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CN109072196A - 老年car-t细胞及其用途 - Google Patents

老年car-t细胞及其用途 Download PDF

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CN109072196A
CN109072196A CN201780011151.9A CN201780011151A CN109072196A CN 109072196 A CN109072196 A CN 109072196A CN 201780011151 A CN201780011151 A CN 201780011151A CN 109072196 A CN109072196 A CN 109072196A
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cell
cancer
car
ycar
gcar
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CN201780011151.9A
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史蒂文森·C·卡茨
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Original Assignee
Roger Williams Medical Center Is Licensed By Plath Park Chate Kell Rwmc Ltd
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Abstract

表达T细胞的嵌合抗原受体(CAR)是有前景的实体肿瘤免疫疗法形式。来自老年供体的CAR‑T细胞(gCART)在本文中显示相对于来自年轻供体的CAR‑T(yCAR‑T)功能受损。与gCAR‑T相比，在yCAR‑T细胞中观察到更高的转导效率和改善的细胞扩增。yCAR‑T显示pERK、pAKT、pSTAT3和pSTAT5的增殖和信号传导激活水平显著增加。此外，yCAR‑T含有较高比例的CD4和CD8效应记忆细胞(EM)，已知它们具有增强的细胞溶解能力。根据CD4和CD8EM的数量较高，与gCAR‑T相比，yCAR‑T表现出更高水平的CEA特异性细胞毒性，其中在IL15处理的yCAR‑T细胞中观察到最大细胞毒性。

Description

老年CAR-T细胞及其用途
技术领域
本文描述的主题涉及用于提高用重组病毒转导离体外周血单核细胞(PBMC)的效率的方法，所述重组病毒含有编码嵌合抗原受体(CAR)构建体的重组DNA分子。可以从患有如癌症的疾病的老年受试者收获PBMC，用感兴趣的CAR转导并将其返回给予受试者以治疗疾病。
背景技术
癌症是老年人的疾病，工业化国家的中位年龄为70岁(Gloeckler等人,2003,Oncologist,8:541-552)。老年人积累了更多与环境致癌物相关的遗传损伤，并且免疫功能降低或具有“免疫衰老”(Gloeckler等人,2003,Oncologist,8:541-552)。免疫衰老的特征在于初始T细胞区室的收缩和CD4+和CD8+T细胞功能缺陷，其损害抗肿瘤免疫力(Naylor等人,2005,J Immunol,174:7446-7452)。因此，癌症免疫疗法必须考虑与年龄相关的免疫变化。
主要通过开发CAR-T细胞平台，在过继性T细胞疗法(ACT)领域取得了重大进展。可以通过遗传工程改造自体T细胞以通过引入编码合成嵌合抗原受体(CAR)的基因来表达赋予肿瘤抗原精确特异性的蛋白质。在最近的I期HITM试验和正在进行的HITM-SIR Ib期研究中，我们测试了正在测试癌胚抗原(CEA)特异性CAR-T细胞的安全性。CEA在几种类型的癌症中表达，包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌。输注具有肿瘤抗原特异性的CAR-T细胞为患者提供即时的高度特异性免疫应答，与试图在宿主内产生免疫力的疫苗形成对比。
