[go: up one dir, main page]

CN109069620A - 拮抗剂ccr7受体的人源化抗体 - Google Patents

拮抗剂ccr7受体的人源化抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN109069620A
CN109069620A CN201680059274.5A CN201680059274A CN109069620A CN 109069620 A CN109069620 A CN 109069620A CN 201680059274 A CN201680059274 A CN 201680059274A CN 109069620 A CN109069620 A CN 109069620A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ccr7
cell
hvr
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680059274.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109069620B (zh
Inventor
J·W·巴克
R·伯斯胡伊岑
W·C·皮伊克
J·图尔克斯特拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pep Maybe Co Ltd
Original Assignee
Pep Maybe Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pep Maybe Co Ltd filed Critical Pep Maybe Co Ltd
Publication of CN109069620A publication Critical patent/CN109069620A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109069620B publication Critical patent/CN109069620B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

本发明提供了人源化抗人CCR7抗体和包含这种抗体的组合物。所述抗体和组合物可用于治疗其中肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症，治疗炎症性病症、由组织或器官移植引起的病症或并发症和由纤维化引起或与纤维化相关的病症或并发症。详细描述了衍生自小鼠抗体的若干抗体的实验结果。具有内部名称mab729的小鼠抗体[具有CDR VH1：GLTFRDFA；VH2：ISSGGFYT；VH3：VRRAYRYDGTGDYSALDY；VL1：QDIGPS；VL2：ATS；VL3：LQFASSPLT]被进一步人源化(内部名称mAB650_H1L1)。如实验结果所示，所述抗体抑制CCR7受体内化。

