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CN109125812A - 一种用于引导骨再生的复合膜及其制备方法 - Google Patents

一种用于引导骨再生的复合膜及其制备方法 Download PDF

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CN109125812A
CN109125812A CN201810958659.6A CN201810958659A CN109125812A CN 109125812 A CN109125812 A CN 109125812A CN 201810958659 A CN201810958659 A CN 201810958659A CN 109125812 A CN109125812 A CN 109125812A
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compacted zone
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韩韦红
葛翠兰
钱锵
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SHANGHAI BAIYI BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
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Abstract

本发明公开一种用于引导骨再生的复合膜及其制备方法。该复合膜的制备方法包括以下操作步骤：猪空肠经机械方法处理得到小肠粘膜下层，经酸、去污剂和碱处理等过程后多层横纵叠加得到致密层，将制备的胶原溶液采用静电纺丝技术均匀地将其纺丝在致密层复合后经真空冷冻干燥得到复合膜。用该方法制备的复合膜具有优异的生物相容性和生物活性，易被组织吸收，结构中的致密层可以选择性阻止软组织向骨缺损区域长入，疏松层为疏松多孔结构，利用静电纺丝技术，疏松层比表面积大，有利于两层膜之间的结合和细胞的粘附及向孔内长入，还可以结合生物活性因子或药物，支持新组织再生，促进伤口愈合。该复合膜的结合，使其获得优异的机械性能，能在一定时间保持再生空间的稳定。

Description

一种用于引导骨再生的复合膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种引导骨再生的双层天然复合膜，用于骨组织和牙周组织的修复。。
背景技术
引导骨组织再生术是目前临床上对组织缺损修复的最佳选择，其原理是通过再生膜的物理屏障等作用，阻止软组织进入骨生长区，为骨缺损区域的新骨生长预留再生空间，并引导成骨类细胞在骨缺损区生长成新骨，从而达到骨性愈合的目的。
早期用于引导骨再生的第一代再生膜材料是以聚四氟乙烯（e-PTFE）为代表的不可降解材料，该类材料由于不能被组织吸收，放置4-6周后需要二次手术取出，增加了创伤的机会，再次手术可能对组织造成损伤，且对新附着的细胞和组织产生破坏作用，并且，传统的再生膜材料缺乏抗菌能力常导致修复失败。
生物可降解材料是目前引导骨再生膜研究较多的一类材料。由于该类材料生物相容性好，分解代谢产物无毒，易于成型和加工，有一定的强度以维持组织增生所需的空间，在组织再生后，材料完全降解或被组织吸收，是一类具有理想前景的材料。生物可降解材料分为人工合成高分子材料和天然高分子材料。其中以聚乳酸类等代表的人工合成高分子材料，具有优异的力学性能和生物相容性，中国专利申请号201010105573.2和201310586143.0均以聚乳酸类材料制备引导组织再生膜。但由于聚乳酸水解酯键断裂后使羧基显露增加导致局部pH值下降，易导致患者出现无菌性炎症反应。以胶原为代表的天然高分子再生膜具有抗原性低、生物相容性好，且有凝血作用，可参与组织愈合过程，降解速率可根据需要调节等优点，是目前国内外使用最多的引导组织再生膜，如国内已经上市的Bio-Gide胶原膜、海奥口腔修复膜、博特医用胶原膜等。但目前临床广泛应用的单纯的来自猪胶原、牛皮或牛腱的胶原作为引导组织再生膜，均存在以下缺陷：一是体内降解时间短；二是相对于再生膜的要求，胶原膜的抗张力较小，在应用过程中容易发生塌陷而失去空间维持能力；三是胶原膜容易导致局部慢性炎症反应。之前的研究表明，暴露在口腔内的胶原膜（Bio-Gide胶原膜和海奥口腔修复膜）会加速降解，增加感染的风险。（白彭，叶平，吴润发，戴勇中.两种胶原膜暴露于口腔环境中降解作用的对照研究.中国口腔种植学杂志，2011,16(01):56-57.）在胶原膜的制备过程中可以通过不同的交联技术及加工工艺降低胶原的抗原性，提高生物相容性并调节其降解速度，增加其机械强度。博特医用胶原修复膜就为醛类交联加工制成的白色片状多孔薄膜。中国专利CN201710126662.7和CN201710124188.4均采用戊二醛为交联剂以到达提高机械性能和降低降解速度的效果，但交联剂的引入，特别是醛类交联剂的引入，会对人体产生潜在的毒副作用，长远来看，找到一种无需添加交联剂且能满足临床需求的引导组织再生膜势在必行。
