[go: up one dir, main page]

CN109071658A - 具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子 - Google Patents

具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子 Download PDF

Info

Publication number
CN109071658A
CN109071658A CN201780009916.5A CN201780009916A CN109071658A CN 109071658 A CN109071658 A CN 109071658A CN 201780009916 A CN201780009916 A CN 201780009916A CN 109071658 A CN109071658 A CN 109071658A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
binding molecule
antibody
polyspecific
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780009916.5A
Other languages
English (en)
Inventor
B.德高依吉
J.莫里斯
T.韦恩克
H.特恩纳普尔
E.布雷吉
D.萨提金
P.帕伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genmab AS
Original Assignee
Genmab AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab AS filed Critical Genmab AS
Publication of CN109071658A publication Critical patent/CN109071658A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及包含第一抗原‑结合结构域和第二抗原‑结合结构域的多特异性抗原‑结合分子。第一结构域特异性结合靶分子(T)，和第二结构域特异性结合内化效应蛋白(E)，第二抗原‑结合结构域与E具有10‑9至10‑8 M的解离常数(KD)。所述多特异性抗原‑结合分子可用于治疗和/或预防癌症的方法。

Description

具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子
发明领域
本发明涉及多特异性抗原-结合分子、包含所述多特异性抗原-结合分子的组合物和所述多特异性抗原-结合分子在治疗疾病中的用途。
发明背景
从开发第一个单克隆抗体开始，研究一直指向进一步优化抗体用于人疗法。第一个单克隆抗体源自小鼠和大鼠。抗体技术的进展导致可获得免疫原性风险特征降低的人源化和人抗体。遗传和化学工程导致治疗潜力增加的更有效抗体的开发。这包括具有优化的Fc-介导的效应功能、优化的结合特性或通过缀合至毒性分子优化的抗-肿瘤活性(抗体-药物缀合物)的抗体。
抗体–药物缀合物(ADC)作为治疗癌症的有力治疗剂出现，因为它们组合了抗体-介导的肿瘤靶向与毒素的细胞毒性活性。ADC包含连接至细胞毒性有效负载(payload)或药物的抗体(例如，单克隆抗体、单链可变片段[scFv]或双特异性抗体)。用针对肿瘤相关抗原的抗体将细胞毒性药物导向肿瘤的优点是相对于未缀合的细胞毒性药物，治疗窗可被改进。这允许应用增加效力的细胞毒性有效负载。
目前，两种ADC已被批准用于治疗应用：brentuximab vedotin (Adcetris)，用于治疗复发性霍奇金淋巴瘤和复发性sALCL；和曲妥珠单抗emtansine (Kadcyla)，用于治疗之前接受曲妥珠单抗和紫杉烷(单独或组合)的HER2-阳性的转移性乳腺癌患者。此外，超过50种不同的ADC目前处于临床评价中。在许多情况下，ADC依赖于毒素-缀合的抗体分子内化至靶向的细胞中以释放其有效负载和诱导随后的细胞毒性。在临床开发中的大多数ADC被设计为在循环中稳定和在抗原/ADC复合物的内化和溶酶体加工后释放其细胞毒性有效负载。
然而，对于抗原和抗体介导的内化的要求限制了合适的ADC靶标的数量。许多肿瘤相关抗原不容易内化或不容易到达溶酶体，因此对基于ADC的治疗提供了较少有前景的候选靶标。此外，在许多情况下，ADC的细胞内加工是不充分的。在内化后，受体例如转铁蛋白、HER2、细胞粘附分子L1和整联蛋白，连续地从内体室再循环回到质膜。因此需要高抗原周转(turn over)、高效转移至溶酶体和高度毒性的有效负载，以实现ADC的最大杀伤活性。
提高ADC的内化、溶酶体靶向、肿瘤内和细胞内加工的方法可用于提高ADC的肿瘤细胞杀伤活性。一种优化ADC活性的方法是通过选择肿瘤相关靶标上的特定表位，因为识别的特定表位可影响内化和溶酶体到达。例如，之前已经表明HER2-ADC的功效可通过选择HER2-ADC改进，HER2-ADC允许通过异源二聚体形成将HER2背负在其它ErbB分子上来提高内化。这提供了用于增加对高和低HER2表达的肿瘤细胞二者的ADC递送和肿瘤细胞杀伤能力的有吸引力的策略。
通常，ADC的高效内化，接着到达溶酶体(在其中可发生蛋白水解)，是优选的。然而，对于肿瘤细胞上的许多细胞表面蛋白和碳水化合物结构，这些过程的程度不足以允许通过ADC的足够有效的细胞杀伤。
国际专利申请WO2013/138400描述了具有特异性结合靶标抗原例如IL-4R或SOST的第一结构域和特异性结合内化效应蛋白的第二结构域的多特异性抗体。如果靶标抗原是肿瘤相关抗原，那么肿瘤相关抗原和内化效应蛋白通过多特异性抗体的结合促进靶向杀伤肿瘤细胞。
本发明的目的是提供双特异性或多特异性抗原-结合分子，相对于针对肿瘤相关靶标的单特异性抗原-结合分子，其内化能力增加。
本发明的另一个目的是提供双特异性或多特异性抗体药物缀合物分子，相对于针对肿瘤相关靶标的单特异性抗体药物缀合物分子，其内化能力增加。
本发明的另一个目的是提供在肿瘤细胞中内化、溶酶体靶向和/或细胞内加工增加的ADC。
本发明的另一个目的是提供对肿瘤细胞的细胞毒性增加和/或较少副作用的ADC。
本发明的另一个目的是提供治疗窗增加的ADC。
本发明的另一个目的是能够产生针对内化差或不足以到达溶酶体的肿瘤相关抗原的有效ADC。
发明简述
在第一方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子，其包含第一抗原-结合结构域和第二抗原-结合结构域，其中第一结构域特异性结合靶分子(T)和其中第二结构域特异性结合内化效应蛋白(E)，和其中第二抗原-结合结构域与E具有10-9至10-8 M的解离常数KD。
本发明人已发现，特定亲和力范围的第二抗原-结合结构域令人惊讶地对本发明的多特异性抗原-结合分子提供有益性质。发现在特定的结合亲和力范围内的第二抗原-结合结构域容易诱导多特异性分子的内化以及诱导药物-缀合的多特异性分子的细胞毒性。在第一结构域特异性结合肿瘤相关抗原例如HER2的情况下，这特别适用。同时，在没有第一结合结构域的结合的情况下，在特定范围的结合亲和力内第二抗原-结合结构域仅产生有限的内化和细胞毒性(当在ADC的情况下使用时)，即，令人惊讶地证实在缺少肿瘤相关靶标(T)的情况下在表达内化效应蛋白(E)的细胞中的低细胞毒性。因此，本发明的多特异性抗原-结合分子证实在肿瘤细胞中的结合、内化、溶酶体到达(lysosomal routing)和毒素释放，伴有在非-肿瘤细胞中的最少内化、溶酶体到达和毒素释放。
本发明人还已发现，本发明的多特异性抗原-结合分子允许利用通常不内化或内化差的肿瘤抗原，从而极大提高潜在ADC靶标库。
在另一方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子，其中所述分子与细胞毒性部分、放射性同位素、药物、细胞因子或RNA沉默媒介缀合。在其它方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子在治疗和/或预防癌症的方法中的用途和多特异性抗原-结合分子在靶向受试者的肿瘤的方法中的用途，所述方法包括给予受试者多特异性抗体或ADC。
在其它方面，本发明涉及包含多特异性抗原-结合分子作为活性成分的药物组合物，编码多特异性抗原-结合分子的核酸，包含所述核酸和合适时能够在单个或多个原核或真核宿主细胞系中表达所述核酸的表达载体，和包含所述载体的原核或真核宿主细胞系。
定义
结合、亲和力和KD
如本文使用的术语“结合”是指抗原-结合分子例如抗体与预定抗原或靶标的结合，例如其结合亲和力对应于约10-8 M或更小的KD值。
技术人员将熟悉亲和力的概念和平衡解离常数KD。解离常数KD可通过生物层测量。
KD值可通过生物层干涉测定法(BLI)在Octet HTX仪器中使用抗原-结合分子、例如抗体作为固定的配体和抗原作为分析物测量。
KD (M)是指多特异性-抗原结合分子和抗原之间的特定相互作用、优选地抗体分子的单一结合臂和抗原之间的相互作用的解离平衡常数，和可通过kd除以ka获得。如本文使用的术语“kd” (sec-1)是指多特异性-抗原结合分子和抗原之间的特定相互作用的解离速率常数。所述值也被称为kdis、koff值或分离速率(off-rate)。如本文使用的术语"ka" (M-1 xsec-1)是指多特异性-抗原结合分子和抗原之间的特定相互作用的缔合速率常数。所述值也被称为kon值或结合速率(on-rate)。
抗体
如本文使用的术语"抗体" (Ab)在本发明的情况下是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段，或其任一者的衍生物，其具有以下的能力：在典型的生理条件下特异性结合抗原、优选地双重结合两种不同的抗原(例如对于双特异性抗体)一段相关功能定义的时间，以诱导、促进、提高和/或调节与抗体结合抗原有关的生理反应。
免疫球蛋白分子(重链和/或轻链的任一种，或仅重链)的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与FcRn的结合。抗体也可以是双特异性或多特异性抗体，例如但不限于：DuoBody分子、串联scFv、串联scFv-Fc、杵臼结构(knob-into-hole) IgG、scFv-Fc杵臼结构、scFv-Fc-scFv、F(ab’)2、Fab-scFv、(Fab’scFv)2、双特异抗体、sc双特异抗体、sc双特异抗体-Fc或sc双特异抗体-CH3、Triomab、kih IgG共同LC、CrossMab、DVD-Ig、2合1-IgG、IgG-scFv、双-纳米抗体、BiTE、TandAb、DART、DART-Fc、scFv-HSA-scFv、orthoFab-IgG、四价Tv-IgG、dock-and-lock(DNL)格式例如DNL-Fab3和Azymetric支架，或类似的分子。
如上所述，本文的术语抗体，除非上下文另外指明或明显矛盾，包括抗体的片段，其为抗原-结合片段，即，保留特异性结合抗原的能力。已表明抗体的抗原-结合功能可通过全长抗体的片段实现。术语"抗体"涵盖的抗原-结合片段的实例包括(i) Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或描述于WO2007059782 (Genmab)的单价抗体；(ii) F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii) 基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv) 基本上由抗体的单个结构域的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v) dAb片段，其基本上由VH结构域组成，和亦称为结构域抗体；(vi) 骆驼或纳米抗体；和(vii) 分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成的接头连接，所述接头使它们能够制备成单一蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv (scFv))。这样的单链抗体在术语抗体内涵盖，除非上下文另外指明或清楚指示。在本发明的情况下这些和其它可用的抗体片段，以及这样的片段的双特异性格式，在本文进一步论述。还应理解，术语抗体除非另外指明，还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽、嵌合抗体、人源化和全人抗体，和保留特异性结合抗原的能力的抗体片段(抗原-结合片段)，其通过任何已知的技术提供，例如酶促裂解、肽合成和重组技术。产生的抗体可具有任何同种型。
如本文使用的"同种型"是指通过重链恒定区基因编码的免疫球蛋白(亚)类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。
术语"单价抗体"在本发明的情况下意指抗体分子能够结合不超过单个抗原分子。
术语“二价抗体”在本发明的情况下意指抗体分子含有两个针对特定抗原的结合结构域，因此能够结合一个或两个该抗原的分子。
多特异性抗体的产生
本发明的多特异性抗体、特别是双特异性抗体可通过受控Fab臂交换(FAE)产生，其描述于Labrijn等，Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange, PNAS, vol. 110, no.13, pp. 5145–5150, March 2013、WO 2011/131746 A2或Labrijn等Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1, Nat Protoc, 2014 Oct;9(10):2450-63，亦称为DuoBody®技术。简言之，在此体外方法中，提供两种不同的抗体，均包含具有CH3区的免疫球蛋白的Fc区，其中各自的CH3区的序列是不同的，和含有匹配的突变。结果是，在第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用。抗体在还原条件下孵育以使铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化和通过受控Fab臂交换获得双特异性抗体。还原剂随后从混合物(现在包含双特异性抗体)除去以使二硫键氧化。所述CH3区的序列含有匹配的突变，即，在两个CH3区的不同位置的突变，优选地在IgG1分子的一个CH3区的位置405的突变和另一个IgG1分子的CH3区的位置409的突变。多特异性抗体还可使用其它技术和格式产生，例如但不限于：串联scFv、串联scFv-Fc、杵臼结构IgGs、scFv-Fc杵臼结构、scFv-Fc-scFv、F(ab’)2、Fab-scFv、(Fab’scFv)2、双特异抗体、sc双特异抗体、sc双特异抗体-Fc或sc双特异抗体-CH3、Triomab、kih IgG共同LC、CrossMab、DVD-Ig、2合1-IgG、IgG-scFv、双-纳米抗体、BiTE、TandAb、DART、DART-Fc、scFv-HSA-scFv、orthoFab-IgG、四价Tv-IgG、dock-and-lock(DNL)格式例如DNL-Fab3和Azymetric支架，或类似的分子。
