质或组合物方面的一种化合物、物质或组合物的用途，该物质或组合物包含至少一种相应于通式(1)的化合物：

其中R₁、R、R₃和R₄可相同或不同并且选自-H，-OH，A，B，C和D，而且其中：

A=

B= (其中任意1-3个-OSO^θ ₃基团可选地用-OH取代)

C=

和

D=-OSO^θ ₃，

2、根据权利要求1的用途，其特征在于每个所说的通式（1）化合物中的R₂和R₃选自-OH，-H和D。

3、按权利要求1或2的用途，其特征在于每个所说的通式（1）化合物中R₁和R₄选自-OH，A，B，C和D。

4、按权利要求1-3的任一项用途，其特征在于每个所说通式（1）的化合物选自化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ，其具有的R₁，R₂，R₃和R₄按前文表1中所述。

5、按权利要求1-4所包括的任一项用途，其特征在于至少一种所说通式（1）的化合物构成至少一植物物种的提取物的一部分，该植物物种是仙茅科（Hypoxidaceae）植物成员。

6、按权利要求5的用途，其特征在于每个所说通式的（1）化合物构成自为仙茅科植物成员的至少一种植物物种的提取物的一部分。

7、按权利要求5或6的用途，其特征在于提取物是来自至少一种植物物种，所说植物种为选自Hypoxis，Spiloxene，Curcuglio和Campynema植物属的成员。

8、按权利要求7的用途，其特征在于提取物来自至少一种植物种，该植物种选自Hypoxis nitida，H.obtusa，H.rigidula，H.villosa，H.interjecta，H.multiceps，H.nyasica H.rooperi H.acuminata，H.latifolia，Spiloxene schlechteri和其杂交物。

9、按权利要求5-8之任一用途，其特征在于每个通式（1）的化合物选自化合物Ⅴ-Ⅷ，其中的R₁、R₂、R₃、R₄列于上文的表1。

10、按权利要求4的用途，其特征在于每个通式（1）的化合物选自化合物Ⅰ-Ⅳ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

11、按权利要求4的用途，其特征在于每个通式（1）的化合物选自化合物Ⅴ-Ⅷ，其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

12、根据权利要求4的用途，其特征在于每个通式（1）的化合物选自化合物Ⅸ-ⅩⅩⅧ。其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

13、根据权利要求1-12的任一项用途，其特征在于病毒感染选自人体免疫缺乏症病毒（HIV）感染，呼吸道融合病毒（RSV）感染和细胞巨化病毒（CMV）感染。

14、根据权利要求13的用途，其特征在于病毒感染是HIV感染。

15、一种用于处置人或动物治疗体病毒感染的化合物、物质或组合物，该化合物、物质或组合物的特征是其包括至少一种按照通式（1）的化合物：

其中R₁、R₂、R₃和R₄可相同或不同并选自-H，-OH，A，B，C和D，其中

A ＝

B ＝

（其中任意1-3个-OSO 基团可选地用-OH取代）

C ＝

;以及

D ＝-OSO

16、根据权利要求15的化合物、物质或组合物，其特征在于其包括的至少一种化合物选自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

17、根据权利要求16的化合物、物质或组合物，其特征在于其包括的至少一种化合物选自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

18、根据权利要求15-17的化合物、物质或组合物，其特征在于其中的病毒感染选自人体免疫缺乏症病毒（HIV）感染，呼吸道融合病毒（RSV）感染和细胞巨化病毒（CMV）感染。

19、根据权利要求18的化合物、物质或组合物，其特征在于病毒感染是HIV感染。

20、一种用作药剂或药品处置人或动物治疗体病毒感染的化合物、物质或组合物，其特征在于其包括至少一种按通式（1）的化合物：

其中R₁、R₂、R₃和R₄可相同或不同且选自-H，-OH，A，B，C和D，而其中

B ＝

（其中任意1-3个-OSO 基团可选地用-OH取代）

C ＝ ;以及

D ＝ -OSO

21、根据权利要求20的化合物、物质或组合物，其特征在于其包括的至少一种通式（1）的化合物选自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文的表1。

22、根据权利要求21的化合物、物质或组合物，其特征在于其包括的至少一种化合物选自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

23、根据权利要求20-22之任一项的化合物、物质或组合物，其特征在于该病毒感染选自人体免疫缺乏病毒（HIV）感染，呼吸道融合病毒（RSV）感染和细胞巨化病毒（CMV）感染。

24、根据权利要求23的化合物、物质或组合物，其特征在于病毒感染是HIV感染。

25、一种用作活性治疗剂处置人或动物治疗体病毒感染的化合物、物质或组合物，其特征在于其包括至少一种按照通式（1）的化合物：

A ＝

B ＝

（其中任意1-3个-OSO

基团可选地用-OH取代）

C ＝

以及

D ＝ -OSO

26、根据权利要求25的化合物、物质或组合物，其特征在于它包括的至少一种通式（1）的化合物选自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文的表1。

