CN109112124B - 一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法，测定转录组数据；TopHat2与参考基因组比对，结合Cufflinks对转录本拼接得转录本；去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠转录本、选择FPKM≥0.5转录本，确定疑似lncRNAs；用PFAM和CPC得lncRNAs。本发明确定在番茄I型腺体毛高表达的lncRNA，得调控番茄腺毛形成的lncRNA000100，全长序列为1266bp；该基因在番茄中超量表达，显著抑制I型番茄腺毛形成；可以在番茄抗虫、抗病毒、抗逆境等方面进行应用。

Description

一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

植物茸毛是表皮细胞所特化的细胞结构，具有重要的抗虫防病毒作用，同时也是研究植物细胞命运调控的模式系统。拟南芥茸毛和棉花纤维为典型的非腺体毛，其形成机制已经较为清楚。番茄、薄荷、烟草等的部分茸毛为典型的腺体毛，其调控机制少有研究。番茄茸毛中的腺体毛类型能够分泌甲基酮、倍半萜烯等次级代谢物而具有很好的抗虫性。番茄是我国重要的蔬菜作物，由于抗虫性研究较为薄弱而阻碍了抗虫种质资源的应用。因此，番茄腺体毛调控机制的研究对于利用腺毛资源来提高番茄的抗虫性和丰富植物细胞命运调控的分子机制具有重要意义。番茄lncRNA000100具有这样的一些功能，因此研究番茄表皮毛lncRNA000100对于丰富番茄茸毛调控途径以及植物细胞命运的调控机制具有重要的意义。

番茄茸毛有Ι-VII七种类型，其中I、IV、VI和VII属于腺体毛，II、III和V属于非腺体毛。I型腺体毛的腺体较小、具有一个长的多细胞颈部；II型和III型腺体毛长度相似，其中II型为多细胞基部，III型为单细胞基部；IV型腺体毛与I型腺体毛类似，只是多细胞颈部较短；V型茸毛长度稍短，基部为单细胞；VI型腺毛包含一个由4个腺体细胞组成的腺体，体积较大，易于观察；VII型腺毛的腺体不规则，由4-8个细胞组成。不同番茄材料具有不同的腺体毛类型和密度。潘那利番茄(Solanum pannellii)含有I、III、IV、VI、VII等5种类型，其中IV型腺毛密度最高；多毛番茄(S.hirsutum)含有I、III、IV、V、VI、VII等6种类型，其中IV、V、VI型腺毛密度大，I、III、VII型密度小；醋栗番茄(S.pimpinellifolium)含有II、V、VI等3种类型；秘鲁番茄(S.peruvianum)含有I、V、VI、VII等4种类型；普通栽培番茄(S.lycopersicum)含有I、III、V、VI、VII等5种类型。番茄体表密被的茸毛具有很好的抗虫性。危害番茄主要为刺吸式昆虫，例如烟粉虱、温室白粉虱、银叶粉虱等。这些害虫既可以直接取食危害番茄的生长发育，又可以携带病毒而传播病毒病。

番茄体表密被的茸毛具有很好的抗虫性。危害番茄主要为刺吸式昆虫，例如烟粉虱、温室白粉虱、银叶粉虱等。这些害虫既可以直接取食危害番茄的生长发育，又可以携带病毒而传播病毒病。番茄近缘野生种是番茄抗虫育种的主要资源，其中多毛番茄、潘那利番茄和秘鲁番茄的抗虫性研究较多，但由于其腺毛类型、密度等差异而导致其抗虫种类和抗性强弱不同。多毛番茄对温室白粉虱、桃蚜、美洲斑潜蝇、叶螨等18种虫害具有抗性；潘那利番茄对桃蚜、温室白粉虱、烟粉虱、甜菜夜蛾等9种害虫具有抗性；秘鲁番茄对南美番茄蛲虫、烟粉虱等具有抗性。另外，针对番茄腺体毛产生次级代谢物的抗虫性，研究较多的为IV和VI型腺毛产生的甲基酮、倍半萜烯和酰基糖等3种成分。潘那利番茄IV型腺毛由于具有较高的酰基糖含量而对斑潜蝇、棉铃、烟粉虱等都具有良好抗性。姜烯是多毛番茄VI型腺毛分泌的一种倍半萜烯，对马铃薯甲虫有明显毒害作用。多毛番茄VI型腺毛分泌的2-十三烷酮和2-十一烷酮对除甜菜夜蛾以外的昆虫表现出很好的抗性。