Description

拮抗剂CCR7受体的人源化抗体
发明领域
本发明一般涉及医药领域，特别涉及用于肿瘤学的生物药物领域。更具体地说，本发明涉及可用于治疗其中肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症的抗CCR7受体抗体。
发明背景
人CC基序受体7(以下称为“CCR7”)是七次跨膜结构域G蛋白偶联受体(GPCR)，最初被发现通过EBV感染而以淋巴细胞选择性方式表达(Birkenbach等，1993，J.Virol.67：2209-2220)。后来发现CCR7是CCL19和CCL21的选择性趋化因子受体。在生理条件下，CCR7的表达局限于未成熟的T和B淋巴细胞和成熟的树突状细胞，并在调控其迁移、组织和活化中发挥作用。
CCR7活性涉及多种疾病状态，包括慢性炎症性病症(Moschovakis等，2012，Eur JImmunol.42：1949-55)，动脉粥样硬化(Luchtefeld等，2010，Circulation 122：1621-28)，HIV感染(Evans等，2012，Cytokine Growth Factor Rev.23：151-57)和癌症(Ben-Baruch，2009，Cell Adhesion Migration 3：328-33)。
各种研究已经揭示CCR7在多种肿瘤细胞中表达，包括例如套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，B细胞急性淋巴细胞白血病，霍奇金病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，蕈样霉菌病，慢性骨髓增殖综合征的急变期，骨髓增生异常综合征的急变期，癌症例如乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，胃癌或头和颈鳞状细胞癌和结肠癌，如B细胞慢性淋巴细胞性白血病，非霍奇金淋巴瘤，乳腺癌细胞和恶性乳房肿瘤(WO 2007/003426)。此外，越来越清楚的是，CCR7在各种癌症的淋巴结转移中起作用(Viola和Luster，2008，Annu Rev Pharmacol Toxicol.48：171-97)。
抗人CCR7的参考小鼠单克隆抗体(MAB197，克隆#150503)可从R&D Systems(www.RnDSystems.com)购得。
WO 2007/003426公开了结合CCR7的抗体用于治疗那些在肿瘤细胞表达CCR7的癌症的用途。公开了抗体与表达CCR7的肿瘤细胞的结合抑制肿瘤细胞的迁移和/或通过补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和诱导细胞凋亡中的一种或多种来杀死肿瘤细胞。
WO 2012/043533公开了8种不同的可用于治疗纤维化或癌症的抗人CCR7的小鼠单克隆抗体。然而，没有一种抗体抑制细胞内Ca2+信号转导的IC50小于7.4nM。
WO 2014/151834公开了在用表达人CCR7的细胞免疫的XenomousTM中产生的三种不同的人抗CCR7抗体，以及小鼠抗人CCR7抗体及其嵌合化和人源化。所述人抗CCR7抗体与参考小鼠单克隆抗体MAB197相比结合人CCR7上的不同表位。这些抗体被公开可用于治疗炎症性病症、癌症以及由组织或器官移植引起的病症和并发症。WO 2014/151834进一步公开了分离小鼠抗人CCR7抗体，其中阻断性抗体MAb22通过用人对应物取代其重链恒定区而被嵌合。该嵌合抗体保留其结合人CCR7的能力。该嵌合抗体的轻链被进一步改变以产生具有嵌合重链和人源化轻链的一系列MAb22变体。WO 2014/151834没有公开这些具有人源化轻链的MAb22变体中哪些(如果有的话)保留了结合人CCR7的能力。
然而，本领域仍然需要能用于人类治疗的更进一步的和改进的抗CCR7抗体。
发明概述
在第一方面，本发明涉及一种包含高变区HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的人源化抗CCR7抗体，其中HVR-H1包含序列：G-F/L-T/A/P-F-S/T/R-N/D/S-Y/F-A；HVR-H2H1包含序列：I-S-S/D-G/R-G-S/T/F-Y/H/F-T/P；HVR-H3H1包含序列：A/T/V/G-R-R/A-A/E/T-Y/G/T-R/V-Y/V-D/*-GTG/*-E/V/D/A/G/*-N/S/D/T-A/S/D-M/L/F-Y/S；HVR-L1H1包含序列：Q/S-D/S-I/L/V-G/S/L-D/S/P/G/N-S/N-*/Y/DGKTY；HVR-L2H1包含序列：A/S/T-T/I/V-S；以及HVR-L3H1包含序列：L/W/Q-Q-Y/F/G/W-A/T/S-S/N/H-S/F/N-P-L/P/Q-T，其中“*”表示没有氨基酸可存在于那个位置。本发明的抗体优选地具有以下中的至少一种：a)对具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的合成抗原SYM1899的最小亲和力，所述最小亲和力定义为比小鼠抗CCR7抗体的Kd高不超过10倍的Kd，所述小鼠抗CCR7抗体的重链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:1，并且所述小鼠抗CCR7抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:2；和，b)不超过100nM的抑制CCR7依赖性细胞内信号传导和CCR7受体内化中的至少一种的IC50，所述CCR7依赖性细胞内信号传导和CCR7受体内化中的至少一种通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人源化抗CCR7抗体，其中HVR-H1包含SEQID NO:3-10之一；HVR-H2包含SEQ ID NO:11-16之一；HVR-H3包含SEQ ID NO:17-23之一；HVR-L1包含SEQ ID NO:24-30之一；HVR-L2包含SEQ ID NO:31-33之一；且HVR-L3包含SEQID NO:34-39之一。更优选地本发明的人源化抗CCR7抗体包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中各自按顺序包含：(i)SEQ ID NO:3、11、17、24、32和34；(ii)SEQID NO:4、12、18、25、31和35；(iii)SEQ ID NO:5、12、18、26、31和35；(iv)SEQ ID NO:6、13、19、27、31和36；(v)SEQ ID NO:7、14、20、24、31和35；(vi)SEQ ID NO:8、15、21、28、31和37；(vii)SEQ ID NO:9、16、22、29、33和38；或(viii)SEQ ID NO:10、14、23、30、31和39。
在进一步优选的实施方案中，本发明的抗体是人源化抗CCR7抗体，其中抗体的重链可变结构域包含4个重链框架区HFR1至HFR4，和3个高变区HVR-H1至HVR-H3，其以HFR1、HVR-H1、HFR2、HVR-H2、HFR3、HVR-H3和HFR4的顺序可操作地连接，其中抗体的轻链可变结构域包含4个轻链框架区LFR1至LFR4，和3个高变区HVR-L1至HVR-L3，其以LFR1、HVR-L1、LFR2、HVR-L2、LFR3、HVR-L3和LFR4的顺序可操作地连接，其中重链框架区HFR1至HFR4具有氨基酸序列：i)分别为SEQ ID NO:40、43、45和48(＝来自VH1的FR)；ii)分别为SEQ ID NO:41、44、46和49(＝来自VH2的FR)；或iii)分别为SEQ ID NO:42、44、47和49(＝来自VH3的FR)，并且其中轻链框架区LFR1至LFR4具有氨基酸序列：iv)分别为SEQ ID NO:50、52、55和58(＝来自VL1的FR)；或v)分别为SEQ ID NO:51、53、56和59(＝来自VL2的FR)。
在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人源化抗-CCR7抗体，其中抗体的重链可变结构域包含与SEQ ID NO:61、62和63(VH1、2或3)中至少一个具有至少95％序列相同性的氨基酸序列；且其中抗体的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:64和65(VK1或2)中的至少一个具有至少95％氨基酸序列相同性的氨基酸序列；其中优选所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，并且优选所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
根据本发明上述任何一个实施方案的人源化抗CCR7抗体优选包含重链恒定区，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区。
根据本发明上述任何一个实施方案的人源化抗CCR7抗体优选包含具有至少一种选自以下的效应子功能的功能性Fc区：C1q结合，补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用。
第二方面，本发明涉及包含根据本发明上述任何一个实施方案的人源化抗CCR7抗体的药物组合物。
第三方面，本发明涉及：a)根据本发明上述任何一个实施方案的人源化抗CCR7抗体；或b)包含此类抗体的药物组合物；其用作药物。
在第四方面，本发明涉及a)根据本发明上述任一个实施方案的人源化抗CCR7抗体；或b)包含此类抗体的药物组合物；其用于治疗癌症，炎症性病症，由组织或器官移植引起的病症或并发症，或由纤维化引起或与之相关的病症或并发症。优选在所述治疗中，癌症是其中肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症，优选癌症选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤，大B细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤，B细胞急性淋巴细胞白血病，霍奇金病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，蕈样霉菌病，慢性骨髓增生综合征的急变期，骨髓增生异常综合征的急变期，乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，胃癌，头和颈鳞状细胞癌和结肠癌。优选地，在所述治疗中，炎症性病症选自炎症性肠病，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，哮喘，变应性气道炎症，气道平滑肌增生，纤维化肺病，类风湿性关节炎，多发性硬化症，银屑病，动脉粥样硬化，HIV感染和AIDS，或其中所述组织或器官移植是肾脏、心脏、皮肤和肺移植中的一种或多种。优选在所述治疗中，纤维化包括肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、皮肤纤维化、心血管纤维化、胃肠纤维化。
在第五方面，本发明涉及包含编码根据本发明的上述任何一个实施方案的人源化抗CCR7抗体的核苷酸序列的核酸分子，其中优选地，所述核酸分子包含编码所述抗体至少一个重链可变结构域和轻链可变结构域的核苷酸序列，并且其中优选地，所述编码核苷酸序列可操作地连接至调节序列以在宿主细胞中表达所述编码核苷酸序列。
第六方面，本发明涉及包含根据第五方面所述的核酸分子的宿主细胞。
本发明的描述
定义
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖例如单一抗CCR7单克隆抗体，包括拮抗剂，中和抗体，全长或完整单克隆抗体，具有多表位特异性的抗CCR7抗体组合物，多克隆抗体，多价抗体，单链抗CCR7抗体和抗CCR7抗体片段(参见下述)，包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段，双抗体，单结构域抗体(sdAb)，只要它们表现出期望的生物学和/或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与抗体互换使用。抗体可以是人抗体和/或人源化抗体。
术语“抗CCR7抗体”或“结合CCR7的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CCR7的抗体，使得该抗体可用作靶向CCR7的诊断剂和/或治疗剂。优选地，如通过例如放射免疫测定法(RIA)或ELISA测量的，抗CCR7抗体与无关的非CCR7蛋白质的结合程度小于抗体与CCR7的结合的约10％。在某些实施方案中，结合CCR7的抗体具有≤1mM，≤100nM，≤10nM，≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CCR7抗体结合在来自不同物种的CCR7中保守的CCR7表位。
“分离的抗体”是从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是会干扰抗体治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，抗体将纯化至(1)通过Lowry方法测定的重量大于95％，并且最优选重量大于99％，(2)足以获得通过使用旋杯式序列分析仪测定N-端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染的均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分不会存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本异四聚体单元和称为J链的额外多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2-5个基本4链单元以及J链的多价集合体)。在IgG的情况下，4-链单元通常约为150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。每个H和L链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N-末端具有可变结构域(VH)，随后是对α链和γ链而言各自的三个恒定结构域(CH)，以及对μ和ε同种型而言的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如Basic andClinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994年，第71页和第6章。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可以被分配到两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对小的差异，γ和α类被进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体中最可变的部分，且含有抗原结合位点。
术语“可变”是指这样的事实，即可变结构域的某些区段在抗体间在序列上广泛不同。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度上并不均匀分布。相反，V区由15-30个氨基酸被称为框架区(FR)的相对不变的区段，及隔开这些区段的各自长9-12个氨基酸具有极高可变性的被称为“高变区”(HVR)的较短区域所组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区一起参与抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD。(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子(effector)功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
“完整”抗体包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域，CH1、CH2和CH3。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
用于本文目的的“裸抗体”是不与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。
木瓜蛋白酶消化抗体产生称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段和残留的“Fc”片段(一个反映结晶容易性能力的名称)。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab')2片段，其大致对应于两个二硫连接的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为成对的Fab'片段产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫化物结合在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定，该区也是某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。从这两个结构域的折叠发出六个高变环(来自H和L链各3个环)，其贡献氨基酸残基用于抗原结合并赋予抗体结合抗原的特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个特异于抗原的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.13，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，该群包含的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成而不被其它抗体污染。修饰语“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文中的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及包括此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(参见美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。对于大部分而言，人源化抗体是具有所需抗体特异性、亲和力和能力的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的一些框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修改以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体通常包含两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多细节参见Jones等，Nature 321:522-525(1986),Riechmann等，Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。另请参阅其中引用的以下综述文章和参考文献：Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.,1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions,23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.,5:428-433(1994)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”指抗体可变结构域的区域，其序列高度可变和/或形成负责抗原结合的结构明确的环。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。许多高变区划分在使用且在被包含与本文中。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，根据Kabat编号系统编号时在VL中残基约24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，在VH中约31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；和/或那些来自“高变环”的氨基酸残基(例如根据Chothia编号系统进行编号时，在VL中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的26-32(H1)，52-56(H2)和95-101(H3)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的氨基酸残基(例如当根据IMGT编号系统进行编号时，在VL中的残基约27-38(L1)，56-65(L2)和105-120(L3)以及在VH中约27-38(H1)，56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc，M.P.etal.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999),Ruiz,M.et al.Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。任选地，当根据Honneger,A.和Plunkthun,A.J.(Mol.Biol.309:657-670(2001))进行编号时，抗体在一个或多个以下点具有对称的插入：VL中的28、36(L1)，63、74-75(L2)和123(L3)以及28、36(H1)，63、74-75(H2)和123(H3)。本发明抗体的高变区/CDR优选根据IMGT编号系统进行定义和编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。
如本文所用，“激动剂抗体”是模拟感兴趣多肽的至少一种功能活性的抗体。
“物种依赖性抗体”，例如哺乳动物抗人IgE抗体是对来自第一哺乳动物物种的抗原具有比对该抗原的来自第二哺乳动物物种的同源物具有更强结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(即，具有不超过约1×10-7M的结合亲和力(Kd)值，优选不超过约1×10-8M的结合亲和力(Kd)值和最优选不超过约1×10-9M)，但对来自第二非人哺乳动物物种的抗原同源物具有弱于其对人抗原的结合亲和力至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体中的任何一种，但优选是人源化或人抗体。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并趋于保持更长的结合。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，其中的任何方法可用于本发明的目的。以下描述具体的说明性实施案例。
