CN108956989B - 一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents
一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其包括样品垫、量子垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和衬板，量子垫上包被有量子点微球标记的抗原复合物，抗原复合物包括Urease抗原、CagA抗原、VacA抗原和鼠IgG；硝酸纤维素膜上设置有第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线，第一检测线上包被有VacA抗原，第二检测线上包被有CagA抗原，第三检测线上包被有Urease抗原，质控线上包被有羊抗鼠IgG。本发明提供的用于检测幽门螺杆菌分型的检测试剂卡，能够快速、准确的得到结果，且能够根据检测结果能够判断幽门螺杆菌的感染类型，进而为临床上的相关疾病提供辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫学中量子点免疫荧光层析技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡及其制备方法。
背景技术
流行病学研究显示，幽门螺杆菌(HP)感染率非常高，全球大约50％的人都携带有HP，其已被国际癌症组织确认为胃溃疡、慢性胃炎和胃癌等胃部疾病最主要的致病因子。发病率的高低与社会经济水平，人口密集程度，公共卫生条件以及水源供应有较密切的关系。流行病学研究显示，HP感染多发生于儿童时期，在缺少抗生素治疗情况下，HP感染通常伴随终生；儿童感染菌株的基因型不受环境迁移而改变，常与父母感染的HP基因型一致。此外，HP感染也是成年人中最广泛的慢性细菌感染，且感染率随年龄增加而上升。中国自然人群HP感染率调查表明：21个省52个地区，累计检测人数25209，HP感染率从34.52％～80.55％，多数地区人群感染率在50％左右，平均感染率为58.07％，胃癌高发区人群HP感染率总体水平高于低发区人群，感染年龄早于发达国家20年左右，20岁～40岁感染率为45.4％～63.6％，70岁以上高达78.9％。
研究证实，HP可以诱发慢性萎缩性炎症改变，进而胃泌素分泌增加，环氧化酶-2(COX-2)和前列腺素(PGE)表达量上升，引起胃粘膜细胞形态和功能改变，导致慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌及胃粘膜相关淋巴瘤等胃肠道疾病的发生。HP感染明显增加了发生十二指肠和胃溃疡的危险性，大约1/6幽门螺杆菌感染者可能发生消化性溃疡病；HP感染还使患胃癌的危险增加了2.7～12倍，有5％的B型萎缩性胃炎病人可发展为胃癌。随着研究的深入，人们发现HP感染在非消化道疾病，如缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜、肝胆管疾病、心血管病、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等的发生发展中也同样发挥重要作用。
幽门螺杆菌是革兰氏阴性菌，菌体呈螺旋形弯曲，故称幽门螺杆菌。幽门螺杆菌生存于胃部及十二指肠的各区域内，它会引起胃黏膜轻微的慢性发炎，甚或导致胃及十二指肠溃疡与胃癌。幽门螺杆菌是人胃内唯一能够产生大量尿毒酶的细菌，故可通过检测尿毒酶来诊断HP感染。1994年，国际癌症研究署将HP感染定为I类致癌物质，可致癌HP主要含有两种细胞毒素：一种是细胞毒素相关蛋白CagA，一种是空泡细胞毒素VacA。根据是否表达CagA和VacA将HP分为两种类型：I型为致病性较强的产毒菌株(CagA和VacA均表达，或表达其中一种)，II型为毒性较弱的不产毒菌株(CagA和VacA均不表达)。
自1983年通过胃镜取活检标本分离培养成功以来，对HP感染的诊断已发展出了许多方法，如免疫学、细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等。从标本采集角度可以分为侵入性和非侵入性两大类。侵入性方法主要指必须通过胃镜取活检标本检查的方法，包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验、荧光PCR(TaqMan探针)等。非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断HP的方法，包括同位素示踪法、免疫学方法(抗原、抗体检测)等。检测方法虽然多种，但简便、快速还能检测分型的却微乎其微。
量子点微球具有较好的生物相同性，其中量子点载体可以是聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丁二烯等，而目前非常理想的荧光材料载体是聚苯乙烯，其具有易合成、表面易修饰有机官能团及反应活性高等优点。形成的量子点聚苯乙烯微球疏水、坚硬、不可生物降解、不被一般溶剂溶解或溶胀，具有比表面积大、吸附性强、凝结作用大及表面反应能力强等特性。