植物茸毛由于其存在的普遍性和重要性，越来越多的腺毛控制基因被定位和克隆。拟南芥茸毛是一种典型的非分泌型腺毛，其结构简单且受多个基因精确调控。GLABROUS1编码R2R3MYB转录因子，是拟南芥中克隆的第一个腺毛调控基因，它与bHLH蛋白ENHANCER OF GLABRA3和GLABRA3，以及WD40蛋白TRANSPARENT TESTA GLABRA1相结合形成复合体共同促进腺毛的形成。同时，另外一类R3MYB蛋白ENHANCER OF TRY AND CPC1(ETC1)、CAPRICE(CPC)、TRIPTYCHON(TRY)、TRICHOMELESS1(TCL1)负向调控腺毛的形成。棉纤维具有与拟南芥茸毛类似的结构和调控机制。例如，与拟南芥茸毛形成关键基因GL1同源的GaMYB2在棉纤维发育早期高表达，且异位表达能够恢复拟南芥突变体gl1的茸毛表型；GaMYB109同样是与GL1同源的R2R3MYB类转录因子，在棉纤维细胞伸长过程中起作用；两个编码含有WD重复结构域的基因—GhTTG1和GhTTG3，也能够恢复拟南芥突变体ttg1表皮毛，说明这类转录因子同样在拟南芥茸毛和棉花纤维具有相同的调控功能。编码HD-ZIP IV型蛋白的OCL4基因被抑制表达后能够促进大型腺毛的形成。黄瓜腺毛基因Tu也被分离，其编码C2H2锌指蛋白转录因子。薄荷、青蒿、番茄、烟草等体表的分泌腺毛形成的分子机制仍不清楚，仅有较少基因被鉴定。MIXTA基因编码R2R3MYB转录因子，是第一个被发现参与调控腺体毛形成的基因，其同源基因MYB MIXTA LIKE 1超量表达可以促进烟草腺毛数量的增加。番茄中多种类型的腺毛可能受不同的基因调控。目前已知的番茄腺毛控制基因有Wo、dl、gi、hl、hl-2等13个。但仅有Wo被定位和克隆，该基因属于HD-ZIP IV型转录因子，主要通过与一个B型细胞周期蛋白直接互作共同调控番茄I型腺毛的形成。

目前，在拟南芥、水稻、玉米等作物中均发现大量lncRNAs，但功能明确的lncRNAs仍不多见。成花诱导是植物生殖发育的关键环节，而春化作用又在该过程中发挥重要作用。植物感受低温抑制春化关键基因FLC的表达促进开花。最新研究表明FLC的反义转录本可以形成2个lncRNAs，COOLAIR和COLDAIR。COOLAIR的表达量在春化初期急剧上升，而COLDAIR在未春化之前就有少量表达，春化开始后持续增加。二者在春化过程的不同阶段发挥作用，低温诱导低表达的COOLAIR持续产生可以抑制FLC的表达，从而促进开花。水稻生殖器官表达谱分析确定多个组织特异性lncRNAs，这种特异性预示着这一类lncRNAs可能参与水稻的生殖发育过程。水稻光敏雄性核不育表型受一个lncRNA的调节，LDMAR。LDMAR足够的表达水平是维持花粉发育的决定因素；LDMAR单碱基突变导致其二级结构发生改变，表达水平下降造成正处于发育阶段的花药提前程序化死亡，出现不育性状。白菜核不育两用系的可育系花粉中特异表达的lncRNA，BcMF11，其异常表达促使绒毡层的提前降解和花粉败育，而且BcMF11下调引起的绒毡层降解和花粉败育起始于减数分裂时期。Npc48是在拟南芥根、茎、叶、花等各个组织中均有表达的lncRNA，过量表达后导致植株表现出叶锯齿、莲座叶直径增大等异常表型外，而且开花时间也显著推迟。GmENOD40是在豆科植物根瘤特异性表达且于共生固氮根瘤密切相关的lncRNA，其在水稻中的同源序列OsENOD40参与调控水稻的器官分化和维管束组织的发育。黄瓜中CsM10是在不同组织、不同发育阶段和不同光照周期都有差异表达一个lncRNA，推测其可能与黄瓜的雌雄分化相关。但是，到目前为止，lncRNA在植物中的功能研究不多，也没有长链非编码RNA参与植物茸毛形成的报道。因此，深入研究lncRNA000100调控番茄茸毛的形成机理对于丰富植物细胞命运调控具有重要意义。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中没有长链非编码RNA参与植物茸毛形成；关于调控番茄茸毛的形成机理对于丰富植物细胞命运调控缺乏指导依据。