在老年患者中，存在从初始到记忆效应T细胞群的主要表型转变，其可使ACT不如治疗年轻患者有效(Kovaiou等人,2005,Int Immunol 17:1359-1366)。已知白细胞介素-2(IL2)和白细胞介素-15(IL15)通过共同的γ链(γc)和IL2β链受体发出信号，并且是T细胞增殖和分化的关键但功能上不同的调节剂。已知IL2和IL15都激活Jak/Stat、PI3k/Akt和Mek/Erk信号传导途径(Marzec等人,2008,Cancer Res,68:1083-1091)，但它们具有不同的免疫治疗效果。IL15对产生记忆和效应T细胞具有优异的作用，因此使用外源IL15代替IL2进行免疫治疗存在增长的趋势(Waldmann,2006,Nat Rev Immunol,6:595-601)。
研究了从老年供体产生的CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并且进行了实验以评估IL2和IL15是否对老年和年轻供体中的CAR-T表型具有任何差异效应。本公开中提供的结果显示，与来自年轻供体的细胞相比，从老年供体获得的T细胞以较低的效率被转导，导致老年T细胞的细胞毒性和肿瘤杀伤活性较低。然而，如本公开所示，通过用增加α5β1表达的药剂处理收获的细胞，可以增加老年T细胞的转导效率。相关技术的前述实例和与其相关的限制旨在是说明性的而非排它性的。在阅读本说明书和研究附图之后，相关领域的其它限制对于本领域技术人员将变得显而易见。
发明内容
以下描述和说明的以下方面和实施例旨在是示例性和说明性的，而不是限制范围。
在一个方面，提供了一种离体转导淋巴细胞群的方法，所述方法包括将淋巴细胞离体与增加淋巴细胞表达α5β1的药剂接触，并将淋巴细胞与重组病毒颗粒混合，其中重组病毒载体含有编码嵌合抗原受体(CAR)的重组DNA分子。在一些实施例中，与未曾和增加α5β1表达的药剂接触的淋巴细胞的转导效率相比，所述方法提高了重组病毒颗粒对淋巴细胞的转导效率。
在一些实施例中，淋巴细胞群包含T细胞、B细胞和/或NK细胞。在其它实施例中，T细胞包含CD4+细胞、CD8+细胞、γδT细胞(γδT细胞)、NK T细胞和/或调节性T细胞(Treg)。
在一些实施例中，增加α5β1表达的药剂包括巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或转化生长因子β-1(TGFβ1)。在其它实施例中，增加α5β1表达的药剂包括M-CSF和TGFβ1。
在一些实施例中，所述药剂通过淋巴细胞群使α5β1的表达增加至少约未用所述药剂转导的等效淋巴细胞群的α5β1表达的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在其它实施例中，通过定量编码M-CSF和/或TGFβ1的mRNA来测量M-CSF和/或TGFβ1表达的增加。在其它实施例中，通过定量M-CSF和/或TGFβ1蛋白水平来测量M-CSF和/或TGFβ1表达的增加。在一些实施例中，淋巴细胞群内的一种或多种细胞不表达内源性M-CSF和TGFβ1蛋白。
在一些实施例中，使淋巴细胞与药剂接触包括用药剂培育约1×105至1×108、1×106至1×107、1×106至1×108个淋巴细胞。换句话说，在一些实施例中，淋巴细胞群包含约1×105至1×108、1×106至1×107、1×106至1×108个淋巴细胞。在其它实施例中，使淋巴细胞与药剂接触包括用药剂培育约1×105、1×106、1×107或1×108个淋巴细胞。
在一些实施例中，使细胞与M-CSF接触包括用0.1ng/ml至10ng/ml、2.5至7.5nm/ml或4ng/ml至7ng/ml M-CSF培育细胞。
在一些实施例中，使细胞与TGFβ1接触包括用1ng/ml至20ng/ml、5ng/ml至15nm/ml、或7.5ng/ml至12.5ng/ml TGFβ1培育细胞。
在一些实施例中，在使细胞与M-CSF或TGFβ1接触之前，从诊断患有疾病的受试者获取细胞。在其它实施例中，所述疾病是癌症或免疫缺陷疾病。在另外的其它实施例中，癌症选自由肝癌、胰腺癌、白血病、淋巴癌、脑癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌和皮肤癌组成的组。在其它实施例中，免疫缺陷疾病由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。
在一些实施例中，重组病毒颗粒是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。
在一些实施例中，CAR编码结合肿瘤抗原的T细胞受体。在其它实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：在其它实施例中，肿瘤抗原是癌胚抗原(CEA)。