量子点荧光微球有较高的荧光强度，这使产品检测具有快速、高灵敏、低成本等优点成为可能。量子点微球是将大量量子点包载或吸附到微球内部或表面形成的微球。它提高单个微球的荧光强度的同时将量子点装载在微球内部，还能提高微球的稳定性，如抗漂白性，热稳定性，化学稳定性等。同时在微球表面修饰官能团或者聚电解质等，便于与生物大分子通过化学、静电、氢键等方式结合，可广泛应用于生物各领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种作简便、反应快速、特异性强的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡及其制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其包括样品垫、量子垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和衬板，所述的量子垫上包被有量子点微球标记的抗原复合物，所述的抗原复合物包括Urease抗原、CagA抗原、VacA抗原和鼠IgG；所述的硝酸纤维素膜上自所述的样品垫所在侧向着所述的吸水纸所在侧依次设置有第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线，所述的第一检测线上包被有VacA抗原，所述的第二检测线上包被有CagA抗原，所述的第三检测线上包被有Urease抗原，所述的质控线上包被有羊抗鼠IgG。
优选地，所述的量子点微球包括量子点聚苯乙烯微球、沉积在所述的量子点聚苯乙烯微球表面的一层或多层聚电解质层，所述的聚电解质层包括由聚丙烯胺盐酸盐形成的内层以及由聚苯乙烯磺酸钠形成的沉积在所述的内层表面的外层。
具体地，所述的量子点微球通过如下步骤制备得到：
(1)将所述的量子点聚苯乙烯微球分散在水中，加入聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30～60min形成所述的聚电解质层的内层，离心去除多余的聚丙烯胺盐酸盐；
(2)将步骤(1)制得的形成有所述的内层的量子点聚苯乙烯微球分散在水中，加入聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30～60min形成所述的聚电解质层的外层，离心去除多余的聚苯乙烯磺酸钠；
(3)选择性地重复步骤(1)和步骤(2)，得到所述的量子点微球。
本发明中，所述的量子点聚苯乙烯微球可以采用市购获得的量子点聚苯乙烯微球，或者采用本领域常规方法制得的量子点聚苯乙烯微球。
更具体地，步骤(1)中，所述的量子点聚苯乙烯微球与所述的聚丙烯胺盐酸盐的投料质量比为1：60～70；步骤(2)中，所述的形成有所述的内层的量子点聚苯乙烯微球与所述的聚苯乙烯磺酸钠的投料质量比为1：60～70。
更具体地，步骤(1)中，所述的量子点聚苯乙烯微球加水稀释至浓度为1～3mg/mL。
更具体地，步骤(1)中，所述的聚丙烯胺盐酸盐溶液的浓度为1～3mg/mL。
更具体地，步骤(2)中，形成有所述的内层的量子点聚苯乙烯微球加水稀释至浓度为1～3mg/mL。
更具体地，步骤(2)中，所述的聚苯乙烯磺酸钠溶液的浓度为1～3mg/mL。
优选地，所述的量子点微球中的量子点为CdSe/CdS和/或CdSe/ZnS。
优选地，所述的抗原复合物中所述的Urease抗原、所述的CagA抗原、所述的VacA抗原和所述的鼠IgG的投料质量比为1：0.9～1,1：0.9～1,1：0.9～1,1。
优选地，所述的量子点微球与所述的抗原复合物的投料质量比为1：0.6～1。
优选地，所述的量子垫为经过预处理的量子垫，所述的预处理的方法为：将量子垫浸没在量子垫优化缓冲液中，然后干燥并控制湿度在30％以下，其中，所述的量子垫优化缓冲液包括浓度为45～55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.8～1.2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.4～0.6％的吐温20、质量百分浓度为1.8～2.2％的蔗糖、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300、以及余量的纯化水。
本发明的另一个目的是提供一种所述的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述的量子点微球分散在磷酸盐缓冲液中，然后加入所述的抗原复合物，10～40℃摇床孵化1.5～2.5h，再加入量子点微球封闭液，孵化2～3h，离心过滤得到所述的量子点微球标记的抗原复合物，其中，所述的量子点微球封闭液包括质量百分浓度为8～12％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.04～0.06％的NaN3、以及余量的纯化水；