可以通过表面等离子体共振测定法，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定抗原CM5芯片以约10-50个响应单位(RU)测量“Kd”或“Kd值”。简而言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释成5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，将抗体或Fab的两倍连续稀释物(0.78nM至500nM)在含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中以大约25μl/min的流速注射。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如Chen，Y。等，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。如果通过上述表面等离子体共振测定法测定的结合速率超过106M-1S-1，则可以通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，其采用分光光度计，例如装备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌红色比色皿的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)，在存在浓度渐增的抗原的情况下，在25℃下测量在pH7.2的PBS中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。
根据本发明的“结合的速率”或“结合速率”或“结合速率”或“kon”也可以使用与上述相同的表面等离子体共振技术使用BIAcore TM-2000或BIAcore TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)来测定。
“结合”感兴趣的抗原(例如，肿瘤相关多肽CCR7抗原靶)的抗体是以足够的亲和力结合抗原使得抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的治疗剂，并且不与其它蛋白质显著地交叉反应的抗体。在这样的实施方案中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀测定(RIA)所确定的，抗体与“非靶”蛋白的结合程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合的约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意味着可测量地不同于非特定互作的结合。例如，可以通过测定分子的结合与对照分子的结合相比来测量特异性结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与靶相似的对照分子竞争来确定特异性结合，例如过量的未标记的靶。在这种情况下，如果标记靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制，则表明是特异性结合。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位可以通过例如分子具有针对靶的至少约10-4M，或者至少约10-5M，或者至少约10-6M，或者至少约10-7M，或者至少约10-8M，或者至少约10-9M，或者至少约10-10M，或者至少约10-11M，或者至少约10-12M或更大的Kd(可以通过如上所述测定)来展示。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的情况下的结合。
术语“表位”是由与抗原结合蛋白(例如抗体)结合的分子的一部分。该术语包括能够特异性结合抗原结合蛋白(例如抗体或T细胞受体)的任何决定簇。表位可以是连续的或不连续的(例如，在多肽中，在多肽序列中彼此不连续的氨基酸残基，但是就在此分子中而言其与抗原结合蛋白结合)。在某些实施方案中，表位可以是模拟的，因为它们包含与用于产生抗原结合蛋白的表位相似的三维结构，但不包含或仅包含一些在用于产生抗原结合蛋白的表位中发现的氨基酸残基。通常，表位存在于蛋白质上，但在某些情况下可能存在于其它种类的分子上，例如核酸。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、磺酰基或硫酸根基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，特定靶抗原的特异性抗体将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。
抗体“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226位置或Pro230位置的氨基酸残基延伸至其羧基末端。例如，Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以，例如，在抗体的生产或纯化过程中或通过重组改造编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可以包含除去所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体，以及，具有和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用如所公开的各种测定来评估，例如，在本文中的定义中所公开的。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人源IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含与天然序列Fc区相比存在至少一个氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中约1至约10个氨基酸取代，并且优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，并且最优选与其具有至少约90％的同源性，更优选与其具有至少约95％同源性。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的464页的表3中有所总结。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在公开的动物模型(Clynes等，(USA)95:652-656(1998))中评估。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括具有主要在其胞质结构域不同的相似氨基酸序列的FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述文章Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在文章Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4:25-34(1994)；和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中被综述。其它FcR，包括未来鉴定的FcR，在本文中由术语“FcR”涵盖。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。
与人FcRn体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期可以在例如表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在采用了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定。WO 2000/42072(Presta)描述了具有改善的或减弱的与FcR的结合的抗体变体。另见例如Shields等，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“人效应子细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。效应子细胞可以从天然来源例如血液中分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体途径的激活是通过补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当亚类的)结合而启动。为了评估补体活化，例如在Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202:163(1996))中描述的CDC测定法可能被实施。在美国专利号6,194,551B1和WO1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的抗体)和增加的或降低的C1q结合能力的抗体变体。也参见例如Idusogie等，J.Immunol.164:4178-4184(2000)。增加C1q结合并由此增加CDC活性的一种此类取代是E333A取代，其可有利地应用于本发明的抗体中。
术语“包含Fc区的抗体”是指抗体包含Fc区。例如，在抗体纯化期间或通过重组改造编码抗体的核酸，可以去除Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，根据本发明的具有Fc区的抗体的组合物可以包含具有K447的抗体，其中所有K447被去除的抗体，或具有和不具有K447残基的抗体的混合物。
根据两个序列的长度，可以通过使用全局或局部比对算法比对两个氨基酸序列或两个核苷酸序列来确定“序列相同性”和“序列相似性”。优选地使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch)比对相似长度的序列，所述全局比对算法在整个长度上最佳地对序列进行比对，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)进行比对。然后，当序列(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT最优地比对)共享至少某个最小百分比的序列相同性(如下所定义)时，可以将序列称为“基本相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法将两个序列在其整个长度(全长)上进行比对，从而最大限度地增加匹配数量并最大限度地减少空位数量。当两个序列具有相似的长度时，全局比对适用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，其空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89,915-919)。序列比对和百分比序列相同性的评分可使用计算机程序来确定，例如可从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA获得的GCG WisconsinPackage，Version 10.3或使用开源软件，例如EmbossWIN 2.10.0版中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用本地Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(对于'needle'和'water'，对于蛋白质和DNA比对，缺省空位开放罚分为10.0，默认空位延伸罚分为0.5；默认评分矩阵为Blossum62用于蛋白和DNAFull用于DNA。当序列具有显着不同的总长度时，局部比对(例如使用Smith Waterman算法的比对)是优选的。或者，百分比相似性或相同性可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法搜索公共数据库来确定。
一旦使用任何上述比对程序比对了两个氨基酸序列，则给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性百分比(其可以替代地表达为给定的氨基酸序列A具有或包含与特定氨基酸序列B特定百分比的氨基酸序列相同性)的计算如下：X/Y分数的100倍，其中X是通过该程序将A和B比对而得的相同序列匹配氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A与B的氨基酸序列相同性的百分比不等于B与A的氨基酸序列相同性百分比。
本文中的“核酸构建体”或“核酸载体”被理解为是指由使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包括天然存在的核酸分子，尽管核酸构建体可以包含(部分)天然存在的核酸分子。术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够在宿主细胞或与这些序列相容的宿主生物体中实现基因表达的核苷酸序列。这些表达载体通常包括至少合适的转录调节序列和任选的3'转录终止信号。还可能存在其它影响表达所必需或有帮助的因素，例如表达增强子元件。表达载体会被导入合适的宿主细胞中，并且能够在宿主细胞的体外培养中实现编码序列的表达。表达载体将适合于在本发明的宿主细胞或生物体中复制。
如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指用于控制一个或多个编码序列转录的核酸片段，并且位于编码序列的转录起始位点转录方向的上游，并且可通过存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列被结构性地鉴定，包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活蛋白结合位点，以及本领域已知的任何其它直接或间接调节通过启动子的核苷酸序列转录量。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中都有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理或发育所调控的启动子，例如通过应用化学诱导剂。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件的功能关系连接。当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接”的。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着所连接的DNA序列通常是连续的，并且需要连接两个蛋白质编码区，连续的并且在阅读框中。
本发明的详细描述
本发明的抗CCR7抗体
在第一方面，本发明提供了结合CCR7的抗原结合蛋白。本发明结合CCR7的抗原结合蛋白优选为如上文所定义的广义含义的抗CCR7抗体，包括例如抗CCR7抗体，抗体片段，抗体衍生物，抗体突变蛋白和抗体变体。本发明的抗CCR7抗体优选是分离的抗体。优选地，本发明的抗CCR7抗体结合灵长类CCR7，更优选结合人CCR7。人CCR7的氨基酸序列可在GenBank中获得：EAW60669.1(SEQ ID NO:75)。该序列的氨基酸1至24包含膜转位信号肽，其在表达过程中被切除。人CCR7的25至59号氨基酸构成N端胞外结构域，该结构域在Y32和Y41位包含硫化酪氨酸残基。与GenBank：EAW60669.1中的序列相比，具有一个或多个氨基酸取代的人CCR7的各种等位基因变体是已知的。本发明中的“人CCR7”包括这些等位基因变体，至少就变体具有细胞外结构域和CCR7的功能而言。
本发明的抗CCR7抗体优选特异性结合CCR7的，优选人CCR7的N端胞外结构域。本发明的抗体优选特异性结合包含氨基酸序列“ZxLFE”或由氨基酸序列“ZxLFE”组成的表位，其中Z是硫化酪氨酸，x可以是任何氨基酸，F可以被疏水性氨基酸置换。因此，本发明的抗体优选特异性结合包含人CCR7的N端胞外结构域中第41至45位氨基酸序列“ZTLFE”或由其组成的表位。抗体优选对特异性针对人CCR7。
本发明的抗CCR7抗体优选具有对人CCR7或对于包含“ZTLFE”表位的合成抗原的最小亲和力，优选对于本文实例中所述的合成抗原SYM1899具有最小亲和力。因此，优选本发明的抗CCR7抗体具有1×10-8M，5×10-9M，2×10-9M，1.8×10-9M，1×10-9M，1×10-10M或1×10-11M或更少的Kd值。或者，当在相同方法中测试时，通过参照抗CCR7抗体的Kd来定义抗体的最小亲和力。因此，优选地，本发明的抗CCR7抗体对于人CCR7或含有“ZTLFE”表位的合成抗原(优选如本文实例中所述的合成抗原SYM1899)具有的Kd，比对抗原的参照抗CCR7抗体的Kd高不超过10、5、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍，其中参照抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链的氨基酸序列可变结构域是SEQ ID NO:1并且其轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQID NO:2。在本文中理解，一个抗体的Kd相比参照的Kd高不超过10倍，这个抗体就具有不低于参考抗体10倍的亲和力。因此，如果参考抗体具有1×10-9M的Kd，则所讨论的抗体具有1×10-8M或更小的Kd。
本发明的抗CCR7抗体优选以最大koff速率常数结合人CCR7或结合至包含“ZTLFE”表位的合成抗原(优选如本文实例中所述的合成抗原SYM1899；SEQ ID NO:76)。因此，优选本发明的抗CCR7抗体具有1×10-3、1×10-4或1×10-5s-1或更低的koff速率常数。或者，当在相同方法中测试时，通过参考参照抗CCR7抗体的koff速率常数来定义抗体的最大koff速率常数。因此，优选地，本发明的抗CCR7抗体结合人CCR7或结合至包含“ZTLFE”表位的合成抗原(优选如本文实例中所述的合成抗原SYM1899)，其比参考抗CCR7抗体对于抗原的koff速率常数高不超过10、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍，此处参考抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链的氨基酸序列可变结构域是SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
本发明的抗CCR7抗体优选为中和抗体，抑制通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体的CCR7依赖性细胞内信号传导和/或CCR7受体内化。抗CCR7抗体优选具有不高于150、100、80、50、30、25、20、15、10、5或3nM的IC50，抑制通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体的CCR7依赖性细胞内信号传导和/或CCR7受体内化，例如可以如本文实例中所述方法测定。或者，当在相同方法中测试时，通过参考参照抗CCR7抗体的IC50来定义抗体的最大IC50。因此，优选地，本发明的抗CCR7抗体具有比参考抗CCR7抗体的IC50高不超过10、5、2、1.5、1.2、1.1或1.05倍的IC50，其中参照抗CCR7抗体是小鼠抗CCR7抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:1且其轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
如上所述，本发明的抗CCR7抗体优选抑制CCR7依赖性细胞内信号传导CCR7，没有实质的激动作用，更优选没有可检测的激动作用，如可以例如通过本文实例中所述方法被测定。
本发明的抗CCR7抗体优选包含高变区HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其中：
HVR-H1包含序列：G-F/L-T/A/P-F-S/T/R-N/D/S-Y/F-A；
HVR-H2H1包含序列：I-S-S/D-G/R-G-S/T/F-Y/H/F-T/P；
HVR-H3H1包含序列：A/T/V/G-R-R/A-A/E/T-Y/G/T-R/V-Y/V-D/*-GTG/*-E/V/D/A/G/*-N/S/D/T-A/S/D-M/L/F-Y/S；
HVR-L1H1包含序列：Q/S-D/S-I/L/V-G/S/L-D/S/P/G/N-S/N-*/Y/DGKTY；
HVR-L2H1包含序列：A/S/T-T/I/V-S；和
HVR-L3H1包含序列：L/W/Q-Q-Y/F/G/W-A/T/S-S/N/H-S/F/N-P-L/P/Q-T，其中“*”表示在该位置没有氨基酸可存在。
更优选地，本发明的抗CCR7抗体是这样的抗体，其中：
HVR-H1包含SEQ ID NO:3-10之一；HVR-H2包含SEQ ID NO:11-16之一；HVR-H3包含SEQ ID NO:17-23之一；HVR-L1包含SEQ ID NO:24-30之一；HVR-L2包含SEQ ID NO:31-33之一；且HVR-L3包含SEQ ID NO:34-39之一。
最优选地，本发明的抗CCR7抗体包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中按顺序各自包含：(i)SEQ ID NO:3、11、17、24、32和34；(ii)SEQ ID NO:4、12、18、25、31和35；(iii)SEQ ID NO:5、12、18、26、31和35；(iv)SEQ ID NO:6、13、19、27、31和36；(v)SEQ ID NO:7、14、20、24、31和35；(vi)SEQ ID NO:8、15、21、28、31和37；(vii)SEQ IDNO:9、16、22、29、33和38；或viii)SEQ ID NO:10、14、23、30、31和39。
本发明的抗CCR7抗体可以是小鼠抗体或嵌合(例如小鼠-人类)抗体。然而优选抗体是人源化抗体。根据本发明的人源化抗体优选在被施用抗体的对象中引发很少或没有免疫原性应答。例如，根据本发明的人源化抗体与原始小鼠抗体(例如包含SEQ ID NO:1和2的序列)相比，宿主对象中引发和/或预期引发充分降低的人抗小鼠抗体应答(HAMA)水平。优选地，人源化抗体引发和/或预期引发最小或无人抗小鼠抗体应答(HAMA)。最优选地，本发明的抗体引发等于或低于临床可接受水平的抗小鼠抗体应答。