在另一个方面，提供了治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包含使用本文所述的任何方法产生的CAR-T的组合物。
在一些实施例中，受试者为至少55岁、60岁、65岁、70岁或75岁。
在一些实施例中，受试者已被诊断患有癌症。在其它实施例中，癌症选自由肝癌、胰腺癌、白血病、淋巴癌、脑癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌和皮肤癌组成的组。
根据以下描述、附图、实例和权利要求，本发明方法和组合物等的其它实施例将是显而易见的。如从前面和后面的描述可以理解的，这里描述的每个特征以及这些特征中的两个或更多个的每个组合都包括在本公开的范围内，只要这样的组合中包括的特征不相互矛盾。另外，可以从本发明的任何实施例中明确地排除任何特征或特征的组合。在以下描述和权利要求中阐述了本发明的其它方面和优点，特别是当结合所附实例和附图考虑时。
附图说明
图1A示出了从人类受试者分离然后用含有编码CAR的构建体的重组病毒载体转导的PBMC的门控流式细胞术。
图1B显示了老年和年轻PBMC的病毒转导效率图(n＝8；*p＝0.002)。
图2A和2B显示了在IL2或IL15存在或不存在下未转导(图2A)和转导(图2B)的老年和年轻细胞的图。(对于各项处理，老年对比年轻*p<0.05)
图3A和3B显示了通过蛋白质印迹分析在老年或年轻细胞中STAT3、STAT5、Erk和Akt的表达水平(对于各项处理，老年对比年轻*p<0.05)。
图4A和4B显示了在IL2或IL15存在下维持的转导(图4A)或未转导(图4B)的年轻或老年细胞存在下的CEA特异性细胞细胞毒性(对于各项处理，老年对比年轻*p<0.005)
图5A显示了培养基中的颗粒酶B水平，其中在与肿瘤细胞一起培育之前将年轻或老年抗CEA CAR-T细胞维持在IL2或IL15中(对于各项处理，老年对比年轻*p<0.005)
图5B显示了培养基中的穿孔素水平，其中在与肿瘤细胞一起培育之前将年轻或老年抗CEA CAR-T细胞维持在IL2或IL15中(对于各项处理，老年对比年轻*p<0.05)。(对于各项处理，老年对比年轻*p<0.005)。
图6A示出了从年轻和老年人类受试者分离并用含有编码CAR的构建体的重组病毒载体转导的PBMC的门控流式细胞术。
图6B、6C和6D显示了转导的年轻和老年CAR T细胞中T细胞群的图。显示了CD4效应记忆细胞(图6B；对于各项处理，老年对比年轻*p<0.05)、CD4效应细胞(图6C；对于各项处理，老年对比年轻*p<0.05)和CD8效应记忆细胞(图6D；相对于相应的老年供体细胞，*p<0.05)的相对水平。
图7A示出了从年轻和老年人类受试者分离，用M-CSF或TGFβ1处理，并用含有编码CAR的构建体的重组病毒载体转导的PBMC的门控流式细胞术。
图7B和7C显示了年轻和老年细胞中α5β1整合素表达(图7B；对比老年*p<0.0005)和CAR表达(图7C；对比老年*p<0.005)的图。
图8A和8B显示年轻和老年CAR-T细胞的细胞毒性图，所述CAR-T细胞已经在IL2(图8A；对比老年*p<0.0005)或IL15(图8B；对比老年*p<0.0005)中扩增和维持，然后用M-CSF或TGFβ1处理。
具体实施方式
现在将在下文中更全面地描述各个方面。然而，这些方面可以按许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的实施例；相反，提供这些实施例是为了使本公开彻底和完整，并且将其范围完全传达给本领域技术人员。
I.定义
除非上下文另外明确规定，否则如本说明书中所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括多个(种)指示物。因此，例如，提及“聚合物”包括单一聚合物以及两种或更多种相同或不同的聚合物，提及“赋形剂”包括单一赋形剂以及两种或更多种相同或不同的赋形剂，等等。
在提供数值范围的情况下，意图是该范围的上限和下限之间的每个中间值以及规定范围内的任何其它规定或中间值涵盖在本公开内。例如，如果规定1μm至8μm的范围，那么意图也明确公开2μm、3μm、4μm、5μm、6μm和7μm，以及大于或等于1μm的值的范围和小于或等于8μm的值的范围。
如本文所用的“巨噬细胞集落刺激因子”或“M-CSF”是指例如在GenBank记录登录号NP_000748中描述的蛋白质，以及任选的其任何前体、变体或同种型。