(2)将步骤(1)制得的所述的量子点微球标记的抗原复合物用量子点稀释缓冲液稀释至0.4～0.6μmol/L，然后以0.8～1.2μL/cm的量喷涂在所述的量子垫上，干燥制得包被有量子点微球标记的抗原复合物的量子垫，其中，所述的量子点稀释缓冲液包括浓度为90～110mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.8～1.2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.4～0.6％的吐温20、质量百分浓度为1.8～2.2％的蔗糖、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300、以及余量的纯化水；
(3)将所述的硝酸纤维素膜粘贴到所述的衬板上，将所述的VacA抗原、所述的CagA抗原和所述的Urease抗原分别用印膜缓冲液稀释成0.8～1.2mg/m L，将所述的羊抗鼠IgG用印膜缓冲液稀释成0.6～1mg/m L，然后分别以0.8～1.2μL/cm的量喷涂在所述的硝酸纤维素膜，干燥制得所述的第一检测线、所述的第二检测线、所述的第三检测线和所述的质控线，其中，所述的印膜缓冲液包括浓度为0.01～0.03mol/L、pH7～7.4的PBS缓冲液、质量百分浓度为0.8～1.2％的海藻糖、浓度为8～12mmol/L的乙二胺四乙酸、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300；
(4)将经步骤(3)处理后的粘贴有硝酸纤维素膜的衬板、样品垫、经步骤(2)处理后的量子垫、吸水纸进行组装得到所述的检测试剂卡。
优选地，所述的制备方法还包括对所述的样品垫进行预处理的步骤：将样品垫浸没在样品垫优化缓冲液中，然后干燥并控制湿度在30％以下，其中，所述的样品垫优化缓冲液包括浓度为45～55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.4～0.6％的吐温20、质量百分浓度为0.08～0.12％的proclin300、以及余量的纯化水。
本发明的第三个目的是提供一种所述的检测试剂卡在幽门螺杆菌分型检测中的应用。
优选地，采用iSIA01荧光免疫分析仪进行检测。
本发明的技术原理是：当样品垫上加入含有待检测物质的待测血清，血清通过虹吸作用流经量子垫和硝酸纤维素膜后即形成固相抗原—抗体—标记抗原复合物，从点样开始15分钟后通过分析仪读取检测线和质控线的信号值，根据3个抗体各自的参考值分别判断Urease抗体、CagA抗体和VacA抗体的阴阳性。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供的用于检测幽门螺杆菌分型的检测试剂卡，能够快速、准确的得到结果。本发明采用量子点免疫荧光法检测血清中的Urease抗体、CagA抗体和VacA抗体，根据检测结果能够判断幽门螺杆菌的感染类型，进而为临床上的相关疾病提供辅助诊断。
附图说明
附图1为本发明试纸条的结构示意图；其中，1：样品垫；2：量子垫；3：硝酸纤维素膜；4：吸水纸；5：衬板；6：第一检测线；7：第二检测线；8：第三检测线；9：质控线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件，本发明中的试剂均可市购获得。
实施例1、检测试剂卡的制备
1、样品垫1的优化：
1.1、材料与试剂：
(1)样品垫1：玻璃纤维材质。
(2)样品垫优化缓冲液：50mmol/L、pH8.2的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.1％的proclin300、以及余量的纯化水。
1.2、将样品垫1浸没在样品垫优化缓冲液中，浸没30～45min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下。
2、量子垫2的优化：
2.1、材料与试剂
(1)量子垫2：玻璃纤维材质。
(2)量子垫优化缓冲液：50mmol/L、pH8.2的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分浓度为0.5％的吐温(Tween)20、质量百分浓度为2％的蔗糖、质量百分浓度为0.1％的proclin300、以及余量的纯化水。
2.2、将量子垫2浸没在量子垫优化缓冲液中，浸没30～45min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下。
3、量子点微球的制备：
3.1、材料与试剂
(1)量子点聚苯乙烯微球：来源是自制或者外购，量子点为CdSe/CdS。
(2)聚丙烯胺盐酸盐(PAH)溶液：浓度为2mg/mL，溶剂为超纯水。
(3)聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液：浓度为2mg/mL，溶剂为超纯水。
3.2、制备步骤：
(1)将量子点聚苯乙烯微球纯化后分散在超纯水中，稀释至浓度为2mg/mL，取3mL量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200mL的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的PAH聚电解质；