本领域已知各种用于人源化非人抗体的方法。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和其同事的方法进行(Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)，通过用高变区序列替代人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物的抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的轻链和重链人可变结构域的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的完整文库，筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后采纳与啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等，1993，J.Immunol.151：2296；Chothia等，1987，J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法使用衍生自所有人抗体的轻或重链特定亚组的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta等(1993)J.Immunol，151：2623)。
进一步重要的是将抗体人源化并保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了实现该目标，根据一种方法，人源化抗体的制备是通过运用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和多种概念上的人源化产物。三维免疫球蛋白模型通常可获得并且对于本领域技术人员来说是熟悉的。可获得用于说明和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查，允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而获得期望的抗体特征，例如对靶抗原的亲和力增加。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及影响抗原结合。
为了选择优选的轻链和重链的人可变结构域框架区，以用于制备本发明优选的人源化抗体，使用BLAST搜索算法搜索人IgG序列在线数据库以与729抗体的鼠VH结构域进行比较。从最高的200个BLAST结果中选择候选人可变结构域。基于框架同源性的组合、维持关键框架残基和经典环结构，这些结果被减少为三个候选物。
本发明的抗CCR7抗体优选是这样的抗体，其中抗体的重链可变结构域包含以HFR1、HVR-H1、HFR2、HVR-H2、HFR3、HVR-H3和HFR4的顺序可操作地连接的4个重链框架区HFR1至HFR4和3个高变区HVR-H1至HVR-H3，并且其中抗体的轻链可变结构域包含以LFR1、HVR-L1、LFR2、HVR-L2、LFR3、HVR-L3和LFR4的顺序可操作地连接的4个轻链框架区LFR1至LFR4和3个高变区HVR-L1至HVR-L3。优选地，本发明抗体中的重链框架区HFR1至HFR4具有以下氨基酸序列：i)分别为SEQ ID NO:40、43、45和48(即来自VH1的FR)；ii)分别为SEQ IDNO:41、44、46和49(即来自VH2的FR)；或iii)分别为SEQ ID NO:42、44、47和49(即来自VH3的FR)。优选地，本发明抗体中的轻链框架区LFR1至LFR4具有以下氨基酸序列：iv)分别为SEQID NO:50、52、55和58(即来自VL1的FR)；或v)分别为SEQ ID NO:51、53、56和59(即来自VL2的FR)。
优选地，在本发明的抗CCR7抗体中，其中抗体的重链可变结构域包含与SEQ IDNO:61、62和63中的至少一个(VH1、2或3)具有至少95、96、97、98、99或100％序列相同性的氨基酸序列，更优选抗体的重链可变结构域包含与SEQ ID NO:61具有至少95、96、97、98、99或100％序列相同性的氨基酸序列。
优选地，在本发明的抗CCR7抗体中，抗体的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:64和65中的至少一个(VK1或2)具有至少95、96、97、98、99或100％序列相同性的氨基酸序列，更优选抗体的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:64具有至少95、96、97、98、99或100％序列相同性的氨基酸序列。
本发明特别优选的抗CCR7抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列(即VH1可变结构域)，和所述轻链可变结构域含有SEQ ID NO:64的氨基酸序列(即VK1可变结构域)。
考虑了本发明的抗CCR7抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入编码抗体的核酸中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这种修饰包括，例如，拮抗剂的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征。氨基酸改变还可以改变拮抗剂的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。
氨基酸序列插入包括长度从单个氨基酸到含一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括，将酶或者增加拮抗剂的血清半衰期的多肽融合到拮抗剂的N-或C-末端。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在拮抗剂分子中至少有一个氨基酸残基被不同的残基取代。对抗体拮抗剂取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。
另一种类型的抗体氨基酸变体改变拮抗剂的原始糖基化模式。改变是指缺失拮抗剂中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加不存在于拮抗剂中的一个或多个糖基化位点。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬氨酸残基侧链的连接。三肽序列天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促附着到天冬氨酸侧链的识别序列。因此，多肽中任何这些三肽序列的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将单糖或单糖衍生物N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。向抗体添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)而方便地完成。该改变还可以通过向原始抗体的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行(对于O-连接的糖基化位点)。编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子是通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生的氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变先前制备的变体或拮抗剂的非变体形式。
在一些实施方案中，本发明的抗CCR7抗体包含轻链和/或重链抗体恒定区。可以使用本领域已知的任何抗体恒定区。轻链恒定区可以是例如κ-或λ-型轻链恒定区，例如人κ或λ-型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α，δ，ε，γ，或μ型重链恒定区，例如人α，δ，ε，γ或μ型重链恒定区。因此，本发明的抗CCR7抗体可以具有任何同种型的恒定区，即包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE恒定区以及IgG1，IgG2，IgG3或IgG4恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。将感兴趣的抗体衍生成不同亚类或同种型的抗体的技术是已知的，即亚类转换。因此，例如IgG抗体可以衍生自IgM抗体，反之亦然。此类技术允许制备新抗体，其具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性，但也显示不同于亲本抗体的抗体同种型或亚型相关的生物学性质。重组DNA技术可被使用。编码特定抗体多肽的克隆DNA可用于此类方法中，例如编码所需同种型抗体恒定结构域的DNA。另见Lantto等，(2002，Methods Mol.Biol.178：303-16)。因此，本发明的抗CCR7抗体包括那些抗体，其包含例如本文公开的一个或多个可变结构域序列并且具有期望的同种型(例如，IgA，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgE和IgD)，以及其Fab或F(ab')2片段。此外，如果需要IgG4，则可能需要如Bloom等人(1997，Protein Science 6：407)所述在铰链区引入点突变(CPSCP->CPPCP)，以减轻形成可导致IgG4抗体异质性的H链内二硫键的倾向。
本发明的抗CCR7抗体，优选地包含具有至少一种效应子功能的功能性Fc区，所述效应子功能选自C1q结合、补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用。
本发明的抗CCR7抗体可以被修饰以改善其效应子功能，例如，增强抗体的ADCC和/或CDC。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。本发明抗体的Fc区中的优选取代是增加C1q结合并由此增加CDC活性的取代，例如，描述于Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。的Fc区中的增加C1q结合优选取代是E333A取代。
通过几种单糖或单糖衍生物形成添加到糖蛋白(例如抗体)的氨基酸主链上的糖基，得到在不同哺乳动物或组织的细胞中产生的同一抗体可以不同的组合物。另外，已经显示糖基的不同组成可以影响介导抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的效力。因此，通过研究来自不同来源的抗体的糖基化模式，可以改善这些性质。这种方法的一个例子是Niwa等人，(2004，Cancer Res，64(6)：2127-33)。
或者或此外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，由此允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人(1992，J.Exp Med.176：1191-1195)和Shopes，(1992，Immunol.148：2918-2922)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体也可以使用异源双功能交联剂制备，如Wolff等(1993，Cancer Research 53：2560-2565)。或者，可以工程化具有双Fc区的抗体，并且可以由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，(1989，Anti-Cancer Drug Design 3：2 19-230)。例如，为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位引入抗体(特别是抗体片段)，如美国专利5,739,277中所述。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指负责增加体内IgG分子血清半衰期的IgG分子(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)的Fc区上的表位。
本发明优选的抗CCR7抗体包含人同种异型(allotype)G1m17,1的重链恒定区(参见Jefferis和Lefranc(2009)单克隆抗体s Vol.1Issue 4，第1-7页)，该重链恒定区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。更优选地，本发明抗体中人同种异型G1m17,1的重链恒定区包含E333A取代，该重链恒定区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
癌症的细胞毒性化疗或放疗受到严重的、有时危及生命的副作用的限制，这些副作用是由对敏感正常细胞的毒性引起的，因为治疗对恶性细胞没有选择性。避免这些问题的一种策略是将治疗剂偶联至抗体，例如本发明的抗CCR7抗体。这增加了恶性细胞的暴露，并减少了正常细胞暴露于配体靶向治疗剂。参见Allen，Nature，2：750-763(2002)。治疗剂可以是免疫抑制剂，即用于抑制或掩蔽本文中正接受治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子产生，下调或抑制自身抗原表达，或掩盖MHC抗原的物质。治疗剂也可以是细胞毒剂，即抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素，化学治疗剂(即可用于治疗癌症的化学化合物)，以及毒素(例如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)。治疗剂还可以是细胞因子、激素、生长因子、坏死因子，即由一细胞群释放的蛋白质或多肽，其作为细胞间介质或甚至在相同细胞群中作用于另一细胞。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和多肽以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。治疗剂也可以是前药，其是指药物活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比对肿瘤细胞具有较小细胞毒性的，并且能够被酶促活化或转化为更具活性的亲本形式。抗体和一种或多种小分子毒素的缀合物。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的抗CCR7抗体与一种或多种毒素分子缀合。可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒素A链，蒴莲根毒蛋白A链，α帚曲毒蛋白(αsarcin)，油桐(Aleurites fordii)蛋白，美洲商陆蛋白(PAP1、PAP11和PAP-S)，苦瓜(momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆酸，肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂，白树毒素(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲霉素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和三氯噻吩。
本发明进一步考虑了与具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNase)或其它能够破坏细胞结构或细胞器并因此杀死或减弱细胞活力的化合物缀合的抗体。
本发明的抗体还可以与前药活化剂缀合，这些活化剂将前药转化为活性抗癌药物。这种缀合物的药剂组分包括能够以这样的方式作用于前药的任何药剂，以便将前药转化为其更具活性的细胞毒性形式。
或者，包含至少本发明抗CCR7抗体的抗原结合区的融合蛋白被连接到本发明的酶的至少功能活性部分，其可以使用本领域总所周知的重组DNA技术来构建(参见例如，Neuberger等，1984，Nature，312：604-608)。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂或接头来制备。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头，肽酶敏感接头，二甲基接头或含二硫化物接头。或者，可以制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白，例如，通过重组技术或多肽合成。
本发明的抗体的产生和纯化
本发明的抗CCR7抗体可以通过许多常规技术中的任何一种来制备。它们通常使用本领域已知的任何技术在重组表达系统中生产。参见例如Shukla和Thommes(2010，“Recentadvances in large-scale production of monoclonal antibodies and relatedproteins”,Trends in Biotechnol.28(5):253-261),Harlow和Lane(1988)“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY和Sambrook and Russell(2001)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY。任何本领域已知的表达系统可用于制备本发明的重组多肽。通常，用包含编码所需多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。
因此，一方面，本发明涉及包含编码本发明的抗CCR7抗体的核苷酸序列的核酸分子。一个核苷酸序列编码至少包含本发明抗CCR7抗体的轻链可变结构域的多肽，另一个核苷酸序列编码至少包含本发明抗CCR7抗体重链可变结构域的多肽。优选的核酸分子是表达载体，其中编码本发明抗体多肽的核苷酸序列被可操作地连接至表达调控序列，例如，启动子和信号序列。用于表达本发明的抗CCR7抗体多肽的优选信号序列包括例如重链信号肽：MGWTLVFLFLLSVTAGVHS(SEQ ID NO:77)和轻链信号肽：MVSSAQFLGLLLLCFQGTRC(SEQ ID NO:78)。
另一方面，本发明涉及包含如本部分中所定义的核酸分子的细胞。细胞优选是分离的细胞或培养的细胞。可以使用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7系(Gluzman等，1981，Cell 23：175)，L细胞，293细胞，C127细胞，3T3细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，BHK细胞系，以及如McMahan等人，1991，EMBO J.10：2821所述的，源自非洲绿猴肾细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系。在细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主中适当的克隆和表达载体被Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，New York，1985)描述。
转化的细胞可在促进多肽表达的条件下培养。因此，一方面，本发明涉及产生本发明的抗CCR7抗体的方法，所述方法包括在有助于表达所述多肽的条件下，培养包含如本文所定义的至少一种表达载体的细胞的步骤，以及任选地，回收多肽。
本发明的抗CCR7抗体可通过常规蛋白质纯化程序回收，包括例如蛋白A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析(参见例如Low等人，2007，J.Chromatography B，848：48-63；Shukla等人，2007，J.Chromatography B，848：28-39)，所述亲和层析包括例如使用基于骆驼衍生的单结构域(VHH)抗体片段的CaptureSelectTM配体的亲和层析以提供的独特的亲和纯化解决方案(参见例如Eifler等，2014，BiotechnologyProgress DOI：10.1002/btpr.1958)。预期用于本文的多肽包括基本上无内源性物质污染的基本上均质的重组抗-CCR7抗体多肽。
包含本发明抗体的组合物
一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗CCR7抗体(即与CCR7受体结合的抗体或其抗原结合片段，或其药学衍生物或前药)，以及药学上可接受的载体/佐剂或载体，用于施用于对象。所述药物组合物可通过将有效量的组合物施用于有需要的对象而用于下文所述的治疗方法中。如本文所用，术语“对象”是指归类为哺乳动物的所有动物，并且包括但不限于灵长类动物和人类。对象优选是任何年龄或种族的男性或女性人类。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(参见例如“Handbookof Pharmaceutical Excipients“，Rowe等编，第7版，2012，www.pharmpress.com)。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。除了考虑任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，还考虑将其用于组合物中。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵了，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本发明的抗体可以在相同的制剂中或可以在不同的制剂中施用。施用可以是同时的或序贯的，并且可以以任何一种顺序有效。
补充活性化合物也可以掺入到本发明的药物组合物中。因此，在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物还可以包含针对待治疗的特定适应症所需的多于一种的活性化合物，优选那些具有互补活性并且不会相互不利影响的活性化合物。例如，可能需要进一步提供化学治疗剂、细胞因子、止痛剂或免疫调节剂，例如免疫抑制剂或免疫刺激剂。除其它之外，此类其它活性剂的有效量取决于药物组合物中存在的本发明抗体的量，疾病或病症或治疗的类型等。
在一个实施方案中，本发明的抗体是用保护所述化合物免于从身体快速消除的载体而制备，所述载体诸如控释制剂，包括植入物和微胶囊化的递送系统，例如脂质体。可使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是明确的。脂质体悬浮液，包括靶向脂质体也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如U.S.4,522,811、WO2010/095940中所述。