多特异性抗原-结合分子的内化的诱导
多特异性抗原-结合分子结合T和E二者优选地诱导本发明的多特异性抗原-结合分子的内化以及本发明的多特异性药物-缀合抗体的细胞毒性，至比单独结合靶标T更大的程度。例如，多特异性抗原-结合分子结合(优选地同时结合) T和E诱导的内化可以比在仅包含结合T而非E的对照构建体的存在时测量的内化的水平高超过10%、例如超过20%、超过30%、超过40%、超过50%、超过60%、超过70%、超过80%、超过90%、超过100%、超过110%、超过150%、超过200%、超过300%、超过400%、超过500%、超过750%、超过1000%、超过2000%或超过5000%。
确定本发明的多特异性抗原-结合分子是否提高多特异性抗原-结合分子的内化至比单独第一结构域结合靶分子(T)更大的程度的非限制性实例显示于实施例5和8的共定位测定法，或实施例9的HER2下调测定法，如下文所述。在所述实施例中，T是HER2和E是CD63。对于提高内化的概念，在实施例13和14中，多特异性抗体的内化提高使用整联蛋白β-1 (CD29)作为靶标(T)和CD63作为诱导提高内化的内化效应蛋白(E)证实。
本发明人已发现，特别是当E是CD63时，特定亲和力范围的第二抗原-结合结构域令人惊讶地对本发明的双特异性抗原-结合分子提供有益性质。在解离常数KD 10-9至10-8 M的特定亲和力范围内的抗原-结合结构域与E的单价结合容易诱导双特异性抗体的内化和双特异性药物-缀合抗体的细胞毒性，特别是当第一结构域特异性结合肿瘤相关抗原例如HER2时。此外，当仅E而非肿瘤相关靶标抗原(T)存在时，在该特定的亲和力范围内第二抗原-结合结构域对多特异性抗原-结合分子的内化和多特异性药物-缀合抗体的细胞毒性仅产生有限贡献，即，令人惊讶地证实在肿瘤靶标(T)不存在的情况下在表达内化效应蛋白(E)的细胞中细胞毒性低或没有细胞毒性。因此，本发明的多特异性抗原-结合分子证实结合，内化，在肿瘤细胞中的溶酶体积聚，伴有至非肿瘤细胞中的最少内化。
CD63
分化簇63 (CD63，Uniprot ID P08962)分子亦称为溶酶体相关膜糖蛋白3 (LAMP-3)。CD63亦称为：血小板糖蛋白40 (Pltgp40)、黑素瘤抗原ME491或MLA1、眼黑素瘤相关抗原(OMA81H)、四跨膜蛋白-30 (TSPAN30)、granulophysin或溶酶体膜内在蛋白-1 (LIMP-1)。CD63是四跨膜蛋白超家族的成员和遍在表达。CD63基因位于人染色体12q13上，和是首先表征的四跨膜蛋白。开始时，CD63作为活化血小板的细胞表面上存在的蛋白(称为Pltgp40)，和在早期人黑素瘤细胞中(其中它被称为ME491)被发现。
CD63在许多细胞类型中表达。特别地，CD63在溶酶体、内体、静息血小板和嗜碱粒细胞的颗粒中经细胞内表达。CD63的细胞表面表达可在活化嗜碱粒细胞和血小板、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞上检出。CD63还在内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、神经组织、黑素瘤细胞、平滑肌细胞和肥大细胞上表达。CD63被描述为在质膜和细胞内室之间穿梭。
大部分CD63位于细胞内室例如内体和溶酶体中，但一些表达可存在于细胞表面上。CD63已被描述调节其它蛋白通常通过胞吞作用的转运。此外，CD63被描述通过靶向用于溶酶体降解的酶来调节膜-1型基质金属蛋白酶的表面表达，和内皮细胞中CD63的沉默阻止血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)在响应其配体VEGF时的内化。此外在不同的肿瘤类型中，已证实CD63在质膜和溶酶体之间连续地穿梭，这取决于AP2和网格蛋白的存在。因此，CD63似乎是促进内化和溶酶体递送的有吸引力的抗原，这是适合于增强靶向肿瘤抗原的某些抗体药物缀合物(ADC)的功效的特征，所述抗体药物缀合物本身不足够内化和/或穿梭至溶酶体。
CD63表达未显示肿瘤特异性表达，尽管CD63首先在早期黑素瘤细胞中作为丰富表达的表面抗原被发现。CD63细胞表面表达在恶性黑素瘤进展期间减少，表明在CD63的细胞表面表达和肿瘤侵袭性之间负相关。
肿瘤相关抗原
肿瘤相关抗原是在(某些)肿瘤细胞的表面上表达的抗原，其表面表达较低程度上在正常细胞上发现。如本文使用的术语"肿瘤相关抗原"是指蛋白或多肽，但也指碳水化合物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、脂多糖或其它非蛋白聚合物，其优先在肿瘤细胞的表面上(外侧)表达。在此情况下使用的术语"优先表达"意指抗原在肿瘤细胞上以比在非肿瘤细胞上的抗原表达水平高至少10%、例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少110%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少750%、至少1000%、至少2000%或至少5000%的水平表达。肿瘤相关抗原可源自肿瘤细胞合成的任何蛋白、糖蛋白或其它大分子。
肿瘤相关抗原可分为不同的抗原类型：1) I类HLA-限制性癌症睾丸抗原，其通常在睾丸中或在一些肿瘤中，但不在正常组织中表达，包括来自MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO和BORIS家族的抗原；2) I类HLA限制性分化抗原，包括黑素细胞分化抗原，例如MART-1、gp100、PSA、酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2；3) 广泛表达的抗原，其是在正常组织和肿瘤组织中均表达的抗原，尽管呈现不同的水平或改变的翻译产物，包括CEA、HER2/neu、hTERT、MUC1、MUC2和WT1；4) 肿瘤特异性抗原，其是从正常基因的突变产生的独特抗原，包括β-连环蛋白、α-胎蛋白、MUM、RAGE、SART等；5) 病毒抗原，例如HPV、EBV；和6) 融合蛋白，其是通过染色体重排(例如缺失、易位、倒位或复制)产生的蛋白，所述重排导致肿瘤细胞专门表达的新蛋白，例如Bcr-Abl。
肿瘤相关抗原的优选实例包括5T4、A33、活化素受体、肾上腺髓质素受体、AFP、AGS-5、ALK、膜联蛋白、AXL、B7-H3、B7-H4、BAGE蛋白、BCMA、蛙皮素、C33抗原、C4.4a、C-型凝集素-样(-受体)、CA19.9、CA-125、CADM1、CAIX、CanAg、CAR、碳酸酐酶、小窝蛋白-1、CCK2R、CD4、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD51、CD57、CD70、CD73、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CEA、CEACAM、c-kit、claudin、趋化因子受体(即，CXCR4、CXCR5)、c-Met、Cripto-1、DEC-205、Derlin-1、桥粒核心糖蛋白-3、Dlk-1、DLL3、DS6、E-钙粘蛋白、E-选择蛋白、EAG-1、ED-B、EpCAM、EGFR、EGFRvlll、emmprin、内皮素受体、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、Ephrin A型受体、Epiregulin、ETA、FAP-α、FcyR's、FGFR、FOLR1、Frizzled、Fyn3、半乳凝素、神经节苷脂、GCC、GD2、GD3、GloboH、lypican-3、GLUT3、GPNMB、G-蛋白偶联受体(即，GPR49)、gp100、Hsp、 HLA/B-raf、HLA-DR、HLA/k-ras、HLA MAG E-A3、HMW-MAA、hTERT、ICAM-3、IGF-R、IL-13-R、L1CAM、层粘连蛋白受体、LIV1、LMP2、LRP5、LRP6、MAGE蛋白、MART-1、黑素转铁蛋白、间皮素、金属蛋白酶、ML-IAP、粘蛋白、Mud、Mud 6 (CA-125)、MU M1、N-钙粘蛋白、NA17、NCAM-1、Nectin4、Notch、NP-55、NRP1、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ES01、PLAC1、PRLR、PRAME、prominin-1、PSMA (FOLH 1)、RON、SLC44A4、SLITRK6、Steap-1、Steap-2、存活素、多配体聚糖、TAG-72、TF、TGF-β、TMPRSS2、TMEFF2、TNFR、Tn、TROP2、TRP-1、TRP-2,TWEAKR、酪氨酸酶、uroplakin-3和VEGFR。
肿瘤相关抗原的优选实例包括高度过表达，但缺少足够的溶酶体转运的肿瘤相关抗原，例如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白(即，磷脂酰肌醇聚糖家族、uPAR、叶酸结合受体、prostasin、FcgRIIIb [CD16b]、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、5’核苷酸酶[p36]、Cripto、LFA-3 [CD58]、DAF [CD55]、Thy-1 [CD90]、Qa-2、Ly-6A和MIRL [CD59])、粘附分子(即，选择蛋白、L1CAM、N-CAM、LRP1、TAG1、钙粘蛋白)，其在胞吞作用后通常再循环回到质膜，仅较少部分被靶向溶酶体降解。
肿瘤相关抗原的优选实例包括已知与CD63相互作用的肿瘤特异性抗原，CD63可以低拷贝数改进bsADC的二价结合。例如，CD63已被描述与其它四跨膜蛋白(即，CD81、CD82、CD9和CD151)、整联蛋白、MHCII、CXCR4、TM4SF5、syntenin-1、TIMP-1、H、K-ATPase、L6-抗原和MT1-MMP相互作用。
肿瘤相关抗原的实例包括糖靶标的选择，例如Lewis-Y (CD174)、Lewis-X(CD15)、SLeX、SLeA、sTn、岩藻糖基-GM1、Globo H、SSEA-3、GM2、GD2、GD3、多唾液酸或糖蛋白(即，粘蛋白)。
附图简述
图1显示抗-CD63抗体结合重组人CD63的剂量反应曲线，如通过ELISA测量的。
图2显示抗-CD63抗体的亲和变体的亲和力测量，其用无标签生物层干涉测定法测量。
图3显示在Colo205细胞中测试单价bsCD63N74Hxb12-Duo3 ADC和bsHER2xCD63N74H-Duo3 ADC的细胞毒性的成活力测定的结果。
图4显示在SK-OV-3细胞中测试单价bsCD63N74Hxb12-Duo3 ADC和bsHER2xCD63N74H-Duo3 ADC的细胞毒性的成活力测定的结果。
图5显示在HCC1954细胞中测试单价bsCD63N74Hxb12-Duo3 ADC和bsHER2xCD63N74H-Duo3 ADC的细胞毒性的成活力测定的结果。
图6显示在SK-OV-3细胞中用共聚焦显微镜检查测量的单价bsCD63N74Hxb12双特异性分子的溶酶体共定位。
图7显示bsHER2xCD63N74H与SK-OV-3细胞的结合，如通过流式细胞术测定的。
图8显示FITC-缀合的CD63抗体和CD63亲和变体抗体在粒细胞和血小板中的细胞内积聚。
图9显示bsHER2xCD63N74H在SK-OV-3细胞中随时间跟踪的溶酶体共定位。
图10显示与未处理的细胞相比，在用bsHER2xCD63N74H孵育三天后，在具有不同的表达水平的HER2的肿瘤细胞系中HER2蛋白的总量，如通过ELISA定量的。
图11显示体外测试Duostatin-3缀合的双特异性ADC的细胞毒性的成活力测定的结果。
图12显示在已用SK-OV-3肿瘤异种移植物皮下接种，接着用Duostatin-3缀合的多特异性ADC治疗的小鼠中的平均肿瘤大小和无肿瘤存活百分比。
图13显示bsBeta1xCD63N74H与SK-OV-3细胞的结合，如通过流式细胞术评价的。
图14显示bsBeta1xCD63N74H在SK-OV-3细胞上的溶酶体共定位。
图15显示bsBeta1xCD63N74H在SK-OV-3细胞上随时间跟踪的溶酶体共定位。
发明详述
在一个方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子，其包含第一抗原-结合结构域和第二抗原-结合结构域，其中第一结构域特异性结合靶分子(T)和其中第二结构域特异性结合内化效应蛋白(E)，和其中第二抗原-结合结构域与E具有10-9至10-8 M的解离常数KD值。
为提供本发明的多特异性抗原-结合分子的肿瘤特异性，在缺少第一抗原-结合结构域的情况下，特异性结合内化效应蛋白(E)的第二结构域可有利地不结合或仅以低亲和力结合和随后不内化或至少在明显更低程度上内化。本发明人已发现，其中第二抗原-结合结构域与E具有10-9至10-8 M的解离常数KD值的多特异性抗原-结合分子满足这些标准。
靶分子(T)、优选地肿瘤相关靶分子，可以是蛋白、多肽、脂质或其它大分子。在优选的实施方案中靶分子是蛋白。在其它实施方案中靶分子、优选地肿瘤相关靶分子是多肽。在一些实施方案中T是细胞表面-表达的靶蛋白或靶多肽。在其它实施方案中T是可溶性靶蛋白或靶多肽、优选地与细胞表面受体相互作用的可溶性靶蛋白或靶多肽。通过多特异性抗原-结合分子的靶标结合可在细胞外或在细胞表面上发生。
在一个实施方案中，靶分子是细胞表面-表达的受体。在优选的实施方案中靶分子是酪氨酸激酶受体、优选地跨膜酪氨酸激酶受体。在其它实施方案中靶分子是膜结合配体。
在其它实施方案中，多特异性抗原-结合分子、优选地双特异性抗原-结合分子，结合在细胞表面上或在细胞内部的E。
特别优选的是，靶分子是肿瘤相关抗原、例如肿瘤相关蛋白或多肽。有利的是，肿瘤相关抗原是通常不内化或内化差的抗原。优选地，肿瘤相关抗原是显示到达溶酶体室效率差的抗原。
内化效应蛋白(E)可以是肿瘤相关或肿瘤特异性的。在其它实施方案中，内化效应蛋白(E)可在肿瘤以及非肿瘤细胞上或其内表达。
内化效应蛋白(E)是能够内化至细胞中或以其它方式参与或促进内化的蛋白。在一些实施方案中，内化效应蛋白是经历胞转作用的蛋白；即，蛋白在细胞的一侧上内化和转运至细胞的另一侧。优选地，内化效应蛋白是膜蛋白或结合膜结合受体的可溶性细胞外蛋白。在优选的实施方案中，内化效应蛋白是显示高效到达细胞的溶酶体室的蛋白。