另外，目前报道的引导组织再生膜大多设计成双层膜或多层膜的形式，但是容易出现分层和撕裂问题。为了避免多层膜粘结不紧密，需要机械压合等复杂工序，而影响了再生膜的微观结果和修复效果。同时多层复合膜间机械强度不均一，多层复合的结构使得植入后有异物感，而临床应用效果不好。中国专利申请号CN201710126698.5所述的一种骨膜制备方法，虽然均能克服上述缺点，但其繁琐的制备工艺，很不利于今后的实际生产。
因此，临床上急需一种生物相容性好、可诱导组织再生、降解时间合适、机械强度好且不易引发感染的引导骨组织再生膜，而且该种膜的生产方式应适合产业化生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物相容性和机械强度好、降解时间合适且不易引发感染，同时又能引导骨再生的复合膜及其制备方法。
上述一种用于引导骨再生的复合膜的制备方法，具体步骤如下：
（1）复合膜致密层的制备
取新鲜屠宰动物的猪小肠组织清洗洁净，置于0.5%醋酸溶液浸泡30min，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，使用物理刮除法除去猪小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层（SIS），切成片段，使用纯化水冲洗3 遍；
使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100min，进行病毒灭活。之后使用纯化水超声清洗3遍；
使用浓度为95%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h。之后使用注射用水超声清洗3遍；
使用含0.02％胰蛋白酶和含0.02%EDTA的混合水溶液，SIS材料与胰蛋白酶/EDTA溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡30min。之后使用PBS超声清洗3遍；
使用含5U/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20min。之后使用PBS漂超声清洗3遍；
使用含5U/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20min。之后使用PBS超声清洗3遍；
使用浓度为25mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50min。之后使用PBS超声清洗直至中性；
将脱细胞处理后的单层猪小肠粘膜下层铺展开，按照横向和纵向交替的方式叠加2~10层，铺于模具上，冻干备用，复合膜致密层的扫描电子显微镜照片见图1；
（2）胶原溶液的制备
用有机酸溶解胶原，形成胶原溶液；胶原溶液的质量体积比浓度范围为0.05~8%，粘度系数为1000~4000cp。搅拌溶解好的胶原溶液，静置脱泡处理；
（3）复合膜的制备
将（1）得到的致密层置于模具中，将（2）制备好的胶原溶液通过静电纺丝技术均匀地纺在致密层上，然后真空冷冻干燥后脱模即可，复合膜疏松层的扫描电子显微镜照片。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
本发明提供的一种用于用于引导骨再生的复合膜，其生物相容性和机械强度好、降解时间合适且不易引发感染，同时又能引导骨再生，植入体内后，可以取得以下有益效果：
1.本发明提供的引导骨再生复合膜，由于致密层具有优异的机械性能和合适的降解时间，可以选择性阻止不需要的软组织长入骨缺损区，且保持和延长再生空间的维持能力和稳定性；
2.本发明提供的引导骨再生复合膜，由于疏松层是利用静电纺丝技术制备而成的，所得胶原纤维层具有比表面积大的优势，有利于增强致密层和疏松层之间的结合力度，有利于提高细胞在疏松层的粘附能力及细胞向孔内生长的能力，有利于新骨的再生；
3.本发明提供的引导骨再生复合膜的制备方法中，静电纺丝比起涂覆，可以更方便又精确地通过调整工艺参数和时间，来控制胶原膜的孔径和厚度，适用于连续生产；
4.本发明提供的引导骨再生复合膜，具有较好的贴附性和柔韧性，不易撕裂破碎，利于手术操作；
5.本发明提供的复合膜的致密层，其降解产物的多肽成分具有抗菌性能，可进一步降低植入后炎症和感染的发生率；
6.本发明提供的复合膜的疏松层，可添加不同药物或生长因子，以获得更好地骨组织再生效果及加速创面愈合；也可以在植入体内之前通过浸泡方式装载促愈合物质或抗生素，从而进一步促进创口愈合和降低感染发生率；
7.本发明提供的复合膜的致密层，采用横纵交替的方式，可以克服单方向机械强度的不足，达到材料各力学性能均一的目的，避免手术中材料撕裂的情况发生。
附图说明
图1为本发明复合膜致密层的扫描电子显微镜照片；
图2为本发明复合膜疏松层的扫描电子显微镜照片；
图3为本发明实施例3的抗菌性能检测结果；
