CN109111509B

CN109111509B - 腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗

Info

Publication number: CN109111509B
Application number: CN201811096571.4A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 王钢; 唐慧芬; 刘强德; 李延涛
Original assignee: Tiankang Pharmaceutical Suzhou Co ltd
Current assignee: Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2038-09-19
Also published as: CN109111509A

Abstract

本发明提供了一种腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗，涉及生物技术领域。该腐败梭菌α毒素突变体包括(a1)‑(a3)中的任意一种。其中，(a1)为将具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的腐败梭菌α毒素第86位氨基酸残基由半胱氨酸突变为亮氨酸，和第189位氨基酸残基由丝氨酸突变为半胱氨酸得到的蛋白质；(a2)为切除(a1)的信号肽得到的蛋白质；(a3)为在(a1)或(a2)所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白中的任意一种，具有毒副作用低，免疫原性好的优点。该腐败梭菌疫苗包含腐败梭菌α毒素突变体或编码其的基因，具有良好的安全性和良好的免疫原性。

Description

腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗。

背景技术

腐败梭菌(Clostridium septium)是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，可引起动物和人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽及坏死性肠炎等疾病，也是引发羊快疫的病原菌。

该菌可分泌α、β和γ等多种外毒素，其中α毒素是其主要致病性毒力因子和免疫保护性抗原。腐败梭菌α毒素是气溶素家族穿孔毒素的一种，是腐败梭菌的主要致死性毒力因子，具有溶血、致死和坏死的作用，此外该毒素还具有良好的免疫原性，由其制备的类毒素可有效抵抗腐败梭菌的感染。

腐败梭菌广泛分布于土壤、粪便、灰尘、沼泽及动物的消化道中，易通过被芽孢污染的饲料、饮水和周围环境等途径，经伤口或消化道引起羊、马、牛、猪、犬、猫、鸡和鹿等动物以及人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽以及坏死性肠炎等疾病，发病与动物的年龄、性别及品种无关。其传染途径一般有两种，一种是由于外伤如去势、断尾、分娩、外科手术或注射的过程中没有严格消毒，致使腐败梭菌芽孢污染而引起感染；另外一种经消化道感染，此时多呈地方流行，多发于秋、冬和初春气候骤变，阴雨连绵的季节。腐败梭菌引起的疾病具有播过程具有传播快、发病急、病程短、死亡率高的特点。其中，绵羊对腐败梭菌最为易感，发病羊的营养多在中等以上，对畜禽养殖业的危害较大。由腐败梭菌引起的疾病如快疫，一般病程极为短促，往往来不及治疗动物即发生死亡。因此，免疫接种是预防该病最为有效途径之一。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种腐败梭菌α毒素突变体，具有毒副作用低，免疫原性好的优点。

本发明的第二个目的在于提供一种编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

本发明的第三个目的在于提供一种上述腐败梭菌α毒素突变体的基因的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供一种上述腐败梭菌α毒素突变体、编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因、上述腐败梭菌α毒素突变体的制备方法或由上述腐败梭菌α毒素突变体制备方法制备得到的蛋白的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种腐败梭菌疫苗，该疫苗包含上述腐败梭菌α毒素突变体或编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

本发明提供了一种腐败梭菌α毒素突变体，包括如下(a1)-(a3)中的任意一种：

(a1)将具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的腐败梭菌α毒素第86位氨基酸残基由半胱氨酸突变为亮氨酸，和第189位氨基酸残基由丝氨酸突变为半胱氨酸得到的蛋白质；

(a2)切除(a1)的信号肽得到的蛋白质；

(a3)在(a1)或(a2)所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

优选地，所述腐败梭菌α毒素突变体具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

优选地，具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

本发明还提供了一种上述腐败梭菌α毒素突变体的制备方法，包括：将编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因在宿主细胞表达。

优选地，所述制备方法包括：使用哺乳动物表达系统表达编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因；

优选地，使用CHO细胞表达系统表达所述腐败梭菌α毒素突变体的基因；CHO细胞优选CHO-S细胞系。

优选地，将所述编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因克隆至表达载体，然后导入宿主细胞，再筛选和培养表达所述腐败梭菌α毒素突变体的宿主细胞，将宿主细胞表达的蛋白经纯化后得到所述腐败梭菌α毒素突变体；