(2)现有技术仅仅从转录调控的角度揭示了部分茸毛形成机理，并不能完全解释茸毛形成的全部调控机理。

(3)非编码RNA作为重要的调控因子，现有技术缺少对该类调控因子在植物中作用机制的研究报道。

解决上述技术问题的难度和意义：

难度：现有技术仅仅从转录调控的角度揭示了部分茸毛形成机理，不能认知长链非编码RNA参与茸毛形成能丰富茸毛调控的分子机理原理。

解决现有技术问题后，带来的意义为：

本发明对于利用长链非编码RNA促进茸毛形成，进而培育多毛抗虫品种也具有重要应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法。

本发明通过反向遗传学方法获得的一个调控番茄腺毛形成的关键长链非编码RNA(lncRNA000100)，利用转基因技术，对该lncRNA在番茄I型腺毛形成的功能进行验证、机理研究与应用。

本发明通过I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组的测定和分析，利用转录组学的技术，确定了在番茄I型腺体毛高表达的lncRNA，并克隆获得了一个调控番茄腺毛形成的lncRNA000100。该lncRNA全长序列为1266bp。本发明利用克隆的lncRNA000100基因在番茄中超量表达，显著抑制I型番茄腺毛形成。

本发明是这样实现的，一种调控番茄腺毛形成的基因，所述调控番茄腺毛形成的基因lncRNA全长cDNA序列为1266bp；cDNA序列为SEQ ID NO：1。

本发明另一目的在于提供一种调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，包括：

步骤一：采用paired-end ssRNA-Seq，测定I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组数据；

步骤二：利用TopHat2与参考基因组进行比对，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，获得转录本；

步骤三：通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本，确定疑似lncRNAs；

步骤四：利用两种编码潜能分析软件PFAM和CPC，对疑似转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终获得lncRNAs。

进一步，调控番茄腺毛形成的基因为：lncRNA000100；

所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，进一步包括：

RNA-seq分别获得109,747,652、102,356,032、104,576,556、99,279,862、102,811,164、105,689,184原始数据；去除低质量的原始数据，分别获得高质量的reads数107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014；

利用TopHat2与参考基因组进行比对的结果，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，共获得70965个转录本；

对70965个转录本进行进一步分析，通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本步骤，确定2356个转录本为疑似lncRNAs；

分别利用两种主流的编码潜能分析软件PFAM和CPC对2356个转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终共获得1303个lncRNAs。

本发明另一目的在于提供一种所述调控番茄腺毛形成的基因在番茄遗传改良中的应用，其特征在于，所述应用包括：

提取番茄叶片基因组RNA，利用反转录酶试剂盒将RNA反转录成cDNA；通过PCR扩增得到lncRNA000100产物，经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，用pEasy-Blunt载体克隆，取5μL连接产物进行热击处理；转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 100mg/L的液体LB培养基中，于37℃200r/min振荡培养过夜，用小量法提取质粒；

将所述质粒用lncRNA000100特异引物进行检测，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用转录组学的技术，确定了在番茄I型腺体毛高表达的lncRNA，并克隆获得一个调控番茄腺毛形成的lncRNA000100。该lncRNA全长cDNA序列为1266bp。

本发明利用克隆的lncRNA000100基因在番茄中超量表达，显著抑制I型番茄腺毛形成(图5)；

本发明在确定lncRNA000100茸毛调控功能的基础上，进一步揭示其作用机理，进而为利用该lncRNA培育多茸毛种质，在番茄抗虫、抗病毒、抗逆境等方面进行应用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的调控番茄腺毛形成的lncRNA000100克隆方法流程图。