27、根据权利要求26的化合物、物质或组合物，其特征在于它包括的至少一种化合物选自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

28、根据权利要求25-27之任一项的化合物、物质或组合物，其特征在于所说病毒感染选自人体免疫缺乏病毒（HIV）感染，呼吸道融合病毒（RSV）感染和细胞巨化病毒（CMV）感染。

29、根据权利要求28的化合物、物质或组合物，其特征在于病毒感染是HIV感染。

30、一种用于制备组合物、药品或药剂来处置人或动物治疗体病毒感染的化合物、物质或组合物，其特征在于它包括至少一种相应于通式（1）的化合物：

A ＝

B ＝

（其中任意1-3个-OSO 基团可选地用-OH取代）

C ＝ ;以及

D ＝ -OSO

31、根据权利要求28的化合物、物质或组合物，其特征在于它包括的至少一种通式（1）的化合物选自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

32、根据权利要求31的化合物、物质或组合物，其特征在于它包括的至少一种化合物选自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1。

33、根据权利要求30-32之任一项的化合物、物质或组合物，其特征在于所说病毒感染选自人体免疫缺乏病毒（HIV）感染，呼吸道融合病毒（RSV）感染和细胞巨化病毒（CMV）感染。

34、根据权利要求33的化合物、物质或组合物，其特征在于该病毒感染是HIV感染。

35、一种化合物，具有如下通式（1）：

其特征在于：

R₁、R₂、R₃和R₄相同或不同且选自-H，-OH，A，B，C及D，而其中：

A ＝

B ＝（其中任意1-3个-OSO

基团可选地用-OH取代）

C ＝

;以及

D ＝ -OSO

条件是当R₂和R₃两者选自-OH和-H时，R₁和R₄不是两个-OH且R₁和R₄不是两个A。

36、根据权利要求35的化合物，其特征在于R₂和R₃选自-OH，-H和D。

37、根据权利要求35或36的化合物，其特征在于R₁和R₄选自-OH，A，B，C和D。

38、根据权利要求35-37的化合物，其特征在于该化合物选自按照式（1）的化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R₁，R₂，R₃和R₄列于上文表1。

39、一种处置人或动物治疗体病毒感染的药品或药剂，其特征在于它包括作为一种活性治疗剂的至少一种如权利要求35-38之任一项所限定的化合物，与之一起的稀释剂或载体。

40、根据权利要求39的药品或药剂，其特征在于其存在的形式选自含有活性治疗剂的片剂，粉剂，胶囊和液体，所述片剂和胶囊每个含20-50mg的活性治疗剂，而粉剂和液体每剂含4-10mg/ml的活性治疗剂。

41、一种通式（1）化合物的制备方法，该化合物选自化合物Ⅸ-Ⅻ且其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1，该方法的特征是它包括：从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取选自化合物Ⅴ-Ⅷ的一种通式（1）的化合物，将提取的化合物过硫酸化，得到作为产品的所述的选自化合物Ⅸ-Ⅻ的化合物。

42、选自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ且其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1的通式（1）的化合物的一种制备方法，其特征在于它包括：从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取选自化合物Ⅴ-Ⅷ的一种通式（1）的化合物，将所述提取化合物进行酶水解，得到选自化合物Ⅰ-Ⅴ的一种化合物，该方法进而包括将选自化合物Ⅰ-Ⅳ的所说化合物进行硫酸化，得到作为产物的选自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的所说化合物。

43、一种为化合物ⅩⅢ且其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1的通式（1）化合物的制备方法，其特征在于它包括：从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取具有通式（1）的化合物Ⅴ，将化合物Ⅴ进行酶水解得到化合物Ⅰ，将所说化合物Ⅰ进行葡糖苷酸化，得到作为产物的所说化合物ⅩⅢ。

44、选自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅺ-XXⅧ且其中R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1的通式（1）的化合物的一种制备方法，其特征在于它包括：从为仙茅科植物成员的至少一种植物种中提取选自化合物Ⅴ-Ⅷ的至少一种通式（1）化合物，使人或动物治疗体摄入该提取的化合物，收集摄入后治疗体的尿，该尿含有作为选自化合物Ⅴ-Ⅷ的代谢物的选自化合物Ⅰ-Ⅴ和ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的所说化合物，自尿中提取所述的代谢物作为产物化合物。

45、根据权利要求44的方法，其特征在于所说产物化合物作为所说化合物Ⅸ-XXⅧ部分多元混合物从尿中提取，选自化合物Ⅴ-Ⅷ的化合物作为化合物Ⅴ-Ⅷ的部分混和物从植物物种中提取。

46、根据权利要求41-45之任一项的方法，其特征在于它包括每种产物化合物的分离和提纯步骤。

47、一种选自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ且其中的R₁、R₂、R₃和R₄列于上文表1的通式（1）化合物，其特征在于该化合物是采用权利要求41-46之任何一个方法而得到的。