优选地，所述表达载体包括pcDNA3，优选为pcDNA^TM

本发明还提供了一种上述腐败梭菌α毒素突变体、编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因、上述腐败梭菌α毒素突变体的制备方法或上述制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素突变体在如下(x1)-(x5)中的应用；

(x1)制备腐败梭菌疫苗；

(x2)制备腐败梭菌α毒素抗体；

(x3)制备检测腐败梭菌α毒素的试剂和/或试剂盒；

(x4)制备检测腐败梭菌α毒素抗体的试剂和/或试剂盒；

(x5)制备腐败梭菌α毒素诊断抗原。

本发明还提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗包含上述腐败梭菌α毒素突变体或编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

优选地，所述腐败梭菌疫苗包括腐败梭菌α毒素突变体；所述腐败梭菌α毒素突变体具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述腐败梭菌α毒素突变体由哺乳动物表达系统表达得到；

优选地，所述腐败梭菌疫苗中腐败梭菌α毒素突变体的浓度为30-50μg/mL；优选为35-45μg/mL；更优选为40μg/mL；

优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA15A佐剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的腐败梭菌α毒素突变体主要为将具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的腐败梭菌α毒素第86位氨基酸残基由半胱氨酸突变为亮氨酸，和第189位氨基酸残基由丝氨酸突变为半胱氨酸得到的蛋白质；或进一步去掉其信号肽后的蛋白质；或在其氨基酸序列的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白，以便于后续蛋白的分离、纯化和鉴定。该腐败梭菌α毒素突变体无毒副作用，大大的降低了生物安全风险，同时有效的保持α毒素的免疫原性。

本发明还提供了可以编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因和上述腐败梭菌α毒素突变体的制备方法，通过将上述融合蛋白的基因在宿主中表达即可。

本发明提供的上述腐败梭菌α毒素突变体、上述编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因、上述腐败梭菌α毒素突变体的制备方法或由上述腐败梭菌α毒素突变体制备方法制备得到的蛋白应用十分广泛，可应用于制备多种由腐败梭菌引起的疾病的疫苗；制备腐败梭菌α毒素抗体；制备检测腐败梭菌α毒素的试剂和/或试剂盒；制备检测腐败梭菌α毒素抗体的试剂和/或试剂盒和制备腐败梭菌α毒素诊断抗原。

本发明提供的腐败梭菌疫苗，包含上述腐败梭菌α毒素突变体或上述编码腐败梭菌α毒素突变体的基因。系经过密码子优化，含有2个氨基酸位点突变，获得了对动物体减毒的α毒素突变体，具有良好的安全性和良好的免疫原性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pcDNA^TM

的质粒图谱；

图2为本发明实施1例提供的腐败梭菌α毒素突变体的重组蛋白的凝胶电泳结果；

图3为本发明实施1例提供的腐败梭菌α毒素突变体的重组蛋白的western blot检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

(a1)将具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的腐败梭菌α毒素第86位氨基酸残基由半胱氨酸突变为亮氨酸；和，第189位氨基酸残基由丝氨酸突变为半胱氨酸得到的蛋白质；

(a2)切除(a1)的信号肽得到的蛋白质；

在现有的已经检测出的腐败梭菌α毒素突变体的基因全长1323bp，具有如SEQ IDNO.2所示序列，编码440个氨基酸，具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。蛋白大小约48kDa，包含一个31个氨基酸的信号肽序列。对其功能位点的研究表明：

KKRRGKR398SVD片段上的第398位精氨酸，对于α毒素的体外活化是必需的，这一位点是含有残基RGKR的真核弗林蛋白酶(furin)识别位点，前体毒素经蛋白酶水解作用后形成41-44kDa大小的活化形态和一个小分子前肽。333NGYSEWDWKWV343上的WDWnW片段是α毒素与受体糖基磷脂酰基醇(GPI)锚定蛋白结合位点，其中n表示该位点为任意的氨基酸。双亲跨膜结构203KIGVKTSFKVGLEAIADSKVETSFEFNAE231是α毒素在细胞膜上穿孔的主要功能区。

本发明发现，同时突变如下两个位点：将第86位的半胱氨酸突变为亮氨酸，和将第189位的丝氨酸突变为半胱氨酸，可有效的降低α毒素的毒性，得到腐败梭菌α毒素无毒突变体，大大的降低了生物安全风险，同时有效的保持α毒素的免疫原性。