图2是本发明实施例提供的生物学重复之间的表达相关性(lncRNA确定过程)示意图。

图3是本发明实施例提供的提取番茄叶片基因组RNA的表达检测(lncRNA000100的组织表达结果)示意图。

图4是本发明实施例提供的构建过程(lncRNA000100基因超量表达载体的构建)的流程图。

图5是本发明实施例提供的转基因植株表型(lncRNA000100基因转基因植株PCR检测结果)示意图。

其中：利用Wo基因特异引物进行PCR扩增，以Ailsa Craig(AC)和Wo突变体材料LA3186(Wo)为对照。M:marker；AC:Ailsa Craig；Wo：LA3186；100OE-3：lncRNA000100转基因植株。

图6是本发明实施例提供的拟南芥表皮毛形成的调控模式流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的调控番茄腺毛形成的基因，所述调控番茄腺毛形成的基因lncRNA全长序列为1266bp；cDNA序列为SEQ ID NO：1。

CGGAAATTCCAAATCAATAAAAAACAATCTATTCATTAGCCAAACCAGAACCGACCCATAACCTGTCTCTTCTCTTTCTCTCAACAACTTGAACAATGAATTCTTGATGCTTCATTAAAAAGGTTACCGGGATGTCTCAGGTAAGGATAACTCTCTTCGTTCTCTGTTTTTTCTTTATTATTTTTTCTATGATCCGACGAGTGCACGTTCTGTTCGTCTTACTCTTCCTCTGATTCCACCAAACCGGCACAAATTGATTTGAACCGATGTTGTTGCCTGTTGATTACGAACATGGTTTTTCGAGATTAAAAGAATTGAAATATTAGGGGTTTTGGTTCAAATCAATGATGAAAAATTGAAAGATTGAAAGTAGGGAATATGAAAGAAAATATAGTGTAAAAGATGGGGTGGAACAGTGAGGCAGAAGGGTGTTGGCCTCTTGCTTTTTGATCGTCAGCGCAGGAAAAGATGTGAATGTACAATTGTATTTGTCACCGTTGAGATCGCTGAAGAGTCGAGGGTTGTCGAAGTACAAGGAAACACCATCAAATACTCTAATGGTGTTTTCTCATTTTCATACCATCTATACAAAAACAATTTGTACCATGGCAGTAGCTTTTTCATTTTTGTTAGTTTATGTATATTCACTTGTACATGACTCTACAAAATCTCTGTTTTTTACCACATTCAGGAAGAAATCTTGAACCACATTGAGGAAGAAAGCTAGAACTTTGAAGTCTCAACAATATTATTTAATTTAGTGGGTCAGGTCTAAATTAAAAGATGGAACCAATTTTAAATGGTCAATTTAATTGAAATTGAGAATTTGGGGTCGATTTAGGATAACCGTTAGTTTGGAGGATATATATGACAAGTTTGCTAACAGTGAGGGTATAAATAACTTCATTTTAACAGTAGGGGTAAAGTTAACTTATAAATTAAAATTGAGGGGTATATTCAACATTACTATCATTATTAGTGTTGAATTAATTTTTTTATTAACAGTAATATTGATAAGATTTTTATTAGAGTTACTAATATCTATGGACTATAACTTTTATTGGACTAGTCTAAATTCCAAGTATCAAAAACTTCAAATGTTCAAATACGCCTTGTTATGAAAGTCGCTCATATATACCCCTATTTATAAATAAATGACTCACATATACTCTTTTCCTCTAATGAAAATGAAAAAAAAATTGAATCTAATTTTTTTATTATTTTTGTATAAAAAAAATAATTCCATATGAGTAAATTTAATCCTCG

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步详细说明；

如图1所示，本发明实施例提供的调控番茄腺毛形成的lncRNA000100克隆方法，包括以下步骤：

S101：采用paired-end ssRNA-Seq，测定I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组数据；

S102：利用TopHat2与参考基因组进行比对，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，获得转录本；

S103：通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本，确定疑似lncRNAs；

S104：利用两种主流的编码潜能分析软件PFAM和CPC，对疑似转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终获得lncRNAs。

步骤S101中，本发明实施例提供的每个样品设两个生物学重复。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步详细说明；

实施例1：本发明lncRNA000100的鉴定

本发明前期成功克隆了番茄茸毛调控基因Wo，该基因可以促使番茄I型腺毛体密度显著增加。

为了鉴定与I型腺体毛密切相关的lncRNAs，本发明采用paired-endssRNA-Seq测定I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组数据，每个样品设两个生物学重复。