第二结构域与内化效应蛋白的结合有利地导致多特异性抗原-结合分子和与其缔合的靶分子内化至细胞中。在优选的实施方案中，内化效应蛋白是具有至少一个细胞外结构域或区的膜缔合蛋白，所述蛋白被内化和优选地通过细胞内降解途径和/或再循环途径加工。直接内化至细胞中的内化效应蛋白的具体实例包括例如，CD63、MHC-I (例如，HLA-B27)、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、转铁蛋白受体、LDL-受体、LDL-相关蛋白1受体、ASGR1、ASGR2、淀粉样蛋白前体蛋白-样蛋白-2 (APLP2)、apelin受体(APLNR)、MAL (髓磷脂和淋巴细胞蛋白、VIP17)、IGF2R、空泡-型H+ ATPase、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦蛋白受体、清道夫受体(例如，SCARA1-5、SCARB1-3、CD36)。在优选的实施方案中，内化效应蛋白E是细胞表面内化受体。在优选的实施方案中，内化效应蛋白E是CD63。
在优选的实施方案中，多特异性抗原-结合分子包含i) 包含第一抗原-结合结构域的第一结合臂，和ii) 包含第二抗原-结合结构域的第二结合臂。
特别优选的是，多特异性抗原-结合分子是双特异性抗原-结合分子。
在本发明的一个实施方案中，第二抗原-结合结构域与E具有高于10-9和低于10-8M的解离常数KD值。根据另一个实施方案，第二抗原-结合结构域与E具有2.0x10-9至9.0x10-9M的解离常数KD。根据另一个实施方案，第二抗原-结合结构域与E具有2.0x10-9至7.3x10-9 M的解离常数KD。
根据另一个实施方案，E是细胞表面-表达的分子，其内化、优选地直接内化至细胞中。优选地，多特异性抗原-结合分子仅在靶分子(T)存在的情况下通过结合E被内化至细胞中。还优选的是，多特异性抗原-结合分子仅当第一结构域特异性结合靶分子(T)时通过结合E被内化至细胞中。
在一个实施方案中，与不表达T的细胞相比，多特异性抗原-结合分子在结合E时更有效地内化至表达T的细胞中。
在另一个实施方案中，与不表达E的细胞相比，多特异性抗原-结合分子在结合T时更有效地内化至表达E的细胞中。
在另一个实施方案中，多特异性抗原-结合分子在结合E时转运至表达T的细胞的溶酶体室。
在另一个实施方案中，与不表达T的细胞相比，多特异性抗原-结合分子在结合E时更有效地转运至表达T的细胞的溶酶体室。
在另一个实施方案中，与不表达E的细胞相比，多特异性抗原-结合分子在结合T时更有效地转运至表达E的细胞的溶酶体室。
根据另一个实施方案，E选自CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、转铁蛋白受体、LDLr、MAL、V-ATPase和ASGR。在优选的实施方案中，E是CD63。
根据另一个实施方案，E是可溶性配体，其通过E和内化细胞表面-表达的受体分子之间的相互作用被内化至细胞中。
根据另一个实施方案，T是细胞表面-表达的靶分子。在特别优选的实施方案中，T是肿瘤相关抗原。本发明内化-提高策略因此可包括组合肿瘤相关靶标抗原与抗原例如CD63的内化能力。特别地，结合CD63和肿瘤相关靶标二者的双特异性抗体可用于其中需要抗体-药物缀合物的特异性靶向和提高的内化的治疗背景。根据一个实施方案，T是HER2。
根据另一个实施方案，第一和/或第二抗原-结合结构域包含至少一个抗体可变区、优选地至少两个抗体可变区。
根据一些实施方案，多特异性抗原-结合分子是多特异性抗体、优选地双特异性抗体，或多特异性、优选地双特异性抗体片段，或其重组改造部分。在特别优选的实施方案中，多特异性抗原-结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体可通过用双特异性抗体的一个臂结合一种抗原和用另一个臂结合靶分子、例如肿瘤相关靶分子，用于利用所述抗原的内化提高性质。这样的双特异性抗体然后可用细胞毒性缀合物加载，以在ADC内化后诱导细胞死亡。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，包含(i) 包含特异性结合本文定义的靶分子(T)的第一抗原-结合结构域的第一抗体和(ii) 包含特异性结合本文定义的内化效应蛋白(E)的第二抗原-结合结构域的第二抗体。
在优选的实施方案中，多特异性抗原-结合分子是双特异性抗体，包含包含第一抗原-结合结构域的第一结合臂和包含所述第二抗原-结合结构域的第二结合臂。有利地，所述第一抗原-结合结构域包含第一重链可变序列(VH)和第一轻链可变序列(VL)，和所述第二抗原-结合结构域包含第二重链可变序列(VH)和第二轻链可变序列(VL)，和其中所述可变序列各自包含三个CDR序列，CDR1、CDR2和CDR3。
在优选的实施方案中，(i) 所述第一结合臂包含包含第一重链可变序列(VH)和第一重链恒定序列(CH)的第一重链和包含第一轻链可变序列(VL)和第一轻链恒定序列(CL)的第一轻链，和(ii) 所述第二结合臂包含包含第二重链可变序列(VH)和第二重链恒定序列(CH)的第二重链和包含第二轻链可变序列(VL)和第二轻链恒定序列(CL)的第二轻链。
根据另一个实施方案，第一结合臂衍生自嵌合抗体或人源化抗体或人抗体。根据另一个实施方案，第二结合臂衍生自嵌合抗体或人源化抗体或人抗体。因此，在一个实施方案中第一结合臂衍生自人抗体和第二结合臂衍生自人源化抗体或嵌合抗体。
优选的是，本发明的多特异性抗原-结合分子是双特异性抗体，其中双特异性抗体是全长抗体、优选地IgG1抗体。
在优选的实施方案中，本发明的多特异性抗原-结合分子是分离的。如本文使用的"分离的多特异性抗原-结合分子"意指多特异性抗原-结合分子、例如双特异性抗体，其基本上不含具有不同的抗原特异性的其它抗原-结合分子或抗体。此外，分离的多特异性抗原-结合分子可基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。
根据另一个实施方案，所述第二抗原-结合结构域具有一个或多个突变，其调节第二抗原-结合结构域与E的亲和力。在另一个实施方案中，所述第二抗原-结合结构域衍生自在VH和/或VL中具有一个或多个突变的抗体，所述突变调节第二抗原-结合结构域与E的亲和力。优选的是，亲和力经调节，使得第二抗原-结合结构域与E具有10-9至10-8 M的解离常数KD值。
根据另一个实施方案，所述抗体在抗-CD63 Fab区中具有一个或多个突变，所述突变调节第二抗原-结合结构域与E的亲和力，其中E是CD63。根据另一个实施方案，突变是单个氨基酸置换、优选地单个氨基酸组氨酸置换。
根据另一个实施方案，在VH和/或VL中的所述一个或多个突变是在根据下表1的SEQ ID NO: 5的VL的位置54或在根据下表1的SEQ ID NO: 1的VH的位置71、72和/或74的氨基酸置换、优选地组氨酸置换。例如，抗-CD63-N74H在根据SEQ ID NO: 1的重链的位置74具有天冬酰胺至组氨酸突变，抗-CD63-LN54H在根据SEQ ID NO: 5的轻链的位置54具有天冬酰胺至组氨酸突变。根据另一个实施方案，第二抗原-结合结构域经选择，使得其以在优选的亲和力范围内的KD结合靶标E。
在优选的实施方案中，所述氨基酸置换、优选地组氨酸置换在根据SEQ ID NO: 1的VH的位置74。在优选的实施方案中，突变是根据SEQ ID NO: 1的VH的N74H。
在优选的实施方案中，所述第二结构域，优选地作为所述第二结合臂的一部分，包含：
a)分别在SEQ ID NO: 2、3和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 9、7和8中提供的VL CDR 1、2和3，或
b) 分别在SEQ ID NO: 2、10和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3，或
c)分别在SEQ ID NO: 2、11和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3，或
d) 分别在SEQ ID NO: 2、12和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3。
在特别优选的实施方案中，所述第二结构域，优选地作为所述第二结合结构域的一部分，包含分别在SEQ ID NO: 2、12和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3。
根据另一个实施方案，所述多特异性抗原-结合分子包含CD63-特异性单克隆抗体的突变的Fab区。根据另一个实施方案，所述多特异性抗原-结合分子包含CD63-特异性单克隆Ab 2192的突变的Fab区。根据另一个实施方案，所述多特异性抗原-结合分子包含选自杂交瘤或噬菌体展示文库的CD63特异性抗原-结合区。
根据另一个实施方案，所述第一和第二抗原-结合结构域各自是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域对。
双特异性抗原-结合分子可优选地进一步包含抗体恒定区。
根据另一个实施方案，抗原-结合分子是肿瘤相关靶标(T)xCD63双特异性抗体。在优选的实施方案中，(T)xCD63双特异性抗体与细胞毒性药物缀合。在一个实施方案中(T)xCD63双特异性抗体与duostatin-3缀合。在一个实施方案中(T)xCD63双特异性抗体与duostatin-3缀合，且抗-CD63结合结构域，其是第二结合结构域，包含分别在SEQ ID NO:2、12和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3。特别地，肿瘤相关靶标(T)xCD63双特异性抗体-药物缀合物(ADC)可用于其中需要抗体-药物缀合物的特异性靶向和提高的内化的治疗背景。发明人已发现当与使用单特异性ADC来靶向仅肿瘤相关抗原相比时，本发明的(T)xCD63双特异性ADC更有效杀伤表达靶标T的细胞。发现这样的ADC在体外和在动物模型中比现有技术的双特异性ADC更有效根除肿瘤细胞。
发现通过能够结合肿瘤相关靶标和CD63抗原的有效内化特性二者来提高ADC的内化，从而通过在靶向的细胞内部更高效的有效负载递送来诱导更强的细胞杀伤，本发明的(T)xCD63双特异性ADC是有利的。为了定制增加靶向各种肿瘤-抗原的抗体的功效的需要，发现窄范围的令人惊讶地高效的CD63亲和变体(跨越一定范围的CD63亲和力)提高双特异性ADC的功效。
根据另一个实施方案，抗原-结合分子是HER2xCD63双特异性抗体。
根据另一个实施方案，对于结合表达肿瘤相关靶标(T)的细胞、例如表达HER2的细胞，抗原-结合分子具有低于5.0 µg/ml、例如低于4.0 µg/ml、例如低于3.0 µg/ml、例如低于2.0 µg/ml、例如低于1.0 µg/ml、例如低于0.9 µg/ml、例如低于0.8 µg/ml、例如低于0.7µg/ml、例如低于0.6 µg/ml、例如低于0.5 µg/ml、例如低于0.4 µg/ml、例如低于0.3 µg/ml、例如低于0.2 µg/ml、例如低于0.1 µg/ml、例如低于0.05 µg/ml、例如低于0.01 µg/ml的EC50值，如通过流式细胞术测定的。
在另一优选的实施方案中，多特异性抗原-结合分子结合T和E诱导多特异性抗原-结合分子的内化至比单独第一结构域结合T更大的程度。类似地，本发明的多特异性药物-缀合的抗体结合T和E优选地诱导细胞毒性至比单独第一结构域结合T更大的程度。
在另一优选的实施方案中，多特异性、优选地双特异性抗原-结合分子结合T和E诱导多特异性抗原-结合分子的内化至比相应的二价单特异性抗体结合T更大的程度。类似地，本发明的多特异性、优选地双特异性药物-缀合抗体结合T和E优选地诱导细胞毒性至比相应的二价单特异性ADC结合T更大的程度。
根据另一个实施方案，KD值通过生物层干涉测定法在30 ℃下测定。在其它实施方案中，KD通过生物层干涉测定法在30 ℃和7.2-7.5、例如7.3-7.4、例如pH 7.4的pH下测定。在其它实施方案中，KD通过生物层干涉测定法在30 ℃下以1000 RPM摇动器速度测定。在另一个实施方案中，KD通过生物层干涉测定法使用Octet系统、例如Octet HTX (ForteBio)测定。
在优选的实施方案中，抗原-结合分子是双特异性抗体，其包含：
i) 包含第一重链的第一结合臂，所述第一重链包含第一重链恒定序列(CH)，所述第一CH包含第一CH3区，和
ii) 包含第二重链的第二结合臂，所述第二重链包含第二重链恒定序列(CH)，所述第二CH包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，使得所述第一和第二结合臂之间的异二聚相互作用强于所述第一和第二结合臂各自的同二聚相互作用。
优选地，在所述第一重链CH3区中在对应于人IgG1重链的位置T366、L368、K370、D399、F405、Y407或K409的位置的至少一个氨基酸已被置换，和在所述第二重链CH3区中在对应于人IgG1重链的位置T366、L368、K370、D399、F405、Y407或K409的位置的至少一个氨基酸已被置换，其中所述第一和所述第二重链未在相同位置被置换，和其中氨基酸位置根据EU-索引编号。
在另一个实施方案中，(i) 第一CH3区具有F405L置换和第二CH3区具有K409R置换，或(ii) 第一CH3区具有K409R置换和第二CH3区具有F405L置换。
根据另一个实施方案，多特异性抗原-结合分子与细胞毒性部分、放射性同位素、药物、细胞因子或RNA沉默媒介缀合。优选地，多特异性抗原-结合分子与细胞毒性部分、放射性同位素或药物缀合。优选地，多特异性抗原-结合分子与细胞毒性部分缀合。