如本文所用的“转化生长因子β-1”或“TGFβ1”是指例如在GenBank记录登录号NP_000651中描述的蛋白质，以及任选的其任何前体、变体或同种型。
如本文所用的“老年供体”是指至少55岁、60岁、65岁、70岁或75岁的人。如本文所用的“老年T细胞”是指从老年供体获得或收获的T细胞。
如本文所用的“年轻供体”是指小于55岁、50岁或45岁的人。如本文所用的“年轻T细胞”是指从年轻供体获得或收获的T细胞。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且每个可以指适合于本文所述的方法的任何动物(例如，啮齿动物，例如小鼠和大鼠)，或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人类或非人类灵长类动物。
如本文所用，关于嵌合T细胞受体的表述“特异性结合”是指嵌合T细胞受体以与结构上不同的蛋白质相比更大的亲和力结合其靶蛋白。
II.老年对比年轻细胞
鉴于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在具有癌症高风险的老龄化群体背景下快速发展，进行了研究以解决潜在的与年龄相关的CAR-T细胞缺陷。据推测，从老年供体产生的CAR-T将显示相对于来自年轻个体或年轻供体的CAR-T的功能性损伤。此外，假定了老年CAR-T(gCAR-T)损伤的机制和用于提高体外或体内具有治疗活性的gCAR-T的产生效率的策略。
产生CAR-T涉及首先从受试者(通常是患有癌症且需要医学干预以治疗癌症的受试者)收获细胞，例如外周单核细胞(PBMC)。通过本文所述的实验(包括实例1)确定，与转导来自年轻供体的T细胞相比，从老年供体获得的T细胞遭受病毒载体的转导减少，所述载体携带编码CAR构建体的重组核酸分子。为了检查老年和年轻供体T细胞的转导效率之间的差异，从年轻和老年供体分离PBMC并使用本领域标准方法激活，然后进行逆转录病毒转导以产生对CEA具有特异性的CAR-T细胞。使用细胞流动分析测量转导效率，并且发现与yCAR-T细胞(来自年轻供体的细胞)相比，gCAR-T细胞(来自老年供体的CAR-T细胞)显著更低。已知衰老导致淋巴细胞增殖能力的降低，这是由于细胞表面标志物的变化和由于衰老而改变的信号转导途径(Fulop等人,2007,Clin Interv Aging,2:33-54)。
此外，当将未转导和转导的细胞维持在IL2或IL15中以允许所需CAR-T细胞的增殖和维持时，与gCAR-T细胞相比，未转导和转导的yCAR-T细胞的扩增显著更高。本领域普通技术人员已知IL2/IL15Rβγc受体激活多种增殖途径，其包括Stat3和Stat5的Akt、Erk和Jak依赖性激活(Cornish等人,2006,Blood,108:600-608)。值得注意的是，与gCAR-T细胞相比，yCAR-T细胞中Akt、Erk、Stat3和Stat5的磷酸化显著增加，表明尽管用IL2和IL15等增殖细胞因子处理，gCAR-T细胞仍具有受损的促增殖信号。
T细胞受体(TCR)以及CD3激活诱导复杂的信号传导级联，其导致初始T细胞增殖和分化成特异性效应细胞(Brownlie和Zamoyska,2013,Nat Rev Immunol,13:257-269)。这种分化取决于细胞因子环境和其它因素，包括但不限于抗原、抗原呈递细胞类型和共刺激分子。研究表明已知识别和破坏肿瘤细胞的记忆CD8+T细胞持续存在的重要性(Wrzesinski和Restifo,2005,Curr Opin Immunol,17:195-201)。记忆T细胞表型的存在也有助于预防肿瘤复发(Straetemans等人,2015,Mol Ther,23:396-406)。研究了年轻组和老年组之间CD4和CD8CAR-T的表型差异。通过对初始细胞使用CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+，对中央记忆细胞使用CD45RA-CD45RO+CCR7+CD62L+，对效应记忆细胞使用CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-和对效应细胞使用CD45RA+CD45RO-CCR7-CD62L-进行表型分析(Sallusto等人,2004,AnnuRev Immunol,22:745-763)。将所有细胞群门控为CD3+CAR+，然后门控CD4+或CD8+。