如图2A所示，生物学重复之间的表达相关性采用皮尔逊相关系数的平方(R2)进行评估，结果显示几组生物学重复之间R2均大于0.9，表示样品重复性好，数据质量可靠。

本次RNA-seq分别获得109,747,652、102,356,032、104,576,556、99,279,862、102,811,164、105,689,184原始数据。去除低质量的原始数据，分别获得高质量的reads数107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014。利用TopHat2与参考基因组进行比对的结果，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，共获得70965个转录本。为了确定可能的lncRNAs，本发明对70965个转录本进行进一步分析，通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本等步骤，确定2356个转录本为疑似lncRNAs。是否具有编码潜能是判断转录本是否为lncRNAs的关键条件。

如图2B所示，分别利用两种主流的编码潜能分析软件PFAM和CPC对2356个转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终共获得1303个lncRNAs。

实施例2：lncRNA000100的克隆与表达分析

依据lncRNA000100的序列信息，设计QRT-PCR引物，正向引物为

SEQ ID NO：2：5’TTAGCCAAACCAGAACCGACC 3’，

SEQ ID NO：3：反向引物为5TTATCCTTACCTGAGACATCCCG 3’。

如图3所示，提取番茄叶片基因组RNA，利用反转录酶试剂盒(购自Transgen公司)将RNA反转录成cDNA，表达检测结果如图3，显示lncRNA000100在I型茸毛特异表达。通过PCR扩增得到lncRNA000100产物，经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒(购自Axgen公司)回收目的片段，用pEasy-Blunt载体(购自Transgen公司)克隆，取5μL连接产物进行热击处理，具体方法参照试剂盒说明书，转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 100mg/L的液体LB培养基中，于37℃200r/min振荡培养过夜，用小量法提取质粒(购自北京普博欣公司，具体程序见该试剂盒的说明书)。将该质粒用lncRNA000100特异引物进行检测，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定，测序工作由北京博奥生物技术有限公司完成。

本实施例获得的lncRNA000100的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

实施例3：lncRNA000100基因的功能验证

利用设计的lncRNA000100的特异引物，正向引物为

SEQ ID NO：4：5’ATTAGGACATTCAAGTAATG3’，

反向引物为SEQ ID NO：5：5’GACGGACTTAAGTTTGATTG3’(引物序列见本发明的实施例2)；

如图4所示，用高保真DNA聚合酶酶(购自Transgen公司)，从Wo突变体LA3186中扩增lncRNA000100全长cDNA序列，将扩增产物切胶回收(回收试剂盒购自Axgen公司)后，连接到pEASY-Blunt载体(购自Transgen公司)上，测序选择正确的阳性克隆，以XbaⅠ和KpnⅠ双酶切带有目的基因H全长片段的克隆pEASY-Blunt载体，同时以XbaⅠ和KpnⅠ双酶切pMV2载体，回收连接后得到含lncRNA000100的重组超量表达载体，构建流程，该载体由35S启动子驱动，选择标记基因为壮观霉素(Spec)。将lncRNA000100的超量表达载体转入Wo突变体LA3186(引自美国番茄遗传资源中心)，进行转化，获得了转基因植株。

利用NPTII特异引物对转基因番茄植株进行了PCR鉴定(方法是：以上述转基因番茄植株的DNA为模板，先进行PCR扩增(采用如上实施例2所述的Wo基因的特异引物)，琼脂糖凝胶电泳检测)，非转基因番茄植株没有条带，阳性转基因植株有目标条带。确认有3株为阳性的转基因植株。同时，由于Wo基因的纯合致死特性，导致该位点处于杂合状态，利用Wo基因特异引物扩增并酶切，确定转基因植株含有Wo基因的突变。结果显示，转基因植株含有Wo基因的突变(图5)。另外，利用QRT-PCR引物检测转基因植株中lncRNA000100的表达变化，发现转基因植株中该lncRNA明显上调。