细胞毒性部分可选自duostatin-3、duostatin-5、吡咯并苯并二氮䓬或其类似物或衍生物、基于IGN的毒素或其类似物或衍生物、α-鹅膏菌素或其类似物或衍生物、多拉司他汀或其类似物或衍生物、泰素；细胞松弛素B；短杆菌肽D；溴化乙锭；依米丁；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；柔红霉素；二羟基炭疽菌素二酮；微管蛋白抑制剂例如美登素或其类似物或衍生物；米托蒽醌；光神霉素；放线菌素D；1-去氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌罗霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、6巯基嘌呤、6硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、门冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷化剂，例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂、卡铂、倍癌霉素A、倍癌霉素SA、雷查霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，例如更生霉素、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、氨茴霉素(AMC))；抗有丝分裂剂，例如阿里他汀或其类似物或衍生物、单甲基阿里他汀E或F或其类似物或衍生物；白喉毒素和相关分子，例如白喉A链和其活性片段和杂合分子，蓖麻毒素例如蓖麻毒素A或去糖基化蓖麻毒素A链毒素、霍乱毒素、志贺样毒素例如SLT I、SLT II、SLT IIV、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、alorin、皂草素、蒴莲根毒素、gelanin、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-sarcin、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白例如PAPI、PAPII和PAP S、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素；核糖核酸酶(RNase)；DNase I、葡萄球菌肠毒素A；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素、假单胞菌内毒素和RNAi (即，siRNA、与抗体缀合或在纳米颗粒中递送的shRNA)。
根据另一个实施方案，细胞毒性部分选自美登素、卡奇霉素、倍癌霉素、duostatin、duostatin-3、duostatin-5、雷查霉素(CC-1065)、阿里他汀、单甲基阿里他汀E、单甲基阿里他汀F、多柔比星、多拉司他汀、吡咯并苯并二氮䓬、基于IGN的毒素、α-鹅膏菌素或其任何的类似物、衍生物或前药。
在一个实施方案中，细胞毒性部分、药物或放射性同位素用可裂解接头、例如N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)-戊酸酯(SSP)、马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-vc-PAB)或AV-1 K-lock缬氨酸-瓜氨酸，连接至所述抗体或其片段。
如本文使用的术语“可裂解接头”是指被靶向的细胞或肿瘤微环境中的特定的蛋白酶催化，导致释放细胞毒性剂的接头子集。可裂解接头的实例是基于包括二硫化物、腙或肽在内的化学基序的接头。另一可裂解接头子集在细胞毒性剂和初始接头之间(即，连接接头-药物联合体与抗体的位点)添加额外的接头基序。在一些实施方案中，额外的接头基序可通过在细胞内环境中(例如在溶酶体或内体或内陷(caveola)内)存在的裂解剂进行裂解。接头可以是例如肽基接头，其通过细胞内肽酶或蛋白酶裂解，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶。在一些实施方案中，肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可包括组织蛋白酶B和D和纤溶酶，已知其全部水解二肽药物衍生物，导致在靶标细胞内部释放活性药物(参见例如Dubowchik和Walker，1999，Pharm. Therapeutics 83:67-123)。在特定的实施方案中，通过细胞内蛋白酶裂解的肽基接头是Val-Cit (缬氨酸-瓜氨酸)接头或Phe-Lys (苯丙氨酸-赖氨酸)接头(参见例如US6214345，其描述了含Val-Cit接头的多柔比星的合成)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的优点是所述试剂当缀合时通常被削弱，和缀合物的血清稳定性通常是高的。
在其它实施方案中，细胞毒性剂、药物或放射性同位素用不可裂解接头、例如琥珀酰亚胺基-4(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(MCC)或马来酰亚胺基己酰基(MC)，连接至所述抗体或其片段。
如本文使用的术语“不可裂解接头”是指与可裂解接头相反，不包含被细胞内或细胞外蛋白酶特异性和可预测地识别的基序的接头子集。因此，基于不可裂解接头的ADC不从抗体释放或裂解，直到完整的抗体-接头-药物复合物在溶酶体室中被降解。不可裂解接头的实例是硫醚。在又一个实施方案中，接头单元不可裂解，和药物通过抗体降解来释放。
在特别优选的实施方案中，多特异性抗原-结合分子结合T和E诱导多特异性抗原-结合分子内化至比结合单独靶标T更大的程度。
在另一方面，本发明涉及使用以下技术或格式产生的多特异性抗体，例如但不限于：DuoBody、CrossMab、Triomab、kih IgG共同LC、DVD-Ig、2合1-IgG、IgG-scFv、双-纳米抗体、BiTE、TandAb、DART、DART-Fc、scFv-HSA-scFv、orthoFab-IgG、四价Tv-IgG、dock-and-lock(DNL)格式例如DNL-Fab3或片段例如串联scFv、串联scFv-Fc、杵臼结构IgG、scFv-Fc杵臼结构、scFv-Fc-scFv、F(ab’)2、Fab-scFv、(Fab’scFv)2、双特异抗体、sc双特异抗体、sc双特异抗体-Fc、sc双特异抗体-CH3或Azymetric支架。
在另一方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子的双特异性抗体片段，其中抗体片段是串联scFv、串联scFv-Fc、scFv-Fc杵臼结构、scFv-Fc-scFv、F(ab’)2、Fab-scFv、(Fab’scFv)2、双特异抗体、sc双特异抗体、sc双特异抗体-Fc、sc双特异抗体-CH3。
在另一方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子或双特异性抗体片段，其用于治疗和/或预防癌症的方法。用这样的方法治疗的受试者优选地是需要这样的治疗的人个体，例如癌症患者。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌，包括原发性、转移性和难治性乳腺癌。
在一些实施方案中，癌症是子宫内膜癌/宫颈癌、肺癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、软组织肿瘤例如滑膜肉瘤、乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肾癌、子宫颈癌、膀胱癌、食管癌、胃癌或结肠直肠癌。
多特异性抗原-结合分子的有效剂量和剂量方案取决于要治疗的癌症。本发明的双特异性抗体的治疗有效量的示例性的非限制性范围是约0.1-100 mg/kg、例如约0.1-50mg/kg、例如约0.1-20 mg/kg、例如约0.1-10 mg/kg、例如约0.5、约例如0.3、约1、约3、约5或约8 mg/kg。
在一些实施方案中，多特异性抗原-结合分子可预防性给予，以减低发生癌症的风险，延迟在癌症进展或佐剂条件下事件发生的开始，和/或当癌症减轻时降低复发风险。
在一个实施方案中，治疗或预防癌症的方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的本发明的多特异性抗原-结合分子和至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，这样的另外的治疗剂可选自抗代谢物例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、门冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨。在其它实施方案中，这样的另外的治疗剂可选自烷化剂例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂衍生物例如卡铂。在其它实施方案中，这样的另外的治疗剂可选自抗有丝分裂剂例如紫杉烷，例如多西他赛和紫杉醇和长春花生物碱，例如长春地辛、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。在其它实施方案中，这样的另外的治疗剂可选自拓扑异构酶抑制剂例如托泊替康或伊立替康，或细胞生长抑制药物例如依托泊苷和替尼泊苷。在其它实施方案中，这样的另外的治疗剂可选自生长因子抑制剂例如ErbB1 (EGFR)的抑制剂(例如EGFR抗体，例如zalutumumab、西妥昔单抗、帕尼单抗或nimotuzumab或其它EGFR抑制剂，例如吉非替尼或厄罗替尼)、ErbB2 (HER2/neu)的其它抑制剂(例如HER2抗体，例如曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-DMl或pertuzumab)或EGFR和HER2二者的抑制剂，例如拉帕替尼)。在其它实施方案中，这样的另外的治疗剂可选自酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼或拉帕替尼。
在另一方面，本发明涉及多特异性抗原-结合分子，其用于靶向受试者的肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者多特异性抗原-结合分子。根据本发明可靶向的肿瘤包括恶性和非恶性肿瘤。可治疗的恶性(包括原发性和转移性)肿瘤包括但不限于在以下中发生的那些：肾上腺；膀胱；骨；乳腺；宫颈；内分泌腺(包括甲状腺、垂体和胰腺)；结肠；直肠；心脏；生血组织；肾；肝；肺；肌肉；神经系统；脑；眼；口腔；咽；喉；卵巢；阴茎；前列腺；皮肤(包括黑素瘤)；睾丸；胸腺；和子宫。这样的肿瘤的实例包括apud瘤、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌心脏症、癌(例如，Walker、基底细胞、基底鳞状、Brown-Pearce、管、Ehrlich肿瘤、原位、Krebs 2、梅克尔细胞、粘蛋白状、小细胞肺、燕麦细胞、乳头状、硬癌、细支气管、支气管原性、鳞状细胞和移行细胞)、浆细胞瘤、黑素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、间充质瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋养层细胞瘤、腺癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、肝癌、汗腺瘤、胰岛细胞瘤、莱迪希细胞瘤、乳头状瘤、睾丸支持细胞瘤、泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、neurilemnnoma、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬副神经节瘤、血管角质瘤、血管淋巴样增生伴嗜酸粒细胞增多、血管瘤硬化、多发性血管瘤、血管球瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、叶状囊肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肉瘤(例如，尤因实验肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、肿瘤和对于其它这样的细胞。给药可包括皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。
类似地，本发明涉及杀伤表达肿瘤相关靶分子、例如HER2的肿瘤细胞的方法，包括给予有需要的个体有效量的本发明的多特异性抗原-结合分子、例如双特异性抗体、例如抗体药物-缀合物(ADC)。
在一个实施方案中，所述肿瘤细胞涉及选自以下的癌症形式：乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、食管癌和头颈鳞状细胞癌、宫颈癌、胰腺癌、睾丸癌、恶性黑素瘤和软组织癌(例如滑膜肉瘤)。
在又一方面，本发明涉及包含多特异性抗原-结合分子作为活性成分的药物组合物。有利地，这样的药物组合物用合适的赋形剂配制，例如抗氧化剂、抗细菌剂、螯合剂、缓冲剂、着色剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂和/或助悬剂。药物组合物可通过输注、通过推注、通过上皮或粘膜皮肤衬里吸收给予。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可包含一种或多种另外的药用活性成分、这样的细胞毒性物质或抗-癌药物。
在另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，包括给予有需要的受试者本发明的多特异性抗原-结合分子或本发明的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的多特异性抗原-结合分子的核酸、例如DNA分子。核酸可编码本发明的双特异性抗原-结合分子(例如抗体)的重链和轻链。
在另一方面，本发明涉及包含所述核酸和能够在原核或真核宿主细胞系中表达所述核酸的表达载体或一组表达载体。抗体的重链和轻链可由相同的载体或不同的载体编码，取决于使用的双特异性抗体技术。这样的表达载体可用于重组生产本发明的抗体。
在本发明的情况下表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色体和合成的核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、和病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码抗体的核酸包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件，致密核酸载体，质粒载体例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119，"midge"最小尺寸核酸载体，或作为沉淀核酸载体构建体例如CaP04-沉淀构建体。
在另一方面，本发明涉及包含所述载体的原核或真核宿主细胞系。宿主细胞是表达载体(即，当Duobody技术用于产生本发明的双特异性抗原-结合分子时编码同二聚单特异性前体分子的表达载体)已引入其中的细胞，或包含编码本发明的双特异性分子的核酸的单个宿主细胞。重组宿主细胞包括例如转染瘤，例如CHO细胞、HEK293细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及针对上文定义的本发明的多特异性抗原-结合分子产生的抗-个体基因型抗体。抗-个体基因型(Id)抗体是识别通常与抗体的抗原-结合位点有关的独特决定簇的抗体。Id抗体可通过用对其制备抗-Id的上述多特异性抗原-结合分子、例如双特异性抗体免疫动物来制备。免疫的动物通常可通过产生对免疫双特异性抗体的个体基因型决定簇的抗体(抗-Id抗体)，来识别和响应这些个体基因型决定簇。