同时，本发明提供的腐败梭菌α毒素突变体也可以为去掉其信号肽后的蛋白质。信号肽是蛋白质的一个片段，信号肽引导核糖体并定位于内质网上的一个通道上，使核糖体附着在内质网上，并将不断伸长的蛋白质链穿透通过通道，随后信号肽被切割下来，合成完成的蛋白质被释放进内质网腔，蛋白最后被转运到胞外。可见，信号肽上以较小的可能性存在具有免疫原性的抗原表位，并且切除信号肽也可以进一步促进蛋白的可溶性表达。

进一步的，本发明提供的腐败梭菌α毒素突变体也可以为在其氨基酸序列的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白，以便于后续蛋白的分离、纯化和鉴定，所述标签例如可以为但不限于为His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、NusA标签、SUMO标签。

在一些优选的实施方式中，所述腐败梭菌α毒素突变体具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。该氨基酸序列为将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第86位氨基酸残基由半胱氨酸突变为亮氨酸；和第189位氨基酸残基由丝氨酸突变为半胱氨酸。然后去掉SEQ IDNO.1所示的氨基酸序N端31个氨基酸残基，即去除腐败梭菌α毒素突变体的信号肽部分。最后再在SEQ ID NO.1的C端添加His标签，本实施方式选择具有6个组氨酸的His标签，在一些其他的实施方式中，也可以选择分子生物学技术中常用的6-10组氨酸的His标签，本发明对此不做限制。通过上述对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的优化，得到腐败梭菌α毒素无毒突变体，具有如SEQ ID NO.所示序列。

本发明还提供了编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因。本发明所述的编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因包含表达上述腐败梭菌α毒素突变体的核苷酸序列，还可以包括用于调节蛋白表达和/或辅助蛋白分离纯化的核苷酸序列，例如可以为但不限于为启动子序列、增强子序列和/或用于表达蛋白标签的序列。在一些优选的实施方式中，所述腐败梭菌α毒素突变体的基因具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

该制备方法通过将上述编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因在宿主中表达即可，例如可以为但不限于为在大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或者哺乳动物表达系统均可。

但是由于采用原核系统，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。同时原核表达系统，表达量低，纯化成本高，内毒素问题。因此在一个优选的实施方式中，采用哺乳动物表达系统对腐败梭菌α毒素突变体进行可溶性的表达。哺乳动物表达系统还具有表达的蛋白经翻译加工后，其结构与生物学特性更接近于天然蛋白的优点。所述哺乳动物表达系统中使用的宿主细胞例如可以为但不限于为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。

在一些优选的实施方式中，优选使用CHO细胞表达所述腐败梭菌α毒素突变体。

CHO(Chinese Hamster Ovary，CHO)细胞是美国科罗拉多大学的Theodore T.Puck博士于1957年，从一成年雌性中国仓鼠卵巢内分离获得。FDA认证的安全宿主工程细胞，是表达目的蛋白，尤其是复杂修饰化大分子蛋白的较佳的表达体系。

目前普遍应用的CHO-S与CHO-K1细胞系均是由CHO母细胞衍生而来。这两种细胞系都属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，本身极少分泌CHO内源蛋白。CHO细胞表达系统具有如下优点：

(1)CHO属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白质，利于外源蛋白的分离。

(2)具有准确的翻译后折叠及修饰功能，表达的蛋白在分子结构，理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。

(3)具有贴壁生长特性，具有较高的耐受剪切力和渗透压能力；也可以进行悬浮培养，无血清培养基中大规模悬浮培养，生物反应器中较高的细胞密度。

(4)具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力。

在一些优选的实施方式中，所述制备方法包括：将所述编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因克隆至表达载体，然后导入宿主细胞，再筛选和培养表达所述腐败梭菌α毒素突变体的宿主细胞，将宿主细胞表达的蛋白经纯化后得到所述腐败梭菌α毒素突变体。其中表达载体优选使用pcDNA3，更优选为pcDNA^TM

pcDNA^TM

载体为双顺反子克隆载体，该载体设计可用于大多数哺乳动物细胞中，使其获得极高表达水平的转基因重组蛋白。pcDNA^TM

载体与TOPO异构酶兼容，能够以>85％的克隆效率包含目的基因的PCR产物。编码腐败梭菌α毒素的基因在TOPO克隆位点插入，其上游有CMV启动子，可促进目的基因转录；下游有TKpA终止子；目的基因两侧有CMV正向结合引物结合位点和TKpA反向引物结合位点，用于质粒测序以确保目的基因序列正确；该载体含有两个抗性标记基因，一为amp即氨苄青霉素抗性基因，用于筛选大肠杆菌阳性转化株；另一为neo即新霉素抗性基因，用于筛选稳定转染CHO细胞的细胞株。