数据显示yCAR-T含有较高比例的CD4效应细胞(EC)、CD4效应记忆(EM)细胞和CD8效应记忆细胞(EM)。在IL2和IL15处理的细胞之间未观察到表型的显著差异。激活的T细胞增殖并分化成CM和EC。EC和CM可以进一步分化成EM细胞。初始、效应、CM和EM从EL退出LN。(Obharai等人,2006,176:4051-4058)EM提供对外周攻击的即时保护，而TCM提供对系统性攻击的保护并产生效应细胞(Bouneaud等人,2005,J Exp Med,201:579-590)。人类CD8TEM显示出直接的离体溶解活性并且组成性地表达颗粒酶和穿孔素，因此可能源自效应细胞(Marzo等人,2007,J Immunol,179:36-40)。
为了评估CAR-T细胞的抗肿瘤功效，进行细胞毒性分析，其中CAR-T细胞与表达CEA(CEA+)的小鼠结肠癌细胞或与用作阴性对照的CEA-的MC38细胞一起培育，并显示对CAR-T受体蛋白结合的靶CEA分子具有特异性。已经在IL2或IL15中扩增和维持的gCAR-T细胞具有显著较低的CEA特异性细胞毒性，然而，在IL2或IL15中扩增和维持的未转导的CAR-T细胞没有差异。细胞毒性T细胞通过颗粒酶/穿孔素裂解靶细胞，在这种情况下是肿瘤细胞(Sin等人,2010,Cancer Immunol Immunother,61:1671-1682)。随后在本研究中确定，与gCAR-T细胞群相比，yCAR-T细胞群具有增加的CD4+效应细胞数量。因此，在一些实施例中，本文公开了经处理以增强或增加CD4+细胞的数量或相对数量的gCAR-T细胞群，其中经处理的gCAR-T细胞的细胞毒性水平高于可比较的gCAR-T细胞，所述gCAR-T细胞未以增加CD4+细胞数量或相对数量的方式进行处理。重要的是，当细胞毒性针对gCAR-T细胞的转导效率标准化时，所述值与yCAR-T细胞没有显著差异。因此，本文还提供了用于增加从受试者获得的细胞(例如T细胞)的转导效率的方法。在一些实施例中，受试者是老年患者。
III.挽救老年T细胞
整合素属于细胞表面粘附分子家族，其介导细胞粘附并负责细胞-细胞粘附和细胞迁移(Weber等人,2011,J Cell Sci,124:1183-1193)。α5β1整合素在基于retronectin的T细胞转导中起关键作用(Yu等人,2008,Cancer Gene Ther,15:508-516)。重组人类纤连蛋白片段Retronectin含有细胞结合结构域，其主要通过与细胞的α5β1整合素相互作用而结合，从而有助于细胞与病毒颗粒的共定位。如下文实例3中所示，与老年供体T细胞相比，在年轻供体T细胞中观察到α5β1整合素的显著更高的表达。这种增加的表达与较低的gCAR-T转导效率相关。已知M-CSF和TGF-β1上调α5β1整合素表达并增强细胞粘附和迁移(Cai等人,Biochem Biophys Res Commun,274:519-525,Shima等人,1995,Proc Natl Acad Sci USA,92:5179-5183)。还已知它们可以调节许多不同的细胞类型(软骨细胞、乳腺癌细胞、成纤维细胞、成骨细胞、结肠癌等)上的数种不同的整合素(如α1、α2、α3、α5和β1)(Hynes,2002,Cell,110:673-687)。因此，进行了研究(例如，实例3)以增加老年T细胞中α5β1整合素表达水平的表达。从老年供体分离的PBMC用M-CSF或TGFβ1处理。结果，观察到用M-CSF或TGFβ1处理的老年细胞中α5β1整合素表达的显著增加。此外，老年细胞中α5β1的表达与年轻T细胞的表达相当。
为了表明α5β1表达的增加与转导效率的增加相关，用相似的转导效率转导用M-CSF或TGFβ1处理的老年和年轻供体T细胞的转导(实例3)。此外，使用细胞毒性分析评估经处理的gCAR-T细胞的抗肿瘤效率证明用M-CSF或TGF-β1处理gCAR-T细胞增加了gCAR-T细胞群的细胞杀伤活性。
总之，这项研究表明，gCAR-T中CAR表达受损可能阻碍CEA特异性CAR-T细胞的抗肿瘤功效，这可能对老年癌症患者的免疫治疗造成巨大障碍。我们的临床前体外数据表明，通过用M-CSF或TGF-β1处理老年T细胞可以逆转这种表型，以挽救这些受损细胞的抗肿瘤活性。在临床应用之前，除了体内测试之外，还需要在其它CAR-T产品中确认这些发现。这项研究具有转化影响，因为它表明年龄相关的CAR-T缺陷是可逆的。在这里输入！(如果你达到100，开始使用ALT+2)
IV.实例