在一个实施方案中，抗-个体基因型抗体用于检测样品中上文定义的多特异性抗原-结合分子的水平。
实施例
实施例1：抗体产生、定点诱变和Duostatin-3缀合
他处已描述了人HER2抗体IgG1-153的克隆和产生；de Goeij B.E.C.G. MAbs，2014. 6(2): p. 392-402。通过从杂交瘤来源的RNA进行可变区的5’-RACE和测序，小鼠单克隆CD63抗体2192的可变结构域重链和轻链区(见下表1，SEQ ID N: 1和5)获自杂交瘤2.19(Metzelaar M.J. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol，1991. 61(4): p.269-77)。将可变区克隆至包含相关的人轻链恒定结构域(密码子优化的，Invitrogen)与相关的人重链恒定结构域突变(K409R或F405L)的哺乳动物表达载体pcDNA3.3(Invitrogen)。人-小鼠嵌合CD63抗体被称为野生型IgG1-CD63。IgG1-CD63抗体突变通过定点诱变或直接基因合成引入可变结构域，目的为产生一组IgG1-CD63亲和变体。氨基酸突变以抗体名称指示，即，抗-CD63-N74H在重链(SEQ ID NO: 1，表1)的氨基酸位置74具有天冬酰胺至组氨酸突变，抗-CD63-LN54H在轻链(如表1的SEQ ID NO: 5编号)的位置54具有天冬酰胺至组氨酸突变。抗体通过重链和轻链载体的共转染和在HEK-293 freestyle细胞(Invitrogen)中瞬时表达产生，如Vink T. Methods，2014. 65(1): p. 5-10所述。双特异性抗体(Duobody)通过受控Fab臂交换制备，如Labrijn A.F. Nat Protoc, 2014. 9(10):p. 2450-63所述。HIV gp120-特异性人抗体IgG1-b12作为同种型对照包括在内，参见Parren P.W.H.I. AIDS, 1995. 9(6): p. F1-6。
Duostatin-3缀合抗体通过在IgG1-HER2-F405L和IgG1-b12-F405L的抗体赖氨酸基团上缬氨酸-瓜氨酸-duostatin-3 (Duo3)的共价缀合产生，如de Goeij B.E.C.G. MolCancer Ther. 2015. 14(5):1130-40所述。双特异性ADC bsHER2xCD63-Duo3和bsHER2xb12-Duo3通过Duo3-缀合抗体IgG1-HER2-F405L-Duo3与未缀合IgG1-CD63-K409R或IgG1-b12-K409R进行Fab臂交换产生。双特异性ADC bsCD63xb12-Duo3通过IgG1-b12-F405L-Duo3与IgG1-CD63-K409R进行Fab臂交换产生。所有双特异性ADC具有1的DAR。为产生具有1的DAR的对照ADC，IgG1-HER2-F405L-Duo3和IgG1-b12-F405L-Duo3分别与IgG1-HER2-K409R和IgG1-b12-K409R进行Fab臂交换，以产生IgG1-HER2-Duo3和IgG1 b12-Duo3。ADC的DAR通过疏水相互作用色谱(HIC)测定。
表1 –抗-CD63抗体2192的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和CDR序列
实施例2：CD63结合ELISA
为了改进ADC的功效，产生双特异性ADC，其用一个Fab臂特异性结合靶蛋白(T)，而其第二个Fab臂结合促进细胞毒性有效负载的内化和溶酶体递送的效应蛋白(E)。得到的bsADC应在表达T和E二者的细胞中诱导细胞毒性。一些细胞毒性也可在表达T但不表达E的细胞中诱导，而bsADC不应在表达E但不表达T的细胞中诱导细胞毒性，CD63用作效应蛋白(E)。为确保bsAb的肿瘤特异性，bsAb的抗-CD63臂(E)应优选地在肿瘤特异性臂(T)不存在时不结合和内化，或仅如此至极度有限的程度。一组在可变区具有突变的IgG1-CD63变体按上所述产生。用ELISA筛选IgG1-CD63抗体变体与可溶性CD63的结合。简言之，ELISA板(Greiner)在40C用0.8 µg/mL山羊抗-人IgG (Jackson)包被过夜。板用2%鸡血清封闭和用1 µg/mL抗-CD63 mAb 2192的组氨酸-突变变体孵育。加入连续稀释(1-0.0005 µg/mL)的重组人CD63(Creative Biomart)，接着加入1 µg/mL小鼠抗-多组氨酸-生物素(R&D)。反应使用ABTS显现和用草酸停止。测量405 nm荧光和使用GraphPad Prism 6软件描述。
如图1所示，对于不同的组氨酸突变抗-CD63抗体，发现CD63结合曲线的广泛变化。对于一些亲和变体，CD63的结合与野生型(wt) IgG1-CD63 (称为wt IgG1-CD63)相当，而其它显示部分或完全失去结合。
实施例3：CD63亲和力测量
抗-CD63抗体与在C端融合了多组氨酸标签和在N端融合了信号肽的重组人CD63第二细胞外结构域(Ala 103-Val 203) (Creative BioMart)的结合动力学使用无标签生物层干涉测定法在Octet HTX (ForteBio)上评价。Wt IgG1-CD63或其亲和变体以1 µg/mL在抗-人IgG Fc捕获生物传感器(ForteBio)上固定1000 s。人His-标记的CD63 (100 nM、50 nM、25nM和12.5 nM，使用预测的分子量13 kDa计算浓度)的缔合和解离动力学在样品稀释液(ForteBio)中使用缔合时间1000 s、解离时间2000 s和摇动器速度1000 rpm在30℃测定。数据迹线使用在缔合和解离步骤期间仅暴露于样品稀释液的参考传感器校正，Y-轴对齐至基线，和应用步骤间校正以及Savitzky-Golay过滤。缔合速率常数Kon(1/Ms)、解离速率常数Kdis(1/s)和平衡解离常数KD (M)用ForteBio数据分析软件v8.1，使用1:1模式和全局完全拟合测定。解离时间1000 s用于计算KD，除了亲和变体T71、P72、N74、Y121、LV49和LY51之外，它们使用解离时间200 s。
对于不同的抗-CD63抗体变体，测量范围为3.6 x 10-10 – 2.7 x 10-8 M的宽范围的Ab-亲和力(见图2和表2)。因此，通过引入单个氨基酸组氨酸置换，可减少wt IgG1-CD63的亲和力。
表2
实施例4：使用HCC1954、SK-OV-3和Colo205细胞，bsCD63xHER2-Duo3 ADC的亲和变体和单价bsCD63xb12-Duo3 ADC的亲和变体的细胞毒性
bsADC与表达靶蛋白(T)和效应蛋白(E)二者的肿瘤细胞结合应优先导致细胞毒性。然而，在缺少肿瘤相关靶蛋白(T)时，bsADC应优选地不诱导细胞毒性。使用不同的抗-CD63亲和变体，产生靶向CD63 (E)和HER2 (T)的许多bsADC。相同的抗-CD63亲和变体还用于产生靶向CD63和HIV gp120的bsADC。HIV gp120是在测试的肿瘤细胞上不表达的病毒蛋白。因此靶向CD63和gp120的bsADC (即，包含源自CD63抗体和gp120-特异性抗体IgG1-b12的结合结构域的bsADC)，可仅结合CD63，这反映了ADC对缺少T表达的正常组织的活性。
bsADC的细胞毒性使用HCC1954、SK-OV-3和Colo205细胞测试。细胞接种在96-孔组织培养板中(5,000个细胞/孔)和在370C孵育6小时。加入连续稀释的ADC (10-0.0005 µg/mL)和细胞在370C孵育4天。细胞成活力使用CellTiter-GLO (Promega)，根据制造商的指南评价。活细胞的百分比描述为相对于未处理的细胞(0%细胞死亡)和staurosporin-处理的细胞(100%细胞死亡)的百分比。
活细胞百分比 = (RFU ADC处理的细胞 – RFU staurosporin-处理的细胞) x100 / (RFU未处理的细胞 – RFU staurosporin-处理的细胞)
RFU = 相对荧光单位
图3-5显示用连续稀释的ADC处理4天后的细胞成活力，作为相对于未处理细胞的百分比。显示的数据为至少两次不同实验的平均值 ± 标准偏差。细胞毒性的IC50值使用GraphPad Prism 6软件测定，和描述于表3。
表3 – IC50值
图3A、4A和5A中的BsADC具有对CD63的最高亲和力(范围为3.6 x 10-10 – 7.8 x 10-10 M；表2)，当作为bsCD63xHER2-ADC测试时以低IC50值诱导细胞毒性，但当作为bsCD63xb12-ADC测试时也显示一些细胞毒性。图3B、4B和5B中的BsADC具有中等亲和力(范围为2.0 x10-9 – 7.3 x 10-9 M)，当作为bsCD63xHER2-ADC测试时以低IC50值诱导细胞毒性，和当作为bsCD63xb12-ADC测试时显示有限的细胞毒性。图3C、4C和5C中的抗体具有低亲和力(范围为1.7 x 10-8 – 2.7 x 10-8 M)，当作为bsCD63xHER2-ADC测试时以差的IC50值诱导细胞毒性，和当作为bsCD63xb12-ADC时当组合时几乎没有显示任何细胞毒性。
得出结论，图3B、4B和5B中所述的CD63抗体，具有范围为2.0 x 10-9 – 7.3 x 10-9 M的亲和力，对于提高ADC的递送显示最有利的特性。这些抗体能够作为bsCD63xHER2-ADC以低IC50值诱导细胞毒性，而作为bsCD63xb12-ADC诱导有限的细胞毒性。
实施例5：单价bsCD63xb12 ADC的亲和变体的溶酶体共定位
进行共聚焦显微镜检查实验以证实对CD63具有降低的亲和力的CD63xb12双特异性抗体显示较少内化和溶酶体转运。SK-OV-3细胞在玻璃盖玻片(Thermo Fisher Scientific)上在37℃培养16小时。加入抗体(2和10 μg/mL)和在37℃孵育细胞16小时。将细胞固定，渗透和用山羊抗-人IgG1-FITC (Jackson)孵育45 min以染色人IgG和用小鼠抗-人CD107a-APC (BD)孵育45 min以染色溶酶体。将盖玻片固定(Calbiochem)在显微镜载玻片上和用配备有LAS-AF软件的Leica SPE-II共聚焦显微镜(Leica Microsystems)成像。使用MetaMorph®软件(Molecular Devices)，分析12-bit灰度TIFF图像的共定位。共定位以代表与溶酶体标记物LAMP1重叠的抗体的总像素强度的任意单位[AU]描述。该值除以LAMP1的总像素强度，以校正在不同图像之间的细胞密度的差异。
如图6所示，野生型IgG1-CD63显示最高的共定位值，然后是其单价对应物(bsCD63WTxb12)和bsCD63-Y79Hxb12。与bsY79Hxb12和野生型bsCD63xb12相比，bsP72Hxb12、bsY121Hxb12、bsLN54Hxb12和bsN74Hxb12的溶酶体共定位值是约1/10。bsV52Hxb12、bsG76Hxb12、bsLV49Hxb12和bsLY51Hxb12的值甚至更低，表明几乎没有单价CD63抗体的任何溶酶体转运。用星号(*)指示的样品未成像。显示的数据为3个图像的平均值 ± 标准偏差。
实施例6：bsHER2xCD63N74H与SK-OV-3细胞的结合，通过流式细胞术测定
基于其作为bsCD63xHER2-ADC以低IC50值诱导细胞毒性，同时作为bsCD63xb12-ADC诱导有限的细胞毒性的能力，克隆抗-CD63-N74H被选择用于进一步分析。bsHER2xCD63N74H与HER2阳性SK-OV-3细胞的结合使用流式细胞术(FACS Canto II，BD Biosciences)测试。连续稀释的抗体在4℃与SK-OV-3细胞孵育30分钟。抗体结合使用藻红蛋白-缀合的山羊抗-人IgG抗体(Jackson)检测，和在流式细胞仪上分析样品。IgG1-b12用作同种型对照抗体。图7显示的所得数据为两次实验的平均值。
如图7所示，bsHER2xCD63N74H和单价HER2抗体bsHER2xb12的结合曲线是相同的。这表明bsHER2xCD63N74H的肿瘤细胞结合通过单价结合HER2而发生。IgG1-CD63N74H和bsCD63N74Hxb12未显示结合SK-OV-3细胞，这与质膜上CD63的低表达一致。
实施例7：用bsHER2xCD63N74H和bsCD63N74Hxb12在全血细胞上的mAb-FITC积聚测定
为证实bsHER2xCD63N74H在不表达模式肿瘤抗原HER2的健康组织中不结合和积聚，将bsHER2xCD63N74H和单价和二价对照抗体与FITC缀合。在不表达HER2的健康供体的粒细胞和血小板中研究它们的积聚。来自健康供体的全血样品在肝素管中收集。将全血在补充有10%热灭活的加强型小牛血清(cosmic calf serum)的RPMI-1640中1:2稀释。抗-CD63抗体与FITC (Thermo Scientific)根据制造商的说明缀合，和以终浓度10 µg/mL加入全血细胞。
在40C孵育1小时或在370C孵育3和16小时后，通过在40C用红细胞溶解缓冲液(155mM NH4Cl、10 mM KHCO3和0.1 mM EDTA，pH 7.4)孵育15分钟，溶解红细胞。在流式细胞仪(BD)上测量FITC的荧光强度。粒细胞使用小鼠抗-人CD66b-PerCP-Cy5.5 (BD)门控，和血小板使用小鼠抗-人CD62-APC (BD)门控。
图8显示在1小时后，CD63抗体与粒细胞或血小板几乎没有任何结合或极低水平的结合。然而，在孵育16小时后在粒细胞上IgG1-CD63的FITC荧光明显增加，表明粒细胞中IgG1-CD63积聚。相反，在16小时后bsCD63N74Hxb12和bsHER2xCD63N74H的FITC荧光几乎没有增加(见图8)。同样，IgG1-HER2和bsHER2xb12未显示任何结合粒细胞或血小板或在粒细胞或血小板中的细胞内积聚，这与这些细胞类型上缺少HER2表达一致。因此，通过使用低亲和力CD63-特异性Fab臂，可将单价CD63 Ab与健康细胞的结合和单价CD63 Ab在健康细胞内的细胞内积聚最小化。
实施例8：随时间跟踪的bsHER2xCD63N74H的共聚焦显微镜检查、溶酶体共定位