本发明还提供了一种上述腐败梭菌α毒素突变体、上述腐败梭菌α毒素突变体、上述编码上述腐败梭菌α毒素突变体的基因、上述腐败梭菌α毒素突变体的制备方法或由上述腐败梭菌α毒素突变体制备方法制备得到的蛋白在如下(x1)-(x5)中的应用：(x1)制备腐败梭菌疫苗；(x2)制备腐败梭菌α毒素抗体；(x3)制备检测腐败梭菌α毒素的试剂和/或试剂盒；(x4)制备检测腐败梭菌α毒素抗体的试剂和/或试剂盒；(x5)制备腐败梭菌α毒素诊断抗原。

由于本发明提供的腐败梭菌α毒素突变体无毒副作用，同时具有较好的免疫原性，因此可以用以制备腐败梭菌疫苗，可用于预防羊、马、牛、猪、犬、猫、鸡和鹿等动物由腐败梭菌引起的疾病。使用该腐败梭菌α毒素突变体制备的抗体以及该腐败梭菌α毒素可以应用于制备多种检测试剂和试剂盒，例如使用含有腐败梭菌α毒素突变体的抗体的ELISA试剂盒以检测腐败梭菌。

本发明还提供了一种腐败梭菌疫苗，包含上述腐败梭菌α毒素突变体或上述编码腐败梭菌α毒素突变体的基因。本发明提供的腐败梭菌疫苗可以以上述腐败梭菌α毒素突变体作为主要的免疫原，制成腐败梭菌α毒素亚单位疫苗；也可以将上述腐败梭菌α毒素突变体作为免疫组合物中的一种组分，以与其他免疫原物质共同作用，起到协同增效的作用；还可以为包括上述编码腐败梭菌α毒素突变体的基因的DNA疫苗。

本发明制备的腐败梭菌疫苗，系经过密码子优化，含有2个氨基酸位点突变，获得了对动物体减毒的α毒素突变体，在兔子动物体内呈现非常好的安全性和良好的免疫原性。

在一些可选的实施方式中，所述腐败梭菌疫苗包括的腐败梭菌α毒素突变体，具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，并且所述腐败梭菌α毒素突变体由CHO细胞表达系统表达得到。

该疫苗为腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗，系经过密码子优化、含有2个氨基酸位点突变，获得了对动物体减毒的a毒素突变体，其哺乳动物表达系统能够高效分泌表达重组a毒素蛋白，非常易于纯化；在兔子动物体内呈现非常好的安全性和良好的免疫原性。因此是腐败梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗，优化了大肠杆菌表达系统目前存在的问题。

在一些优选的实施方式中，所述腐败梭菌疫苗中腐败梭菌α毒素突变体的浓度为30-50μg/mL；优选为35-45μg/mL；更优选为40μg/mL。优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。所述疫苗佐剂例如可以为但不限于为氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA 15A佐剂。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

将SEQ ID NO.4所示核苷酸序列(人工合成)插入pcDNA^TM

载体上的TOPO克隆位点，其上游有CMV启动子，下游有TKpA终止子，得到转染用pcDNA3.3-α毒素质粒，pcDNA3.3-α毒素质粒用ApaLI酶进行线性化，线性化后的重组载体电击转化到哺乳动物细胞CHO-S中，得到哺乳动物细胞重组细胞株CHO-S a-toxin。将上述重组细胞株接种到CHO-S-SFM II培养基中。然后筛选出表达腐败梭菌α毒素突变体的细胞株，37℃，5％CO₂的条件下悬浮培养10天，离心收集上清，同时进行SDS-PAGE和WEST-BLOT检测，检测结果如图2和图3所示，其中图2和图3中的泳道2和泳道3为腐败梭菌α毒素突变体的重组蛋白，有图上可以看出CHO-S细胞株成功表达了腐败梭菌α毒素突变体。