(2)将步骤(1)制得的量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为2mg/mL，取3mL量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的PSS聚电解质；
(3)将步骤(2)制得的量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为2mg/mL，取3mL量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200mL的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的PAH聚电解质；
(4)将步骤(3)制得的量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为2mg/mL，取3mL量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的PSS聚电解质，制得沉积有两层聚电解质层的量子点微球，其中，每层聚电解质层分别包括由聚丙烯胺盐酸盐形成的内层以及由聚苯乙烯磺酸钠形成的沉积在内层表面的外层。
4、量子点微球标记的抗原复合物的制备：
4.1、材料与试剂
(1)步骤3制得的量子点微球。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)：组成为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
(3)抗原复合物：质量比为1：1：1：1的Urease抗原、CagA抗原、VacA抗原和鼠IgG。
(4)量子点微球封闭液：质量百分浓度为10％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分浓度为0.05％的NaN3、以及余量的纯化水。
4.2、将1mg量子点微球加入10mL磷酸盐缓冲液中，超声分散均匀；然后加入0.8mg的抗原复合物，室温摇床孵育2h，使抗原与量子点微球结合；加入0.5mL的量子点微球封闭液，孵化2.5h，然后以12000r/min的速度离心30min，离心2次。4℃保存。
5、包被有量子点微球标记的抗原复合物的量子垫2的制备
5.1、材料与试剂
(1)步骤2优化后的量子垫2。
(2)步骤4制得的量子点微球标记的抗原复合物。
(3)量子点稀释缓冲液：浓度为100mmol/L、pH8.2的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)、质量百分浓度为0.5％的吐温(Tween)20、质量百分浓度为2％的蔗糖、质量百分浓度为0.1％的proclin300、以及余量的纯化水。
5.2、将量子点微球标记的抗原复合物用量子点稀释缓冲液稀释至0.5μmol/L，然后用划膜喷金仪以1μL/cm的量喷涂在量子垫2上，干燥0.5h。
6、硝酸纤维素膜3上检测线和质控线9的制备
6.1、材料与试剂
(1)硝酸纤维素膜3。
(2)衬板5：PVC板。
(3)VacA抗原。
(4)CagA抗原。
(5)Urease抗原。
(6)羊抗鼠IgG。
(7)印膜缓冲液：浓度为0.01～0.03mol/L、pH7.2的PBS缓冲液、质量百分浓度为1％的海藻糖、浓度为10mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、质量百分浓度为0.1％的proclin300。
6.2、将硝酸纤维素膜3粘贴到衬板5上，将VacA抗原、CagA抗原和Urease抗原分别用印膜缓冲液稀释成1mg/mL，将羊抗鼠IgG用印膜缓冲液稀释成0.8mg/mL，将VacA抗原稀释液用划膜喷金仪以1μL/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜3上，干燥0.5h制得第一检测线6；将CagA抗原稀释液用划膜喷金仪以1μL/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜3上，干燥0.5h制得第二检测线7；将Urease抗原稀释液用划膜喷金仪以1μL/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜3上，干燥0.5h制得第三检测线8；将羊抗鼠IgG稀释液用划膜喷金仪以1μL/cm的量喷涂在硝酸纤维素膜3上，干燥0.5h制得质控线9。
7、检测试剂卡的组装
将步骤6制得的粘贴有硝酸纤维膜的衬板5、步骤1优化后的样品垫1、步骤5制得的量子垫2、吸水纸4按照由上到下、由内到外的顺序组装得到检测试剂卡，如图1所示。
对比例1
基本上与实施例1相同，不同之处在于：采用金标垫代替实施例1的量子垫且金标垫不经过实施例1步骤2的优化。
本发明对比例1的检测试剂卡的最低检测限：分别将幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体、细胞毒素相关蛋白CagA抗体和空泡细胞毒素VacA抗体的灵敏度参考品1:3、1:9、1:27稀释，稀释度为1:3、1:9的参考品检测应为阳性，稀释度为1:27的参考品检测应为阴性。
