CN109125328A - 3β-乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及3β‑乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明的3β‑乙酰基齐墩果酸可抑制转录因子RORγt的功能，抑制Th17细胞的分化，也能在RNA水平上抑制RORγt的靶基因IL‑17A、IL‑17F分子的转录表达，抑制IL‑17A细胞因子的分泌，抑制血清中anti‑dsDNA抗体的水平，降低脾脏中IL‑17A细胞总数，降低肾损伤程度；本发明的3β‑乙酰基齐墩果酸具有明显的Th17细胞活性抑制功能，为自免疫疾病治疗的新药研发提供先导结构。

Description

3β-乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及3β-乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

自免疫疾病大约影响了5％的人口，包括牛皮癣、多发性硬发症、风湿性关节炎、哮喘和炎症性肠道病在内的大约70多种人类疾病都和自免疫失调有关。目前自免疫疾病的治疗主要依赖于一些非选择性的免疫抑制剂，其疗效有限且副作用大，因而在临床中还没有非常特效的治疗自免疫疾病的药物。因此，开发新型的高疗效低副作用的自免疫药物成为一种急切的临床需要。最新研究表明，一种新的T细胞亚群Th17细胞和人类自免疫疾病和相关动物模型的发生相关。在风湿性关节炎、牛皮癣、哮喘、炎症性肠炎等自免疫疾病中，Th17细胞的特征细胞因子IL-17表达上调，而抑制IL-17表达和Th17细胞形成可以减轻自免疫疾病的发生或临床严重程度。现有研究表明Th17细胞的分化形成受到转录因子RORγt的控制，而RORγt基因敲除的小鼠中Th17细胞的分化能力下降，数量减少，同时诱导发生的小鼠EAE自免疫疾病概率和临床打分指标均有显著的降低。这意味着RORγt的功能抑制剂可以做为开发Th17介导的自免疫疾病治疗药物的定向靶标。

RORγt是类固醇类核受体家族成员，蛋白分子中包括一个保守的DNA结合域和有12个螺旋构成的配体结合域，而配体结合域是结合配体、核定位和二聚体形成的重要区域。类固醇类受体共激活分子SRCs能够通过结合配体结构域的AF2区域来解聚转录抑制复合物，招募转录激活分子，启动相关基因转录。目前RORγt的天然配体还没有找到，但最近两个研究找到了人工合成分子地高辛及其衍生物和SR1001能够特异性的结合到RORγt的配体结构域，抑制RORγt的功能并降低Th17细胞的分化能力，减弱小鼠自免疫疾病EAE的临床症状。然而地高辛及其衍生物具有很强的毒性，而SR1001分子尽管在体外能够有效抑制Th17细胞分化，但在体内实验中即使在高浓度给药下(40mg/kg)，也只能略微减轻EAE的临床症状。此外，SR1001能够同其他的RORs作用，选择性较差。这些研究一方面表明抑制RORγt的功能来治疗自免疫疾病是一个可行的方案，但目前还没有找到一个理想的靶标药物。因此，寻找高效低毒且有较强特异性的RORγt功能抑制剂将是开发Th17介导的自免疫疾病药物的一个重要方向。

目前没有基于RORγt靶点的Th17细胞活性抑制剂用于临床使用，现在发现的部分抑制剂尚处于临床前研究阶段，能否成药尚不确定。

发明内容

本发明的目的在于提供3β-乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用，本发明的3β-乙酰基齐墩果酸(AOA)可抑制转录因子RORγt的功能，抑制Th17细胞的分化，也能在RNA水平上抑制RORγt的靶基因IL-17A、IL-17F分子的转录表达，抑制IL-17A细胞因子的分泌。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明提供了3β-乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制转录因子RORγt的功能。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制Th17细胞的分化。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制RORγt的靶基因IL-17A、IL-17F分子的转录表达。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制IL-17A细胞因子的分泌。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于在一种肾炎动物模型中抑制血清中anti-dsDNA抗体的水平，降低脾脏中IL-17A细胞总数，减轻肾损伤的程度。

本发明还提供了一种治疗自免疫疾病的药物，所述药物含有3β-乙酰基齐墩果酸。

作为本发明所述治疗自免疫疾病的药物的优选实施方式，所述药物还含有药用载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的3β-乙酰基齐墩果酸可抑制转录因子RORγt的功能，抑制Th17细胞的分化，也能在RNA水平上抑制RORγt的靶基因IL-17A、IL-17F分子的转录表达，抑制IL-17A细胞因子的分泌，抑制血清中anti-dsDNA抗体的水平，降低脾脏中IL-17A细胞总数，降低肾损伤程度；本发明的3β-乙酰基齐墩果酸具有明显的Th17细胞活性抑制功能，为自免疫疾病治疗的新药研发提供先导结构。