随时间跟踪bsHER2xCD63N74H的内化和溶酶体共定位。SK-OV-3细胞(20.000)在玻璃盖玻片(Thermo Fisher Scientific)上在37℃生长16小时。抗体处理前1小时，细胞用50 μg/mL亮肽素(Sigma)预孵育以封闭溶酶体活性。加入抗体(5或1 μg/mL)和将细胞在37℃孵育1、3或16小时。将细胞固定，渗透和用山羊抗-人IgG1-FITC (Jackson)孵育45 min以染色人IgG和用小鼠抗-人CD107a-APC (BD)孵育45 min以染色溶酶体。加入Hoechst (MolecularProbes，1:10.000)以染色细胞核(室温5分钟)。将盖玻片固定(Calbiochem)在显微镜载玻片上，和用配备有LAS-AF软件的Leica SPE-II共聚焦显微镜(Leica Microsystems)成像。使用MetaMorph®软件(Molecular Devices)分析12-bit灰度TIFF图像的共定位。共定位描述为代表与溶酶体标记物LAMP1重叠的抗体的总像素强度的任意单位[AU]。该值除以LAMP1的总像素强度，以校正不同图像之间的细胞密度的差异。总IgG染色描述为FITC的总像素强度，其除以LAMP1的总像素强度。
图9的灰色条表示总IgG染色(描述为任意单位)。图9的黑色条表示溶酶体共定位(描述为任意单位)。在1、3和16小时后IgG1-HER2和bsHER2xb12二者显示SK-OV-3细胞的类似染色(灰色条)。在16小时抗体暴露后小部分的IgG1-HER2和bsHER2xb12显示溶酶体共定位(黑色条)。1和3小时后，CD63靶向抗体IgG1-CD63N74H未显示染色(灰色条)或溶酶体共定位(黑色条)，然而16小时抗体暴露导致全部与溶酶体标记物LAMP1共定位的细胞的Ab染色。在任何测量时间点，单价CD63抗体bsCD63N74Hxb12未显示mAb染色或溶酶体共定位。另一方面，bsHER2xCD63N74H的溶酶体共定位随时间逐渐增加(黑色条)。显示的数据是3个图像的平均值 ± 标准偏差。
实施例9：BsHER2xCD63N74H诱导HER2下调
使用HER2下调ELISA，研究了用bsHER2xCD63N74H观察到的强溶酶体靶向是否还导致靶向抗原的下调增加。AU565、SK-OV-3和Colo 205细胞被接种(1百万个细胞/烧瓶)在T25烧瓶(Greiner)中和在370C孵育过夜以获得汇合单层。加入抗体(10 µg/mL)和在370C培养细胞另外3天，洗涤和溶解。总蛋白水平使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白测定试剂(Pierce)，根据制造商的说明定量。接着，ELISA板(Greiner)用1 µg/mL兔抗-人HER2(Cell Signalling Technology)包被，用2%鸡血清(Hyclone)封闭和用50 µL细胞裂解液孵育。加入山羊抗-人HER2-生物素(R&D，50 ng/mL)以检测HER2，接着加入链霉亲和素-多HRP(Sanquin，100 ng/mL)。反应使用ABTS显现，和用草酸停止。测量405 nm荧光，和HER2的量表示为相对于未处理细胞的百分比。
在具有不同表达水平的HER2的肿瘤细胞系：AU565 (500,000 HER2/细胞，图10A)、SK-OV-3 (200,000 HER2/细胞，图10B)和Colo205 (50,000 HER2/细胞，图10C)中的HER2蛋白的总量在用HER2抗体孵育3天后定量，并与未处理的细胞比较(参见图10)。在表达高水平的HER2的AU565细胞中IgG1-HER2诱导总HER2的约40%下调。尽管单价bsHER2xb12抗体显示与HER2阳性SK-OV-3细胞剂量依赖性结合的事实(FACS结合实施例)，但是用bsHER2xb12未观察到HER2下调。这突出了二价抗体结合对于增加HER2的降解是重要的。bsHER2xCD63N74H能够在AU565细胞上恢复HER2的下调。此外，在具有较低HER2表达的细胞系上，例如SK-OV-3和Colo205，bsHER2xCD63N74H也诱导HER2的下调，而IgG1-HER2不影响HER2蛋白水平。
实施例10：Duostatin-3缀合的ADC诱导的细胞毒性
将细胞接种到96-孔组织培养板(5,000个细胞/孔)和在370C放置贴壁6小时。加入连续稀释的ADC (10-0.0005 µg/mL)和在370C将细胞孵育另外3天。使用CellTiter-GLO(Promega)，根据生产商的指南评价细胞成活力。活细胞的百分比描述为相对于未处理细胞的百分比。
如图11所示，IgG1-HER2-Duo3能够杀伤约80%的显示高HER2表达(500.000 HER2/细胞)的HCC1954。在表达200.000 HER2/细胞的SK-OV-3细胞上，IgG1-HER2-Duo3仅杀伤约30%的细胞，而表达低HER2的Colo205细胞(50.000 HER2/细胞)的成活力不受影响。
与IgG1-HER2-Duo3相比，单价bsHER2xb12杀伤类似百分比的细胞，但具有约1/10的IC50值。在HCC1954细胞上bsHER2xCD63N74H-Duo3 ()诱导的细胞毒性等于IgG1-HER2-Duo3。然而在具有较低拷贝数的HER2的细胞上(SK-OV-3和较少程度的Colo205)，与仅靶向HER2的ADC相比，bsHER2xCD63N74H-Duo3诱导了明显更多细胞毒性(参见图11)。显示的数据是至少两次单独实验的平均值 ± 标准偏差。
实施例11：bsHER2xCD63N74H-ADC对SK-OV-3肿瘤异种移植物的抗-肿瘤影响
研究了bsHER2xCD63N74H-ADC对SK-OV-3肿瘤异种移植物的抗-肿瘤影响。6-11周龄雌性SCID小鼠(C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL)购自Charles River。皮下肿瘤通过在小鼠的右胁腹接种5 x 106 SK-OV-3细胞诱导。肿瘤体积根据数字卡尺测量计算为0.52 x 长度 x 宽度2 (mm3)。当肿瘤达到200 – 400 mm3时，将小鼠分组为具有相等肿瘤大小分布的7只小鼠的各组，和腹膜内注射mAb (8 mg/kg)。在研究期间，将血液样品收集到含肝素的管中以证实血浆中人IgG的存在。IgG水平使用比浊计(Siemens Healthcare)定量。在血浆中未显示人IgG的小鼠从分析中排除。
如图12所示，bsHER2xCD63N74H-ADC诱导肿瘤生长的显著抑制，而单价bsHER2xb12-ADC或bsCD63N74Hxb12-duo3对肿瘤生长没有影响。这证实了低亲和力CD63特异性Fab臂可用于在体内肿瘤中诱导内化差的ADC的溶酶体递送和毒素释放。Kalan Meyer曲线的Mantel-Cox分析表明bsHER2xCD63N74H-ADC显著抑制肿瘤生长，P-值<0.0001。
实施例12：用流式细胞术检测的bsBeta1xCD63N74H与SK-OV-3细胞的结合
研究了针对E的低亲和力结合-结构域是否也可用于提高其它肿瘤抗原的内化和溶酶体靶向。已描述整联蛋白对于其内化，依赖于簇集。因此，单价整联蛋白抗体预期显示最少内化和溶酶体靶向，因此可代表合适的模型系统以测试内化是否可以靶向T和E的双特异性格式而被提高。为此，选择靶向整联蛋白β-1的抗体huK20。抗体huK20的序列获自WO1996/008564，和按其实施例1所述克隆和产生。
IgG1-Beta1抗体、单价对照bsBeta1xb12和双特异性抗体bsBeta1xCD63N74H与SK-OV-3的结合使用流式细胞术(FACS Canto II，BD Biosciences)研究。在4℃，连续稀释的抗体与SK-OV-3细胞孵育30分钟。接着，使用藻红蛋白-缀合的山羊-抗-人IgG抗体(Jackson)检测抗体结合，和在流式细胞仪上分析样品。IgG1-b12用作同种型对照抗体。
如图13所示，bsBeta1xCD63N74H和单价整联蛋白β-1抗体bsBeta1xb12的结合曲线非常类似。这表明bsBeta1xCD63N74H的肿瘤细胞结合通过单价结合整联蛋白β-1发生。IgG1-CD63N74H和bsCD63N74Hxb12未显示结合SK-OV-3细胞，这与质膜上CD63的低表达一致。
实施例13：用共聚焦显微镜检查测量的bsBeta1xCD63N74H的溶酶体共定位
为研究整联蛋白β-1和CD63的双重靶向是否导致bsBeta1xCD63N74H的溶酶体共定位增加，用在质膜上具有不同拷贝数的整联蛋白β-1的肿瘤细胞系进行共聚焦显微镜检查实验。20.000个SK-OV-3、NCI-H1975和MDA-MB-468细胞在玻璃盖玻片(Thermo FisherScientific)上在37℃生长4小时。抗体处理前1小时，细胞用50 μg/mL亮肽素(Sigma)预孵育以封闭溶酶体活性。加入抗体(2、0.4和0.08 μg/mL)和将细胞在37℃孵育16小时。将细胞固定，渗透和用山羊抗-人IgG1-FITC (Jackson)孵育45 min以染色人IgG和用小鼠抗-人CD107a-APC (BD)孵育45 min以染色溶酶体。加入Hoechst (Molecular Probes，1:10.000)以染色细胞核(室温5分钟)。将盖玻片固定(Calbiochem)在显微镜载玻片上和用配备有LAS-AF软件的Leica SPE-II共聚焦显微镜(Leica Microsystems)成像。使用MetaMorph®软件(Molecular Devices)分析12-bit灰度TIFF图像的共定位。共定位描述为表示与溶酶体标记物LAMP1重叠的抗体的总像素强度的任意单位[AU]。该值除以LAMP1的总像素强度，以校正在不同图像之间的细胞密度的差异。
如图14所示，在所有测试的细胞系和mAb浓度(仅对于SK-OV-3显示)中bsBeta1xCD63N74H证实了最大量的溶酶体共定位。IgG1-Beta1和bsAb-Beta1xb12显示中等溶酶体共定位，其不受mAb浓度影响。IgG1-CD63N74H仅在2 µg/mL和0.4 µg/mL时在NCI-H1975细胞上显示显著的溶酶体共定位。尽管单价对照bsCD63N74Hxb12仅在2 µg/mL时在NCI-H1975细胞上显示溶酶体共定位，其与CD63N74H的亲和力减少相关。bsBeta1xCD63N74H的溶酶体共定位增加在表达高整联蛋白β-1拷贝数的细胞上最明显(SK-OV-3 > NCI-H1975 >MDA-MB-468)。对于一些克隆，未描述AU，因为未测量溶酶体共定位。显示的数据为3个图像的平均值 ± 标准偏差。
实施例14：随时间跟踪的bsBeta1xCD63N74H的共聚焦显微镜检查、内化和溶酶体共定位
为了更好地理解bsBeta1xCD63N74H的内化和溶酶体共定位动力学，随时间跟踪bsBeta1xCD63N74H的内化和溶酶体共定位。SK-OV-3细胞(20.000)在玻璃盖玻片(ThermoFisher Scientific)上在37℃生长16小时。在抗体处理前1小时，细胞用50 μg/mL亮肽素(Sigma)预孵育以封闭溶酶体活性。加入抗体(2 μg/mL)和将细胞在37℃孵育1、3或16小时。将细胞固定，渗透和用山羊抗-人IgG1-FITC (Jackson)孵育45 min以染色人IgG和用小鼠抗-人CD107a-APC (BD)孵育45 min以染色溶酶体。加入Hoechst (Molecular Probes，1:10.000)以染色细胞核(室温5分钟)。将盖玻片固定(Calbiochem)在显微镜载玻片上和用配备有LAS-AF软件的Leica SPE-II共聚焦显微镜(Leica Microsystems)成像。使用MetaMorph®软件(Molecular Devices)分析12-bit灰度TIFF图像的共定位。共定位描述为表示与溶酶体标记物LAMP1重叠的抗体的总像素强度的任意单位[AU]，其除以LAMP1的总像素强度。总IgG染色描述为FITC的总像素强度，其除以LAMP1的总像素强度。
图15的灰色条表示总IgG染色(描述为任意单位)。图15的黑色条表示溶酶体共定位(描述为任意单位)。IgG1-Beta1和bsBeta1xb12二者显示在1、3和16小时后SK-OV-3细胞的类似染色(灰色条)，然而几乎没有任何溶酶体共定位被测量(黑色条)。因此尽管IgG1-Beta1和bsBeta1xb12能够结合SK-OV-3细胞，但它们不被转运至溶酶体。CD63靶向抗体IgG1-CD63N74H和bsCD63N74Hxb12在1小时后未显示染色(灰色条)或溶酶体共定位(黑色条)。然而延长孵育导致全部与溶酶体标记物LAMP1共定位的细胞的Ab染色，表明两种抗体直接转运至溶酶体。对于IgG1-CD63N74H该效果是最显著的，和对于bsCD63N74Hxb12较不显著。最后，Beta1xCD63N74H证实在1、3和16小时后SK-OV-3细胞的相等染色(灰色条)。尽管溶酶体共定位随时间逐渐增加(黑色条)，但表明Beta1xCD63N74H首先通过整联蛋白β-1结合肿瘤细胞，和随后被转运至溶酶体。显示的数据为至少3个图像的平均值 ± 标准偏差。
<110> Genmab A/S
<120> 具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子
<130> P/0099-WO
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Ala
115 120
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ile Thr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Val Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Asn Ile Met Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Ser Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Trp Ala Ser
1
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
His Gln Tyr Phe Ser Ser Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser His Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ile His Pro Tyr Asn Asp Gly Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ile Thr His Tyr Asn Asp Gly Thr
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Ile Thr Pro Tyr His Asp Gly Thr
1 5