表1为对比例1的检测试剂卡的最低检测限检测结果
从表1可见，本发明对比例1的检测试剂卡的灵敏度不符合要求。
对比例2
基本上与实施例1相同，不同之处在于：采用十二胺盐酸盐代替实施例1的聚丙烯胺盐酸盐；采用十二烷基磺酸钠代替实施例1的聚苯乙烯磺酸钠。
对比例2的检测试剂卡的阴性符合率：取临床检测十五份阴性血清即Urease抗体、CagA抗体和VacA抗体全部为阴性。
表2为对比例2的检测试剂卡的阴性符合率检测结果
从表可见，对比例2的检测试剂卡的阴性符合率为87％，存在检测不准的风险。
实施例2、幽门螺杆菌分型检测方法
(1)将待测血清分别加到实施例1的检测试剂卡的样品垫(1)上，室温反应15min。
(2)将检测试剂卡插到iSIA01荧光免疫分析仪中，读取抗体的阴阳性。
检测方法与检测结果
(1)分别用大量的三种类型的符合正态的阴性血清去测浓度值，由于大于99％的可信度，因此把每种血清所测的均值+3SD定为阳性判断值。
(2)本发明实施例1的检测试剂卡的最低检测限：分别将幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体、细胞毒素相关蛋白CagA抗体和空泡细胞毒素VacA抗体的灵敏度参考品1:3、1:9、1:27稀释，稀释度为1:3、1:9的参考品检测应为阳性，稀释度为1:27的参考品检测应为阴性。
表3为实施例1的检测试剂卡的最低检测限检测结果
从表3可见，本发明实施例1的检测试剂卡的灵敏度符合要求。
(3)实施例1的检测试剂卡的阴性符合率：取临床检测十五份阴性血清即Urease抗体、CagA抗体和VacA抗体全部为阴性。
表4为实施例1的检测试剂卡的阴性符合率检测结果
| 名称 | Urease抗体 | CagA抗体 | VacA抗体 |
| 阴性血清1 | - | - | - |
| 阴性血清2 | - | - | - |
| 阴性血清3 | - | - | - |
| 阴性血清4 | - | - | - |
| 阴性血清5 | - | - | - |
| 阴性血清6 | - | - | - |
| 阴性血清7 | - | - | - |
| 阴性血清8 | - | - | - |
| 阴性血清9 | - | - | - |
| 阴性血清10 | - | - | - |
| 阴性血清11 | - | - | - |
| 阴性血清12 | - | - | - |
| 阴性血清13 | - | - | - |
| 阴性血清14 | - | - | - |
| 阴性血清15 | - | - | - |
从表4可见，实施例1的检测试剂卡的阴性符合率为100％。
(4)实施例1的检测试剂卡的阳性符合率：取临床检测阳性血清即Urease抗体阳性血清、CagA抗体阳性血清和VacA抗体阳性血清各十三份。
表5为实施例1的检测试剂卡的阴性符合率检测结果
从表5可见，实施例1的检测试剂卡的阳性符合率为100％
(5)实施例1的检测试剂卡和免疫印迹法检测临床样本结果比较
表6
从表6可见，实施例1的检测试剂卡的检测结果与已上市的试剂盒的检测结果一致，而且实施例1的检测试剂卡与其相比操作简单，反应快速。
上述表格中，+表示阳性，-表示阴性。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其包括样品垫（1）、量子垫（2）、硝酸纤维素膜（3）、吸水纸（4）和衬板（5），其特征在于：所述的量子垫（2）上包被有量子点微球标记的抗原复合物，所述的抗原复合物包括Urease抗原、CagA抗原、VacA抗原和鼠IgG；所述的硝酸纤维素膜（3）上自所述的样品垫（1）所在侧向着所述的吸水纸（4）所在侧依次设置有第一检测线（6）、第二检测线（7）、第三检测线（8）和质控线（9），所述的第一检测线（6）上包被有VacA抗原，所述的第二检测线（7）上包被有CagA抗原，所述的第三检测线（8）上包被有Urease抗原，所述的质控线（9）上包被有羊抗鼠IgG；所述的量子点微球包括量子点聚苯乙烯微球、沉积在所述的量子点聚苯乙烯微球表面的一层或多层聚电解质层，所述的聚电解质层包括由聚丙烯胺盐酸盐形成的内层以及由聚苯乙烯磺酸钠形成的沉积在所述的内层表面的外层；所述的量子点微球中的量子点为CdSe/CdS。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其特征在于：所述的量子点微球通过如下步骤制备得到：
1）将所述的量子点聚苯乙烯微球分散在水中，加入聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30~60min形成所述的聚电解质层的内层，离心去除多余的聚丙烯胺盐酸盐；
2）将步骤1）制得的形成有所述的内层的量子点聚苯乙烯微球分散在水中，加入聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30~60min形成所述的聚电解质层的外层，离心去除多余的聚苯乙烯磺酸钠；
3）选择性地重复步骤1）和步骤2），得到所述的量子点微球。