本发明抗体(或其片段)的施用途径可以是口服、注射、通过吸入或局部施用。本文使用的术语“注射”包括静脉内、动脉内、淋巴内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。注射施用的静脉内形式是优选的。“全身施用”是指口服、静脉内、腹膜内和肌肉内施用。当然，治疗或预防效果所需抗体的量将随所选抗体，所治疗病症的性质和严重程度以及患者本身而变化。另外，抗体可以适当地通过脉冲输注来施用，例如，以减少剂量的抗体施用。优选通过注射施用，最优选静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是慢性的。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物可以是适合注射施用的形式，例如适当单位剂型的无菌溶液剂、混悬剂或冻干产品。适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是以便容易注射的液体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水，乙醇，药学上可接受的多元醇如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇及它们适当的混合物。适当的流动性可通过例如使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的粒子大小，和通过使用表面活性剂来维持。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物的活动。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。
可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液可通过根据需要将所需量的活性化合物(例如多肽或抗体)与上述列举成分的一种或组合掺入到合适的溶剂中，随后过滤除菌来制备。通常，分散体可通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质和所需的那些来自上面列举的其它成分的无菌载体中来制备。对于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥以从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分与任何另外的所需成分的粉末。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物通过静脉内(IV)或皮下(SC)施用。可以使用适当的赋形剂，例如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。所提及的制剂将按照制备注射用组合物的标准方法来制备，如本领域中众所周知且更详细地描述于各种来源中，包括例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(Ed.Allen，L.V.第22版，2012，www.pharmpress.com)。
以剂量单位形式配制药物组合物(即注射用组合物)以便于施用和均匀化剂量是特别有利的。本文使用的剂量单位形式是指适合作为接受治疗的对象的单位剂量的物理分离单位；每个单位含有经计算以产生期望治疗效果的预定量活性化合物(本发明的抗体)和与之结合的所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规格决定于并直接取决于活性化合物的独特特征和待达到的特定治疗效果，以及配制这种活性化合物用于治疗个体的本领域固有限制。
通常，本发明抗体的有效施用量将取决于所选化合物的相对功效，所治疗病症的严重程度和患者的体重。然而，活性化合物通常每天一次或多次施用，例如每天1、2、3或4次，典型的总每日剂量为0.001-1000mg/kg体重/天，优选约0.01至约100mg/kg体重/天，最优选约0.05至10mg/kg体重/天。
除了向患者施用抗体之外，本申请考虑通过基因疗法施用抗体。WO96/07321涉及运用基因疗法以产生细胞内抗体。
药物组合物可以与用于施用的说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明的抗体和药物组合物可以与其它药物一起使用以提供组合疗法。其它药物可以形成同一组合物的一部分，或者可作为单独组合物被提供以用于同时或不同时间施用。
本发明的抗体的用途
本发明的抗体和药物组合物可用于治疗各种疾病、病症和适应症。可以治疗的疾病类型的例子包括癌症、炎症性病症、由组织或器官移植引起的病症和并发症，以及由纤维化引起或与纤维化相关的病症和并发症。
本发明的抗体和药物组合物可适用于治疗与癌症相关的病症或疾病，特别是用于治疗癌症，所述癌症的特征在于表达CCR7受体的肿瘤细胞，更具体地，用于杀死或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞的凋亡。说明性的、非限制性的、易被本发明治疗的其中肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤，大B细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，B细胞急性淋巴细胞白血病，霍奇森病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，蕈样霉菌病，慢性骨髓增殖综合征急变，骨髓增生异常综合征急变，乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，胃癌或头和颈鳞状细胞癌和结肠癌。在一个优选的实施方案中，根据本发明易于治疗的癌症包括乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，胃癌或头和颈鳞状细胞癌和结肠癌。在一个最优选的实施方案中，根据本发明易于治疗的癌症包括滤泡性淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，慢性骨髓增生综合征急变期和骨髓增生异常综合征急变期。在仍然最优选的实施方案中，根据本发明被治疗的癌症包括CLL和MCL。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体可以与本文所述医学病症的其它治疗组合，例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法或手术方法，包括烷化剂，抗代谢物，抗激素剂，针对各种症状的治疗剂，例如止痛药，利尿剂，抗利尿剂，抗病毒剂，抗生素，细胞因子，营养补充剂，贫血治疗剂，凝血治疗剂，骨治疗剂，精神和心理治疗剂等。
可以在用抗CCR7抗体治疗后从所述患者收获骨髓或外周血干细胞以实现自体骨髓或干细胞移植。
在施用本发明的抗体之前，对患者使用细胞因子以上调癌性B细胞表面上CCR7或其它靶蛋白的表达也可能是有用的。细胞因子也可以在施用缺失抗体或放射性标记抗体同时、之前或之后被施用以刺激免疫效应子功能。
在一个实施方案中，化学治疗方案可以用于补充本文公开的治疗，并且可以与所述放射性标记的抗体同时施用或按任何顺序先后施用。化疗方案可以选自CHOP(环磷酰胺、多柔比星(也称为羟基柔红霉素)，长春新碱(也称为oncovin)和泼尼松)，ICE(伊达比星、阿糖胞苷和依托泊苷)，美托沙星，阿糖胞苷，DVP(柔红霉素、长春新碱和泼尼松)，ATRA(全反式维甲酸)，伊达比星，hoelzer化疗方案，La化疗方案，ABVD(博来霉素、达卡巴嗪、多柔比星和长春新碱)，CEOP(环磷酰胺、表柔比星、长春新碱和泼尼松龙)，2-CdA(有或没有随后的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)治疗)，VAD(长春新碱、多柔比星和地塞米松)，M&P(美法仑和强的松)，C(环磷酰胺)-Weekly，ABCM(阿霉素、博来霉素、环磷酰胺和丝裂霉素-C)，MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)和DHAP(地塞米松、阿糖胞苷和顺氯氨铂)。优选的化疗方案是CHOP。
因此，另一方面，本公开内容涉及用于治疗癌症，特别是肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症的方法，该方法包括向需要所述治疗的对象施用治疗有效量的本发明抗体(即与CCR7受体结合的抗体或其抗原结合片段)或本发明的药物组合物。在一个具体的实施方案中，所述癌症是以表达CCR7受体的肿瘤细胞为特征的癌症。说明性的、非限制性的根据本发明待治疗的癌症包括CLL，MCL，滤泡性淋巴瘤，大B细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，B细胞急性淋巴母细胞性白血病，霍奇金病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，蕈样霉菌病，慢性骨髓增生综合征急变期，骨髓增生异常综合征急变期，乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，胃癌或头和颈鳞状细胞癌和结肠癌。在一个优选的实施方案中，根据本发明被治疗的癌症包括乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，胃癌或头和颈鳞状细胞癌和结肠癌。在一个最优选的实施方案中，根据本发明被治疗的癌症包括滤泡性淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，慢性骨髓增殖综合征急变期和骨髓增生异常综合征急变期。在仍然最优选的实施方案中，根据本发明被治疗的癌症包括CLL和MCL。
另一方面，本发明涉及用于杀死表达CCR7受体的肿瘤细胞或诱导表达CCR7受体的肿瘤细胞凋亡的体外方法，其包括使所述细胞与本发明的结合CCR7受体的抗体(即抗体或其抗原结合片段)接触。在一个具体的实施方案中，所述肿瘤细胞是表达CCR7受体的肿瘤细胞，如CLL和MCL细胞。
“抑制表达CCR7多肽的肿瘤细胞的生长”的抗体或“生长抑制性”抗体是导致表达或过表达适当多肽的癌细胞的可测量的生长抑制的抗体。CCR7多肽是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽。优选的生长抑制性抗CCR7抗体，与对照相比较，抑制表达CCR7的肿瘤细胞的生长超过20％，优选约20％至约50％，甚至更优选大于50％(例如约50％至约100％)，对照通常是未用所测抗体处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，可以在细胞培养物中存在约0.1至30mg/ml或约0.5nM至200nM的抗体浓度下测量生长抑制，其中生长抑制在肿瘤细胞暴露于抗体1至10天后测定。体内肿瘤细胞的生长抑制可以通过各种方式确定，例如针对表达CCR7的肿瘤细胞描述于EP2474557B1。如果以约1mg/kg至约100mg/kg体重施用抗CCR7抗体，导致在首次施用所述抗体后约5天至3个月内(优选在约5至30天内)肿瘤大小或肿瘤细胞增殖减少，则该抗体在体内是生长抑制性的。
“诱导细胞凋亡”的抗体可诱导程序性细胞死亡，可通过annexin V的结合、DNA片段化、细胞收缩、内质网扩张、细胞碎裂、和/或膜囊泡形成(称为凋亡小体)来确定。细胞通常是过表达CCR7多肽的细胞。优选细胞是肿瘤细胞，例如，血液细胞，如B细胞，T细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，单核细胞，血小板或红细胞。多种方法可用于评估与凋亡相关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可以通过annexin结合来测量；DNA片段化可以通过DNA梯形带来评估；且核/染色质浓缩连同DNA片段化可以通过亚二倍体细胞中的任何增加来评估。优选地，诱导细胞凋亡的抗体是在annexin结合测定中导致相对于未处理的细胞约2至50倍，优选约5至50倍，并且最优选约10至50倍的annexin结合诱导的抗体。
“诱导细胞死亡”的抗体是导致活细胞变得无法存活的抗体。该细胞是表达CCR7多肽并且是特异性表达或过表达CCR7多肽的类型的细胞。细胞可以是癌细胞或特定细胞类型的正常细胞。CCR7多肽可以是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽，或者可以是由癌细胞产生和分泌的多肽。该细胞可以是癌细胞，例如B细胞或T细胞。体外细胞死亡可以在不存在补体和免疫效应细胞的情况下测定，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，细胞死亡测定可以使用热灭活血清(即在不存在补体的情况下)和不存在免疫效应细胞的情况下进行。为了确定相对于未经处理的细胞，抗体是否能够诱导细胞死亡，可通过吸收碘化丙锭(PI)、台盼蓝(参见Moore等人，Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD来评估的膜完整性丢失。优选的诱导细胞死亡的抗体是在BT474细胞中的PI摄取测定法中诱导PI摄取的那些抗体。
先前已经提及关于易受本发明方法治疗的表达CCR7受体的肿瘤细胞、抗体、施用方案和剂量的信息。在一个具体的实施方案中，易受上述方法治疗的表达CCR7受体的肿瘤细胞是CLL或MCL细胞。
在所有情况下，表述“治疗有效量”意指如先前所定义的有效治疗癌症的量；所述量可以是足以实现所需应答，或者改善例如转移或原发性肿瘤进展、大小或生长的症状或体征的量。特定对象的治疗有效量可以根据诸如所治疗的病症、对象的总体健康状况、方法、途径和施用剂量以及副作用的严重程度等因素而变化。优选地，该效果将导致定量改变至少约10％，优选至少20％，30％，50％，70％或甚至90％或更多。当组合使用时，治疗有效量与各组分的组合比例有关，并且效果不限于各单独组分。一个治疗有效量通常将调节症状至少约10％；通常至少约20％；优选至少约30％；或更优选至少约50％。或者，迁移的调节意味着各种细胞类型的迁移或运输将受到影响。这将导致例如所受影响细胞的数量在统计上显著且可量化的变化。这可能是一段时间或目标区域内被吸引的目标细胞数量的减少。原发肿瘤进展速度、大小、传播或生长也可以被监测。
本发明的抗CCR7抗体及包含此类抗体的组合物也可用于治疗炎症性病症和由组织或器官移植引起的病症以及并发症。
CCR7活性涉及炎症性肠病(IBDs)，如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。克罗恩氏病是慢性和衰弱性炎症性肠病，其被认为反映了针对肠道菌群的过度活跃的TH1介导的免疫应答。克罗恩氏病的病变可出现在肠道的任何地方，偶尔也可出现在胃肠道的其它地方。另一方面，溃疡性结肠炎病变通常出现在结肠中。病变的性质也不同，但这些疾病十分相似，有时难以在临床上区分它们。参见，例如，美国专利号6,558,661。本文所述的抗体和组合物可用于治疗IBD患者，和/或减少、预防或消除IBD的一种或多种症状或并发症。
抑制CCR7的活性涉及组织或器官移植排斥(Lo等，25 2011，Transplantation 91：70-77；Liu等，2011，Eur J Immunol 41：611-23；Yuling等，Am J Transplant 8：1401-12)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗组织或器官移植受体，例如肾、心脏、皮肤或肺移植受体，和/或减少、预防或消除移植手术的一种或多种并发症。
CCR7活性涉及哮喘、变应性气道炎症、气道平滑肌增生和纤维化肺疾病(Gomperts等，2007，J Leukoc Biol.82：449-56；Kawakami等，2012，Cell Immunol2575：24-32；Saunders等，2009，Clin Exp Allergy 39：1684-92)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗患有哮喘、变应性气道炎症、气道平滑肌增生或纤维化肺病的患者，和/或减少、预防或消除这些疾病的一种或多种症状或并发症。
CCR7活性涉及类风湿性关节炎(Moschovakis等，2012，Eur J Immunol.42：1949-55)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗类风湿性关节炎患者，和/或减少、预防或消除类风湿性关节炎的一种或多种症状或并发症。
CCR7活性涉及多发性硬化症(Aung等，2010，J Neuroimmunol.226：158-64)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗患有多发性硬化症的患者，和/或减少、预防或消除多发性硬化症的一种或多种症状或并发症。
CCR7活性涉及银屑病(Fan等，2008，Indian J Dermatol Venereol Leprol.74(5)：550；Bosè等，2013，Am J Pathol，183(2)：413-421)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗银屑病患者，和/或减少、预防或消除银屑病的一种或多种症状或并发症。
CCR7活性涉及动脉粥样硬化(Luchtefeld等，2010，Circulation 10 122：1621-28)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗患有动脉粥样硬化的患者，和/或减少、预防或消除动脉粥样硬化的一种或多种症状或并发症。
CCR7活性涉及HIV感染(Evans等，2012，Cytokine Growth Factor Rev.23：151-57)。本文所述的抗体和组合物可用于治疗感染HIV的患者，包括患有AIDS的患者，或具有HIV感染或发展AIDS的风险的患者，和/或减少、预防或消除一种或多种HIV或AIDS的症状或并发症。
本发明的抗CCR7抗体和包含此类抗体的组合物可进一步用于纤维化治疗，优选的是组织纤维化。组织纤维化的实例包括选自以下的纤维化：肝纤维化，肾纤维化，肺纤维化，皮肤纤维化，心血管纤维化，胃肠纤维化和其它纤维性疾病。肝纤维化的实例包括选自肝硬化、缺血再灌注、肝移植后障碍、坏死性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的肝纤维化。关于肝硬化，选自酒精诱导、药物诱导和化学诱导中的至少一种而引起的肝硬化。肾纤维化的实例包括选自增殖性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、肾源性纤维化性皮肤病、糖尿病性肾病、肾小管间质纤维化和局灶节段性肾小球硬化症的肾纤维化。肺纤维化的实例包括选自肺间质纤维化、药物诱导的结节病、肺纤维化、特发性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病、弥漫性肺泡损伤疾病、肺动脉高压和新生儿支气管肺发育不良的肺纤维化。皮肤纤维化的实例包括选自硬皮病、瘢痕疙瘩、银屑病、肥厚性瘢痕形成和假性硬皮病的皮肤纤维化。心血管纤维化的实例包括选自动脉粥样硬化、冠状动脉再狭窄、充血性心肌病、心力衰竭、心脏移植和心肌纤维化的心血管纤维化。胃肠纤维化的实例包括选自胶原性结肠炎、绒毛萎缩、隐窝增生、息肉形成、克罗恩病纤维化、胃溃疡愈合和腹部后粘连手术瘢痕的胃肠纤维化。纤维化可能具有由骨相关纤维化疾病引起的病症并且可能是类风湿性血管翳形成。
任何上述治疗方法可以应用于需要这种治疗的任何对象，包括例如哺乳动物，优选灵长类动物，最优选为人类。
在此文献和其权利要求中，动词“包含”及其变形，以其非限制性含义使用，意味着包括该词后面的项目，但未特别提及的项目不排除在外。此外，用不定冠词“一(a)”或“一(an)”对某个成分的引用，并不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅有一个元件。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常意味着“至少一个”。
本说明书中引用的所有专利和参考文献都以其全文通过引用并入本文。
提供以下实施例仅用于说明目的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
附图描述
图1.(a)鼠mAb 729和(b)人源化mAb 650(mAb 729的人源化版本)的表位作图。两种抗体识别位于人CCR7的N端的相同线性表位(Z＝硫化酪氨酸)。
图2.配体结合(a：CCL19；b：CCL21)对人T淋巴瘤细胞迁移的激动作用受到鼠抗CCR7mAb 730的抑制(IC50分别为15nM和6nM)。
图3.在CDC测定中，正常幼稚人T细胞没被抗人CCR7mAb 729-2A(三角形)处理杀死，也没被美罗华(Rituxan)(RTX；方形)或坎帕斯(Campath)(CAMP；圆形)杀死。IgG2A(菱形)作为阴性对照。
图4.CDC测定。CD20-难治性CLL患者肿瘤细胞被鼠抗人CCR7mAb 729-2A(729-2A；三角形)而不是阴性对照IgG2A(菱形)杀死。
图5.人源化抗CCR7mAb(1*1＝HC1LC1，2*1＝HC2LC1和3.1＝HC3LC1)和嵌合抗人CCR7mAb(Fab小鼠/Fc人，0*0＝HC0LC0)诱导白血病淋巴细胞的裂解。阳性对照：mAb阿仑单抗(ALEM)和美罗华(RTX)和阴性对照：IGG1。用效应子细胞/靶细胞(CLL细胞)比例5：1(浅灰色条)和10：1(深灰色条)进行ADCC分析(n＝2)。
图6.通过活性内化测定法(PathHunter TM，DiscoverX，Fremont，CA，USA)测定的人源化抗CCR7mAb 650对CCL19诱导的CCR7受体内化的抑制。x轴显示mAb650的浓度(μg/ml)，而y轴显示CCL19诱导的CCR7内化的抑制(％抑制)。
图7.通过建立的β-arrestin招募测定法(PathHunter TM，DiscoverX，Fremont，CA，USA)测定的人源化抗CCR7mAb 650抑制CCL19诱导的CCR7依赖性细胞内β-arrestin途径信号传导。x轴显示mAb 650的浓度(μg/ml)，而y轴上显示抑制CCL19诱导的β-arrestin招募(％抑制)。
图8.通过建立的cAMP次级信使通路测定法(PathHunter TM，DiscoverX，Fremont，CA，USA)测定的人源化抗CCR7mAb 650对CCL19诱导的CCR7依赖性细胞内cAMP信号传导的抑制。x轴上显示mAb 650的浓度(μg/ml)而y轴上显示抑制CCL19诱导的CCR7cAMP次级信使通路(％抑制)。
实施例
1.小鼠抗CCR7mAb的生成
用包含或表达来自人CCR7N端胞外结构域的氨基酸序列的抗原免疫正常小鼠(即，具有鼠免疫系统的小鼠)。使用标准杂交瘤技术获得小鼠单克隆抗体。
使用在CCR7N-末端结构域的Y41处缺乏硫化的抗原的初始尝试产生不能中和CCL19-或CCL21-依赖性CCR7信号传导的抗体。用包含Y41硫化的抗原免疫产生一系列能够中和CCL19-或CCL21-依赖性CCR7信号传导的小鼠单克隆抗体。对于八种选择的小鼠抗人CCR7单克隆抗体序列进行测定。这8种单克隆抗体的高变区的氨基酸序列列于表1中。
729小鼠抗体的重链和轻链可变结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1和2中给出。
表1：八种选择的小鼠抗人CCR7单克隆抗体的高变区的氨基酸序列。