附图说明

图1为3β-乙酰基齐墩果酸的结构式图与其在RORγt--Jurkat细胞中的EC₅₀、CC₅₀曲线图。其中，A为3β-乙酰基齐墩果酸的结构式图；B为3β-乙酰基齐墩果酸在RORγt--Jurkat细胞中的量效关系图；C为不同浓度的3β-乙酰基齐墩果酸与RORγt--Jurkat细胞生存率的关系图。

图2为3β-乙酰基齐墩果酸对IL-17A、IL-17F抑制作用的检测图。其中，A为3β-乙酰基齐墩果酸对IL-17A细胞因子抑制作用的流式检测图像；B为3β-乙酰基齐墩果酸对IL-17A细胞因子的抑制结果统计图；C为3β-乙酰基齐墩果酸对IL-17A、IL-17F表达量的影响结果统计图。

图3为3β-乙酰基齐墩果酸对小鼠血清中anti-dsDNA、脾脏中IL-17A细胞总数抑制作用的统计图。其中，A为3β-乙酰基齐墩果酸对不同年龄的小鼠血清中anti-dsDNA抑制作用的统计图；B为3β-乙酰基齐墩果酸对小鼠血清中anti-dsDNA抑制作用的散点统计图；C为3β-乙酰基齐墩果酸降低脾脏中IL-17A细胞总数的统计图。

图4为3β-乙酰基齐墩果酸对肾脏损伤的缓解作用的PAS染色图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中，若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 3β-乙酰基齐墩果酸在RORγt--Jurkat细胞中的EC₅₀、CC₅₀试验

1、基于转录因子活性的荧光素酶活性筛选系统按下述方法构建得到：

材料：

细胞系Jurkat为本实验室保存；DH5α细菌菌株由北京中科院遗传所马润林教授馈赠；限制性内切酶购自美国fermentas公司；DNA连接酶购自美国的NEB公司；报告基因序列IRES-GFP为发明人自有保存(也可以采用其他现有的报告基因序列)；报告质粒pGL4.31[luc2P/GAL4UAS/Hygro]质粒和pBIND质粒购自美国promega公司；DMEM培养基和RPMI1640培养基以及培养细胞用的丙酮酸钠、谷氨酰胺、β巯基乙醇、非必须氨基酸、双抗是购自美国life公司；胎牛血清(FBS)购自美国hyclone公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Lipo2000购自美国life公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自Sigma公司；8～12周龄的C57小鼠购自中山大学实验动物中心(SPF级)；T细胞电转试剂盒和电穿孔仪购自瑞士的lonza公司；潮霉素B购自瑞士Roche公司；逆转录试剂盒购自大连Takara公司；Realtime检测试剂盒购自美国promega公司；细胞因子hTGF-β和mIL-6购自美国RD公司；小鼠CD3和CD28抗体购自美国eBioscience公司；小鼠IL-17A的ELISA检测试剂盒购自武汉华美公司；其他常用化学试剂购自Sigma公司和上海生工公司。

方法：

质粒构建：将荧光蛋白基因IRES-GFP目的片段通过Not1单酶切位点插入到pBIND载体中完成pBIND-IRES-GFP的质粒构建；用PCR法从PBMC的cDNA中调取人的RORγt(hRORγt)目的基因，hRORγt调取时两端加上BamH1的单酶切位点；再将hRORγt基因克隆到pBIND-IRES-GFP质粒中，完成pBIND-Gal4DBD-hRORγt-IRES-GFP重组质粒的构建(Gal4DBD的序列是pBIND质粒自带的)。

细胞培养：Jurkat细胞培养在含10％FBS(胎牛血清)、1％双抗、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50μM的β巯基乙醇的RPMI1640完全培养基中。细胞置于5％CO₂，37℃培养箱中恒温培养，约每两天传代一次。

稳定细胞系的构建：pGL4.31⁺hRORγt⁺Jurkat稳定细胞系的构建：将20μg经Not1单酶切的质粒pGL4.31[luc2P/GAL4UAS/Hygro]电转入Jurkat细胞(1×10⁷)中，再用200μg/mL的潮霉素B进行抗性筛选；筛选进行2～3周后，再将20μg用限制性内切酶Eam1105酶切的pBIND-Gal4DBD-hRORγt-IRES-GFP重组质粒电转至经潮霉素B筛选后的Jurkat细胞中，再次转染后的细胞继续培养2～3周后，用GFP荧光蛋白标记进行流式分选，并收集GFP⁺阳性Jurkat细胞。