Claims (53)

1. 多特异性抗原-结合分子，包含第一抗原-结合结构域和第二抗原-结合结构域，其中第一抗原-结合结构域特异性结合靶分子(T)，第二抗原-结合结构域特异性结合内化效应蛋白(E)，且第二抗原-结合结构域与E具有10-9至10-8 M的解离常数KD值。
2. 权利要求1的多特异性抗原-结合分子，包含i) 包含第一抗原-结合结构域的第一结合臂，和ii) 包含第二抗原-结合结构域的第二结合臂。
3.权利要求1或2的多特异性抗原-结合分子，其中所述多特异性抗原-结合分子是双特异性抗原-结合分子。
4. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中第二抗原-结合结构域与E具有高于10-9和低于10-8 M的解离常数KD值。
5. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中第二抗原-结合结构域与E具有2.0x10-9至9.0x10-9 M的解离常数KD值。
6. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中第二抗原-结合结构域与E具有2.0x10-9至7.3x10-9 M的解离常数KD值。
7.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中E是内化至细胞中的细胞表面-表达的分子。
8.权利要求7的多特异性抗原-结合分子，其中多特异性抗原-结合分子通过仅在靶分子(T)存在的情况下结合E的方式内化至细胞中。
9.权利要求7或8的多特异性抗原-结合分子，其中多特异性抗原-结合分子通过仅当第一结构域与靶分子(T)特异性结合时结合E的方式内化至细胞中。
10.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其在结合E时与不表达T的细胞相比，更有效地内化至表达T的细胞中。
11.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其在结合T时与不表达E的细胞相比，更有效地内化至表达E的细胞中。
12.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其在结合E时转运至表达T的细胞的溶酶体室。
13.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其在结合E时与不表达T的细胞相比，更有效地转运至表达T的细胞的溶酶体室。
14.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其当结合T时与不表达E的细胞相比，更有效地转运至表达E的细胞的溶酶体室。
15.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中E选自CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、转铁蛋白受体、LDLr、MAL、V-ATPase和ASGR。
16.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中E是CD63。
17.权利要求1-6中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中E是通过E和内化细胞表面-表达的受体分子之间的相互作用内化至细胞中的可溶性配体。
18.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中T是细胞表面-表达的靶分子。
19.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中T是肿瘤相关抗原。
20.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中T是HER2。
21.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中第一和/或第二抗原-结合结构域包含至少一个抗体可变区。
22.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中多特异性抗原-结合分子是多特异性抗体，优选地双特异性抗体，或多特异性、优选地双特异性抗体片段或其重组改造部分。
23.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中多特异性抗原-结合分子是双特异性抗体，其包含包含第一抗原-结合结构域的第一结合臂和包含所述第二抗原-结合结构域的第二结合臂。
24.权利要求23的多特异性抗原-结合分子，其中所述第一抗原-结合结构域包含第一重链可变序列(VH)和第一轻链可变序列(VL)，所述第二抗原-结合结构域包含第二重链可变序列(VH)和第二轻链可变序列(VL)，且所述可变序列各自包含三个CDR序列，CDR1、CDR2和CDR3。
25. 权利要求23或24的多特异性抗原-结合分子，其中(i) 所述第一结合臂包含包含第一重链可变序列(VH)和第一重链恒定序列(CH)的第一重链和包含第一轻链可变序列(VL)和第一轻链恒定序列(CL)的第一轻链，和(ii) 所述第二结合臂包含包含第二重链可变序列(VH)和第二重链恒定序列(CH)的第二重链和包含第二轻链可变序列(VL)和第二轻链恒定序列(CL)的第二轻链。
26.权利要求23-25中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中第一结合臂衍生自嵌合抗体或人源化抗体或人抗体。
27.权利要求23-26中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中第二结合臂衍生自嵌合抗体或人源化抗体或人抗体。
28.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其是双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是全长抗体，优选地IgG1抗体。
29.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中所述第二抗原-结合结构域具有调节第二抗原-结合结构域与E的亲和力的一个或多个突变。
30.权利要求29的多特异性抗原-结合分子，其中所述第二抗原-结合结构域衍生自在VH和/或VL中具有一个或多个突变的抗体，所述突变调节第二抗原-结合结构域与E的亲和力。
31.权利要求30的多特异性抗原-结合分子，其中所述突变是单个氨基酸置换、优选地单个氨基酸组氨酸置换。
32. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中所述第二结构域包含：
a. 分别在SEQ ID NO: 2、3和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 9、7和8中提供的VL CDR 1、2和3，或者
b. 分别在SEQ ID NO: 2、10和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3，或者
c. 分别在SEQ ID NO: 2、11和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3，或者
d. 分别在SEQ ID NO: 2、12和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3。
33. 权利要求32的多特异性抗原-结合分子，其中所述第二结合结构域包含分别在SEQID NO: 2、12和4中提供的VH CDR 1、2和3和分别在SEQ ID NO: 6、7和8中提供的VL CDR 1、2和3。
34.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中所述第一和第二抗原-结合结构域各自是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域对。
35.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中抗原-结合分子是肿瘤相关靶标(T)xCD63双特异性抗体。
36.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中抗原-结合分子是HER2xCD63双特异性抗体。
37. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中对于结合表达肿瘤相关靶标(T)的细胞、例如表达HER2的细胞，抗原-结合分子具有低于5.0 µg/ml、例如低于0.5 µg/ml的EC50值，如通过流式细胞术测定的。
38. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中KD通过生物层干涉测定法在30 ℃测定。
39. 前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中抗原-结合分子是双特异性抗体，其包含：
i) 包含第一重链的第一结合臂，所述第一重链包含第一重链恒定序列(CH)，所述第一CH包含第一CH3区，和
ii) 包含第二重链的第二结合臂，所述第二重链包含第二重链恒定序列(CH)，所述第二CH包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二结合臂之间的异二聚相互作用比所述第一和第二结合臂各自的同二聚相互作用更强。
40.权利要求39的多特异性抗原-结合分子，其中在所述第一重链CH3区中，在对应于人IgG1重链的位置T366、L368、K370、D399、F405、Y407或K409的位置的至少一个氨基酸已被置换，和在所述第二重链CH3区中，在对应于人IgG1重链的位置T366、L368、K370、D399、F405、Y407或K409的位置的至少一个氨基酸已被置换，和其中所述第一和所述第二重链未在相同的位置被置换和其中氨基酸位置根据EU-索引编号。
41. 权利要求40的多特异性抗原-结合分子，其中(i) 第一CH3区具有F405L置换和第二CH3区具有K409R置换，或(ii) 第一CH3区具有K409R置换和第二CH3区具有F405L置换。
42.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中多特异性抗原-结合分子与细胞毒性部分、放射性同位素或药物缀合。
43.权利要求42的多特异性抗原-结合分子，其中细胞毒性部分选自美登素、卡奇霉素、倍癌霉素、duostatin、duostatin-3、duostatin-5、雷查霉素(CC-1065)、阿里他汀、单甲基阿里他汀E、单甲基阿里他汀F、多柔比星、多拉司他汀、吡咯并苯并二氮䓬、基于IGN的毒素、α-鹅膏菌素或前述任何一种的类似物、衍生物或前药。
44.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子，其中通过多特异性抗原-结合分子结合T和E诱导多特异性抗原-结合分子的内化至比单独结合T更大的程度。
45.前述权利要求中任一项的多特异性抗原-结合分子的双特异性抗体片段，其中抗体片段是串联scFv、串联scFv-Fc、scFv-Fc杵臼结构、scFv-Fc-scFv、F(ab’)2、Fab-scFv、(Fab’scFv)2、双特异抗体、sc双特异抗体、sc双特异抗体-Fc、sc双特异抗体-CH3或azymetric支架。
46.权利要求1-44中任一项的多特异性抗原-结合分子或权利要求45的双特异性抗体片段，用于治疗和/或预防癌症的方法。
47.权利要求46的多特异性抗原-结合分子，其中所述癌症是子宫内膜癌/宫颈癌、肺癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、软组织肿瘤例如滑膜肉瘤、乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肾癌、子宫颈癌、膀胱癌、食管癌、胃癌或结肠直肠癌。
48.权利要求1-44中任一项的多特异性抗原-结合分子，用于靶向受试者的肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者多特异性抗原-结合分子。
49.药物组合物，包含权利要求1-44中任一项的多特异性抗原-结合分子作为活性成分。
50.治疗疾病的方法，包括给予有需要的受试者前述权利要求1-44中任一项的多特异性抗原-结合分子或权利要求49的药物组合物。
51.编码权利要求1-44中任一项的多特异性抗原-结合分子的核酸。
52.包含权利要求51的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞系中表达所述核酸。
53.原核或真核宿主细胞系，包含权利要求52的载体。
CN201780009916.5A 2016-02-05 2017-02-03 具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子 Pending CN109071658A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201600074 2016-02-05
DKPA201600074 2016-02-05
PCT/EP2017/052335 WO2017134197A1 (en) 2016-02-05 2017-02-03 Multispecific antigen-binding molecule with improved internalization characteristics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109071658A true CN109071658A (zh) 2018-12-21