3.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其特征在于：步骤1）中，所述的量子点聚苯乙烯微球与所述的聚丙烯胺盐酸盐的投料质量比为1：60~70；步骤2）中，所述的形成有所述的内层的量子点聚苯乙烯微球与所述的聚苯乙烯磺酸钠的投料质量比为1：60~70。
4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其特征在于：所述的抗原复合物中所述的Urease抗原、所述的CagA抗原、所述的VacA抗原和所述的鼠IgG的投料质量比为1：0.9~1.1：0.9~1.1：0.9~1.1；所述的量子点微球与所述的抗原复合物的投料质量比为1：0.6~1。
5.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡，其特征在于：所述的量子垫（2）为经过预处理的量子垫，所述的预处理的方法为：将量子垫（2）浸没在量子垫优化缓冲液中，然后干燥并控制湿度在30%以下，其中，所述的量子垫优化缓冲液包括浓度为45~55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.8~1.2%的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.4~0.6%的吐温20、质量百分浓度为1.8~2.2%的蔗糖、质量百分浓度为0.08~0.12%的proclin300、以及余量的纯化水。
6.一种如权利要求1至5中任一项所述的幽门螺杆菌分型检测用检测试剂卡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将所述的量子点微球分散在磷酸盐缓冲液中，然后加入所述的抗原复合物，10~40℃摇床孵化1.5~2.5h，再加入量子点微球封闭液，孵化2~3h，离心过滤得到所述的量子点微球标记的抗原复合物，其中，所述的量子点微球封闭液包括质量百分浓度为8~12%的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.04~0.06%的NaN3、以及余量的纯化水；
2）将步骤1）制得的所述的量子点微球标记的抗原复合物用量子点稀释缓冲液稀释至0.4~0.6μmol/L，然后以0.8~1.2μL/cm的量喷涂在所述的量子垫（2）上，干燥制得包被有量子点微球标记的抗原复合物的量子垫（2），其中，所述的量子点稀释缓冲液包括浓度为90~110mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.8~1.2%的牛血清白蛋白、质量百分浓度为0.4~0.6%的吐温20、质量百分浓度为1.8~2.2%的蔗糖、质量百分浓度为0.08~0.12%的proclin300、以及余量的纯化水；
3）将所述的硝酸纤维素膜（3）粘贴到所述的衬板（5）上，将所述的VacA抗原、所述的CagA抗原和所述的Urease抗原分别用印膜缓冲液稀释成0.8~1.2mg/m L，将所述的羊抗鼠IgG用印膜缓冲液稀释成0.6~1mg/m L，然后分别以0.8~1.2μL/cm的量喷涂在所述的硝酸纤维素膜（3），干燥制得所述的第一检测线（6）、所述的第二检测线（7）、所述的第三检测线（8）和所述的质控线（9），其中，所述的印膜缓冲液包括浓度为0.01~0.03mol/L、pH7~7.4的PBS缓冲液、质量百分浓度为0.8~1.2%的海藻糖、浓度为8~12mmol/L的乙二胺四乙酸、质量百分浓度为0.08~0.12%的proclin300；
4）将经步骤3）处理后的粘贴有硝酸纤维素膜（3）的衬板（5）、样品垫（1）、经步骤2）处理后的量子垫（2）、吸水纸（4）进行组装得到所述的检测试剂卡。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述的制备方法还包括对所述的样品垫（1）进行预处理的步骤：将样品垫（1）浸没在样品垫优化缓冲液中，然后干燥并控制湿度在30%以下，其中，所述的样品垫优化缓冲液包括浓度为45~55mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.4~0.6%的吐温20、质量百分浓度为0.08~0.12%的proclin300、以及余量的纯化水。
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Denomination of invention: A detection reagent card for Helicobacter pylori typing and its preparation method Granted publication date: 20210813 Pledgee: CHINA FOREIGN ECONOMY AND TRADE TRUST Co.,Ltd. Pledgor: CHONGQING XINSAIYA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024990000377 |