通天然植物抽提物分离得到3β-乙酰基齐墩果酸(AOA)，结构式如图1A所示。对3β-乙酰基齐墩果酸在RORγt--Jurkat细胞中的量效关系，以及不同浓度的3β-乙酰基齐墩果酸与RORγt--Jurkat细胞生存率的关系进行试验，试验结果分别如图1B和图1C所示。

2、EC₅₀试验

EC₅₀的测定基于构建的Gal4/hRORγt的报告体系：将pGL4.31⁺hRORγt⁺Jurkat细胞铺板至96孔圆底板中，每孔2×10⁵个细胞，按药物浓度梯度设置不同浓度值，在不同浓度的3β-乙酰基齐墩果酸下作用6h，之后收集细胞，进行luciferase活性检测以得到3β-乙酰基齐墩果酸的EC₅₀的值，结果如图1B所示。

由图1B可知，3β-乙酰基齐墩果酸具有抑制Th17细胞分化的关键转录因子RORγt的表达，根据计算公式测得3β-乙酰基齐墩果酸抑制RORγt转录因子表达的EC₅₀为0.9483μM。

3、CC₅₀试验

CC₅₀的测定基于构建的Gal4/hRORγt的报告体系：将pGL4.31⁺hRORγt⁺Jurkat细胞铺板至96孔圆底板中，每孔2×10⁵个细胞，按药物浓度梯度设置不同浓度值，在不同浓度的3β-乙酰基齐墩果酸下作用48h，之后加入

dimethylthiazolyl-2-5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)作用4h后收集细胞，进行luciferase活性检测以得到3β-乙酰基齐墩果酸的CC₅₀的值；结果如图1C所示。

由图1C可知，根据计算公式测得3β-乙酰基齐墩果酸的CC₅₀为23.96μM，毒性非常小，安全性很高。

实施例2 3β-乙酰基齐墩果酸对Th17细胞、IL-17A、IL-17F抑制作用的试验

通过体外Th17细胞分化实验，验证3β-乙酰基齐墩果酸具有抑制Th17分化的功能。通过流式细胞术检测，研究3β-乙酰基齐墩果酸对Th17细胞、IL-17A、IL-17F抑制作用，检测结果分别如图2A、图2B、图2C所示。

试验操作：实验前一天晚上用含有5μg/mL CD3抗体、1μg/mL CD28抗体的PBS溶液包被12孔板，每孔0.5mL，4℃包被过夜。第二天开展实验，首先用Miltenyi磁珠分选小鼠脾脏的CD4+T细胞，分选后的细胞按1×10⁶个/mL的细胞密度重悬细胞，向包被后的12孔板的每个孔加1mL的细胞悬液，同时向溶液中加入终浓度为5μg/mL的hTGF-β、30μg/mL的mIL-6的细胞因子、20μg/mL的mIL-1β、5μg/mL的anti-mouse-IL-4的抗体和5μg/mL的anti-mouse-IFN-γ的抗体，体外诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化。24h后，再向每孔加2.5μL的终浓度为0.625μM 3β-乙酰基齐墩果酸、2.5μM 3β-乙酰基齐墩果酸、10μM 3β-乙酰基齐墩果酸(并设置3个孔的DMSO对照组)，37℃、5％二氧化碳培养48h。48h后，每孔补加2mL RPMI1640完全培养基以及终浓度为5μg/mL的hTGF-β、30μg/mL的mIL-6的细胞因子、20μg/mL的mIL-1β、5μg/mL的anti-mouse-IL-4的抗体和5μg/mL的anti-mouse-IFN-γ的抗体和终浓度为0.625μM 3β-乙酰基齐墩果酸、2.5μM 3β-乙酰基齐墩果酸、10μM 3β-乙酰基齐墩果酸，补加完成后再培养48h。至此，CD4+T细胞体外诱导Th17分化培养了约5天，5天后收集细胞，用于抽提RNA和细胞染色后的流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测：用IL-17A和CD4的抗体进行细胞染色，实验操作严格按照eBioscience细胞内染色试剂盒和流式细胞仪操作说明进行，结果如图2所示。