CHO细胞复苏与传代：1、提前将水浴锅打开37℃；培养基提前在37℃预热。2、从液氮罐中取出冻存的CHO细胞。3、把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其快速融化(约1min)，取出。4、用75％乙醇消毒管外壁，放入生物安全柜内,转移到含10mL培养基的15mL离心管中，离心800rpm，5min。5、离心后的细胞去掉上清，取少许新鲜培养基重悬细胞，再转移到培养瓶中，加入新鲜培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，使密度控制在3-4×10⁵cells/mL，活力>95％。6、置于培养箱中110rpm，37℃，5％CO₂培养。7、细胞培养2-3天，密度达到2.0×10⁶cells/mL左右时需对细胞进行传代。8、从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养基，对剩余的细胞培养物稀释(留下的细胞培养物根据细胞密度、培养体积、稀释后密度等而定。9、放入培养箱中110rpm，37℃，5％CO₂，继续培养。10、每天需对细胞密度及活力检测，当细胞密度达到2×10⁶cells/mL左右时，要对细胞进行传代。

Alpha-toxin质粒转染CHO细胞：1、转染前1天将CHO细胞悬浮培养至300mL，接种密度为1×10⁶cells/mL，置于培养箱中110rpm，37℃，5％CO₂培养。2、转染当天使细胞密度控制在1-1.5×10⁶cells/mL左右。3、DNA-转染试剂混合物：向转染缓冲液中加入DNA和转染试剂混匀，37℃温育。4、将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中，放入培养箱中110rpm，37℃，5％CO₂培养。5、收集：转染后约4-6天，取出细胞培养物，离心，收集上清或细胞。6、上清通过镍柱亲和纯化，然后将获得的蛋白定量。

实施例2

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为30μg/mL，并按照抗原与商品佐剂ISA 15A的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例3

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为40μg/mL，并按照抗原与商品佐剂ISA 15A的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例4

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为50μg/mL，并按照抗原与商品佐剂ISA 15A的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例5

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为30μg/mL，并按照抗原与商品佐剂MF59的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例6

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为40μg/mL，并按照抗原与商品佐剂MF59的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例7

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为50μg/mL，并按照抗原与商品佐剂MF59的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例8

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为30μg/mL，并按照抗原与商品佐剂ISA206的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例9

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为40μg/mL，并按照抗原与商品佐剂ISA206的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

实施例10

本实施例提供了一种腐败梭菌疫苗，该疫苗中包含实施例1提供的蛋白，其中蛋白含量为50μg/mL，并按照抗原与商品佐剂ISA206的体积比为1:1混合均匀，制得疫苗。

效果例1

安全检验用体重1.5-2.0kg健康家兔45只，共分为9组，每组5只，各组家兔的肌肉或皮下注射实施例2-实施例10提供的疫苗2.0ml，观察10日，全部健活，且注射部位肌肉或皮肤无坏死。

效果例2

检验实施例2-实施例9提供的疫苗的效力，每组实验如下：

用体重1.5-2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗1.0ml。接种后14-21日，采血，分离血清。将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4ml与腐败梭菌毒素(含4个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16-20g小鼠2只，0.3ml/只。同时各用同批小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。观察1日，判定结果。对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌毒素达到1(0.1ml免疫动物血清中和1MLD毒素)，即判为合格。效力检验：各实施例提供的疫苗中，血清中和效价对腐败梭菌毒素达到1，疫苗有效。效力结果表明，佐剂为IS15A效果最好。结果如表1所示。

表1各实施例提供的疫苗的效力结果

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 腐败梭菌α毒素突变体、表达其的基因、制备方法和腐败梭菌疫苗

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 腐败梭菌(Clostridium septium)

<400> 1

Met Ser Lys Lys Ser Phe Ala Lys Lys Val Ile Cys Thr Ser Met Ile

1 5 10 15

Ala Ile Gln Cys Ala Ala Val Val Pro His Val Gln Ala Tyr Ala Leu

20 25 30

Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser

35 40 45

Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile

50 55 60

Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser

65 70 75 80

Leu Gly Phe Gly Trp Cys Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln

85 90 95

Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr

100 105 110

Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val

130 135 140

Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu

145 150 155 160

Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr

165 170 175

Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val

180 185 190

Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr

195 200 205

Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu Thr

210 215 220

Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser Thr

225 230 235 240

Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser Pro

245 250 255

Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile Asp

260 265 270

Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu Met

275 280 285

Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn Ala Arg Glu Asp His Thr Glu Asp