如图5所示，对转基因植株表型进行观察后发现，转基因番茄植株茎杆上的茸毛明显减少。

结果：本发明利用克隆的lncRNA000100基因在番茄中超量表达，显著抑制I型番茄腺毛形成；可以在番茄抗虫、抗病毒、抗逆境等方面进行应用。

图6是本发明实施例提供的拟南芥表皮毛形成的调控模式流程图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggaaattcc aaatcaataa aaaacaatct attcattagc caaaccagaa ccgacccata 60

acctgtctct tctctttctc tcaacaactt gaacaatgaa ttcttgatgc ttcattaaaa 120

aggttaccgg gatgtctcag gtaaggataa ctctcttcgt tctctgtttt ttctttatta 180

ttttttctat gatccgacga gtgcacgttc tgttcgtctt actcttcctc tgattccacc 240

aaaccggcac aaattgattt gaaccgatgt tgttgcctgt tgattacgaa catggttttt 300

cgagattaaa agaattgaaa tattaggggt tttggttcaa atcaatgatg aaaaattgaa 360

agattgaaag tagggaatat gaaagaaaat atagtgtaaa agatggggtg gaacagtgag 420

gcagaagggt gttggcctct tgctttttga tcgtcagcgc aggaaaagat gtgaatgtac 480

aattgtattt gtcaccgttg agatcgctga agagtcgagg gttgtcgaag tacaaggaaa 540

caccatcaaa tactctaatg gtgttttctc attttcatac catctataca aaaacaattt 600

gtaccatggc agtagctttt tcatttttgt tagtttatgt atattcactt gtacatgact 660

ctacaaaatc tctgtttttt accacattca ggaagaaatc ttgaaccaca ttgaggaaga 720

aagctagaac tttgaagtct caacaatatt atttaattta gtgggtcagg tctaaattaa 780

aagatggaac caattttaaa tggtcaattt aattgaaatt gagaatttgg ggtcgattta 840

ggataaccgt tagtttggag gatatatatg acaagtttgc taacagtgag ggtataaata 900

acttcatttt aacagtaggg gtaaagttaa cttataaatt aaaattgagg ggtatattca 960

acattactat cattattagt gttgaattaa tttttttatt aacagtaata ttgataagat 1020

ttttattaga gttactaata tctatggact ataactttta ttggactagt ctaaattcca 1080

agtatcaaaa acttcaaatg ttcaaatacg ccttgttatg aaagtcgctc atatataccc 1140

ctatttataa ataaatgact cacatatact cttttcctct aatgaaaatg aaaaaaaaat 1200

tgaatctaat ttttttatta tttttgtata aaaaaaataa ttccatatga gtaaatttaa 1260

tcctcg 1266

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttagccaaac cagaaccgac c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatccttac ctgagacatc ccg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attaggacat tcaagtaatg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacggactta agtttgattg 20

Claims (4)

1.一种调控番茄腺毛形成的基因，其特征在于，所述调控番茄腺毛形成的基因lncRNA全长cDNA序列为1266bp；cDNA序列为SEQ ID NO：1。

2.一种如权要求1所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，其特征在于，所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，包括：

步骤一：采用paired-end ssRNA-Seq，测定I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组数据；

步骤二：利用TopHat2与参考基因组进行比对，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，获得转录本；

步骤三：通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本，确定疑似lncRNAs；

步骤四：利用两种编码潜能分析软件PFAM和CPC，对疑似转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终获得lncRNAs。

3.如权利要求2所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，其特征在于，调控番茄腺毛形成的基因为：lncRNA000100；

所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法，进一步包括：

RNA-seq分别获得109,747,652、102,356,032、104,576,556、99,279,862、102,811,164、105,689,184原始数据；去除低质量的原始数据，分别获得高质量的reads数107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014；

利用TopHat2与参考基因组进行比对的结果，再结合Cufflinks进行转录本的拼接，共获得70965个转录本；

对70965个转录本进行进一步分析，通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本步骤，确定2356个转录本为疑似lncRNAs；

分别利用两种主流的编码潜能分析软件PFAM和CPC对2356个转录本分别进行编码潜能的预测，取交集，最终共获得1303个lncRNAs。

4.一种如权利要求1所述调控番茄腺毛形成的基因在番茄遗传改良中的应用，其特征在于，所述应用包括：

提取番茄叶片基因组RNA，利用反转录酶试剂盒将RNA反转录成cDNA；通过PCR扩增得到lncRNA000100产物，经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，用pEasy-Blunt载体克隆，取5μL连接产物进行热击处理；转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖苷(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 100mg/L的液体LB培养基中，于37℃200r/min振荡培养过夜，用小量法提取质粒；

将所述质粒用lncRNA000100特异引物进行检测，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定。

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