以下实例本质上是说明性的，决不是限制性的。
实例1：产生抗CEA CAR-T细胞
为了检查老年T细胞和年轻供体T细胞的转导效率之间的差异，从8名年龄大于65岁的老年患者(gCAR-T组)和8名年龄在18至45岁的非老年患者(yCAR-T组)获得的全血中分离PBMC。用OKT3(50ng/ml，Ortho Biotech)将各组的PBMC激活48小时，并将细胞维持在2×106/ml的浓度。使用逆转录病毒递送系统将PMBC转导3次，所述逆转录病毒递送系统含有通过MFG逆转录病毒骨架中IgTCR(IgCEA)的hMN14 sFv-CD8铰链区段与杂合CD28/CD3分子(根据Emtage等人,2008,Clin Cancer Res,14:8112-8122的方法产生)的分子融合产生的串联分子。使用与表面表达的抗CEA CAR构建体特异性结合的CEA-Ig融合蛋白在转导后48小时测量转导效率。使用流式细胞术检测转导细胞对CEA-Ig融合蛋白的结合。标准门控策略被用于鉴定表达CD3和嵌合抗CEA CAR-T的活的单细胞。图1A中展现的结果显示，从gCAR-T组获得的细胞中的病毒转导效率(21.3％)显著低于从yCAR-T组获得的细胞(36.9％)，其中n＝8，p＝0.002(图1B)。
将来自两组中每一组的未转导和转导的细胞维持在IL2(3000IU/ml)或IL15(5ng/ml)中20天的时间，并测量生长曲线。对于IL2和IL15，与gCAR-T细胞的扩增相比，未转导(图2A)和转导(图2B)的yCAR-T细胞的扩增显著更高。未转导和转导的yCAR-T细胞的扩增比未转导和转导的gCAR-T细胞高约2.5倍(图2A和2B)。结果显示为平均值±SEM(*p<0.05)。
实例2：yCAR-T和gCAR-T细胞的分子谱
IL2/IL15Rβγc受体激活多种增殖途径，包括Stat3和Stat5的Akt、Erk和Jak依赖性激活(Cornish等人,2006,Blood,108:600-608)。为了进一步理解yCAR-T和gCAR-T细胞和功能之间的差异，进行实验以测量表达抗CEA CAR的yCAR-T和gCAR-T细胞中Stat3、Stat5、Erk和Akt的磷酸化。在第20天从如实例1中所述产生和维持并用IL2或IL15处理的gCAR-T和yCAR-T细胞分离总蛋白。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用补充有蛋白酶抑制剂混合液(Roche Diagnostics)、1mM NaVO4和1mM NaF的RIPA缓冲液(Life Technologies)裂解，如Ghosh等人,2012,Proc Natl Acad Sci,109:10024-10029)中所述。将裂解物在4℃以10,000rpm离心10分钟，收集上清液并使用Bradford蛋白质分析法(Thermo Scientific)以BSA作为标准进行蛋白质定量。使用β-巯基乙醇(Life Technologies)和Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)使裂解物变性，并在70℃下加热10分钟，在Mini Protean TGX4-15％凝胶(Biorad)中电泳，转移至TransBlot Turbo PVDF膜(Biorad)并用针对磷酸化和总Erk、Akt、Stat3和Stat5蛋白的一抗进行免疫印迹。使用HRP缀合的二抗(Santa Cruz)和ECL PrimeWetser Blot试剂(Amersham)作为化学发光底物检测一抗结合。用针对GAPDH的抗体重新探测免疫印迹以控制相等的加载。对每个处理组加载一式三份样品，并通过密度分析对信号进行定量，并将其标准化为各自的总蛋白质。与gCAR-T细胞相比，yCAR-T细胞中Akt、Erk、Stat3和Stat5各自的磷酸化显著增加(图3A和3B)，表明尽管用增殖细胞因子如IL2和IL15处理，gCAR-T细胞仍具有受损的促增殖信号传导。
实例3：CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