图4为实施例5的动物实验Micro CT的扫描结果；
图5为实施例5的动物实验缺损区骨再生情况（BV/TV）；
图6为实施例6牙龈卟啉单细胞菌落在复合膜的生长情况；
图7为实施例6牙周膜干细胞在复合膜的生长情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1
复合再生膜致密层制备
（1）预处理
取新鲜屠宰动物的猪小肠组织清洗洁净，置于0.5%醋酸溶液浸泡30min，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，使用物理刮除法除去猪小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，切成片段，使用纯化水冲洗3 遍；
（2）病毒灭活
使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100min，进行病毒灭活。之后使用纯化水超声清洗3遍；
（3）去免疫原物质
使用浓度为95%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h。之后使用注射用水超声清洗3遍；
使用含0.02％胰蛋白酶和含0.02%EDTA的混合水溶液，SIS材料与胰蛋白酶/EDTA溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡30min。之后使用PBS超声清洗3遍；
使用含5U/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20min。之后使用PBS漂超声清洗3遍；
使用含5U/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20min。之后使用PBS超声清洗3遍；
使用浓度为25mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50min。之后使用PBS超声清洗直至中性；
（4）冻干
将脱细胞处理后的单层猪小肠粘膜下层铺展开，按照横向和纵向交替的方式叠加6层，铺于冻干模具上冻干，待用。
实施例2
对实施例1制备得到的样品进行免疫原性物质检测
（1）细胞残留量检测方法：用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成0.4微米的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，苏木精—伊红染色，显微镜下观察细胞残留情况和基质纤维结构；
（2）DNA含量检测方法：依据YY/T 0606.25-2014《动物源性生物材料DNA 残留量测定法：荧光染色法》进行检测；
（3）α-Gal抗原含量检测方法：将样品用多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，片厚3微米。利用生物素标记BSI-B4与α-Gal抗原的特异亲和特性进行免疫组化反应。染色结果判定 ：深棕黄色颗粒为强阳性（+++）， 棕黄色颗粒为阳性（++），黄色颗粒为弱阳性（+），未见着色为阴性 （-）；
（4）脂质含量检测方法：参照《GB/T 5009.6 食品中脂肪的测定》中索氏抽提法进行测定；
结果显示：残留细胞量为0个/镜下视野（400×）、 DNA 残留量为80±12pg/g、α-Gal抗原为阴性、脂质含量为0.8%。
实施例3
对实施例1制备得到的样品进行抗菌性能检测
用研磨棒在0.01M的盐酸中研磨实施例1所制得的样品，直至无肉眼可见颗粒，并调整其浓度为100mg/10mL。加入胃蛋白酶消化，胃蛋白酶:样品比例为1:10。 25℃下持续搅拌48h，后降温至4℃，加入1/10体积的0.1 M氢氧化钠调节PH至7.2-7.4；
制备混菌培养基平板，用接种环分别挑取少许已培养好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面培养基物于无菌生理盐水 5ml中，制成菌悬液。取菌悬液 1.0ml和上述经降解的样品1ml加到已灭菌干燥的培养皿中，加入冷却至 50℃左右的普通营养肉汤琼脂培养基，摇匀，待充分冷凝后备用，35～37℃倒置培养 24 小时，观察细菌生长情况；同时增加不用抗菌材料和加入5 μg/mL抗菌肽做对比，结果见图3。
实施例4
对实施例1制备得到的样品进行力学性能检测
（1）缝合强度
方法：用3-0非吸收缝合线在样品两边中央距边缘2mm处缝合，将缝合线另一端与样品的另一端分别固定在拉力仪两端上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值；
结果：缝合强度在3N-5N范围；
（2）拉伸强度
方法：将样品沿两个方向分别裁剪为宽度为10mm形状；裁剪后在相对湿度40%-60%、温度22±2℃环境内放置2小时后进行试验。夹具间距为25mm，将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度拉伸，记录断裂时的最大力值；