2.评估小鼠抗CCR7mAb
2.1表位作图
根据先前公开的方案(Slootstra等，1996Mol Divers，1：87-96；Timmerman等，2007，J Mol Recognit，20：283-99)进行单克隆抗体的表位作图(图1)。简而言之：在基于ELISA的PEPSCAN中测试抗体与每种肽的结合。将肽阵列与例如用封闭液(4％马血清、5％卵清蛋白(w/v)在PBS/1％吐温中)稀释到1mg/ml的一抗溶液孵育。洗涤后，将肽与抗体过氧化物酶缀合物的1000倍稀释液在25℃温育1小时。洗涤后，添加过氧化物酶底物溶液(0.5mg/ml 2,2’-连氮基–二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和在0.05M柠檬酸盐缓冲液(pH 4)中的0.006％H2O2)。在室温下孵育1小时后，测量显色。使用电荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统对显色进行量化。
2.2抗CCR7mAb抑制CCR7依赖性细胞内信号传导
通过已建立的标准β-arrestin招募法(PathHunterTM，DiscoverX，Fremont，CA，USA；Southern等，2013，J Biomol Screen.18(5)：599-609)测定获得的抗CCR7单克隆抗体(表2)抑制过表达人CCR7的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的CCL19和CCL21介导的细胞内信号传导。
表2：通过β-arrestin招募法确定的过表达人CCR7的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中CCL19和CCL21介导的细胞内信号传导的抑制。
2.3抗CCR7mAb抑制细胞迁移
鼠mAb 730分别抑制由配体CCL19和CCL21诱导的人T淋巴瘤细胞(内源性表达人CCR7受体)的迁移(趋化性)，其IC50分别为15nM和6nM(图2)。
细胞迁移法使用具有8μm孔径插入物的通透性双室(Costar，Cambridge，MA，USA)进行。下室含有稀释于补充有0.5％牛血清蛋白的HamF12培养基中的配体(CCL19或CCL21)。将与抗CCR7单克隆抗体预孵育的CCR7内源性表达细胞(T细胞淋巴瘤(HuT-78))置于插入物中，并将室置于37℃孵育。下室中跨膜迁移细胞的量通过将细胞裂解后进行DNA染色(CyQuant GR染料溶液，Life Technologies Ltd，UK)测定。
2.4抗CCR7mAb阻断CCR7信号传导而没有激动作用
在高浓度(267nM)下测试，上表2中列出的鼠抗人CCR7结合单克隆抗体(包括mAb729和730)均未在过表达人CCR7的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中检测到可检测的细胞内激动作用，测定是通过已建立的标准β-arrestin招募法(PathHunterTM，DiscoverX，Fremont，CA，USA；Southern等，2013，J Biomol Screen.18(5)：599-609)(数据未显示)。使用IgG2a作为阴性对照，并使用CCL21(CCR7的天然配体)作为阳性对照。
2.5亲和力测量
2.5.1Biacore亲和力测量
在标准条件下通过Biacore测量确定鉴定的单克隆抗体的亲和力。将单克隆抗体固定在合适的传感器表面上，并将包含衍生自人CCR7的N-末端残基19-49的硫化抗原SYM1899((pyroGlu)DEVTDDZIGDNTTVDZTLFESLCSKKDVRNK；SEQ ID NO:76)；其中Z表示硫化酪氨酸)的溶液通过传感器表面。所获得针对SYM1899的鼠mAb 729的亲和力值(Kd)为0.7nM。
2.5.2流式细胞仪亲和力测量
将表达人CCR7的CHO细胞(106个细胞/ml)在4℃下与3倍稀释系列(范围20nM-0.11pM)的鼠mAb 726-735预温育24小时。通过用藻红蛋白(PE)标记的小鼠特异性二抗染色，并随后通过流式细胞术检测来确定结合抗体的量。EC50值(表3由S形结合曲线中最小和最大平稳值的50％处确定。
表3：通过流式细胞术测定的鼠抗人CCR7mAb对表达hCCR7的CHO细胞的亲和力值(EC50)。
mAb 726 727 728 729 730 731 732 733 734 735
EC50(nM) 13.9 4.2 7.0 2.4 5.1 4.6 4.3 3.8 4.6 3.9
2.6抗CCR7mAb对正常细胞是安全的
在CDC测定中，在有效浓度(范围33-0.5nM)内，正常幼稚人类T细胞(图3对于抗CCR7单克隆抗体mAb 729-2A的处理是安全的。CDC测定如Cuesta-Mateos等描述的实施(2015，Cancer Immunol Immunother.DOI：10.1007/s00262-015-1670-z)。
2.7抗CCR7mAb杀死CD20难治性CLL患者肿瘤细胞
CD20-难治性CLL肿瘤B细胞(来自对细胞抑制剂和抗CD-20单克隆抗体治疗无反应，且被认为对抗CD20疗法具有抗性的患者)在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中被mAb729-2A(IC50 0.15nM)高效杀死(图4)。CDC测定如Cuesta-Mateos等人所述进行(2015，同上)。
3.人源化
3.1人源化Ab的设计和构建
鼠单克隆抗体抗人CCR7Mab 729被选择用于人源化。使用来自IMGT和Kabat的抗体编号系统，在单克隆抗体729中鉴定CDR(参见上表1)。这两个编号系统将鼠抗体的不同残基鉴定为属于CDR，并且使用组合的IMGT/Kabat CDR序列来优化CDR-环构象的保留。如本文中使用的鼠mAb 729的人源化变体的编码是mAb 650。
对于鼠重链，最接近的人种系基因V区是人IGHV3-21(SEQ ID NO:73)。对于鼠轻链，最接近的人种系基因V区是人IGKV1-39(SEQ ID NO:74)。
为了重链的人源化，使用BLAST搜索算法搜索人IgG序列的在线数据库以比对小鼠VH结构域，并从最高的200个BLAST结果中选择候选人源可变结构域。基于框架同源性、保留关键框架残基和典型环结构的组合，又将其精简为三个候选者，分别为CAG17616(SEQ IDNO:67)，AAL67510(SEQ ID NO:68)和ACS96226(SEQ ID NO:69)。将鼠抗人CCR7mAb 729VH的CDR移植到这些受体框架中，它们变成人源化变体VH1、VH2和VH3，具有人源化重链可变区氨基酸序列，分别如SEQ ID NO:61、62和63中所示。表4列出了根据IMGT编号的三种人源化重链可变结构域中框架区的氨基酸序列。
表4：根据IMGT编号的三种人源化重链可变结构域中重链框架区的氨基酸序列
为了使轻链人源化，使用BLAST搜索算法搜索人IgG序列的在线数据库以与鼠VL结构域进行比较，并从最高200个BLAST结果中选择候选人可变结构域。基于框架同源性、保持关键框架残基和典型环结构的组合，又将它们减少至三个候选者，分别为ABI74066(SEQ IDNO:70)、ABA26122(SEQ ID NO:71)和ABU90653(SEQ ID NO:72)。通过移植到这些受体框架中的鼠抗人CCR7mAb 729VH的CDR，它们分别变成人源化变体VK1、VK2和VK3，分别具有SEQID NO:64、65和66的人源化重链可变结构域氨基酸序列。表5列出了根据IMGT编号的三种人源化轻链可变结构域中的框架区的氨基酸序列。
表5：根据IMGT编号的三种人源化轻链可变结构域中的轻链框架区的氨基酸序列
Ab FR 氨基酸序列 SEQ ID NO:
VK1 1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 50
VK1 2 LNWYQQKPGKAPKRLIY 52
VK1 3 NLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 55
VK1 4 FGQGTKVEIK 58
VK2 1 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 51
VK2 2 LNWYQQKPGKAPKLLIY 53
VK2 3 NLDSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC 56
VK2 4 FGQGTKLEIK 59
VK3 1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 50
VK3 2 LAWLQQKPGKAPKSLIY 54
VK3 3 NLDSGVPSKFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYC 57
VK3 4 FGQGTRLEIK 60
原始VK3变体含有N-连接糖基化基序(NXS/T，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)。通过将位置72处的天冬氨酸残基改变为丝氨酸残基来除去该N-连接糖基化基序。天冬氨酸突变为丝氨酸，其是在鼠VL中该位置的残基。一些人源抗体在此位置也含有丝氨酸。除了VK3变体中的这种N-连接糖基化基序之外，在其它人源化变体的序列中未发现其它N联糖基化基序。
4.评估人源化抗CCR7mAb
4.1结合免疫原SYM1899
ELISA用来评估抗体650变体与免疫原SYM1899(源自人源CCR7的N末端(残基19-49)的硫化肽，SEQ ID NO:76)的结合。在包被缓冲液中将100ng/孔SYM1899固定的96孔Maxisorp板上。除去包被缓冲液并加入200μl/孔的封闭溶液(3％w/v半脱脂奶粉，PBS)并在室温下搅拌2小时。用PBS-T(0.001％v/v Tween 20)洗涤平板6次。将抗体650变体在PBS中稀释至1ug/ml，并用PBS进行系列1:1稀释至浓度为0.0078μg/ml。除了PBS的阴性对照之外，将每个抗体稀释液一式三份的100μl加入到平板中，并在室温搅拌下孵育2小时。用PBS-T洗板6次。加入100μl/孔的山羊抗人HRP(Fc特异的)(1：60000，在PBS中)并将平板在室温下搅拌1小时。将板用PBS-T洗涤6次，并用PBS洗涤1次。加入100μl/孔的TMB底物溶液并在37℃温育10分钟。每孔加入50μl 1M HCl，立即在Biolise读板仪上读取450nm下的值。
表6：使用4参数回归曲线拟合计算的抗体650变体的Kd测定
抗体650变体 Kd(nM)
HC0 LC0 2.14
HC1 LC1 1.78
HC1 LC2 3.29
HC1 LC3 >100
HC2 LC1 10.05
HC2 LC2 8.33
HC2 LC3 >100
HC3 LC1 4.404
HC3 LC2 3.05
HC3 LC3 >100
mAb 650的人源化成功地鉴定了许多潜在的候选变体。包含LC3轻链变体的全部三种抗体650变体与SYM1899没有良好结合并且给出的Kd高于100。
HC1LC1产生1.78的最佳Kd并且是与SYM1899惊人地结合的唯一构建体，其甚至比嵌合体HC0LC0(Kd为2.14)更好。
4.2抗体650变体1-1、2-1和3-1介导CLL细胞中的ADCC
包含相同轻链变体(LC1，即重链*轻链：1*1＝HC1LC1；2*1＝HC2LC1；和3.1＝HC3LC1)的三种人源化抗人CCR7IgG1mAb和嵌合抗人CCR7mAb(Fab小鼠/Fc人类：0*0＝HC0LC0)，通过抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)测定法(n＝2)，确定从慢性淋巴细胞白血病患者中杀死50-60％的恶性T细胞(图5)。阿伦单抗(ALEM)和美罗华(RTX)用作阳性对照，mAbIGG1用作阴性对照。按Somovilla-Crespo等人(2013，J.of Hematol.&Oncol.6：89)所述进行ADCC测定。
4.3人源化抗CCR7mAb 650抑制CCR7受体内化
采用一种基本上如下所述的已建立的活性内化测定法(PathHunterTM，DiscoverX，Fremont，CA，USA)，通过测定抑制CCL19诱导的CCR7受体内化(IC50 0.4155μg/ml＝2.8nM；测试范围：267-0.014nM)(图6)证明了抗CCR7mAb 650-H1L1的拮抗活性(图6)。
活性内化测定设计：GPCR内吞作用
使用EFC技术，DiscoveRx开发了几种研究受体内化的方法。激活的GPCR内化分析提供了arrestin介导的GPCR内化的定量测量，此法允许监测活细胞中质膜上未标记的arrestin结合的GPCR的运动。
为了拮抗剂的测定，将细胞与拮抗剂一起预孵育，然后在EC80浓度下进行激动剂挑战。对样品原液进行中间稀释以产生5倍在测定缓冲液中的样品。将5μL的5X样品加入到细胞中并在37℃或室温下温育30分钟。载体浓度为1％。将5μL在测定缓冲液中的6X EC80激动剂加入到细胞中，并在37℃或室温下温育90或180分钟(EA-arrestin/EA-内体)或在37℃温育16小时(EA-膜)。
信号检测
通过单独添加12.5或15μL(50％v/v)的PathHunter Detection试剂混合物，然后在室温下孵育1小时来产生测定信号。使用进行化学发光信号检测的PerkinElmerEnvisionTM仪器，在信号生成后读取微板。
数据分析
使用CBIS数据分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。对于拮抗剂模式测定，使用以下公式计算抑制百分比：％抑制＝100％×(1-(测试样品的平均RLU-载体对照的平均RLU)/(EC80对照的平均RLU-载体对照的平均RLU))。
4.3人源化抗CCR7mAb 650抑制β-arrestin途径的CCR7依赖性细胞内信号传导
通过已建立的β-arrestin招募法(PathHunterTM，DiscoverX，Fremont，CA，USA)测定，mAb 650-H1L1(鼠mAb 729的人源化版本)有效抑制CCL19诱导CCR7的细胞内信号传导(IC50 9.5622μg/ml＝63.7nM；测试范围267-0.014nM)(图7)，基本上如下所述。
Arrestin通路
β-Arrestin测定使用由DiscoveRx开发的称为酶切片段互补(EFC)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)作为功能性报告基因的技术，以均匀、非成像检测形式监测GPCR的活化。
测定设计
拮抗剂调节形式：为了拮抗剂测定，将细胞与拮抗剂一起预孵育，然后在EC80浓度下进行激动剂挑战。对样品原液进行中间稀释以产生5倍在测定缓冲液中的样品。将5μL的5倍样品加入到细胞中并在37℃或室温下温育30分钟。载体浓度为1％。将5μL在测定缓冲液中的6倍EC80激动剂加入到细胞中，并在37℃或室温下温育90或180分钟。
信号检测
通过单独添加12.5或15μL(50％v/v)的PathHunter Detection试剂混合物，然后在室温下孵育1小时来产生测定信号。使用进行化学发光信号检测的PerkinElmerEnvisionTM仪器，在信号生成后读取微板。
数据分析
使用CBIS数据分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。对于拮抗剂模式测定，使用以下公式计算抑制百分比：％抑制＝100％×(1-(测试样品的平均RLU-载体对照的平均RLU)/(EC80对照的平均RLU-载体对照的平均RLU))。
4.4人源化抗CCR7mAb 650抑制CCR7依赖性细胞内cAMP信号传导
通过已建立的基本上如下所述的cAMP次信使途径测定法(PathHunterTM，DiscoverX，Fremont，CA，USA)测定，mAb 650-H1L1抑制CCL19诱导的CCR7依赖性细胞内cAMP信号传导(IC50 1.609μg/ml＝10.7nM；测试范围267-0.014nM)(图8)。
cAMP次级信使通路
DiscoveRx开发了一组稳定表达无标记的GPCR的细胞系，其通过cAMP内源性地发出信号。HitcAMP法使用由DiscoveRx开发的称为酶切片段互补(EFC)并以β-半乳糖苷酶(β-Gal)作为功能终点的技术，通过Gi和Gs次级信使信号传导以均匀的非成像测定形式监测GPCR的活化。
测定设计：GPCR cAMP调节
反激动剂形式
为了反向激动剂的测定，将细胞与EC20福司柯林中的样品预孵育。从细胞中吸出培养基并用15μL 2:1HBSS/10mM HEPES:cAMP XS+Ab试剂代替。进行样品原液的中间稀释以生成含有4×EC20福司柯林的测定缓冲液中的4倍样品。将4.5μL的4倍样品加入到细胞中并在37℃或室温下温育30或60分钟。最终测定载体的浓度为1％。
信号检测
在适当的化合物温育后，通过与20μL cAMP XS+ED/CL裂解混合物孵育1小时，然后与20μL cAMP XS+EA试剂在室温下温育3小时产生测定信号。使用PerkinElmer EnvisionTM仪器进行化学发光信号检测，在信号生成后读取微板。
数据分析
使用CBIS数据分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。对于Gi反激动剂模式测定法，百分比活性使用以下公式计算：
％反激动剂活性＝100％×((测试样品的平均RLU-EC20福司柯林的平均RLU)/(福司柯林阳性对照的平均RLU-EC20对照的平均RLU))。
5.人源化抗CCR7抗体的同种异型转换和CDC增强的Fc突变体
5.1同种异型转换和CDC增强突变体的设计
人源化抗CCR7mAb 650变体1-1、2-1和3-1(参见上文4.2编码)的原始同种异型不产生足够强的CDC效应子功能。因此，三种变体1-1、2-1和3-1的同种异型被转换为人类同种异型G1m17,1以产生变体11-17、21-17、31-17，各自具有如SEQ ID NO:79所示的重链恒定区。为了进一步增强CDC效应子功能，这三种变体的重链恒定区被进一步引入E333A取代修饰(如Idusogie等人，2000，J.Immunol.164：4178-4184)，以产生变体11-AE、21-AE、31-AE，其各自具有如SEQ ID NO:80中所示的重链恒定区。此外，通过将11-17抗体的重链中的HVR-H3(CDR3)氨基酸序列改变为SEQ ID NO:：81中的氨基酸序列来构建对照抗体“11-x”，完全消除了其识别和结合CCR7的能力。将抗体在500ml培养体积中的CHO细胞中瞬时表达，纯化，并用于如下所述的进一步测试，以及也与被称为“0-0”的嵌合HC0LC0抗体(参见上文)一起。
5.2同种异型转换和CDC增强的突变体人源化抗CCR7抗体的表现
接下来在多种测定中测试了抗体11-17、21-17、31-17、11-AE、21-AE、31-AE、11-x 和嵌合Ab 0-0的性能。
1.通过流式细胞术对三种不同的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)样品和三种不同的T细胞幼淋巴细胞性白血病(TPLL)样品进行荧光激活细胞分选(FACS)，测定抗体与膜表达CCR7的结合(数据未显示)。包括适当的对照(人类同种型对照)以容易地计算从比率MFI(样品)/MFI(对照)获得的阳性细胞百分比和/或相对中值荧光强度(RMFI)。在CLL样品上，抗体11-AE、11-17、31-17、31-AE表现最佳，甚至优于嵌合0-0抗体。在TPLL样品上，抗体11-AE和11-17表现最好。抗体11-AE、11-17、31-17、31-AE显示了从两个健康供体(HD)获得的T细胞上的类似FACS谱，而它们不结合嗜中性粒细胞、单核细胞或NK细胞(数据未显示)。
2.对三种不同的CLL样品和一种TPLL样品(数据未显示)测试抗体介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。基本上按照Cuesta-Mateos等人(2015，同上)所述进行CDC测定。在样品#1和#3的新鲜分离的CLL细胞中，抗体11-17、11-AE和31-AE显示介导CDC的最佳响应。抗体11-17和11-AE在样品#2的CLL细胞上显示介导CDC的应答。抗体11-17、11-AE、21-AE和31-AE在样品#1的TPLL细胞上显示介导CDC的应答。
基于以上关于抗体在FACS谱和CDC中的表现的结果，抗体11-AE、11-17、31-17和31-AE被选择用于进一步测试。
3.在四种选择的抗体中，11-AE和11-17在第四种CLL样品上显示最佳CDC谱(数据未显示)。
4.四种选择的抗体进一步测试其介导ADCC的能力。如下进行ADCC测定：
A)靶细胞：将分离的PBMC或源自患者的恶性细胞在37℃在单独培养基(RPMI+0.1％BSA)或在存在终浓度10μg/ml的测试抗体的培养基中孵育30分钟。根据所使用的样品，测试同种型对照(IC)和/或抗CD52(阿仑单抗)和/或抗CD20(利妥昔单抗)和/或抗CCR7抗体。通过加入2ml RPMI+0.1％BSA洗涤未结合的抗体两次，并以1800rpm旋转细胞2分钟。
B)效应子细胞：通过Ficoll密度梯度离心获得人或小鼠PBL。如上所述，使用针对CD16-PE和CD14-APC的抗体，通过FACS测定NK细胞和单核细胞的比例。
C)为了区分靶细胞和效应子细胞，根据制造商的方案，用钙黄绿素-UV细胞追踪器(Invivogen)标记PBL。简言之，将1μL的5mM Cell Tracker溶液加入到每1毫升PBS细胞悬液(1×106个细胞/mL)中，使最终的工作浓度为5μM。将样品在37℃孵育20分钟，避光。然后，将5倍原始染色体积的培养基添加到细胞中并温育5分钟(该步骤除去溶液中剩余的所有游离染料)，并用1800rpm离心2分钟使细胞沉淀。
D)将靶细胞以104细胞/孔置于RPMI+10％FBS中的96孔圆底平板中。然后，以不同的效应子-靶标比例(E:T)，将钙黄绿素-UV-标记的PBL用作效应子细胞(作为细胞裂解的效应子)。温育4小时后，靶细胞用几种特异性标记物染色，通过7AAD染色测定细胞活性。每个样品通过流式细胞术分析。由ADCC杀死的靶细胞的百分比通过：％裂解＝100×(ER-SR)/(MR-SR)确定。ER、SR和MR代表实验性、自发性和最大细胞死亡。数据归一化至培养基对照。
对2种不同的CLL样品，所有四种选择的抗体在使用分离的PBL介导的ADCC上，都优于阿仑单抗和利妥昔单抗(数据未示出)。
5.在阿仑单抗难治性CLL样品上，所有四种选择的抗体都能使用分离的PBL介导ADCC(数据未示出)。
6.流式细胞术亲和谱(FCAP)显示所有四种选择的抗体在CLL和TPLL细胞上具有相似的结合谱，尽管具有11重链组合的抗体比具有31重链组合的抗体具有稍高的亲和力(数据未示出)。
7.在CLL和TPLL样品中，所有四种选择的抗体都阻断了向CCL19的迁移，然而抗体31-AE对阻断向CCL21的迁移的效果略低(数据未示出)。
表7给出了上述结果的综述，其中个别同种异型转换和CDC增强的突变体人源化抗CCR7抗体变体根据它们在上述测定中的相对表现来排列。通过FACS分析，11-x没有显示与膜表达的CCR7的任何结合，也不介导CDC或ADCC。