为了观察抗CEA年轻和老年CAR-T细胞的抗肿瘤功效，进行细胞毒性分析，其中将实例1中描述的抗CEA CAR-T细胞与MC38(鼠结肠癌细胞系)靶细胞一起培育。如实例1所述，用IL2(3000IU/ml)或IL15(5ng/ml)处理y-CAR-T和gCAR-T细胞(效应细胞(E))，然后以1:1、1:10和1:20的靶与效应细胞比与MC38CEA+(靶细胞(T))一起培育。用编码人类CEA的基因稳定转染MC38细胞以产生MC38CEA+细胞。MC38CEA-细胞用作阴性对照以显示CAR-T细胞的CEA特异性细胞毒性。通过测量LDH(乳糖脱氢酶)向细胞培养上清液中的释放来测定细胞裂解(细胞毒性)。如图4A和4B所示，用于IL2和IL15处理的gCAR-T的gCAR-T细胞具有比IL2和IL15处理的yCAR-T细胞显著更低的CEA特异性细胞毒性(比yCAR-T低约2倍，p<0.005)，在未转导的CAR-T细胞中没有差异。还测量了IL2或IL15处理的yCAR-T和gCAR-T细胞对穿孔素和颗粒酶B的分泌。如图5A和5B所示，yCAR-T细胞分泌颗粒酶B(图5A)和穿孔素(图5B)显著大于gCAR-T细胞的分泌。结果显示为平均值±SEM。*p<0.05。与对于IL2和IL15处理的gCAR-T相比，yCAR-T增强的肿瘤杀伤与穿孔素(1.3±0.1ng/ml，p＝0.01)和颗粒酶B(0.4±0.03ng/ml，p＝0.02)的水平增加相关。当细胞毒性针对转导效率标准化时，gCAR-T细胞的转导效率较低，所述值在gCAR-T细胞和yCAR-T细胞之间没有显著差异(数据未显示)。
使用门控策略，基于CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7表达(yCAR-T和gCAR-T细胞各自n＝8)进行CD4或CD8记忆和效应T细胞表型分析。CEA特异性CD4和CD8T细胞针对效应细胞、中央记忆细胞和效应记忆细胞进行表型分型。检查了yCAR-T和gCAR-T细胞之间CD4和CD8CAR-T的表型差异。通过对初始细胞使用CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+，对中央记忆细胞使用CD45RA-CD45RO+CCR7+CD62L+，对效应记忆细胞使用CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-和对效应细胞使用CD45RA+CD45RO-CCR7-CD62L-进行表型分析(Sallusto等人,2004,Annu RevImmunol,22:745-763)。将所有细胞群门控为CD3+CAR+，然后门控CD4+或CD8+，如图6A所示。图6B、6C和6D显示，与gCAR-T细胞相比，yCAR-T细胞含有更高比例的CD4效应记忆(EM)细胞(43.2±6.8％，p＝0.002)、CD4效应细胞(EC)(64.3±7.6％，p＝0.003)以及CD8效应记忆细胞(EM)(16.5±3.6％，p＝0.002)。结果显示为平均值±SEM。对比各组(IL2或IL15)的老年供体T细胞，*p<0.05。未观察到IL2和IL15处理的细胞之间表型的显著差异。
激活的T细胞增殖并分化成CM T细胞和EC。EC和CM细胞可以进一步分化成EM细胞。初始、效应、CM和EM细胞从EL细胞离开LN细胞。(12)EM细胞提供对外周攻击的即时保护，而TCM提供对系统性攻击的保护并产生效应细胞(Bouneaud等人,2005,J Exp Med,201:579-590)。人类CD8TEM显示出直接的离体溶解活性并且组成性地表达颗粒酶和穿孔素，因此可能源自效应细胞(Marzo等人,2007,J Immunol,179:36-40)
因此，其它实验集中于挽救gCAR-T转导。细胞毒性T细胞通过颗粒酶/穿孔素裂解靶细胞，在这种情况下是肿瘤细胞。我们发现与gCAR-T细胞相比，yCAR-T细胞中CD4+效应细胞数量增加，并且这可能导致该组中观察到的细胞毒性增加。
实例4：挽救gCAR-T细胞
为了挽救老年T细胞中降低的α5β1整合素表达水平，从而增加病毒转导，从老年供体分离的PBMC用M-CSF(5ng/ml)或TGFβ1(10ng/ml)处理，并测量了处理对CAR-T细胞中α5β1整合素表达的影响。进行流式细胞术分析(图7A)，在所有8个供体中定量M-CSF和TGFβ1处理的激活老年T细胞中α5β1整合素的相对表达，并与未处理的yCAR-T和gCAR-T细胞进行比较(每个组n＝8)。对于M-CSF和TGFβ1处理，观察到gCAR-T细胞中α5β1整合素表达的显著增加。gCAR-T细胞中的α5β1整合素表达，如图7B所示，与yCAR-T细胞中的α5β1整合素表达相当(gCAR-T细胞+M-CSF：41.0+1.0，gCAR-T细胞±TGFβ1：31.8±1.4，yT细胞44.41±4.2，p<0.0005)。然后如实例1中进行的，用含有抗CEA CAR-T构建体的逆转录病毒转导处理过的细胞，并且在M-CSF和TGFβ1处理的gCAR-T细胞中转导效率增加(yCAR-T 36.9±4.3，gCAR-T29.9±1.0，gCAR-T+M-CSF 41.4±1.0，gCAR-T±TGFβ1 40.1±2.0，相比gCAR-T，p<0.002(图7C)。