结果：拉伸强度在30N-35N范围；
（3）顶破强度
方法：按照《YY 0500-2004 心血管植入物 人工血管》8.3.3.2探头破裂强度的测量方法选取9.5mm直径探头进行检测；
结果：顶破强度在85N-90N范围。
实施例5
（1）用于骨组织再生的复合膜
用醋酸溶解胶原，形成胶原溶液，粘度系数为1800 cp。在胶原溶液中加入骨形态发生蛋白生长因子，含量为5.0 μg/mL，混合均匀后静置脱泡；
将实施例1获得的致密层裁剪成长方形模具大小，置于模具中，将制备好的胶原溶液采用静电纺丝技术均匀地将其纺丝在致密层上，在-40℃下预冻8 h后，转移至冷冻干燥机中-50℃下干燥48h。脱模即可获得引导骨组织再生的复合再生膜；
（2）冻干胶原的制备
将（1）制备的胶原溶液，在-40℃下预冻8 h后，转移至冷冻干燥机中-50℃下干燥48h。脱模即可获得含骨形态发生蛋白生长因子的冻干胶原；
（3）动物实验
方法：采用实施例1获得的致密补片层、实施例5（2）获得的冻干胶原及实施例5（1）获得的复合膜分别用于Beagle犬下颌骨缺损区覆盖口腔的修复研究；
植入3个月后，Micro CT 扫描结果见图4，缺损区骨再生情况用骨体积分数（BV/TV）表示见图5，结果显示，复合膜的复合修复效果远比单一的致密补片层或冻干胶原层好很多。
实施例6
用于牙周组织再生的复合再生膜
用醋酸溶解胶原，形成0.5%质量体积比的胶原溶液。在胶原溶液中加入甲硝唑，浓度为1.0 mg/mL，混合均匀后静置脱泡；
将实施例1获得的致密层裁剪成长方形模具大小，置于模具中，将制备好的胶原溶液采用静电纺丝技术均匀地将其纺丝在致密层上，在-20℃下预冻20 h后，转移至冷冻干燥机中-54℃下干燥24h。脱模即可获得引导牙周组织再生的复合再生膜；
将上述获得的含有甲硝唑的复合再生膜，采用牙周炎主要病原菌—牙龈卟啉单细胞菌进行体外抗菌活性实验，结果可验证复合再生膜的抗菌效果，见图6。其中图6（左）显示的为生长的牙龈卟啉单细胞菌落，图6（右）显示的为被杀灭的牙龈卟啉单细胞菌落。由此可见，本发明的含甲硝唑的复合再生膜，可以保持甲硝唑的药效，达到明显抑制牙龈卟啉单细胞菌生长的作用；
将上述获得的含有甲硝唑的复合再生膜，采用牙周干细胞进行体外细胞粘附铺展实验，结果可证实该复合再生膜的具有优异的促进细胞铺展能力，见图7。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (9)

1.一种用于引导骨再生的复合膜，其特征在于：复合膜包括致密层和疏松层，所述致密层由猪小肠粘膜下层构成，疏松层由采用静电纺丝技术制备的胶原膜构成。
2.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于：
所述猪小肠粘膜下层致密层通过病毒灭活、去除免疫原物质、叠加、冻干制备工艺制成；
所述胶原疏松层通过溶解、载药、静置脱泡、静电纺丝、冻干制备工艺制成。
3.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于：所述疏松层可以采用静电纺丝技术，通过调节工艺参数和时间来控制胶原膜的孔径和厚度。
4.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于：所述致密层均匀分布着互相贯穿的孔，孔径＜30μm，猪小肠粘膜下层横向、纵向交替叠加2-10层，厚度100-1000μm，所述疏松层是胶原溶液通过静电纺丝成膜后真空冷冻干燥形成，孔径300-500μm，厚度100-500μm，静电纺丝的纤维直径为100-350 nm。
5.根据权利要求1或2所述的复合膜，其特征在于：所述致密层免疫原性物质极低，包括残留细胞量不大于1个/镜下视野（400×）、DNA 残留量不大于120pg/g、α-Gal抗原为阴性（免疫荧光检测法）、脂质含量不大于1%。
6.根据权利要求1或2所述的复合膜，其特征在于：所述致密层具有一定力学性能，拉伸强度不小于18N、顶破强度不小于10N、缝合强度不小于2N、撕裂强度不小于2N。
7.根据权利要求1或2所述的复合膜，其特征在于：所述疏松层中可加入药物，药物可以为紫杉醇、阿霉素、庆大霉素、乙酰螺旋霉素、阿莫西林、甲硝唑、四环素、阿奇霉素、青霉素中的一种或多种，加入药物的浓度的0.1-20 mg/mL。
8.根据权利要求1或2所述的复合膜，其特征在于：所述疏松层中可加入生物活性因子，生长因子可以为骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子、成纤细胞生长因子中的一种或多种，加入生长因子的含量为2-10 μg/mL。
9.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于：所述复合膜具有体内可降解性，降解时间为8-20周，降解后具有抗菌作用。
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