如图2A、2B所示，随着3β-乙酰基齐墩果酸浓度的升高，3β-乙酰基齐墩果酸对于IL-17A细胞因子的抑制率也逐渐升高。

cDNA的合成及荧光定量PCR的检测：Trizol法提取细胞的总RNA，并按逆转录试剂盒的操作说明反转总RNA合成cDNA；然后用合成的cDNA按Promega公司的使用说明进行IL-17A、IL-17F基因的荧光定量PCR检测(以GAPDH基因为内参)，结果如图2所示。

如图2C所示，3β-乙酰基齐墩果酸也能够在RNA水平上抑制RORγt的靶基因IL-17A和IL-17F分子的转录表达。

实施例3 3β-乙酰基齐墩果酸对狼疮肾炎小鼠模型中血清anti-dsDNA的抑制和肾炎的治疗作用试验

建立姥鲛烷诱导的狼疮肾炎模型，腹腔单次注射姥鲛烷500μL，对照为单次注射500μL生理盐水。将3β-乙酰基齐墩果酸与溶剂对照和阳性药物泼尼松进行对比试验，药物均使用25％的无水乙醇与75％的羟丙基β环糊精(含量为30％)溶解，灌胃100μL，每周给药两次，连续给药2个月。进而研究3β-乙酰基齐墩果酸对小鼠血清中anti-dsDNA的抑制作用。结果如图3A、3B所示。

如图3A、3B所示，2为建立肾炎模型前的2月龄小鼠初始血清抗dsDNA抗体浓度，6为建立肾炎模型4个月后6月龄小鼠血清抗dsDNA抗体浓度，7、8为小鼠给予药物1个月、2个月后小鼠血清抗dsDNA抗体浓度。由图3A和图3B可知，3β-乙酰基齐墩果酸可以抑制各个阶段小鼠血清中anti-dsDNA抗体的水平，给予药物两个月后检测，3β-乙酰基齐墩果酸可以明显地抑制血清中anti-dsDNA抗体的产生。

ELISA检测血清中anti-dsDNA抗体的操作：(1)预处理板：poly-lys(2μg/mL)，100μL/孔，37℃孵育1h；洗板：PBST洗板，三次，每次3min；(2)包被抗原：包被dsDNA(3μg/mL)，100μL/孔，4℃过夜；洗板：PBST洗板，三次，每次3min；(3)封闭：使用20％FBS封闭，100μL/孔，37℃孵育2h；(4)孵育待测血清：将校准品血清倍比稀释，共8个稀释梯度分别为：50倍稀释、100倍稀释、400倍稀释、800倍稀释、1600倍稀释、3200倍稀释、6400倍稀释、12800倍稀释；100μL/孔，每个样本3个复孔，37℃孵育1h；洗板：PBST洗板，三次，每次3min；(5)孵育抗小鼠IgG抗体：二抗稀释为0.1％，100μL/孔，37℃孵育45min；洗板：PBST洗板，三次，每次3min；(6)TMB显色：加TMB，70μL/孔，37℃孵育3min；(7)终止显色反应：使用2M H2SO4，50μL/孔；(8)还用酶标仪读板。

脾细胞中IL-17A细胞总数的检测方法：用IL-17A和CD4的抗体进行细胞染色，实验操作严格按照eBioscience细胞内染色试剂盒和流式细胞仪操作说明进行，脾脏研磨，裂解红细胞后，获得脾细胞，用细胞计数仪记录细胞总数。通过流式结果，获得IL-17A细胞比例后，乘以脾细胞总数，获得脾细胞中IL-17A细胞总数，结果如图3所示。如图3C所示，3β-乙酰基齐墩果酸能降低脾脏中IL-17A细胞总数。

通过PAS染色试验观察肾脏损伤的缓解作用，试验结果如图4所示，由图4可知，与对照组相比，3β-乙酰基齐墩果酸可以大大缓解肾脏的损伤。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.3β-乙酰基齐墩果酸在制备治疗自免疫疾病的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制转录因子RORγt的功能。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制Th17细胞的分化。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制RORγt的靶基因IL-17A、IL-17F分子的转录表达。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制IL-17A细胞因子的分泌。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述3β-乙酰基齐墩果酸用于抑制血清中anti-dsDNA抗体的水平，降低脾脏中IL-17A细胞总数，降低肾损伤程度。

7.一种治疗自免疫疾病的药物，其特征在于，所述药物含有3β-乙酰基齐墩果酸。

8.如权利要求7所述的治疗自免疫疾病的药物，其特征在于，所述药物还含有药用载体。