290 295 300

Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala Glu

305 310 315 320

Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr Ser

325 330 335

Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe Lys

340 345 350

Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile Lys

355 360 365

Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu Gly

370 375 380

Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu Asn

405 410 415

Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr Tyr

420 425 430

Asn Asp Lys Lys Ile Asp Ile Asn

435 440

<210> 2

<211> 1323

<212> DNA

<213> 腐败梭菌(Clostridium septium)

<400> 2

atgtcaaaaa aatcttttgc taaaaaagta atttgtacat ctatgattgc aattcagtgt 60

gcggcagtag taccacatgt acaagcttat gcacttacaa atcttgaaga ggggggatat 120

gcaaatcata ataatgcttc ttcaattaaa atatttggat atgaagacaa tgaagattta 180

aaagctaaaa ttattcaaga tccagagttt ataagaaatt gggcaaatgt agctcattca 240

ttaggatttg gatggtgcgg tggaacggct aatccaaacg ttggacaagg ttttgaattt 300

aaaagagaag ttggggcagg tggaaaagta tcttatttat tatctgctag atacaatcca 360

aatgatcctt atgcaagtgg gtatcgtgca aaagatagac tttctatgaa aatatcaaat 420

gttagatttg ttattgataa tgattctata aaattaggta cacctaaagt gaaaaaatta 480

gcacctttaa actctgctag ttttgattta ataaatgaaa gtaaaactga gtctaaatta 540

tcaaaaacat ttaattatac aacttctaaa acagtttcta aaacagataa ctttaaattt 600

ggagaaaaaa taggagtaaa aacatcattt aaagtaggtc ttgaagctat agctgacagt 660

aaagttgaga caagctttga atttaatgca gaacaaggtt ggtcaaatac aaatagtact 720

actgaaacta aacaagaaag tactacatat actgcaacag tttctccaca aactaaaaag 780

agattattcc tagatgtgtt aggatcacaa attgatattc cttatgaagg aaaaatatat 840

atggaatacg acatagaatt aatgggattt ttaagatata caggaaatgc tcgtgaagat 900

catactgaag atagaccaac agttaaactt aaatttggta aaaacggtat gagtgctgag 960

gaacatctta aagatttata tagtcataag aatattaatg gatattcaga atgggattgg 1020

aaatgggtag atgagaaatt tggttattta tttaaaaatt catacgatgc tcttactagt 1080

agaaaattag gaggaataat aaaaggctca tttactaaca ttaatggaac aaaaatagta 1140

attagagaag gtaaagaaat tccacttcct gataagaaga gaagaggaaa acgttcagta 1200

gattctttag atgctagatt acaaaatgaa ggtattagaa tagaaaatat tgaaacacaa 1260

gatgttccag gatttagact aaatagcata acatacaatg ataaaaaaat tgatattaat 1320

taa 1323

<210> 3

<211> 415

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Leu Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys

20 25 30

Ile Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His

35 40 45

Ser Leu Gly Phe Gly Trp Leu Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly

50 55 60

Gln Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly

85 90 95

Tyr Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe

100 105 110

Val Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys

115 120 125

Leu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys

130 135 140

Thr Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Cys Lys Thr

145 150 155 160

Val Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys

165 170 175

Thr Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu

180 185 190

Thr Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser

210 215 220

Pro Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile

225 230 235 240

Asp Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu

245 250 255

Met Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn Ala Arg Glu Asp His Thr Glu

260 265 270

Asp Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala

275 280 285

Glu Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr

290 295 300

Ser Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe

305 310 315 320

Lys Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile

325 330 335

Lys Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu

340 345 350

Gly Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser

355 360 365

Val Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu

370 375 380

Asn Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr

385 390 395 400

Tyr Asn Asp Lys Lys Ile Asp Ile Asn His His His His His His

405 410 415

<210> 4

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cttacaaatc ttgaagaggg gggatatgca aatcataata atgcttcttc aattaaaata 60