然后如实例2中那样评估处理过的gCAR-T细胞的抗肿瘤细胞毒活性。通过将MC38CEA+细胞与已经用IL2(图8A)或IL15(图8B)处理的yCAR-T细胞和gCAR-T细胞一起培育来进行细胞毒性分析。通过将yCAR-T和gCAR-T效应细胞与MC38CEA+靶细胞以1:1、1:10和1:20的靶与效应细胞比一起培育来评估yCAR-T和gCAR-T效应细胞。还使用MC38CEA-细胞作为阴性对照进行对照实验，以显示CAR-T细胞的CEA特异性。在分析数据后，结果显示对于IL2和IL15处理的细胞，用M-CSF或TGFβ1处理gCAR-T细胞似乎已经在细胞毒性方面挽救了gCAR-T细胞。具体地，与未用M-CSF或TGFβ1处理的gCAR-T细胞相比，用M-CSF(图8A，结果显示为平均值±SEM，对比未处理的gCAR-T细胞*p<0.005)或TGFβ1(图8B，结果显示为平均值±SEM，对比未处理的gCAR-T细胞*p<0.0005)处理的gCAR-T细胞具有显著增加的细胞毒活性。
虽然上面已经讨论了许多示例性方面和实施例，但是本领域技术人员将认识到某些修改、置换、添加和其子组合。因此，以下所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这些修改、置换、添加和子组合。

Claims (12)

1.一种离体转导淋巴细胞群的方法，其包含
将所述淋巴细胞离体与增加所述淋巴细胞表达α5β1的药剂接触；和
将所述淋巴细胞与重组病毒颗粒混合，所述重组病毒颗粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的重组DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使所述淋巴细胞与所述药剂接触包含用所述药剂培育所述淋巴细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述药剂包括M-CSF或TGFβ1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使所述淋巴细胞与所述药剂接触包含用0.1ng/ml至10ng/ml、2.5ng/ml至7.5ng/ml或4ng/mL至7ng/ml M-CSF培育所述淋巴细胞。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述药剂接触包含用1ng/ml至20ng/ml、5ng/ml至15nm/ml或7.5ng/ml至12.5ng/ml TGFβ1培育所述细胞。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在使所述细胞与所述药剂接触之前，从诊断患有疾病的受试者获取细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述疾病是癌症或获得性免疫缺陷疾病。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症选自由肝癌、胰腺癌、白血病、淋巴癌、脑癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌和皮肤癌组成的组。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述疾病是癌症或获得性免疫缺陷疾病。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组病毒颗粒为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。
11.一种治疗有需要的受试者的方法，其包含向所述受试者施用包含使用根据权利要求1至10中任一项所述的方法产生的CAR-T的组合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述受试者为至少65岁。
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