Claims (15)

1.包含高变区HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的人源化抗CCR7抗体，其中：
HVR-H1包含SEQ ID NO:6；
HVR-H2H1包含SEQ ID NO:13；
HVR-H3H1包含SEQ ID NO:19；
HVR-L1H1包含SEQ ID NO:27；
HVR-L2H1包含SEQ ID NO:31；和
HVR-L3H1包含SEQ ID NO:36，
并且其中抗体具有以下至少一种：
a)对具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的合成抗原的最小亲和力，所述最小亲和力定义为比小鼠抗CCR7抗体的Kd高不超过10倍的Kd，所述小鼠抗CCR7抗体的重链可变结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO:1，并且所述小鼠抗CCR7抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列是SEQID NO:2；和，
b)不超过100nM的抑制CCR7依赖性细胞内信号传导和CCR7受体内化中的至少一种的IC50，所述CCR7依赖性细胞内信号传导和CCR7受体内化中的至少一种通过选自CCL19和CCL21的至少一种CCR7配体。
2.根据权利要求1所述的人源化抗CCR7抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含4个重链框架区HFR1至HFR4，和3个高变区HVR-H1至HVR-H3，所述4个重链框架区和所述3个高变区以HFR1、HVR-H1、HFR2、HVR-H2、HFR3、HVR-H3和HFR4的顺序可操作地连接，其中所述抗体的轻链可变结构域包含4个轻链框架区LFR1至LFR4，和3个高变区HVR-L1至HVR-L3，所述4个轻链框架区和所述3个高变区以LFR1、HVR-L1、LFR2、HVR-L2、LFR3、HVR-L3和LFR4的顺序可操作地连接，其中重链框架区HFR1至HFR4具有氨基酸序列：
i)分别为SEQ ID NO:40、43、45和48；
ii)分别为SEQ ID NO:41、44、46和49；或，
iii)分别为SEQ ID NO:42、44、47和49，
并且其中轻链框架区LFR1至LFR4具有氨基酸序列：
iv)分别为SEQ ID NO:50、52、55和58；或，
v)分别为SEQ ID NO:51、53、56和59。
3.根据权利要求1或2所述的人源化抗CCR7抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含与SEQ ID NO:61、62和63中的至少一个具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，并且其中所述抗体的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:64和65中的至少一个具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，其中优选地所述抗体的重链可变结构域包含氨基酸SEQ ID NO:61的序列并且优选地所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的人源化抗CCR7抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:61并且所述抗体的轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:64。
5.根据前述权利要求中任一项所述的人源化抗CCR7抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区。
6.根据前述权利要求中任一项所述的人源化抗CCR7抗体，其中所述抗体包含具有选自以下的至少一种效应子功能的功能性Fc区：C1q结合，补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用。
7.根据前述权利要求中任一项所述的人源化抗CCR7抗体，其中所述抗体包含同种异型G1m17,1的重链恒定区，其中优选地所述重链恒定区包含E333A取代。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项的人源化抗CCR7抗体。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的人源化抗CCR7抗体或根据权利要求8所述的药物组合物，其用作药物。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的人源化抗CCR7抗体或根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗癌症、炎症性病症、由组织或器官移植引起的病症或并发症、或由纤维化引起或与之相关的病症或并发症。
11.用于权利要求10所述用途的根据权利要求1至7中任一项所述的人源化抗CCR7抗体或根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述癌症是其中肿瘤细胞表达CCR7受体的癌症，优选地所述癌症选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、霍奇金病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、蕈样霉菌病、慢性骨髓增殖综合征的急变期、骨髓增生异常综合征的急变期、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、胃癌、头和颈鳞状细胞癌和结肠癌。
12.用于权利要求10所述用途的根据权利要求1-7中任一项所述的人源化抗CCR7抗体或根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述炎症性病症选自炎症性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性气道炎症、气道平滑肌增生、纤维化肺病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、动脉粥样硬化、HIV感染和AIDS，或其中所述组织或器官移植是肾、心脏、皮肤和肺移植中的一种或多种。
13.用于权利要求10所述用途的根据权利要求1-7中任一项所述的人源化抗CCR7抗体或根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述纤维化选自肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、皮肤纤维化、心血管纤维化、胃肠纤维化。
14.包含编码根据权利要求1-7中任一项的人源化抗CCR7抗体的核苷酸序列的核酸分子，其中优选地所述核酸分子包含编码所述抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域中至少一个的核苷酸序列，并且其中优选地所述编码核苷酸序列与调节序列可操作地连接以在宿主细胞中表达所述编码核苷酸序列。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的核酸分子。
CN201680059274.5A 2015-08-10 2016-08-10 拮抗剂ccr7受体的人源化抗体 Active CN109069620B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15180415 2015-08-10
EP15180415.0 2015-08-10
PCT/EP2016/069055 WO2017025569A1 (en) 2015-08-10 2016-08-10 Humanized anti-ccr7 receptor antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109069620A true CN109069620A (zh) 2018-12-21
CN109069620B CN109069620B (zh) 2022-04-26