Family

ID=58009794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780009916.5A Pending CN109071658A (zh) 2016-02-05 2017-02-03 具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20190352423A1 (zh)
EP (1) EP3411406B1 (zh)
JP (2) JP2019506865A (zh)
KR (1) KR20180104148A (zh)
CN (1) CN109071658A (zh)
AU (1) AU2017214338B2 (zh)
MA (1) MA46419A (zh)
WO (1) WO2017134197A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020177717A1 (zh) * 2019-03-04 2020-09-10 上海一宸医药科技有限公司 新型双特异性结合分子及其药物偶联物
US20210079109A1 (en) * 2018-05-17 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
WO2021068890A1 (zh) * 2019-10-09 2021-04-15 中山大学 溶酶体靶向的抗体-药物偶联物及其应用
CN113614111A (zh) * 2019-01-14 2021-11-05 加利福尼亚大学董事会 用于调节细胞内化的组合物和方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102152109B1 (ko) 2010-04-20 2020-09-07 젠맵 에이/에스 이종이량체 항체 ｆｃ-함유 단백질 및 그의 생산 방법
EA036225B1 (ru) 2012-03-14 2020-10-15 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Мультиспецифические антигенсвязывающие молекулы и их применения
IL296285A (en) 2015-07-06 2022-11-01 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
CN106883297B (zh) * 2015-12-16 2019-12-13 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
SG11201907427YA (en) 2017-02-17 2019-09-27 Denali Therapeutics Inc Engineered transferrin receptor binding polypeptides
US10484066B2 (en) * 2017-04-04 2019-11-19 Qualcomm Incorporated Beam management using synchronization signals through channel feedback framework
JP7348844B2 (ja) 2017-06-07 2023-09-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 内部移行酵素のための組成物および方法
TWI728250B (zh) 2017-06-21 2021-05-21 美商基利科學股份有限公司 靶向hiv gp120及cd3之多特異性抗體
CA3079215A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd117+ cells
US10899843B2 (en) 2017-10-24 2021-01-26 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of CD117+ cells
WO2019157224A1 (en) * 2018-02-07 2019-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for therapeutic protein delivery
EP3788075A1 (en) 2018-04-30 2021-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind her2 and/or aplp2, conjugates, and uses thereof
US20220047715A1 (en) * 2018-09-11 2022-02-17 The Johns Hopkins University Force-dependent drug release system to enhance selective killing and minimize adverse effects in cancer treatment
AU2019404061A1 (en) 2018-12-19 2021-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional molecules for lysosomal targeting and related compositions and methods
CA3157075A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal scfv multispecific binding molecules
WO2022037582A1 (zh) * 2020-08-18 2022-02-24 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cldn-18.2双特异性抗体及其用途
KR20240036604A (ko) 2021-07-14 2024-03-20 리시아 테라퓨틱스, 인크. Asgpr 세포 표면 수용체 결합 화합물 및 접합체
CN114702593B (zh) * 2022-03-11 2023-12-08 苏州思萃免疫技术研究所有限公司 一种抗folr1/vegf的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013138400A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP2808035A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-03 Samsung Electronics Co., Ltd Composition for target membrane protein depletion
WO2015157592A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Bispecific her2 antibodies

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012143524A2 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
IL296285A (en) * 2015-07-06 2022-11-01 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013138400A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
CN104302664A (zh) * 2012-03-14 2015-01-21 瑞泽恩制药公司 多特异性抗原结合分子及其用途
EP2808035A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-03 Samsung Electronics Co., Ltd Composition for target membrane protein depletion
WO2015157592A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Bispecific her2 antibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARCEL J. METZELAAR ET AL.: "Biochemical and immunohistochemical characteristics of CD62 and CD63 monoclonal antibodies", 《VIRCHOWS ARCHIV B CELL PATHOL》 *
黎晓维等: "双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展", 《中国新药杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210079109A1 (en) * 2018-05-17 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
US12252544B2 (en) * 2018-05-17 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD63 antibodies, conjugates, and uses thereof
CN113614111A (zh) * 2019-01-14 2021-11-05 加利福尼亚大学董事会 用于调节细胞内化的组合物和方法
WO2020177717A1 (zh) * 2019-03-04 2020-09-10 上海一宸医药科技有限公司 新型双特异性结合分子及其药物偶联物
CN113677705A (zh) * 2019-03-04 2021-11-19 南通壹宸生物医药科技有限公司 新型双特异性结合分子及其药物偶联物
WO2021068890A1 (zh) * 2019-10-09 2021-04-15 中山大学 溶酶体靶向的抗体-药物偶联物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP7592660B2 (ja) 2024-12-02
EP3411406A1 (en) 2018-12-12
KR20180104148A (ko) 2018-09-19
US20190352423A1 (en) 2019-11-21
JP2022103195A (ja) 2022-07-07
WO2017134197A1 (en) 2017-08-10
US20230076417A1 (en) 2023-03-09
AU2017214338B2 (en) 2024-04-11
AU2017214338A1 (en) 2018-08-09
JP2019506865A (ja) 2019-03-14
EP3411406B1 (en) 2025-04-09
MA46419A (fr) 2018-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109071658A (zh) 具有改进的内化特性的多特异性抗原-结合分子
US20220332814A1 (en) Cldn18.2-targeting antibody, preparation method therefor, and use thereof
JP6326137B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及びその結合体
US10548987B2 (en) Antibody-drug conjugates for targeting CD56-positive tumors
CN109071636A (zh) 用于选择特异性结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法
CN108290955A (zh) 人源化抗-cll-1抗体
CN112851808B (zh) Igf-1r抗体及其作为定位载体用于治疗癌症的用途
CN109715666A (zh) 癌症治疗方法和使用结合糖基化pd-l1的抗体的组合的疗法
US20240173424A1 (en) Anti-nectin-4-antibody exatecan conjugates
TWI812645B (zh) 新型抗cd19抗體
CN113784987B (zh) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法
CN109923126A (zh) 抗-pd-1抗体
CN110036028A (zh) 抗il1-rap抗体
CN109575139A (zh) 针对表皮生长因子受体和程序性死亡受体的双特异抗体
CN109988240A (zh) 抗gpc-3抗体及其用途
TW202246323A (zh) 抗ｃｌａｕｄｉｎ—６之抗體及其用途
CN110382541A (zh) 人源化抗cd40抗体
JP2024531944A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２標的化抗体、二重特異性抗体、及びそれらの使用
KR20200039604A (ko) Pdgf 수용체에 대한 항체 및 이의 용도
CN113677709A (zh) 针对程序性细胞死亡蛋白配体-1(pd-l1)的抗体及其用途
WO2023222068A1 (en) Anti-cd200r1 antibodies
CN118871469A (zh) 一种靶向ror1的结合分子及其应用
NZ624989B2 (en) Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Country or region after: Denmark

Address after: DanMai Val Be

Applicant after: GENMAB A/S

Address before: Tanba Goro haro

Applicant before: GENMAB A/S

Country or region before: Denmark

CB02 Change of applicant information