tttggatatg aagacaatga agatttaaaa gctaaaatta ttcaagatcc agagtttata 120

agaaattggg caaatgtagc tcattcatta ggatttggat ggttaggtgg aacggctaat 180

ccaaacgttg gacaaggttt tgaatttaaa agagaagttg gggcaggtgg aaaagtatct 240

tatttattat ctgctagata caatccaaat gatccttatg caagtgggta tcgtgcaaaa 300

gatagacttt ctatgaaaat atcaaatgtt agatttgtta ttgataatga ttctataaaa 360

ttaggtacac ctaaagtgaa aaaattagca cctttaaact ctgctagttt tgatttaata 420

aatgaaagta aaactgagtc taaattatca aaaacattta attatacaac ttgtaaaaca 480

gtttctaaaa cagataactt taaatttgga gaaaaaatag gagtaaaaac atcatttaaa 540

gtaggtcttg aagctatagc tgacagtaaa gttgagacaa gctttgaatt taatgcagaa 600

caaggttggt caaatacaaa tagtactact gaaactaaac aagaaagtac tacatatact 660

gcaacagttt ctccacaaac taaaaagaga ttattcctag atgtgttagg atcacaaatt 720

gatattcctt atgaaggaaa aatatatatg gaatacgaca tagaattaat gggattttta 780

agatatacag gaaatgctcg tgaagatcat actgaagata gaccaacagt taaacttaaa 840

tttggtaaaa acggtatgag tgctgaggaa catcttaaag atttatatag tcataagaat 900

attaatggat attcagaatg ggattggaaa tgggtagatg agaaatttgg ttatttattt 960

aaaaattcat acgatgctct tactagtaga aaattaggag gaataataaa aggctcattt 1020

actaacatta atggaacaaa aatagtaatt agagaaggta aagaaattcc acttcctgat 1080

aagaagagaa gaggaaaacg ttcagtagat tctttagatg ctagattaca aaatgaaggt 1140

attagaatag aaaatattga aacacaagat gttccaggat ttagactaaa tagcataaca 1200

tacaatgata aaaaaattga tattaatcat catcatcatc atcat 1245

Claims

1.一种腐败梭菌α毒素突变体，其特征在于，为如下（a1）-（a2）中的任意一种：

（a1）将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的腐败梭菌α毒素第86位氨基酸残基由半胱氨酸突变为亮氨酸，和第189位氨基酸残基由丝氨酸突变为半胱氨酸得到的蛋白质；

（a2）切除（a1）的信号肽得到的蛋白质。

2.一种腐败梭菌α毒素突变体，其特征在于，所述腐败梭菌α毒素突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.编码权利要求1或2所述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

4.根据权利要求3所述的编码腐败梭菌α毒素突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种权利要求1或2所述的腐败梭菌α毒素突变体的制备方法，其特征在于，包括：将编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因在宿主细胞中表达。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括：使用哺乳动物表达系统表达编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，使用CHO细胞表达系统表达所述腐败梭菌α毒素突变体的基因。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-S细胞系。

9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述编码所述腐败梭菌α毒素突变体的基因克隆至表达载体，然后导入宿主细胞，再筛选和培养表达所述腐败梭菌α毒素突变体的宿主细胞，将宿主细胞表达的蛋白经纯化后得到所述腐败梭菌α毒素突变体。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pcDNA^TM3.3-TOPO^R。

12.权利要求1或2所述的腐败梭菌α毒素突变体、权利要求3或4所述的基因、权利要求5-11中任一项所述的腐败梭菌α毒素突变体的制备方法或所述制备方法制备得到的腐败梭菌α毒素突变体在如下（x1）-（x4）中任意一项的应用：

（x1）制备腐败梭菌疫苗；

（x2）制备腐败梭菌α毒素抗体；

（x3）制备检测腐败梭菌α毒素的试剂和/或试剂盒；

（x4）制备检测腐败梭菌α毒素抗体的试剂和/或试剂盒。

13.一种腐败梭菌疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的腐败梭菌α毒素突变体或权利要求3或4所述的基因。

14.根据权利要求13所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述腐败梭菌疫苗包括腐败梭菌α毒素突变体；所述腐败梭菌α毒素突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述腐败梭菌α毒素突变体由哺乳动物表达系统表达得到。

15.根据权利要求14所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述腐败梭菌疫苗中腐败梭菌α毒素突变体的浓度为30-50μg/mL。

16.根据权利要求15所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述腐败梭菌疫苗中腐败梭菌α毒素突变体的浓度为35-45μg/mL。

17.根据权利要求16所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述腐败梭菌疫苗中腐败梭菌α毒素突变体的浓度为40μg/mL。

18.根据权利要求13所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。

19.根据权利要求18所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂。

20.根据权利要求19所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂使用MontanideISA系列佐剂。

21.根据权利要求20所述的腐败梭菌疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂使用ISA 15A佐剂。