Family

ID=53836447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680059274.5A Active CN109069620B (zh) 2015-08-10 2016-08-10 拮抗剂ccr7受体的人源化抗体

Country Status (17)

Country Link
US (4) US10640565B2 (zh)
EP (1) EP3334457B1 (zh)
JP (1) JP6844864B2 (zh)
KR (1) KR102663440B1 (zh)
CN (1) CN109069620B (zh)
AU (1) AU2016305283B2 (zh)
BR (1) BR112018002877A2 (zh)
CA (1) CA2994214C (zh)
DK (1) DK3334457T3 (zh)
EA (1) EA037397B1 (zh)
ES (1) ES2828368T3 (zh)
HU (1) HUE051920T2 (zh)
IL (1) IL257359B (zh)
MX (1) MX394165B (zh)
PT (1) PT3334457T (zh)
SI (1) SI3334457T1 (zh)
WO (1) WO2017025569A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112957472A (zh) * 2021-02-05 2021-06-15 无锡市第五人民医院 靶向ccl19/ccr7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途
CN119390838A (zh) * 2024-05-29 2025-02-07 锐胜科生物医药(上海)有限公司 一种靶向ccr7的纳米抗体及其制备与应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10640565B2 (en) * 2015-08-10 2020-05-05 Pepmab B.V. Humanized anti-CCR7 receptor antibodies
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
GB201820006D0 (en) * 2018-12-07 2019-01-23 Lifearc Humanised anti-IL17BR antibody
CA3123512A1 (en) * 2018-12-18 2020-06-25 Catapult Therapeutics B.V. The use of anti-ccr7 mabs for the prevention or treatment of graft-versus-host disease (gvhd)
EP3947472A4 (en) * 2019-04-04 2023-02-22 Vanderbilt University THERAPEUTIC ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF LUNG CANCER
WO2021069632A1 (en) * 2019-10-09 2021-04-15 Catapult Therapeutics B.V. Use of an anti-ccr7 antibody in combination therapies with a btk inhibitor and/or bcl2- inhibitor for treating hematological malignancies
US20230181756A1 (en) * 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
TW202216771A (zh) * 2020-06-26 2022-05-01 德商拜耳廠股份有限公司 用於治療應用之ccr8抗體
KR20230152032A (ko) 2021-02-03 2023-11-02 모차르트 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 결합제 및 이를 사용하는 방법
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
KR102748862B1 (ko) * 2022-05-19 2025-01-02 국민대학교 산학협력단 Ccr7의 활성 조절 항체
CN116284419B (zh) * 2023-02-07 2024-10-11 深圳市先康达生命科学有限公司 靶向人gucy2c蛋白的单克隆抗体及其应用
WO2024194605A1 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Quell Therapeutics Limited Treg therapy
CN119236085A (zh) * 2024-12-05 2025-01-03 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 可治疗系统性硬化病的趋化因子配体19抑制剂的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009139853A2 (en) * 2008-05-14 2009-11-19 Kim, Eldar Human monoclonal antibodies against human chemokine receptor ccr7
WO2013184200A1 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 Msm Protein Technologies Human monoclonal antibodies against human chemokine receptor ccr7
WO2014151834A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-ccr7 antigen binding proteins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
WO2007003216A1 (en) 2005-07-06 2007-01-11 Universidad Autónoma de Madrid Anti-ccr7 receptor antibodies for the treatment of cancer
WO2012043533A1 (ja) 2010-09-28 2012-04-05 積水化学工業株式会社 抗ヒトｃｃｒ７抗体、ハイブリドーマ、核酸、ベクター、細胞、医薬組成物、並びに、抗体固定化担体
US10640565B2 (en) * 2015-08-10 2020-05-05 Pepmab B.V. Humanized anti-CCR7 receptor antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009139853A2 (en) * 2008-05-14 2009-11-19 Kim, Eldar Human monoclonal antibodies against human chemokine receptor ccr7
WO2013184200A1 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 Msm Protein Technologies Human monoclonal antibodies against human chemokine receptor ccr7
WO2014151834A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-ccr7 antigen binding proteins

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112957472A (zh) * 2021-02-05 2021-06-15 无锡市第五人民医院 靶向ccl19/ccr7的乙型肝炎免疫治疗剂及其用途
CN119390838A (zh) * 2024-05-29 2025-02-07 锐胜科生物医药(上海)有限公司 一种靶向ccr7的纳米抗体及其制备与应用
CN119390838B (zh) * 2024-05-29 2025-06-10 锐胜科生物医药(上海)有限公司 一种靶向ccr7的纳米抗体及其制备与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109069620B (zh) 2022-04-26
DK3334457T3 (da) 2020-09-21
AU2016305283A1 (en) 2018-02-22
CA2994214A1 (en) 2017-02-16
PT3334457T (pt) 2020-09-24
WO2017025569A1 (en) 2017-02-16
US20180237529A1 (en) 2018-08-23
EP3334457A1 (en) 2018-06-20
US20200362043A1 (en) 2020-11-19
AU2016305283B2 (en) 2022-05-26
JP6844864B2 (ja) 2021-03-17
JP2018522568A (ja) 2018-08-16
KR20180030931A (ko) 2018-03-26
US10640565B2 (en) 2020-05-05
EA037397B1 (ru) 2021-03-24
EA201890447A1 (ru) 2018-11-30
MX2018001596A (es) 2018-05-02
US11254749B2 (en) 2022-02-22
CA2994214C (en) 2024-03-12
US20250092147A1 (en) 2025-03-20
HUE051920T2 (hu) 2021-03-29
KR102663440B1 (ko) 2024-05-07
IL257359A (en) 2018-04-30
SI3334457T1 (sl) 2021-01-29
ES2828368T3 (es) 2021-05-26
IL257359B (en) 2022-03-01
US12122838B2 (en) 2024-10-22
BR112018002877A2 (pt) 2018-11-06
MX394165B (es) 2025-03-24
US20220135693A1 (en) 2022-05-05
EP3334457B1 (en) 2020-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12122838B2 (en) Humanized anti-CCR7 receptor antibodies
JP7455787B2 (ja) グリコシル化ｐｄ－１に対して特異的な抗体およびその使用方法
JP5068270B2 (ja) 癌を処置するためのｉｌ−１７アンタゴニスト抗体
KR102048718B1 (ko) 항-cxcr4 항체 및 항체-약물 접합체
CN105473615B (zh) 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
CN102958534B (zh) Notch1结合剂及其使用方法
CN109715666A (zh) 癌症治疗方法和使用结合糖基化pd-l1的抗体的组合的疗法
CN108738324A (zh) 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
CN109195991A (zh) 对糖基化pd-l1特异的双重功能抗体及其使用方法
CN108112254A (zh) 抗-pdl1抗体、可活化的抗-pdl1抗体、及其使用方法
CN109575136A (zh) 新型抗dpep3抗体和使用方法
CN109311997A (zh) 抗axl拮抗抗体
CN110204614A (zh) 抗人lag-3单克隆抗体及其制备方法和用途
CN109069627A (zh) 对foxp3衍生肽特异性的t细胞受体样抗体
CN109789208A (zh) 抗膜联蛋白a2单克隆抗体
CN110366564A (zh) 使用与程序性死亡1(pd-1)结合的抗体的免疫疗法
CN110382541A (zh) 人源化抗cd40抗体
CN109661406A (zh) 靶向肿瘤相关巨噬细胞的抗体及其用途
CN114616245A (zh) 一种抗cd38的抗体及其用途
HK1255020A1 (zh) 人源化抗ccr7受體抗體
HK1255020B (zh) 人源化抗ccr7受體抗體
OOSTINDIE CLUSTERING: A RATIONAL DESIGN PRINCIPLE FOR POTENTIATED ANTIBODY

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: J W Buck

Inventor after: R. Burth Hoyzen

Inventor after: W. C. Piick

Inventor after: J. Tulkstra

Inventor after: K. H. swanborn

Inventor before: J W Buck

Inventor before: R. Burth Hoyzen

Inventor before: W. C. Piick

Inventor before: J. Tulkstra

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant